diss_gorynia_susanne.pdf (1877 KB) - Ernst-Moritz-Arndt ...

Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin
(Direktor Univ.-Prof. Dr. Axel Kramer)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Aufbau und Vergleich zweier Prüfmodelle zur in vitro Testung
der antimikrobiellen Wirksamkeit von Argon-Plasma
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Zahnmedizin
(Dr. med. dent.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
2013
vorgelegt von:
Susanne Gorynia
geboren am 07. Oktober 1985
in Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar
1. Gutachter: Prof. Dr. A. Kramer
2. Gutachter: Prof. Dr. Ing. J. Lademann
Ort: Seminarraum, Raum-Nr.: J 02.15, der Klinik für MKG-Chirurgie/
Plastische Operationen, Sauerbruchstraße, Greifswald
Tag der Disputation: 12. November 2013

meinen lieben Eltern gewidmet

Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
II
Abkürzungsverzeichnis
IV
1 Einleitung 1
1.1 Definition und Bedeutung von Biofilmen 1
1.2 Aufbau und Struktur von Biofilmen 4
1.3 Entstehung dentaler Biofilme 5
1.4 Die dentale Plaque - ein komplexer bakterieller Biofilm:
pathogen oder protektiv? 6
1.5 Zielsetzung 8
2 Eigene Untersuchungen 13
2.1 Materialien und Methoden 13
2.1.1 Materialien 13
2.1.2 Methodenvergleich zwischen der Biofilmbildung im
Biofilmreaktor (Modell A) und in 24-Well-Platten (Modell B) 15
2.1.3 Behandlung des im Biofilmreaktor bzw. in 24-Well-Platten
angezüchteten Biofilms mit Argon-Plasma 18
2.1.4 Statistik 22
2. 2 Ergebnisse 23
2.2.1 Vergleich der Biofilmbildung zwischen Modell A und B 23
2.2.2 Wirksamkeit von Argon-Plasma im Modell A und B 27
3 Diskussion 33
3.1 Notwendigkeit neuer Strategien zur Prävention und Bekämpfung
dentaler Biofilme 33
3.2 Methode 34
3.3 Ergebnisse 37
3.3.1 Biofilmentwicklung 37
3.3.2 Antibiofilmwirkung des kINPen 09 mit Argon-Plasma 40
4 Zusammenfassung 47
5 Literaturverzeichnis 49
6 Anhang mit Auflistung aller Einzelergebnisse 72

Abbildungsverzeichnis
II
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Koaggregation von Bakterien durch „bridging“ 2
Abb. 2: Schematische Darstellung des Aufbaus von bakteriellen Biofilmen 4
Abb. 3: Europäischer Biofilmreaktor (EUREBI) 14
Abb. 4: Infusomat fmS B.Braun Ag (Melsungen, Deutschland) 14
Abb. 5: Versuchsaufbau zur Biofilmbildung im Biofilmreaktor 16
Abb. 6: Aufbau des Plasmajets kINPen 09 (aus Weltmann et al. 2010) 18
Abb. 7: Atmosphären-Druck Plasmajet (APPJ) kINPen 09
(Neoplas GmbH, Greifswald, Deutschland; Weltmann et al. 2010) 19
Abb. 8: Computergesteuerte Einwirkung von Argon-Plasma auf in vitro
Biofilme von S. sanguinis 20
Abb. 9: Plasmajet kINPen09, Einwirkung ungepulsten Argonplasmas
auf Titanplättchen in der 24-Well-Platte 21
Abb. 10: Kulturelle KbE-Bestimmung des 3 d reifen Biofilms 23
Abb. 11: Photometrischer Nachweis des 3 d reifen Biofilms
mit 0,1 % Kristallviolett 24
Abb. 12: Kulturelle KbE-Bestimmung des 3 d reifen Biofilms 25
Abb. 13: Photometrischer Nachweis des 3 d reifen Biofilms
mit 0,1 % Kristallviolett 25
Abb. 14: Versuch 1-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A
(kulturelle Nachweismethode) 27
Abb. 15: Versuch 2-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A
(kulturelle Nachweismethode) 28
Abb. 16: Versuch 3-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A
(kulturelle Nachweismethode ) 28
Abb. 17: Zusammenfassung der Versuche 1 bis 3-Wirksamkeit von
Argonplasma im Modell A (kulturelle Nachweismethode) 29
Abb. 18: Versuch 4-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B
(kulturelle Nachweismethode) 30
Abb. 19: Versuch 5-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B
(kulturelle Nachweismethode) 31

Abbildungsverzeichnis
III
Abb. 20: Versuch 6-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B
(kulturelle Nachweismethode) 31
Abb. 21: Zusammenfassung der Versuche 4 bis 6 - Wirksamkeit von
Argonplasma im Modell B (kulturelle Nachweismethode) 32

Abkürzungsverzeichnis
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
AG
APPJ
Bakt.
BHI
bzw.
CDC
CE
cfc
d
DBD
DC
d.h.
DSM
et al.
EUREBI
Exp.
g
GmbH
h
HDBD
Hz
IgA
IgG
IgM
KbE
kHz
kV pp
Abbildung
Aktiengesellschaft
atmospheric pressure plasma jet
Bakterium
Brain Heart Infusion
beziehungsweise
Center for Disease Control
Communauté Européenne (Europäische Gemeinschaft) bzw.
Conformité Européenne (Übereinstimmung mit EU-Richtlinien)
continuous flow culture technique
Tag
dielektrisch behinderte Entladung (Dielectric Barrier Discharge)
Gleichstrom (direct current)
das heißt
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
und andere - (et alii, et aliae, et alia)
Europäischer Biofilmreaktor
Experiment
Gramm
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
Stunde
Hohlelektroden-DBD
Hertz
Immunglobulin A
Immunglobulin G
Immunglobulin M
koloniebildende Einheit
Kilohertz
Kilovolt peakpeak

Abkürzungsverzeichnis
V
L. Legionella
log Logarithmus
Ltd Limited
MHz Megahertz
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
MW Mittelwert
N
Anzahl
NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer
P. Pseudomonas
RF Reduktionsfaktor
Rpm revolutions per minute
S. Streptococcus bzw. Staphylococcus
s
Sekunde
slm Standardliter/Minute
sog. sogenannt
spp. Pluralform, lat. für species
s
Standardabweichung (standard deviation)
u.a. unter anderem
UK United Kingdom
V
Volt
VDB Volumen-DBD
W Watt
z.B. zum Beispiel
zw. zwischen
µm Mikrometer
°C Grad Celsius
% Prozent

Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Definition und Bedeutung von Biofilmen
Grundsätzlich existieren zwei verschiedene Formen mikrobieller Lebensweisen: das
planktonische Wachstum, bei dem sich Bakterien frei schwebend in Suspension
befinden, und die Biofilmbildung an festen Oberflächen (Folwaczny und Hickel 2003).
Der Biofilm kann als eine Akkumulation einzelner Bakterienzellen und Mikrokolonien
an der Grenzfläche zwischen 2 verschiedenen Phasen definiert werden, die in eine
hochhydrierte, hauptsächlich anionische Matrix aus bakteriellen Exopolysacchariden
und anderen organischen Makromolekülen eingebettet sind (Hardie und Bowden 1975;
McKee et al. 1985; Keevil et al. 1987; Brown et al. 1988; Marsh 1992; Bryers 1993;
Peyton und Characklis 1995; Kinniment et al. 1996; Wimpenny 1996, 1997;
Marsh 1999; Schierholz et al. 1999; Stickler 1999). Über 90 % der Mikroorganismen
leben in dieser Kolonieform (Marsh und Bradshaw 1995; Marsh 2005), da sie besondere
Vorteile gegenüber der planktonischen Phase aufweist. Planktonische Zellen sind durch
antimikrobielle Wirkstoffe leichter zu eliminieren als in Biofilmen eingebettete
Mikroorganismen (Gängler et al. 2005). Die Bakteriendichte in Biofilmen ist bis zu
1000 mal höher als in der Plankton-Phase (Gängler et al. 2005). In Biofilmen ist die
Resistenz gegenüber Therapien mit Antibiotika oder Antiseptika 20- bis 5000-fach
höher im Vergleich zu planktonisch lebenden Bakterien (Brown et al. 1988;
Costerton et al. 1994; Costerton 1997; Kharazemi et al. 1999; Stickler 1999). Auch eine
Veränderung des Phänotyps der im Biofilm wachsenden Bakterien führt zu einer
reduzierten Empfindlichkeit (Bradshaw und Marsh 1999). Die gezielte Änderung der
phänotypischen Funktionen wird durch einen interzellulären Informationsaustausch
vermittelt, der als Signaltransduktion, Quorum sensing oder Biofilm signaling,
bezeichnet wird (Bowden und Hamilton 1998; Costerton et al. 1999b). Dabei werden
Signalmoleküle durch Bakterienzellen abgegeben, die bei Überschreiten einer
bestimmten Schwellenkonzentration in Abhängigkeit von der Zelldichte zu einer
Veränderung der Genexpression (Burne 1998; Costerton et al. 1999b) führen.

Einleitung 2
Außerdem ist ein Genaustausch durch Konjugation über die Ausbildung von
Zytoplasmabrücken, sog. F-Pili, möglich (Ou und Anderson 1970).
Der Zusammenhalt zwischen den einzelnen Bakteriengruppen des Biofilms wird durch
spezifische Adhäsionsmechanismen (Handely et al. 1999) und Koaggregationen
(Abb. 1) vermittelt (Kolenbrander et al. 1989, 1990, 1993, 1999).
Abb. 1: Koaggregation von Bakterien durch „bridging“ (a) An eine bereits auf der Oberfläche
haftende Zelle (Bakt. 1) adhäriert eine neu kolonisierende Bakterienzelle (Bakt.2). Diese kann
die Anheftung einer weiteren Bakterienzelle (Bakt. 3) an den Biofilm vermitteln; (b) indirekte
Adhäsion einer neu besiedelnden Bakterienzelle (Bakt. 2) an eine bereits vorhandene
Bakterienzelle (Bakt. 1) durch gemeinsame Anlagerung an die Extrazellularmatrix
(aus Folwaczny und Hickel 2003)
Auch gegenseitige Stoffwechselbeziehungen (Marsh und Bradwhaw 1997, 1999) sind
charakteristisch für Biofilme.
Biofilme sind in der Natur von großer Bedeutung (Gjaltema und Griebe 1995;
Handley 1995; Peyton und Characklis 1995). Sie beeinflussen die Lebensqualität durch
Biofilm-assozierte Infektionen (Hoyle und Costerton 1991; Johnson et al. 1998;
Costerton et al. 1999), die Wirtschaft z.B. durch Korrosion oder Verlegung von Lumen
in Rohrsystemen (Elvers et al. 1998) und belasten das Gesundheitssystem

Einleitung 3
(Anwar und Costerton 1990; Costerton 1997, 1999). Sie finden sich
z.B. in Wassersystemen, Kläranlagen, Trinkwasserleitungen und Ölpipelines
(Peyton und Characklis 1995).
In der Medizin spielen Biofilme besonders bei Kathetern, Herzschrittmachern,
Implantaten, Endoskopen und Operationsbestecken (Costerton 1997;
Stickler et al. 1998; Bayston et al. 1999; Costerton et al. 1999a;
Wattanakaroon und Steward 2000) oder bei der Infektion von Wunden und Organen
eine große Rolle (Hoyle und Costerton 1991; Johnson et al. 1998;
Pozo und Patel 2007).
Im Bereich der Zahnmedizin ist die Biofilmbildung in zahnärztlichen Einheiten
(Van der Kooij 1999; Bierhenke et al. 2001; Montebugnoli et al. 2001;
Tonetti-Eberle et al. 2001; Assadian et al. 2012; Fischer et al. 2012; Kramer et al. 2012)
ein bedeutendes Problem, weil über das Kühlwasser der Hand- und Winkelstücke eine
Infektionsgefährdung des Patienten (Grün 1967) und des zahnärztlichen Teams
(Riethe 1960; Kramer et al. 2012) vor allem durch L. pneumophila (Ricci et al. 2012)
und P. aeruginosa (Kramer et al. 2012) und gegeben ist. Diese können per Aspiration
oder Aerosol u.a. Atemweginfektionen auslösen (Kramer et al. 2005; Lück et al. 2011;
Ricci et al. 2012; Suerbaum et al. 2012). Bei 6 % der Patienten wurde P. aeruginosa
vor und bei 42 % der Patienten nach der Behandlung in der Mundhöhle nachgewiesen
(Exner et al. 1981). Im Vergleich zur Bevölkerung konnte bei Zahnärzten ein
signifikant höherer Antikörper-Titer von L. pheumophila festgestellt werden
(Fotos et al. 1985; Reinthaler et al. 1987; Lück et al. 1992).
Die dentale Plaque des Menschen stellt mikrobiologisch einen komplexen Biofilm dar
(Liljemark et al. 1997; Thrower et al. 1997; Embleton et al. 1998;
Bradshaw und Marsh 1999; Marsh 1999; Wilson 1999; Balzar Ekenbäck et al. 2001;
Guggenheim et al. 2001). Sie gilt als Auslöser der häufigsten Infektionserkrankungen
des Menschen, der Karies und der Parodontitis. Bei Periimplantiden spielt die
bakterielle Besiedlung ebenfalls eine große Rolle. Diese kann zu periimplantärer
Mukositis und Periimplantitis führen (Koban et al. 2011) sowie schwerwiegende
Konsequenzen wie Abszesse oder Verlust des Implantats nach sich ziehen
(Bumgardner et al. 2011).

Einleitung 4
1.2 Aufbau und Struktur von Biofilmen
Mikromorphologisch ist der Biofilm keine homogene Masse, sondern besteht aus
Zellnestern mit charakteristischem Aussehen in Form von Maiskolben-, Rosetten- und
Stoppelbürstenstruktur, die in die Matrix eingebettet sind (Marsh und Bradshaw 1995).
Die Bakterienzellen sind von extrazellulärer Matrix umgeben. Der anionische Teil
besteht aus Polysacchariden (Costerton et al. 1994; Gottenbos et al. 1999), die zur
Stabilität, Struktur und Haftung des Biofilms an der Oberfläche beitragen
(Costerton et al. 1995; Stickler 1999). Kanäle in der Matrix sorgen für einen besseren
Transport von Nährstoffen und Sauerstoff in tiefere Schichten (Abb. 2). Desweiteren
gewährleisten sie den Abfluss von Stoffwechselprodukten (Bryers 1993;
Costerton et al. 1994). Makromorphologisch sehen Biofilme oft pilz- oder tulpenförmig
(Abb. 2) aus (Costerton et al. 1994; Costerton 1995, 1999; Dibdin und Wimpenny 1999;
Roberts et al. 1999). Die Erscheinungsform ist sowohl von endogenen Faktoren wie der
Zellmorphologie und dem Ausmaß der extrazellulären Matrixbildung als auch von
exogenen Faktoren wie dem Nährstoffangebot und dem Diffusionsgradienten abhängig
(Wimpenny 1982).
Abb. 2: Schematische Darstellung des Aufbaus bakterieller Biofilme mit pilz- oder
turmförmigen Mikrokolonien; zwischen den einzelnen Mikrokolonien liegen Wasserkanäle;
diese ermöglichen eine Flüssigkeitszirkulation im Biofilm und den Zu- und Abtransport von
Nährstoffen und Metaboliten (aus Folwaczny und Hickel 2003)

Einleitung 5
1.3 Entstehung dentaler Biofilme
Auf der Zahnoberfläche bildet sich innerhalb von wenigen Minuten ein unstrukturierter
Film, die sog. ‚acquired Pellicle‘ (Marsh und Bradshaw 1993). Das exogene 0,1-1 µm
dicke Zahnoberhäutchen besteht aus Speichelproteinen wie Glykoproteinen,
Serumproteinen, Enzymen, Immunglobulinen und sauren prolinreichen Proteinen
(Liljemark et al. 1997). Die Eigenladung der Proteine ermöglicht eine elektrostatische
Bindung an die Kalzium- und Phosphatgruppen des Schmelzes, so dass es zur initialen
Adhäsion grampositiver Kokkenbakterien kommt (Busscher et al. 1992a), bei
der S. sanguinis einer der ersten und bedeutendsten Koloniebildner ist
(Rosan et al. 1982a, b; Marsh 1993; Marsh und Bradshaw 1993; Scheie 1994;
Fine 1995; Wilson et al. 1996a, 1998; Liljemark et al. 1997; Embleton et al. 1998;
Kolenbrander et al. 1999). Diverse Interaktionen, u.a. van-der-Waals Kräfte zwischen
der Bakterienzellwand und den Pellikelmolekülen, ermöglichen eine reversible
Anheftung weiterer Pionierbakterien (Folwaczny und Hickel 2003). Daraufhin erfolgt eine
Anheftung von Frühkolonisatoren wie Aktinomyceten, weitere Streptokokken,
Prevotellen, Capnocytophagen, Propionibakterien und Veillonellen (Döring 2001). Zu
den Spätkolonisatoren zählen Treponema spp., Porphyromonas gingivalis,
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Döring 2001). Gram-positive und
Gram-negative Aerobier und Anaerobier bestimmen jetzt die Plaque
(Hardie und Bowden 1975; Gilbert et al. 1993; Hellwig et al. 1995;
Bowden und Hamilton 1998). Adhäsine auf der Zelloberfläche der Bakterien bewirken
eine irreversible Haftung (Bowden und Hamilton 1998; Pratten et al. 1998b;
Amano et al. 1999; Bradshaw und Marsh 1999). Die Plaquevielfalt wird durch
Koadhärenz zwischen genetisch identischen Bakterienarten und Koaggregation
zwischen genetisch unterschiedlichen Bakterienarten gesteigert (Stickler 1999). Durch
Multiplikation der Mikroorganismen kommt es zu einer Zunahme der Biomasse
(Brecx et al. 1983; Stickler 1999). Auch die Zunahme der extrazellulären Matrix trägt
dazu bei.

Einleitung 6
Die Plaqueakkumulation ist an verschiedenen Stellen der Mundhöhle und auch an
verschiedenen Flächen des Zahns unterschiedlich (Bradshaw und Marsh 1999;
Stickler 1999).
1.4 Die dentale Plaque – ein komplexer bakterieller Biofilm: pathogen oder
protektiv?
Die orale Mikroflora umfasst 400-1000 Bakterien (Moore und Moore 1994). Die
Mikroorganismen binden an alle harten und weichen Oberflächen der Mundhöhle
(Weber und Netuschil 1992; Auschill et al. 2002). Dabei stellt die Adhäsion an
Weichgewebe kein Problem dar, da die Epithelzellen abgeschilfert werden
(Marsh 1989). Dadurch kann ein physiologisches Gleichgewicht aufrecht erhalten
werden. Hartoberflächen jedoch, wie die Zahnoberfläche, können nicht abgeschilfert
werden (Netuschil 2005). Somit kann sich an den Prädilektionsstellen, wie
Margo gingivae, Approximalraum und Fissuren, besonders leicht Plaque bilden
(Netuschil 2005).
Plaque kann auf gesundem Zahnschmelz (McKee et al. 1985; Pratten et al. 1998b) mit
kariogenen Bakterien (Pratten et al. 1998b; Marsh 1999) physiologisch sein
(Seymour und Heasman 1995; Bradshaw et al. 1996). Sie dient zum Schutz
vor pathogener Fremdbesiedlung (Costerton et al. 1995; Fine 1995;
Bradshaw und Marsh 1999). Protektive Eigenschaften sind vor allem dem initialen
Biofilm, der sog. Pellikel, zuzuordnen (Hannig und Hannig 2007). Diese stellt eine
bakterienfreie Schicht aus Glykoproteinen, adsorbierten Proteinen und anderen
Makromolekülen aus der Mundflüssigkeit dar (Hannig und Hannig 2007). Die Pellikel
mit den enthaltenen schützenden Speichelproteinen reduziert die Reibungskräfte
zwischen den antagonistischen Zahnflächen (Aguirre et al. 1987). Desweiteren werden
der Pellikel anti-erosive Eigenschaften zugeschrieben, die ebenfalls auf die
Proteinschutzschicht zurückzuführen sind (Zahradnik et al. 1976, 1978;
Zahradnik 1979; Hannig und Balz 2001; Hannig 2002; Hannig et al. 2003;
Nekrashevych und Stösser 2003). Der initiale Biofilm besitzt semipermeable
Eigenschaften und trägt damit zur Regulation des Mineralhaushaltes bei. Dabei werden

Einleitung 7
De- und Remineralisationsprozesse über Diffusion von Kalzium und Phosphat reguliert
(Zahradnik et al. 1976, 1978; Zahradnik 1979). Auch Lipide sind in der Pellikel
wirksam (Slomiany et al. 1986, 1990). Vermutlich optimieren hydrophobe
Lipidkomponenten die Schutzeigenschaften des initialen Biofilms gegenüber sauren
Noxen (Slomiany et al. 1986, 1990). Man vermutet einen Zusammenhang
zwischen der Lipidmenge und -zusammensetzung sowie der Kariesaktivität
(Hannig und Hannig 2007).
In der Pellikel sind Komponenten der spezifischen und unspezifischen Abwehr
nachgewiesen worden (Al- Hashimi und Levine 1989). Bedeutende Vertreter der
spezifischen Abwehr sind die drei Immunglobuline IgG, IgM and IgA. Zu den
wichtigen protektiven Enzymen in der Pellikel gehört das Lysozym (Pruitt et al. 1969),
das eine Lyse von Bakterienzellen (Wang und Germaine 1993) bewirkt, sowie die
Peroxidasen, die Radikale hydrolysieren und den oxidativen Stress in der Mundhöhle
eliminieren können (Mansson-Rahemtulla et al. 1988). Darüber hinaus katalysiert die
Peroxidase die Reduktion von Wasserstoffperoxid und Thiocyanat und bildet
daraus Hypothiocyanat, das eine Inhibition des Bakterienwachstums bewirkt
(Steele und Morrison 1969; Lenander-Lumikari et al. 1993).
Von der Pellikel bis zur etablierten Plaque gibt es verschiedene Stadien, wobei die
pathogene Potenz mit der Entwicklung zu einer etablierten Plaque ansteigt. Ein
bestimmtes Alter, eine Zunahme der Plaquemasse (Marsh und Bradshaw 1999) und eine
Änderung der Zusammensetzung bewirken eine Abnahme der Pufferwirkung des
Speichels (Marsh und Bradshaw 1993) und damit eine Störung des physiologischen
Gleichgewichts (Bradshaw et al. 1996; Marsh 1999).
Nach 3 d wird das Milieu in der Plaque kariogen (Millward und Wilson 1989;
Marsh 1992, 1993; Embleton et al. 1998; Schierholz et al. 1999). S. mutans und
Lactobacillen sind für die Entstehung von Karies Leitbakterien. Der bakterielle Abbau
von Kohlenhydraten zu Säuren bewirkt eine Verschiebung des pH-Wertes in den sauren
Bereich (Bradshaw et al. 1990; Pratten und Wilson 1999). Es stellt sich ein
Ungleichgewicht von Re- und Demineralisation der Zahnhartsubstanz zugunsten der
Demineralisation ein (Bradshaw et al. 1990; Marsh und Bradshaw 1995;
Bowden und Hamilton 1998; Bradshaw und Marsh 1999; Marsh 1999;
Pratten und Wilson 1999).

Einleitung 8
Die Plaque ist jedoch nur ein Faktor, der zu einer kariösen Läsion beiträgt. Desweiteren
sind an dem Prozess der Wirt, das Substrat und die Zeit von Bedeutung (Splieth 2000).
Es kommt zu einer Verschiebung des bakteriellen Gleichgewichts hin zu einem
Übergewicht bestimmter, immer in der Mundhohle vorhandener pathogener
Bakterienarten, sodass man Karies als eine opportunistische Infektion beschreiben kann
(Brauckhoff et al. 2009).
Entzündliche Parodonthopathien werden ebenfalls als opportunistische Infektionen
bezeichnet (Hellwig et al. 1995). Neben der Plaque spielen u.a. Pathogene
wie Actinobacillus actinomycetemcomitans und Porphyromonas gingivalis
(van Winkelhoff et al. 2002), ein ungünstiges Milieu und eine verminderte
Resistenzlage des Wirtes eine große Rolle. Es handelt sich jedoch nicht wie bei einem
kariösen Prozess um eine Demineralisation durch Säure, sondern um eine proteolytisch
enzymatische Gewebezerstörung (Marsh und Bradshaw 1995).
1.5 Zielsetzung
Die dentale Plaque beeinflusst entscheidend die Ätiologie von Karies und Parodontitis
(Marsh und Bradshaw 1993; Scheie 1994; Costerton 1995; Bowden 1998;
Gottenbos et al. 1999; Schierholz et al. 1999; Wilson 1999). Zudem kann der dentale
Biofilm eine Mukositis oder Periimplantitis induzieren und somit den Langzeiterfolg
von Implantaten gefährden (Duarte et al. 2009). Sowohl die Mukositis als auch die
Periimplantitis stellen infektiöse Störungen dar, die mit pathogenen Bakterienspezies
assoziiert sind und häufig bei parodontalen Erkrankungen beobachtet werden. Deshalb
ist es, ähnlich wie bei der parodontalen Behandlung, wichtig, den bakteriellen Biofilm
von den Implantaten zu entfernen, um periimplantären Infektionen vorzubeugen bzw.
diese zu behandeln (Klinge et al. 2002; Roos-Jansaker et al. 2003; Renvert et al. 2008).
Die dentale Plaque hat ernste Konsequenzen und stellt eine therapeutische
Herausforderung dar. Daher wird seit Jahrzehnten nach effizienten Mitteln zur
Ablösung, Zerstörung oder Vermeidung der Entstehung von Biofilmen geforscht.
Das häufigste Verfahren zur Entfernung ist die mechanische Reinigung
(Gottenbos et al. 1999), die durch eine Kombination mit chemischen Wirkstoffen,

Einleitung 9
Ultraschall, magnetischen oder elektrischen Feldern verbessert werden kann
(Thrower et al. 1997; Wilson 1999).
Dem Erfolg bisheriger Verfahren sind jedoch Grenzen gesetzt. So gelingt die
mechanische Reinigung aufgrund der schweren Zugänglichkeit vieler Biofilme nur
schlecht bzw. gar nicht. Nach Thrower et al. (1997) und Pratten et al. (1998b) sind die
meisten Menschen nicht in der Lage, ihre Mundhöhle effektiv zu reinigen. Die
mechanische Plaqueentfernung von Implantaten durch Küretten oder Ultraschall führt
zudem zur Beschädigung des Abutments (Koban et al. 2011). Chemische Maßnahmen
wie antiseptische Mundspülungen können zwar die Bakterienzahlen um 1-3 log-Stufen
senken (Kramer et al. 1998), führen jedoch auch zu Problemen wie Umweltbelastung
und zytotoxische Nebeneffekte. Obwohl z.B. Chlorhexidin effektiv den Biofilm
reduzieren kann und als Goldstandard in der Antiplaquebehandlung gilt
(Sladek et al. 2007), hat es einige Nebenwirkungen. Diese sind schlechter Geschmack,
Verfärbung der Zähne bei längerer Anwendung (Gjermo 1989; Thrower et al. 1997),
Desquamation und schmerzhafte Schleimhaut (Sladek et al. 2007). In Tierexperimenten
konnte außerdem eine Induktion prämaligner Veränderungen festgestellt werden
(Kramer 2001).
Daher ist es sinnvoll bzw. notwendig, neue Verfahren zu entwickeln und
einzuführen, die auf dem Einsatz von Wirkstoffen mit einem hohen
Biokompatibilitätsindex beruhen (Müller und Kramer 2008).
Zu den jüngsten Innovationen gehört die Entwicklung von Atmosphärendruckplasmen.
Plasma stellt den 4. Aggregatzustand nach fest, flüssig und gasförmig dar. Es wird
gebildet, wenn ein Gas ionisiert wird (Koban et al. 2011). Plasma ist ein elektrisch
neutrales, ionisiertes Gas, das aus Elektronen, Ionen, neutralen Teilchen,
vakuumultravioletter und ultravioletter Strahlung, freien Radikalen und chemisch
reaktiven neutralen Teilchen besteht (Duske et al. 2012).
Durch Modifikation von Oberflächen können Plasmen die Adhäsionsfähigkeit und
somit auch die Entstehung von Biofilmen beeinflussen (Yousefi Rad et al. 1998a, b).
Ebenso konnte bereits eine Reduzierung, Inaktivierung oder sogar
Zerstörung des Biofilms durch Atmosphärendruckplasmen nachgewiesen werden
(van den Bedem et al. 2005; Kamgang et al. 2007; Yu et al. 2006; Scholtz et al. 2007;

Einleitung 10
Sladek et al. 2007; Daeschlein et al. 2010, Hübner et al. 2010; Joaquin et al. 2009;
Hammann et al. 2010; Koban et al. 2010, 2011; Duske et al. 2012). Die Möglichkeit,
Biofilme durch gewebekompatible Atmosphärendruckplasmen zu bekämpfen, eröffnet
vielfältige Anwendungsbereiche (Kramer et al. 2009). Atmosphärendruckplasmen
könnten zur Verbesserung der Plaqueelimination in der Mundhöhle, v.a. an schwer
zugänglichen Stellen wie Zahnfleischtaschen, zur Elimination des Biofilms bei
Revisionseingriffen aufgrund infizierter Implantate, zur Behandlung chronischer
Wunden und zur Aufbereitung von Medizinprodukten wie Kontaktlinsen oder Prothesen
genutzt werden (Kramer et al. 2009; Daeschlein et al. 2010), sofern die
Unbedenklichkeit für diese Anwendungen nachgewiesen worden ist. Desweiteren
kommen Plasmen zur Unterstützung bei der Behandlung von Periimplantitis
in Betracht (Duske et al. 2012), da es das Wachstum der Osteoblasten
fördert und somit den Prozess der Reossifikation von dentalen
Implantaten verbessert. Atmosphärendruckplasmen schaffen hydrophile Oberflächen,
die die Adhäsion von Zellen und Gewebe verbessern (Duske et al. 2012). Außerdem
wurde eine antifungielle Wirkung nachgewiesen, die höher ist als die von Chlorhexidin
oder Natriumhypochlorit (Koban et al. 2010). Neben diesen Eigenschaften weisen
Niedertemperaturplasmen entscheidende Vorteile auf, z.B. kein Temperaturanstieg des
dekontaminierten Materials, geringe Anschaffungs- und Betriebskosten und
dekontaminierte Objekte sind sofort nutzbar (Scholtz et al. 2007).
Um die antimikrobielle Wirkung chemischer Wirkstoffe und unterschiedlicher
Plasmaquellen untersuchen zu können, wurden verschiedene in vitro Modelle
entwickelt. Viele dieser Modelle sind jedoch kostenintensiv, kompliziert und liefern
keine reproduzierbaren Ergebnisse (Keevil et al. 1987). Außerdem machen die
unterschiedlichen Kultursysteme, in denen oftmals keine zahnmedizinisch relevanten
Bakterien eingesetzt wurden, Vergleiche zwischen den Studien schwierig
(McLean et al. 1999). Aus diesen Gründen ist es wichtig, neue in vitro Modelle zu
entwickeln, die reproduzierbare, gut analysierbare und homogene Biofilme erzeugen.
Auch aus ethischen Gründen müssen zur Abklärung medizinischer
Anwendungsmöglichkeiten zunächst in vitro Modelle entwickelt werden
(Kramer et al. 2009).

Einleitung 11
Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, zwei in vitro Prüfmodelle mit dem
medizinisch und zahnmedizinisch relevanten Bakterium S. sanguinis aufzubauen und
miteinander zu vergleichen.
S. sanguinis kommt natürlicherweise im Mund- und Rachenraum vor und gilt als
Primärbesiedler der dentalen Plaque (Rosan et al. 1982a, b; Marsh 1993;
Marsh und Bradshaw 1993; Scheie 1994; Fine 1995; Wilson et al. 1996a, 1998;
Liljemark et al. 1997; Embleton et al. 1998; Kolenbrander et al. 1999). Zudem
beeinflusst S. sanguinis die Ätiologie von Karies und parodontalen Erkrankungen
(Xu et al. 2007) und zählt mit zu den häufigsten Erregern der bakteriellen Endokarditis
(Paik et al. 2005).
Die Biofilmbildung sollte bei beiden Modellen auf Titan simuliert werden. Dieses wird
seit vielen Jahren sowohl legiert als auch unlegiert in verschiedenen Bereichen der
Technik, der Medizin und Zahnmedizin, hier besonders im Bereich der Implantologie,
verwendet. Titan zeichnet sich durch eine hohe Biokompatibilität aus und gilt als
reaktives Metall, dass eine sehr resistente 2-10 mm dicke Oxidschicht auf der
Oberfläche ausbilden kann (Sibum 2002). Zahnärztliche Implantate aus Titan stellen
exzellente Alternativen zu konventionellen Prothesen dar (Duarte et al. 2009).
Deshalb kommen derzeit diverse Implantattypen in der Mundhöhle zum
Einsatz (Duarte et al. 2009). Trotz der Bemühungen, die Osseointegration durch
Modifizierung der Implantatoberflächen zu verbessern, hat man nachgewiesen, dass
bakterielle Infektionen eine Mukositis oder Periimplantitis induzieren und somit
den Langzeiterfolg von Implantaten gefährden können (Duarte et al. 2009).
In dieser Arbeit sollte durch die Erzeugung von Biofilmen auf Titanoberflächen ein
klinischer Bezug zur Periimplantitis, die immer stärker an Bedeutung gewinnt,
hergestellt werden. Denn 16 - 28 % der Patienten entwickeln bereits 10 Jahre nach der
Implantation periimplantäre Läsionen (Duske et al. 2012).
Prüfmodell A stellt den kostenintensiveren Europäischen Biofilmreaktor (EUREBI) dar
und zeichnet sich dadurch aus, dass es der Situation in der Mundhöhle besser entspricht.

Einleitung 12
Prüfmodell B ist die konventionelle 24-Well-Platte, die wegen ihrer geringeren Kosten
und leichteren Handhabung seit vielen Jahren in zahlreichen Laboren verwendet wird.
Die vorliegende Hypothese geht davon aus, dass der EUREBI bezüglich der
Biofilmbildung der 24-Well-Platte überlegen ist.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss von Atmosphärendruckplasmen zu
untersuchen. Dabei stellte sich die Frage, ob beide Modelle geeignet sind, einen
antimikrobiellen Effekt des Plasmas nachzuweisen. Als Hypothese wurde angenommen,
dass beide Prüfmodelle geeignet sind, den antimikrobiellen Effekt des Plasmas
nachzuweisen.

Eigene Untersuchungen 13
2 Eigene Untersuchungen
2.1 Materialien und Methoden
2.1.1 Materialien
Bakterienstamm: Es wurde ein Monospezies-Biofilm mit S. sanguinis DSM 20068
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig,
Deutschland) angezüchtet. Diese Spezies gehört zu den α-hämolysierenden oralen
Streptokokken (S. viridans), ist grampositiv und fakultativ aerob.
Nährmedium: Als Wachstumsmedium diente Hirn-Herz-Bouillon (BBL TM , Becton,
Dickinson and Company, Heidelberg, Deutschland), die mit 1 % Saccharose
(Merck, Darmstadt, Deutschland) supplementiert wurde, sowie NaCl (Carl Roth GmbH
& Co. KG, Karlsruhe, Deutschland).
Probekörper und Kultivierungsgefäße: Die Biofilme wurden auf Titanplättchen
(15 mm Durchmesser, 1 mm Dicke, Institut Straumann AG, Basel, Schweiz)
angezüchtet. Als Kultivierungsgefäß dienten der EUREBI, eine Weiterentwicklung des
Center for Disease Control durch das Institut für Hygiene und Umweltmedizin und die
NeoPlas GmbH (Abb. 3), bzw. 24-Well-Platten. Die Flüssigkultur wurde in 500 ml
Kolben angesetzt.

Eigene Untersuchungen 14
Abb. 3: Europäischer Biofilmreaktor (EUREBI)
Vorratsbehälter für das Nährmedium für den Bioreaktor: Als Vorratsgefäß diente
ein Infusionsbeutel.
Durchfluss: Der Durchfluss des Nährmediums wurde mit dem Infusomat fmS
(B. Braun Ag, Melsungen, Deutschland) gesteuert (Abb. 4).
Abb. 4: Infusomat fmS (B. Braun Ag, Melsungen, Deutschland)

Eigene Untersuchungen 15
Färbungen: 0,1 % Kristallviolett (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland).
Ablösen des Biofilms: Das Entfernen des Biofilms von den Plättchen wurde im
Ultraschallbad (Branson 2510, 130 W, 42 kHz, Dietzenbach, Deutschland) erreicht.
Weitere Materialien: Es wurden serielle Verdünnungen in 24-Well-Platten
(Techno Olastic Products AG, Trasadingen, Schweiz) erstellt. Die Verdünnungsstufen
wurden mit Hilfe von Glasspateln auf Columbia-Blut-Agar (BD BBL TM Stacker Plates)
ausplattiert. Anschließend wurden die KbE mit dem Kolonienzähler
(Bibby Scientific Ltd, Stone, UK) gezählt. Nach Färbung mit Kristallviolett wurden für
die Messung im Photometer (anthos, Mikrosysteme GmbH) 96-Well-Platten benutzt.
2.1.2 Methodenvergleich zwischen der Biofilmbildung im Biofilmreaktor
(Modell A) und in 24-Well-Platten (Modell B)
Modell A: Zunächst wurde eine Flüssigkultur angelegt. Dazu wurde aus der
Stammkultur eine Impföse in 100 ml BHI eingerührt. Die Flüssigkultur wurde für 48 h
im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Nach 48 h wurde die Flüssigkultur zusammen mit
550 ml frischer BHI in den Biofilmreaktor gegeben. Das Gesamtvolumen im Reaktor
betrug 650 ml. Die Titanplättchen wurden in den Reaktor eingespannt. Dabei können
5 Proben in einem Reaktorstab befestigt werden. Der Durchfluss, der durch den
Infusomaten reguliert wurde, betrug 18,6 ml/h und wurde 24 h nach Befüllen des
Reaktors eingeschaltet. Für die Durchmischung des Mediums diente ein Magnetrührer
(IKA RCT basic). Die Drehzahl des Magnetrührers wurde auf 50 rpm und die
Temperatur der Heizplatte auf 37 °C eingestellt. Zur Konstanthaltung der Temperatur
wurde ein Temperaturmessfühler in den Reaktor eingeführt. Abb. 5 zeigt den
Versuchsaufbau. Die Koloniezahl wurde nach 0 h, 24 h, 48 h und 72 h bestimmt. Nach
72 h bildete sich eine etablierte Plaque. Der Versuch wurde daher nach dieser Zeit
gestoppt.

Eigene Untersuchungen 16
Abb. 5: Versuchsaufbau zur Biofilmbildung im Biofilmreaktor
Zum Biofilmnachweis wurden die mit Biofilm bewachsenen Plättchen in eine
24-Well-Platte mit jeweils 1 ml NaCl pro Well gegeben. Die 24-Well-Platte wurde
anschließend im Ultraschallbad 30 min lang behandelt, um den Biofilm von den
Plättchen zu lösen. Es folgte eine serielle Verdünnung bis 10 -5 . Dabei wurden 100 µl der
Suspension in 900 µl 0,89 % ige NaCl-Lösung pipettiert. Anschließend wurden 100 µl
der Verdünnungsstufen 10 -3 , 10 -4 und 10 -5 auf Columbia-Blut-Agar ausplattiert. Die
Platten verblieben dann für 48 h im Brutschrank. Nach 48 h waren die Kolonien groß
genug, um sie mit dem Kolonienzähler zählen zu können.
Zum photometrischen Nachweis wurden die mit Biofilm bewachsenen Plättchen mit
0,1 % Kristallviolett-Lösung angefärbt. Dazu wurden 500 µl der Lösung in jedes Well
auf die Plättchen pipettiert. Nach 15 min Einwirkdauer wurde jedes Plättchen 3 mal mit

Eigene Untersuchungen 17
1 ml 0,89 % iger NaCl-Lösung gewaschen, um nicht gebundenen Farbstoff abzuspülen.
Anschließend wurden 500 µl eines Ethanol-Salzsäure-Gemisches (Merck, Darmstadt,
Deutschland) in jedes Well pipettiert, um den im Biofilm gebundenen Farbstoff zu lösen
und in Suspension zu bringen. Nach erneuter 15 min Inkubation wurden von jedem
Well 200 µl des Farbstoff-Entfärbelösung-Gemisches entnommen und in eine
96-Well-Platte pipettiert. Daraufhin wurde die Extinktion im Photometer bei 620 nm
bestimmt.
Modell B: Zunächst wurde eine Flüssigkultur angelegt. Dazu wurde aus der
Stammkultur eine Impföse in 100 ml BHI eingerührt. Diese wurde anschließend für
24 h in den Brutschrank gestellt. Nach 24 h wurde jeweils 1 ml von der Kultur in jedes
Well pipettiert. In den einzelnen Wells befanden sich die Titanplättchen. Zur
Negativkontrolle wurden 10 Titanplättchen nicht mit der Kultur beimpft, sondern nur
mit BHI bedeckt. Nach 0 h, 24 h, 48 h und 72 h wurde jeweils eine serielle
Verdünnungsreihe erstellt, um die Koloniezahl zu bestimmen.
Zum Biofilmnachweis wurden die mit Biofilm bewachsenen Plättchen in eine
24-Well-Platte mit jeweils 1 ml 0,89 % iger NaCl-Lösung pro Well gegeben. Die
24-Well-Platte wurde anschließend im Ultraschallbad 30 min lang behandelt, um den
Biofilm von den Plättchen zu lösen. Es folgte eine serielle Verdünnung. Dabei wurden
100 µl der Suspension in 900 µl 0,89 % ige NaCl-Lösung pipettiert. Anschließend
wurden 100 µl der Verdünnungsstufen 10 -3 , 10 -4 und 10 -5 auf Columbia-Blut-Agar
ausplattiert. Die Platten verblieben dann für 48 h im Brutschrank. Nach 48 h waren die
Kolonien groß genug, um sie mit dem Kolonienzähler zählen zu können.
Für den photometrischen Nachweis wurden 10 mit Biofilm bewachsene Plättchen sowie
10 Plättchen der Negativkontrolle mit 0,1 % Kristallviolett-Lösung angefärbt. Dazu
wurden 500 µl der Lösung in jedes Well auf die Plättchen pipettiert. Nach 15 min
Einwirkdauer wurde jedes Plättchen 3 mal mit 1 ml 0,89 % iger NaCl-Lösung
gewaschen, um nicht gebundenen Farbstoff abzuspülen. Anschließend wurden 500 µl
eines Ethanol-Salzsäure-Gemisches (Merck, Darmstadt, Deutschland) in jedes Well
pipettiert, um den im Biofilm gebundenen Farbstoff zu lösen und in Suspension zu

Eigene Untersuchungen 18
bringen. Nach erneuter 15 min Inkubation wurden von jedem Well 200 µl des
Farbstoff-Entfärbelösung-Gemisches entnommen und in eine 96-Well-Platte pipettiert.
Daraufhin wurde die Extinktion im Photometer bei 620 nm bestimmt.
2.1.3 Behandlung des im Biofilmreaktor bzw. in 24-Well-Platten angezüchteten
Biofilms mit Argon-Plasma
Plasmaquelle: Als Plasmaquelle wurde der Plasmajet kINPen 09 (Neoplas GmbH,
Greifswald, Deutschland) mit ungepulstem Plasma verwendet. Das Gerät besitzt
die CE-Kennzeichnung und erfüllt somit die EU-Verbrauchersicherheit
(Weltmann et al. 2010). Es besteht aus einem Handstück (Länge = 170 mm,
Durchmesser = 20 mm, Gewicht = 170 g) zur Erzeugung eines Plasmastrahls bei
Atmosphärendruck, einer DC Stromversorgung (Systemleistung: 8 W bei 220 V,
50/60 Hz) und einer Gasversorgungseinheit (Koban et al. 2010, 2011;
Weltmann et al. 2010). Das Plasma wird, wie in Abbildung 6 dargestellt, im Inneren
der Düse erzeugt und durch den Gasstrom auf das Objekt transportiert
(Weltmann et al. 2010).
Abb. 6: Aufbau und Funktionsweise des Plasmajets kINPen09 (aus Weltmann et al. 2010)

Eigene Untersuchungen 19
Nach Weltmann et al. (2010) wird der Plasmajet kINPen09 (Neoplas GmbH,
Greifswald, Deutschland) wie folgt beschrieben: In der Mitte einer Quarzkapillare
(Innendurchmesser 1,6 mm) ist eine Stift-Typ-Elektrode (1 mm Durchmesser)
angebracht. Im Dauerbetrieb-Modus wird eine Hochfrequenz-(HF)-Spannung
(1,1 MHz, 2-6 kV pp ) an die Stift-Typ-Elektrode gekoppelt. Das Plasma wird von dem
oberen Rand der zentrierten Elektrode erzeugt und dehnt sich in der umgebenden Luft
außerhalb der Düse aus. Das System funktioniert mit allen Edelgasen (insbesondere
Argon) mit Gasdurchflussraten zwischen 5 und 10 slm. Es ist möglich, geringe
Beimengungen (≤ 1 %) anderer Gase wie Sauerstoff oder Stickstoff zum Einsatzgas
hinzuzufügen. Mit dieser Gasdurchflussrate und einer maximalen DC
Eingangsgleichstromstärke von 3,5 W weist der gezündete Plasmastrahl eine Länge von
bis zu 12 mm auf (Abb. 7).
Abb. 7: Atmosphären-Druck Plasmajet (APPJ) kINPen 09 (Neoplas GmbH, Greifswald,
Deutschland; Weltmann et al. 2010)
In den Experimenten dieser Arbeit betrug die Frequenz 1,8 MHz, die Spannung war mit
170 V festgelegt und der Gasfluss umfasste 5 slm Argon. Die Fließrate wurde durch
einen Durchflussregler (MKS Instruments, München, Deutschland) kontrolliert.
Exposition: Die Titanplättchen mit dem 72 h reifen Biofilm wurden zur
Plasmabehandlung in 24-Well-Platten übertragen. Die Proben wurden in jedem Well
auf zusätzlichen Titanplättchen hochgelagert, sodass der Abstand zwischen Proben und

Eigene Untersuchungen 20
und Plasmaquelle 10 mm betrug. Die 24-Well-Platte befand sich hierbei auf einem
x/y/z Tisch. Jedes Well wurde in einem Durchmesser von 15 mm mäanderförmig
abgefahren.
Es wurden 36 Proben (Titanplättchen) behandelt (Abb. 8 und 9). Davon dienten
6 unbehandelte Proben als Negativkontrolle und 6 weitere Proben, die nur mit Argongas
exponiert wurden, als Gaskontrolle. Die restlichen Proben wurden unterschiedlich lange
mit Plasma behandelt. Die ersten 6 Proben wurden 30 s mit Plasma bestrahlt. Für die
nächsten 6 Titanplättchen war eine Behandlungsdauer von 60 s programmiert. Folgende
weitere Zeiten waren für jeweils 6 Probenkörper festgelegt: 90 s, 120 s und 180 s.
Abb. 8: Computergesteuerte Einwirkung von Argon-Plasma auf in vitro Biofilme von
S.sanguinis

Eigene Untersuchungen 21
Abb. 9: Plasmajet kINPen09, Einwirkung ungepulsten Argonplasmas auf Titanplättchen in der
24-Well-Platte
KbE-Bestimmung: Im Anschluss wurden die Titanplättchen in eine neue
24-Well-Platte mit jeweils 1 ml 0,89 % iger NaCl-Lösung pro Well übertragen. Es
folgte eine Ultraschallbehandlung für 30 min. Anschließend wurden von der seriellen
Verdünnungsreihe von 10 -3 bis 10 -5 je 100 µl ausplattiert. Die Koloniezahlbestimmung
erfolgte nach 48 h. Um sicher zu sein, dass ein Biofilmwachstum nach 72 h vorhanden
war, wurden zusätzlich 18 Proben (ohne Plasmabehandlung) ausgewertet. Von
6 Titanplättchen wurden die KbE bestimmt. Die restlichen 12 Plättchen wurden mit
Kristallviolett angefärbt, wobei 6 davon als Negativkontrolle dienten. In der
Kontrollgruppe wurde kein Biofilm angezüchtet. Als Medium diente hierbei BHI.
Um die Wirksamkeit von Argonplasma zu prüfen, wurde der Reduktionsfaktor (RF)
nach folgender Formel (Müller et al. 2003) berechnet und in KbE/ml angegeben:
RF = log 10 n c (KbE Kontrolle) - log 10 n u (KbE nach Behandlung)
n c = KbE der unbehandelten Kontrolle, n u = KbE des mit Plasma behandelten Biofilms

Eigene Untersuchungen 22
2.1.4 Statistik
Mittelwerte und Standardabweichungen wurden mit Microsoft Exel berechnet. Die
Ergebnisse der einzelnen Untersuchungen (MW, s) wurden mit Hilfe des SPSS
Programmes graphisch dargestellt. Für die Berechnung signifikanter Unterschiede
wurde die Software Statview (SAS Institute GmbH, Heidelberg, Deutschland)
verwendet und der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test bei festgelegtem Signifikanzniveau
von 0,05 und die Bonferroni-Korrektur durchgeführt.

Eigene Untersuchungen 23
2.2 Ergebnisse
2.2.1 Vergleich der Biofilmbildung zwischen Modell A und B
Die Ergebnisse der Biofilmanzüchtung im Biofilmreaktor (Modell A) sind in den
Abbildungen 10 und 11 dargestellt. Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse der kulturellen
Nachweismethode. Dazu wurden die KbE nach 72 h bestimmt. Der Mittelwert liegt bei
7,3 log 10 KbE/ml. Es konnte in allen 5 Versuchen ein gleichmäßiges Biofilmwachstum
erreicht werden. Die Ergebnisse innerhalb eines Versuchs waren annähernd gleich. Das
zeigt sich in den Standardabweichungen, die mit 0,24 gering ausfielen (Abb. 10).
Abb. 10: Kulturelle KbE-Bestimmung des 3 d reifen Biofilms

Eigene Untersuchungen 24
Abbildung 11 stellt die Ergebnisse der photometrischen Nachweismethode dar. Dazu
wurde der Biofilm nach 72 h mit 0,1 % Kristallviolett angefärbt und nach den im
Methodenteil beschriebenen Zwischenschritten anschließend die Extinktion im
Photometer bei 620 nm bestimmt. Die Versuche 3 und 4 ergaben etwa die gleichen
Ergebnisse, nur die Versuche 1 und 2 zeigten geringfügige Abweichungen.
Zusammenfassend kann jedoch ebenfalls ein gleichmäßiges Biofilmwachstum mit einer
geringen Standardabweichung von 0,17 festgestellt werden (Abb. 11).
Abb. 11: Photometrischer Nachweis des 3 d reifen Biofilms mit 0,1 % Kristallviolett

Eigene Untersuchungen 25
Die Ergebnisse der Biofilmanzüchtung in 24-Well-Platten (Modell B) sind in den
Abbildungen 12 und 13 dargestellt. Wie mit dem Modell A konnte auch mit dem
Modell B ein gleichmäßiges Biofilmwachstum erreicht werden. Abbildung 13 zeigt die
Ergebnisse der photometrischen Nachweismethode. Zusätzlich zu den Ergebnissen der
Biofilmanzüchtung sind in dieser Abbildung auch die Kontrollgruppen dargestellt. Es
ist ein deutlicher Unterschied zu den Kontrollgruppen und somit eine erfolgreiche
Biofilmbildung erkennbar. Im Versuch 3 und 4 konnte eine etwas höhere Extinktion als
im Versuch 1 und 2 ermittelt werden. Die Ergebnisse der photometrischen
Nachweismethode stimmen mit den Ergebnissen der kulturellen Nachweismethode
überein.
Abb. 12: Kulturelle KbE-Bestimmung des 3 d reifen Biofilms
Abb.13: Photometrischer Nachweis des 3 d reifen Biofilms mit 0,1 % Kristallviolett

Eigene Untersuchungen 26
Bei der Gegenüberstellung von Modell A und B ergibt sich ein geringfügig
unterschiedlicher Mittelwert mit der kulturellen Nachweismethode. Die Biofilmbildung
im Biofilmreaktor (Modell A) liegt bei 7,3 log 10 KbE/ml (MW) und ist somit um
0,4 log 10 KbE/ml stärker als die der 24-Well-Platten (Modell B) mit einem Mittelwert
von 6,9 log 10 KbE/ml. Der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test ergab für die kulturelle
Anzüchtung bei festgelegtem Signifikanzniveau von 0,05 einen signifikanten
Unterschied (p = < 0,0001). 0,4 log 10 KbE/ml sind jedoch aus biologischer Sicht gering,
so dass die Biofilmbildung in beiden Modellen als gleichwertig betrachtet werden kann.
Die Gegenüberstellung der Ergebnisse von Modell A und B mit der photometrischen
Nachweismethode ergab nach dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Test ebenfalls einen
signifikanten Unterschied (p = 0,0282). Der Extinktionsmittelwert für den
Biofilmreaktor beträgt 1,3422, der für die 24-Well-Platte liegt bei 1,2185. Trotz des
signifikanten Unterschieds besteht jedoch keine relevante Abweichung zwischen beiden
Modellen. Die Schlussfolgerung aus der kulturellen Nachweismethode, dass beide
Modelle eine gleichwertige Biofilmbildung erzielen, kann für die photometrische
Nachweismethode verifiziert werden.

Eigene Untersuchungen 27
2.2.2 Wirksamkeit von Argon-Plasma im Modell A und B
Modell A: Die Ergebnisse der Versuche 1-3 mit Plasmabehandlung im Modell A sind
in den Abbildungen 14-16 dargestellt. Sie zeigen die koloniebildenden Einheiten
der Kontrollgruppe und der Gruppen mit folgenden Behandlungsmodi: keine
Plasmabehandlung, Plasmabehandlung mit 30 s, 60 s, 90 s, 120 s und 180 s Dauer. Der
Wilcoxon-Mann-Whitney-Test ergab nach 90 s bereits einen signifikanten Unterschied
(p = 0,0052). Das Signifikanzniveau lag bei 0,05. Nach Bonferroni-Korrektur der
p – Werte wurde αkor = 0,01 ermittelt. Nach 90 s fand eine Reduktion von 0,3 log 10
KbE/ml statt.
Nach 180 s wurde ein Reduktionsfaktor von 0,58 log 10 KbE/ml erreicht.
Abb. 14: Versuch 1-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A (kulturelle Nachweismethode)

Eigene Untersuchungen 28
Abb. 15: Versuch 2-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A (kulturelle Nachweismethode)
Abb. 16: Versuch 3-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A (kulturelle Nachweismethode)

Eigene Untersuchungen 29
Abbildung 17 fasst die Versuche 1-3 zusammen. Trotz signifikanter Unterschiede nach
90, 120 und 180 s unterscheiden sich bei den Versuchen 1-3 die Ergebnisse nach
Plasmabehandlung nur geringfügig von den Ergebnissen der Kontrollgruppe sowie den
Ergebnissen ohne Plasmabehandlung.
Abb. 17: Zusammenfassung der Versuche 1 bis 3-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell A
(kulturelle Nachweismethode)

Eigene Untersuchungen 30
Analog zeigt die Plasmabehandlung im Modell B (Abb. 18-20) kaum Unterschiede
zu den Ergebnissen im Modell A (Abb. 14-16), d.h. es wurden ähnliche
Reduktionsfaktoren erreicht. Nach 180 s Plasmabestrahlung konnte eine Reduktion von
0,5 log 10 KbE/ml erzielt werden. Es ist lediglich hervorzuheben, dass ein signifikanter
Unterschied erst nach 120 s Plasmabehandlung erreicht wurde (Wilcoxon-Mann-
Whitney-Test p-Wert = 0,009 und Signifikanzniveau = 0,05). Die Bonferroni-Korrektur
der p-Werte ergab αkor = 0,01. Nach dieser Behandlungszeit (120 s) lag der
Reduktionsfaktor bei 0,37 log 10 KbE/ml.
Abb. 18: Versuch 4-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B (kulturelle Nachweismethode)

Eigene Untersuchungen 31
Abb. 19: Versuch 5-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B (kulturelle Nachweismethode)
Abb. 20: Versuch 6-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B (kulturelle Nachweismethode)

Eigene Untersuchungen 32
Abbildung 21 fasst die Versuche 4-6 zusammen. Bei den Versuchen 4-6 unterscheiden
sich die Ergebnisse nach Plasmabehandlung nur geringfügig von den Ergebnissen der
Kontrollgruppe sowie den Ergebnissen ohne Plasmabehandlung, obwohl ein
signifikanter Unterschied sowohl nach 120 s als auch nach 180 s gegeben ist.
Abb. 21: Zusammenfassung der Versuch 4 bis 6-Wirksamkeit von Argonplasma im Modell B
(kulturelle Nachweismethode)

Diskussion 33
3 Diskussion
3.1 Notwendigkeit neuer Strategien zur Prävention und Bekämpfung dentaler
Biofilme
Die dentale Plaque ist schwierig zu entfernen (Liljemark et al. 1997) und stellt somit
eine therapeutische Herausforderung dar. Es wird daher seit Jahrzehnten nach
effizienten Mitteln zur Ablösung, Zerstörung oder Vermeidung der Entstehung von
dentalen Biofilmen geforscht. Das häufigste Verfahren zur Entfernung der
supragingivalen Plaque ist die mechanische Reinigung (Gottenbos et al. 1999) mit
Zahnbürste, Zahnpasta und Zahnseide. Die mechanische Entfernung gelingt jedoch
aufgrund der schweren Zugänglichkeit vieler Biofilme nur schlecht bzw. gar nicht.
Chemische Maßnahmen wie antiseptische Mundspülungen können zwar die
Bakterienzahlen senken (Kramer et al. 1998), sind jedoch auch in ihrer Effektivität
limitiert (Müller und Kramer 2006; Müller und Kramer 2008; Daeschlein et al. 2010)
und können Nebenwirkungen induzieren (Welk et al. 2005). Es ist daher notwendig,
neue Verfahren zu entwickeln und einzuführen. Eine aussichtsreiche Perspektive
scheinen Atmosphärendruckplasmen zu sein. Der antimikrobielle Wirkmechanismus
von Plasma ist weitaus komplexer als der einer antiseptischen Lösung
(Koban et al. 2010). So greift Chlorhexidin die Zellmembranen an und führt zur
Freisetzung des Zytoplasmas (Koban et al. 2010). Plasma dagegen greift mehrere
Komponenten der Zelle an, besonders Proteine, Lipide und je nach Plasma auch
DNA/RNA (Koban et al. 2010). Der desinfizierende Effekt des Plasmas basiert auf
3 Komponenten: (1) energiegeladene Photonen der UV-Strahlung, (2) kurzlebige,
reaktive Teilchen und Radikale wie Sauerstoffradikale und (3) geladene Teilchen wie
Elektronen und Ionen (Vleugels et al. 2005; Sladek et al. 2007). Diese führen zu einer
Peroxidation der Lipide und somit zur Zerstörung der Zellmembran und zur Lyse der
Bakterienzelle (Koban et al. 2010). Mittels rasterelektronenmikroskopischer
Aufnahmen konnten Yu et al. (2006) zeigen, dass nach Argon-Plasmabehandlung die
Bakterienzellen strukturelle Veränderungen in Form von Lipidverlusten aufweisen.
Zudem sind eine Reduktion der Zellgröße, eine Verformung der toten Zellen und eine
deutliche Dezimierung der Zellzahl erkennbar. Mit Plasma können Bakterien, Hefen

Diskussion 34
und Bakteriensporen inaktiviert werden (Hury et al. 1998; Spilimbergo et al. 2003;
Fridmann et al. 2007; Kolb et al. 2008; Woedtke et al. 2008; Joaquin et al. 2009;
Rupf et al. 2009; Koban et al. 2010). Daeschlein et al. (2010) konnten keine
Resistenzentwicklung gegen Argonplasma erzeugen. Um die antimikrobielle Wirkung
von Plasmaquellen vertieft zu untersuchen, sind in vitro Biofilm-Modelle von Interesse.
3.2 Methode
Biofilmmodell: Aus folgenden Gründen wurde in der vorliegenden Versuchsanordnung
S. sanguinis DSM 20068 in einer Monobiofilmkultur verwendet. Ihm wird eine
große Bedeutung als Primärbesiedler bei der Entstehung dentaler Biofilme
(Rosan et al. 1982a, b; Marsh 1993; Marsh und Bradshaw 1993; Scheie 1994;
Fine 1995; Wilson et al. 1996a, 1998; Liljemark et al. 1997; Embleton et al. 1998;
Kolenbrander et al. 1999) und bei der Entwicklung von Karies und parodontalen
Erkrankungen (Xu et al. 2007) beigemessen. Außerdem besitzt der Erreger eine große
medizinische Bedeutung bei der Entstehung der bakteriellen Endokarditis
(Paik et al. 2005). Bei der Auswahl der Bakterien spielte zudem eine Rolle, dass
S. sanguinis besser als andere Streptokokken-Stämme (z.B. S. mutans, S. mitis,
S. salivarius) an Oberflächen haftet und stabile Biofilme ausbildet (Rosan et al. 1982).
Nach Rosan et al. (1982) liegt eine erhöhte Affinität zu Oberflächen von 10 bis 100 im
Vergleich zu S. mutans vor. Darüber hinaus hat S. sanguinis einen hohen metabolischen
Quotienten und erreicht dadurch schnell hohe Zellzahlen (Bowden 1997, 1999). Diese
aus der Literatur bekannten Ergebnisse stimmen mit denen aus dieser Arbeit überein.
S. sanguinis erwies sich als gutes Testbakterium für den Aufbau von in vitro
Monospezies-Biofilmen. Arbeiten von Astasov-Frauenhoffer et al. (2011) und
Hauser-Gerspach et al. (2012), die auch S. sanguinis DSM 20068 verwendeten, konnten
das bestätigen.
In der Mundhöhle und in der Plaque kommen jedoch über 500 Bakterienspezies vor
(Rosan und Lamont 2000). Deshalb wird in der Literatur besonders der Multispezies-
Charakter von Biofilmen hervorgehoben (Bradshaw et al. 1990, 1996;
Gilbert et al. 1993, 1997; Herles et al. 1994; Costerton 1995). Multispezies-Biofilme

Diskussion 35
zeichnen sich durch eine größere Imitation der natürlichen Situation
(Larsen und Fiehn 1996; Pratten et al. 1998a) und eine erhöhte Resistenz
(Bradshaw und Marsh 1999) aus. Daher wird häufig gefordert, eine
Bakteriensuspension von 9 oder 10 verschiedenen Spezies einzusetzen
(Ten Cate und Marsh 1994; Sissons 1997; Dibdin und Wimpenny 1999; Wilson 1999).
Kinniment et al. (2008) beschrieben daher ein Biofilmmodell mit 9 und
Guggenheim et al. (2001, 2004) mit 6 verschiedenen Spezies. Es besteht jedoch kein
Unterschied zwischen Mono- und Multispezies-Biofilmen hinsichtlich der Sequenz der
Biofilmentstehung und der Zellzahl (Bowden 1997). In der Literatur gibt es zu
Monospeziesstudien unterschiedliche Meinungen. Nach McLean et al. (1999) werden
häufig Monokulturen benutzt, obwohl sie für die natürliche Situation nicht relevant
sind. Hingegen halten Costerton et al. (1995) sowohl Monospezies- als auch
Multispezies-Biofilme für gerechtfertigt. Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass beide
Monospezies-Biofilmmodelle mit S. sanguinis eine hohe Widerstandsfähigkeit
aufweisen. Da die Bakterienzellen einen festen Verbund bilden und sich durch
Plasmabehandlung nicht sofort und nur teilweise eliminieren lassen, erscheint der
Einsatz von Monospezies-Modellen gerechtfertigt, um die Wirksamkeit von Argon-
Plasma zu testen.
Versuchsanordung: In Versuchen mit in vitro Biofilmmodellen wurden häufig
Hydroxylapatit (Appelbaum et al. 1979; Guggenheim et al. 2001; Shapiro 2002),
Acrylate (Keevil et al. 1987; Anwar et al. 1989; Anwar und Costerton 1990), Titan
(Kreisler et al. 2002; Duarte et al. 2009; Koban et al. 2010, 2011;
Hauser-Gerspach et al. 2012), Silikon (Prosser et al. 1987; Larsen und Fiehn 1996),
Amalgam (Wilson et al. 1998; Wilson 1999) oder Membranfilter
(Millward und Wilson 1989; Thrower et al. 1997) verwendet. In dieser Arbeit wurde
Titan benutzt, dass seit vielen Jahren sowohl legiert als auch unlegiert in verschiedenen
Bereichen der Technik, Medizin und Zahnmedizin, hier besonders im Bereich der
Implantologie, verwendet wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Titan eine
gute Anheftungsfläche zur Ausbildung eines Biofilms darstellt. Andere Arbeiten wie
z.B. von Duarte et al. (2009) oder Hauser-Gerspach et al. (2012), die ebenfalls Titan
und als Bakterium S. sanguinis verwendet haben, erzielten ähnliche Ergebnisse.

Diskussion 36
Neben der Anheftungsfläche ist für die Biofilmbildung auch das Kultivierungssmedium
von entscheidender Bedeutung. In der Literatur wurde vielfach für die Anzüchtung von
S. sanguinis BHI als Nährmedium eingesetzt. S. sanguinis zeigt unter Verwendung
dieser Bouillon hohe Vermehrungsraten und eine gute Biofilmbildung. Ergebnisse
dieser Arbeit konnten das bestätigen. In Anlehnung an Larsen und Fiehn (1996) sowie
Koban et al. (2011) wurde die Bouillon zusätzlich mit 1 % Saccharose angereichert.
Diese soll einen positiven Effekt auf das Bakteriumwachstum haben (Wimpenny 1997;
Wilson et al. 1998). Neben einer besseren Anhaftung an die Oberfläche (Scheie 1994;
Bowden und Li 1997) zeigten sich auch eine verstärkte Exopolysaccharidsynthese
und eine vermehrte Matrixbildung (Bowden und Li 1997; Sissons 1997;
Embleton et al. 1998; Wilson et al. 1998; Pratten und Wilson 1999). Streptokokkale
Fructosyl- und Glucosyltransferasen bilden dabei aus Saccharose das für den
Matrixaufbau wichtige Glucan (Scheie 1994; Bowden und Hamilton 1998;
van der Ploeg und Guggenheim 2004). Vielfach wird in der Literatur auch Speichel als
Nährmedium eingesetzt. Jedoch ist die Speichelzusammensetzung extrem komplex
(Wilson 1999), sodass es schwierig ist, das Medium zu standardisieren. Zudem besteht
die Schwierigkeit, den Speichel zu autoklavieren. Aus diesen Gründen wurde in der
vorliegenden Arbeit als standardisiertes Medium BHI mit 1 % Saccharose eingesetzt.
Desweiteren spielt die Inkubationszeit eine entscheidende Rolle für das
Biofilmwachstum, weil die Zellzahl über die Zeit entscheidend zunimmt
(Rändler et al. 2010). Auch nach Herles et al. (1994) und Oliveira et al. (2010) wird die
Quantität der Bakterien bis zu einer Kultivierungszeit von 72 h gesteigert. Trotz der
quantitativen Zunahme betrachten einige Autoren 48 h alte Biofilme für
Routineexperimente als ausreichend (Larsen und Fiehn 1996; Pratten 1998;
Spencer et al. 2007; Duarte et al. 2009). Nach Wirthin et al. (2005) ist sogar erst nach
einer Bebrütungszeit von 100 h ein steady state erreicht. Dagegen halten
Bowden und Li (1997) eine Wachstumszeit von 12 - 24 h und Kamgang et al. (2007)
eine Bebrütungszeit von 17 h für optimal. Nach Bowden und Li (1997) ist nach dieser
Zeit bereits ein Wachstumsplateau erreicht. Konträr hierzu trat bei Rändler et al. (2010)
eine stationäre Phase erst nach 72 h ein, wobei die Abweichungen in der Biofilmbildung
zu diesem Zeitpunkt auf ein Minimum reduziert waren. Ein weiterer Aspekt, der für die
Kultivierungsdauer von 72 h spricht, ist der Zusammenhang zwischen der

Diskussion 37
Inkubationszeit, dem damit verbundenen Biofilmwachstum und der Resistenz
gegenüber antimikrobiellen Substanzen. Oliveira et al. (2010) sieht eine eindeutige
Beziehung zwischen der Biofilmproduktion, die nach 72 h am höchsten war, und der
Resistenz gegenüber Antibiotika. Anwar und Costerton (1990) bestätigten, dass 72 h
alte Biofilme eine höhere Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen aufweisen
als 24 h alte. Hierbei sind die Koloniezahl und –dichte von Bedeutung
(Schierholz et al. 1999; Stickler 1999). Zudem ist zu diesem Zeitpunkt eine stationäre
Phase erreicht (Rändler et al. 2010), d.h., dass kein exponentielles Wachstum mehr
stattfindet. Tief gelegene Bakterien im Biofilm sind hierbei physiologisch inaktiv
(Stickler 1999; Wirthlin et al. 2005), da nur die Nährstoffe sie erreichen, die die oberen
Schichten penetrieren konnten (Gilbert et al. 1997). Sie wachsen daher langsam und
reagieren nicht so sensibel auf antimikrobielle Substanzen (Brown und Williams 1985).
Eine langsame Zellteilung bzw. verminderte Wachstumsrate bewirkten demnach eine
gesteigerte Resistenz (Anwar et al. 1990; Hoyle et al. 1990; Costerton et al. 1995, 1999;
Pratten et al. 1998; McLean et al. 1999). Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde in
dieser Arbeit eine Inkubationszeit von 72 h gewählt. Außerdem wurde damit die
Tatsache berücksichtigt, dass das Milieu in der Plaque erst nach 72 h kariogen wird
(Millward und Wilson 1989; Marsh 1992, 1993; Embleton et al. 1998;
Schierholz et al. 1999).
3.3 Ergebnisse
3.3.1 Biofilmentwicklung
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl der Biofilmreaktor (Prüfmodell A) als
auch die 24-Well-Platten (Prüfmodell B) gut geeignet sind, um homogene, gut
analysierbare, standardisier- und reproduzierbare Biofilme zu entwickeln.
Der Europäische Biofilmreaktor (EUREBI) stellt eine Weiterentwicklung des
Biofilmreaktors des Centers for Disease Control (CDC) dar. Mit dem CDC-Reaktor
sind ein gutes und reproduzierbares Biofilmwachstum erreichbar (Goeres et al. 2005).
Der EUREBI weist entscheidende Vorteile gegenüber dem CDC-Reaktor auf. Er

Diskussion 38
verfügt über 3 statt 2 Eingänge, die die Zufuhr verschiedener Nährlösungen erlauben.
Durch die Veränderung bestimmter Parameter, z.B. der Substratkonzentration oder
durch Zufuhr von Stress auslösenden Substanzen, kann die Stoffwechselaktivität der
Bakterien beeinflusst werden. Zeitgleich ist es möglich, Parameter wie mechanische
Belastung auf den Biofilm und Temperatur zu verändern. Auf Grund der
standardisierten Versuchsbedingungen können verschiedene Materialien und
Fremdeinflüsse auf die Biofilmbildung untersucht werden. Da der Glasboden nicht
gewölbt ist, verringert sich die Reibung des Rührwerks zwischen dem Glasboden und
dem Rührflügel. Dadurch verbessert sich die Genauigkeit zum Einstellen der
Rührgeschwindigkeit. Der EUREBI lässt sich komplett säubern und autoklavieren. Es
können mehr Probenkörper (40 statt 24) pro Durchlauf verwendet und damit bessere
statistische Aussagen getroffen werden. Da die mechanisch beanspruchten Teile aus
Edelstahl bestehen, ist die Haltbarkeit des Systems verlängert. Außerdem ermöglicht
das Luerlock-System das Anbringen von sterilen Schlauchsystemen.
Alle Biofilmreaktoren zeichnen sich dadurch aus, dass sie über einen kontinuierlichen
Medienwechsel der natürlichen Situation besser entsprechen. Über die oberen Zugänge
kann Mediumlösung oder ein Gas bzw. Gasgemisch zugeführt werden, um das Milieu
für die Mikrooganismen zu beeinflussen. Darüber hinaus ist eine kontinuierliche
Mediumänderung möglich, um z.B. den Nährstoffgehalt und die Erregerzahl im
Medium zu verändern. Über den Ab- und Zufluss ist es möglich, ein Durchflusssystem
herzustellen, das für die Biofilmbildung von entscheidender Bedeutung sein kann. Die
Verwendung der kontinuierlichen Fließtechnik erzeugt ein steady state
(Allison et al. 1999). Mittels des gleichmäßigen Nährstoff- und Gasgradienten
(Allison et al. 1999) kann diese Technik die Mundhöhle (Rogers 1988) bzw. den
Speichelfluss (Herles et al. 1994; Larsen und Fiehn 1996) am besten simulieren.
Der Wilcoxon-Mann-Whitney Test ergab für die kulturelle Anzüchtung im
Biofilmreaktor einen signifikanten Unterschied (p = < 0,0001) zuungunsten der
24-Well-Platte. Allerdings übertraf die KbE/ml im Biofilmreaktor die Biofilmbildung in
der 24-Well-Platte nur um 0,4 log 10 . Da die konventionelle 24-Well-Platte
kostengünstiger und leichter in der Handhabung ist und das Mitführen einer

Diskussion 39
Kontrollgruppe ermöglicht, rechtfertigt der geringe Unterschied nicht den mit dem
erhöhtem Aufwand verbundenen Einsatz des EUREBI.
Nach der Auswertung der Ergebnisse sowohl der kulturellen als auch der
photometrischen Nachweismethode aller Versuche konnte die zu Beginn dieser Arbeit
aufgestellte Hypothese, dass der EUREBI bezüglich der Biofilmbildung der
24-Well-Platte überlegen ist, zwar verifiziert werden, allerdings war die signifikante
Differenz ohne praktische Relevanz, sodass beide Prüfmodelle gut geeignet sind, ein
in vitro Biofilmmodell mit S. sanguinis aufzubauen. Trotzdem hebt sich der EUREBI
durch die beschriebenen Vorteile von anderen Biofilmmodellen wie einfachen Agar-
Platten, Membran-Filtern (Giardino et al. 2007), Chemostaten (Wilson 1996) oder
komplexeren Modellen wie dem Robbins Device, dem Fluidized Bed Reactors oder der
Roto Torque ab. Letztere sind nach Wimpenny (1997) und Wirthlin et al. (2005) für die
Untersuchung dentaler Biofilme ungeeignet. Nur der von Peters und Wimpenny 1988
entwickelte Constant Depth Film Fermenter (CDFF) stellt ein weiteres in vitro Modell
dar, dass gut geeignet ist, orale Biofilme zu erzeugen. Durch seine Konstruktion kann
vergleichsweise genau die Situation in der Mundhöhle simuliert werden (Wilson 1996,
1999; Wilson et al. 1996a, 1998; Pratten et al. 1998a, b; Dibdin und Wimpenny 1999;
Pratten und Wilson 1999). Die Reproduzierbarkeit wird als sehr gut eingeschätzt. Durch
einen fest installierten Schaber lässt sich jeder Biofilm mit einer bestimmten
Schichtdicke herstellen und das Medium verteilen. Zudem verwendet der Constant
Depth Film Fermenter die kontinuierliche Fließtechnik und erzeugt dadaurch ein steady
state (Wirthlin 2005; Coulthwaite und Verran 2008). Nachteilig ist jedoch, dass die
stationäre Phase erst nach 100 h erreicht wird (Kinniment et al. 1996). Darüber hinaus
ist dieses Modell kostenintensiv und durch die große Anzahl an Testkörpern
(Wimpenny 1999) kompliziert.
Dagegen sind die eigenen Modelle, der Europäischer Biofilmreaktor und die
24-Well-Platte, unkompliziert zu handhaben, liefern reproduzierbare Ergebnisse und
erreichen bereits nach 72 h ein steady state.
Mit Hilfe des EUREBI können in Zukunft verschiedene Einflussfaktoren auf das
Biofilmwachstum überprüft werden, die sich mit einer konventionellen 24-Well-Platte
nicht modulieren lassen. Da Ergebnisse mit dem EUREBI lediglich in einem begrenzten

Diskussion 40
Umfang publiziert sind, stellt diese Arbeit eine Grundlage für weitere
Forschungsprojekte dar.
3.3.2 Antibiofilmwirkung des kINPen 09 mit Argon-Plasma
Da mit dem kINPen 09 Argon-Plasma im Bereich der Körpertemperatur zur Verfügung
steht, sollte in dieser Arbeit ein in vitro Biofilmmodell aufgebaut werden, um die
Wirksamkeit des kINPen 09 prüfen zu können. Einfache in vitro Biofilmmodelle bieten
den Vorteil, die Effektivität von antimikrobiellen Behandlungsstrategien unter
standardisierten Bedingungen zu untersuchen (Müller et al. 2007; Koban et al. 2011).
Auch in Hinblick auf die biologische Wirkung von Atmosphärendruckplasmen
ist es unerlässlich, die Möglichkeiten der Anwendung von Atmosphärendruckplasmen
aus ethischen Gründen zunächst in vitro abzuklären, um den Umfang von
Tierexperimenten zu begrenzen (Kramer et al. 2009).
In vitro Modelle bieten gegenüber in vivo Modellen die Vorteile der Reproduzierbarkeit,
der einfachen Kontrolle durch die mögliche Veränderung spezieller Parameter
(Wimpenny 1982, 1997; McKee et al. 1985; Keevil et al. 1987; Sissons 1997) und der
kontrollierten Beobachtung (Anwar et al. 1992). In vitro Modelle helfen somit, zum
Verständnis der Struktur und Funktionsweise eines komplexen Biofilms beizutragen
(Kinniment et al. 1996). Dagegen sind bei in vivo Experimenten die Vergleichbarkeit
zwischen verschiedenen Studien, die Reproduzierbarkeit innerhalb einer Studie oder die
Probengewinnung weitaus schwieriger zu gewährleisten (Sissons 1997).
Durch die Plasmabehandlung im Modell A (Biofilmreaktor) war zwar nach 90 s ein
signifikanter Unterschied (p = 0,0052) zwischen der Gruppe ohne und mit
Plasmabehandlung nachweisbar, der nach 180 s noch stärker ausgeprägt war, trotzdem
war die maximal erreichte Wirksamkeit mit einem RF von 0,6 log 10 KbE/ml im
Vergleich zu Antiseptika gering (Hübner et al. 2010).
Vergleichbare Reduktionsafaktoren wurden im Modell B (24-Well-Platten) erreicht
(nach 180 s Plasmabestrahlung RF = 0,5 log 10 KbE/ml).
Die am Beginn dieser Arbeit formulierte Frage, ob mit Hilfe dieser Modelle die
antimikrobielle Wirksamkeit von Argonplasma getestet werden kann, kann nach

Diskussion 41
Auswertung der Ergebnisse positiv beantwortet werden. Beide Modelle sind geeignet,
die antimikrobielle Wirksamkeit des Plasmas nachzuweisen, da sowohl beim
Biofilmreaktor als auch bei der 24-Well-Platte ein gleichmäßiges Biofilmwachstum und
ein signifikanter Unterschied erreicht wurden. Zudem konnte mit beiden Modellen ein
Biofilm mit > 6 log 10 KbE/ml erzielt werden und enthält damit ausreichend viele
Bakterienkolonien, um einen antimikrobiellen Effekt zu untersuchen. Allerdings ist die
antimikrobielle Wirksamkeit des Plasmas, verglichen mit der Wirkung von Plasma in
anderen Arbeiten, weniger stark ausgeprägt. So erzielten Daeschlein et al. (2010) mit
dem APPJ und einer Behandlungszeit von 6 min statt wie in unseren Versuchen von
max. 3 min Reduktionsfaktoren für P. aeruginosa von 4 log 10 KbE/Platte, für
ß-hämolysierende Streptokokken von 3,2 log 10 KbE/Platte, für Methicillin-sensitive
S. aureus von 2,7 log 10 KbE/Platte und für C. albicans von 2 log 10 KbE/Platte. Jedoch
wurde in dieser Arbeit nicht S. sanguinis verwendet, so dass es nicht möglich ist, einen
direkten Vergleich zur eigenen Arbeit zu ziehen. Zudem wurde lediglich eine
Inkubationszeit von 24 h gewählt und der Biofilm auf Agarplatten kultiviert. 72 h alte
Biofilme zeigen sich resistenter als 24 h alte Biofilme. Wie aus der Literatur hervorgeht,
sind Biofilme umso widerstandfähiger, je größer die Biofilmproduktion und damit die
Koloniezahl und –dichte ist (Schierholz et al. 1999; Stickler 1999; Oliveira et al. 2010).
Yu et al. (2006) beschreiben, dass die Zellkonzentration und Dichte vom Alter des
Biofilms abhängig ist und entscheidenden Einfluss auf die Wirksamkeit des Plasmas
hat. So wird in dieser Studie ein Reduktionsfaktor von 7 log 10 KbE/cm -2 für ein
Bakterienwachstum nach 2, 5 h erzielt, während ein 24 h alter Biofilm mit
höherer Zellkonzentration um lediglich 1 log 10 KbE/cm -2 reduziert wurde. Auch
Sladek et al. (2007) bestätigten, dass der Grad der Hemmung von dem Alter und von
der Dicke des Biofilms abhängig ist. Dichtere Biofilme stellen eine weitaus größere
Herausforderung für die Durchdringung von Plasma reaktiven Teilchen dar (Sladek und
Stoffels 2005; Vleugels et al. 2005; Sladek et al. 2007). Eine weitere Ursache für die
höheren Reduktionsfaktoren von Daeschlein et al. (2010) dürfte darin begründet sein,
dass diese Arbeitsgruppe die Wirksamkeit gegen Bakterienkolonien auf Agarplatten
geprüft hat, während in der vorliegenden Arbeit Biofilme erzeugt wurden, die der
Realität näher kommen, weil die meisten Mikroorganismen in der besonderen
Kolonieform des Biofilms leben (Marsh und Bradshaw 1995; Marsh 2005). Wie bereits

Diskussion 42
in der Einleitung beschrieben, sind Biofilme resistenter als planktonisch vorliegende
Bakterien. Das gilt auch für die Einwirkung von Plasma. So konnten
Kamgang et al. (2007) zeigen, dass planktonische und adhärente Zellen sensibler auf
Plasma reagieren als Zellen im Biofilm. In dieser Studie wurde S. epidermidis nach
30 min Bestrahlungsdauer im Biofilm um 3 log 10 KbE/cm -2 und als adhärente Zellen
sogar um 6 log 10 KbE/cm -2 reduziert, d.h. die antimikrobielle Wirkung des Plasmas
nimmt von adhärenten Bakterienzellen über planktonische Bakterienzellen zu Zellen im
Biofilm ab. Die Effizienz des Plasmas kann in der planktonischen Phase dadurch
reduziert werden, dass die Bakterienzellen in Wasser suspendiert schwieriger erreichbar
sind (Kamgang et al. 2007). Im Biofilm ist die Effizienz noch stärker herabgesetzt, da
durch den pilzförmigen Aufbau des Biofilms und durch die Ausbildung einer
wallartigen Struktur während der Biofilmbildung die Wirkung der aktiven
Plasmateilchen deutlich erschwert wird (Kamgang et al. 2007). Auch
Joaquin et al. (2009) beschrieben, dass für Biofilme ein komplexerer
Inaktivierungsmechanismus notwendig ist als für Bakterienzellen in der planktonischen
Phase. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die in der vorliegenden Arbeit
gezüchteten Biofilme resistenter sind als Bakterienzellen, die auf Agarplatten oder in
Suspensionen kultiviert wurden. Zudem wurde eine Inkubationszeit von 72 h bei
gleichzeitigem Zusatz von 1% Saccharose gewählt, die zu der starken
Biofilmproduktion und hohen Widerstandsfähigkeit beitragen. In der Studie von
Hamman et al. (2010) wurden bei einer Inkubationszeit von nur 48h höhere
Reduktionsfaktoren mit Argon-Plasma verglichen zu der eigenen Arbeit erreicht. So
erzielten die Autoren mit reinem Argon-Plasma und einer Behandlungsdauer von 58 s
bei S. aureus ein Reduktionsfaktor von 2,6 log 10 KbE/ml und bei P. aeruginosa von
2,4 log 10 KbE/ml. Allerdings wurden hierbei keine Biofilme erzeugt, sondern die
antiseptische Wirkung nach experimenteller Kontamination des Auges von
Schlachtschweinen ermittelt. Koban et al. (2011) erreichten für S. mutans Biofilme mit
Argon-Plasma einen Reduktionsfaktor von 5,4 log 10 KbE/ml. Allerdings wurde nicht
der kINPen09 eingesetzt, sondern der Biofilm für 10 min mit VDBD behandelt. Ein
Vergleich zwischen unterschiedlichen Plasmaquellen gestaltet sich schwierig, da
unterschiedlich viel Eingangsenergie und Spezies erzeugt werden (Koban et al. 2011).
Zudem ist die Behandlungsdauer von 10 min sehr lang und hat somit eine stärkere

Diskussion 43
antimikrobielle Wirkung zur Folge. Auch Koban et al. (2011) erzielten mit dem
kINPen09 deutlich niedrigere Reduktionsfaktoren (RF = 3,2 log 10 KbE/ml) im
Vergleich zum DBD (RF = 5,4 log 10 KbE/ml). Koban et al. (2011) sehen als mögliche
Ursache dafür, dass bei Ihnen der kINPen09 nicht das gesamte Plättchen mäanderförmig
abfuhr, sondern nur einen Punkt bestrahlte, so dass sich die reaktiven Plasmaspezies
vermutlich nicht in einer wirksamen Dosis über das gesamte Plättchen verteilten.
Allerdings erreichten Koban et al. (2011) verglichen mit der eigenen Arbeit nach
60 s Exposition einen deutlich höheren Reduktionsfaktor mit dem kINPen 09
(nach 60 s Plasmabestrahlung RF = 3,2 log 10 KbE/ml). Dabei ist zu bedenken, dass
in der Studie von Koban et al. (2011) ein anderer Erreger eingesetzt wurde. Zudem
kamen Titanplättchen mit einem Durchmesser von 5 mm zum Einsatz, während in der
eigenen Arbeit Titanplättchen mit 15 mm Durchmesser verwendet wurden. Zwar
wurden durch das mäanderförmige Abfahren des Plättchens dem Plasma
möglicherweise mehr Bakterienzellen ausgesetzt, jedoch war aufgrund der größeren
Fläche die Einwirkzeit des Plasmas auf die Bakterienzellen geringer. Trotz gleicher
Behandlungsdauer von 60 s hatten Koban et al. (2011) günstigere Voraussetzungen
(punktförmige Bestrahlung auf eine kleinere Fläche), um eine stärkere antimikrobielle
Wirksamkeit zu erzielen. Deshalb können die Ergebnisse dieser Autoren nicht direkt mit
den Ergebnissen der eigenen Arbeit verglichen werden.
In einer weiteren Studie von Koban et al. (2010) war der kINPen09 ebenfalls schlechter
wirksam als die Plasmaquellen VDBD und HDBD und erzielte ähnliche
Reduktionsfaktoren verglichen mit der vorliegenden Arbeit. So wurde nach 2 min
Behandlungsdauer mit reinem Argonplasma ein Reduktionsfaktor von 0,5 log 10 KbE/ml
erzielt. Es handelte sich bei dieser Studie jedoch nicht um einen bakteriellen Biofilm,
sondern um einen Biofilm mit C. albicans.
Zwei weitere Aspekte, die bezüglichen des relativ geringen Reduktionsfaktors diskutiert
werden sollten, sind die Behandlungsdauer der Proben und der Abstand zur Elektrode.
Nach Scholtz et al. (2007) ist die antimikrobielle Wirkung, dargestellt durch die
Inhibitionszone, am größten, je länger die Expositionszeit und je kleiner der Abstand
sind. Eine Ausnahme stellte hierbei nur S. sanguinis dar. Er zeigte nach 4-8 min
Behandlungsdauer keine Veränderung der Inhibitionszone. In der eigenen Arbeit wurde
eine maximale Behandlungsdauer von 3 min festgelegt, die für eine mögliche

Diskussion 44
Anwendung in der Zahnarztpraxis in Frage kommt. Koban et al. (2011) erreichten eine
maximale Reduktion von S. mutans nach 10 min Einwirkung von Argon-Plasma durch
eine Volumen-DBD. Diese Dauer erscheint unter dem Aspekt der praktischen
Anwendung und auf Grund der Erkenntnis von Scholtz et al. (2007), dass S. sanguinis
nach 4-8 min keine Veränderung der Inhibitionszone mehr zeigt, nicht sinnvoll.
Die in der vorliegenden Arbeit gewählte Behandlungsdauer stellt vermutlich nicht
die Ursache der vergleichsweise geringen antimikrobiellen Wirksamkeit des
Argon-Plasmas dar. Vielmehr geht aus der Literatur hervor, dass S. sanguinis eine
besondere Stellung in Bezug auf die Resistenz gegen Plasma einnimmt.
In diesem Zusammenhang ist auch der gewählte Abstand zu den Proben in der eigenen
Arbeit zu bewerten. Es wurde versucht, einen möglichst geringen Abstand zu wählen,
um eine bestmögliche Plasmaeinwirkung zu gewährleisten (Abb. 9). Der Abstand
zwischen Probe und Plasmaquelle betrug 10 mm. Daeschlein et al. (2010)
empfahlen dagegen einen Abstand von nur 1 mm zwischen Probe und Plasmaquelle.
Im Unterschied dazu wurden in der Arbeit von Matthes et al. (2010) ein Abstand von
2 mm, in dem Artikel von Hamman et al. (2010) eine Entfernung von 5 mm und in der
Studie von Koban et al. (2010) ein Abstand von 7 mm festgelegt. Da die eigenen
Ergebnisse eine geringere antimikrobielle Wirkung zeigten, kann vermutet werden, dass
der Abstand von 10 mm eventuell nicht optimal gewählt war und ein geringerer
Abstand zu den Proben möglicherweise einen besseren antimikrobiellen Effekt erzielt
hätte.
Ein zusätzlicher Punkt, der in die Diskussion einfließen sollte, ist die Zusammensetzung
des Argon-Plasmas beim kINPen09. Nach Hamman et al. (2010) ist bei der Behandlung
von S. aureus Biofilmen Argon-Plasma mit 0,4 % Sauerstoffzusatz signifikant
wirksamer als reines Argon-Plasma. Jedoch war in derselben Studie bei der Bestrahlung
von P. aeruginosa Biofilmen kein signifikanter Unterschied zwischen verschiedenen
Plasmazusammensetzungen feststellbar. Im Gegensatz dazu war in der Arbeit von
Koban et al. (2011) der maximale Reduktionsfaktor für Argon-Plasma mit 1 %
Sauerstoffbeimengung deutlich unter dem von reinem Argon-Plasma. Nur mit reinem
Argon-Plasma konnte eine signifikante Reduktion des S. mutans Biofilms in dieser
Studie erzielt werden. Im Bezug auf C. albicans Biofilme stellten Kramer et al. (2009)

Diskussion 45
und Koban et al. (2010) wiederum fest, dass sich Argon-Plasma mit 1 %
Sauerstoffzusatz wirksamer als reines Argon-Plasma erwies. In der Studie von
Koban et al. (2010) wurde nach 2 min Behandlungsdauer mit dem kINPen09 ein
doppelt so hoher Reduktionsfaktor für Argon-Plasma mit 1 % Sauerstoffzusatz
verglichen zu reinem Argon-Plasma erzielt. Allerdings wurden die Reduktionsfaktoren
als unbedeutend eingeschätzt, da keine beständige Reduktion der koloniebildenden
Einheiten im Vergleich zur Positiv-Kontrolle stattfand. Aus diesen unterschiedlichen
Ergebnissen kann somit nicht eindeutig abgeleitet werden, ob ein Sauerstoffzusatz zum
Argon-Plasma beim kINPen 09 eine höhere antimikrobielle Wirksamkeit begünstigt.
Die Hypothese von Hamman et al. (2010), dass höhere Konzentrationen von Sauerstoff
zu mehr Radikalen und somit zu einem größeren antiseptischen Effekt führen, ist
hiermit nicht eindeutig bestätigt.
Nach Scholtz et al. (2007) gehört S. sanguinis zu den weniger sensitiven Bakterien,
die durch Plasma zerstört werden. Auch die Arbeit von Hauser-Gerspach et al. (2012),
in der S. sanguinis DSM 20086 verwendet wurde, zeigt einen ähnlichen
Befund. So erwies sich S. sanguinis als weniger sensitiv im Bezug auf
Ozongasbehandlung im Vergleich zum getesteten Porphyromonas gingivalis. Nach
Hauser-Gerspach et al. (2012) hat zwar Ozon eine antibakterielle Wirkung auf
S. sanguinis, allerdings entspricht sie nicht der von Chlorhexidin. Ihrer Meinung nach
müsste daher eine höhere Dosis an Ozon in der klinischen Anwendung bereitgestellt
werden, um eine erfolgreiche Elimination von S. sanguinis zu bewirken. Die Autoren
heben hervor, dass besonders die im Biofilm angeordneten Bakterien weniger durch die
Ozonbehandlung reduziert werden können (Hems et al. 2005; Müller et al. 2007).
Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass S. sanguinis einen besonders
stabilen Biofilm ausbildet und sich im Vergleich zu anderen Bakterien weniger stark
reduzieren lässt.
Auch Kramer et al. (2009), Laroussi et al. (2003) sowie Kamgang et al. (2007)
konnten nachweisen, dass sich die Sensibilität unterschiedlicher Bakterienspezies
gegenüber Plasma deutlich unterscheidet. So ist aufgrund der unterschiedlichen
Zellmembranstruktur zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien für die

Diskussion 46
Zerstörung von Gram-negativen Bakterien wie Escherichia coli eine längere
Plasmabehandlungszeit notwendig als für die Abtötung von Gram-positiven Bakterien
wie M. luteus (Yu et al. 2006).
Insgesamt kann geschlussfolgert werden, dass S. sanguinis einen stabilen, schwierig zu
eleminierenden Biofilm ausbildet. Diese Tatsache könnte eine Erklärung dafür sein,
warum mit den hier angewandten Methoden der S.sanguinis Biofilm nicht vollständig
zerstört werden konnte.
Um in Zukunft S. sanguinis Biofilme besser eliminieren zu können, sollten die in dieser
Arbeit diskutierten Aspekte berücksichtigt werden. So empfiehlt sich ein geringerer
Abstand zwischen Plasmaquelle und Biofilm sowie eine mögliche
Sauerstoffbeimischung zum Argon-Plasma zur Erhöhung der antimikrobiellen
Wirksamkeit. Auch andere Plasmaquellen wie HDBD und VDBD, die hohe
Reduktionsfaktoren erzielen, könnten an S. sanguinis Biofilmen getestet werden. Jedoch
sollte unter dem Aspekt der praktischen Anwendung in der Mundhöhle berücksichtigt
werden, dass sich HDBD und VDBD als weniger geeignet erweisen, weil sie auf Grund
ihrer Konfiguration keine lokalisierte Anwendung in der Mundhöhle ermöglichen
(Koban et al. 2011). Außerdem erzeugen die DBD-Geräte ein nicht so homogenes
Plasma wie der kINP-Pen09 (Koban et al. 2011). Die Folge ist, dass unzerstörte Zellen
neben intakten Zellen zu finden sind (Koban et al. 2011). Um DBD-Geräte am
Patienten anwenden zu können, müssen diese in ihrer Größe reduziert werden
(Koban et al. 2011).
Die vorliegende Arbeit bietet einen Ansatz, um die Anwendung von
Niedertemperaturplasma weiter zu entwickeln. Für den Einsatz von
Atmosphärendruckplasma in der Zahnmedizin zur Bekämpfung von Karies,
Parodontitis und Periimplantitis sind weitere Untersuchungen an in vitro und in vivo
Modellen erforderlich, die eine höhere Eliminierung des Biofilms bewirken. Zugleich
sind mögliche Risiken für den Patienten abzuklären. Das betrifft insbesondere den
Ausschluss von Mutagenität und Carcinogenität.

Zusammenfassung 47
4 Zusammenfassung
Die dentale Plaque beeinflusst entscheidend die Ätiologie von Karies, Parodontitis und
Periimplantitis und stellt eine therapeutische Herausforderung dar, da Mikroorganismen
im Biofilm eine deutlich höhere Resistenz zeigen als planktonische Zellen. Deshalb
wird seit Jahrzehnten nach effizienten Mitteln zur Eliminierung von Biofilmen
geforscht. Das übliche Verfahren ist die mechanische Reinigung, die aufgrund der
schweren Zugänglichkeit vieler Biofilme nur schlecht bzw. gar nicht gelingt. Die
mechanische Plaqueentfernung von Implantaten durch Küretten oder Ultraschall führt
zur Beschädigung des Abutments. Chemische Maßnahmen wie antiseptische
Mundspülungen können zwar vorübergehend die Bakterienzahlen senken, können
jedoch Nebenwirkungen verursachen. Deshalb sind Alternativen zur chemischen
Antiseptik von Interesse.
Zur Untersuchung der Antibiofilmwirksamkeit wurden verschiedene in vitro Modelle
entwickelt, von denen viele kostenintensiv und aufwendig sind und keine ausreichend
reproduzierbaren Ergebnisse liefern. Anliegen dieser Arbeit war es daher, zwei in vitro
Modelle, den Europäischen Biofilmreaktor und die 24-Well-Platte, die homogene und
gut analysierbare Biofilme erzeugen, zu vergleichen. Als Hypothese wurde
angenommen, dass der Europäische Biofilmreaktor bezüglich der Biofilmbildung der
24-Well-Platte überlegen ist.
Als Testbakterium wurde S. sanguinis eingesetzt, der als Primärbesiedler der dentalen
Plaque gilt. Dieser bildete in beiden Prüfmodellen nach einer Inkubationszeit von 72 h
einen stabilen Biofilm auf Titanplättchen, die eine Imitation von Implantatoberflächen
darstellen. Der Vergleich beider Prüfmodelle ergab, dass die Biofilmbildung im
Biofilmreaktor signifikant höher war. Die aufgestellte Hypothese, dass der EUREBI
bezüglich der Biofilmbildung der 24-Well-Platte überlegen ist, kann zwar verifiziert
werden, allerdings war die signifikante Differenz ohne praktische Relevanz, sodass
beide Prüfmodelle gut geeignet sind, ein in vitro Biofilmmodell mit S. sanguinis
aufzubauen.

Zusammenfassung 48
Im 2. Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Atmosphärendruckplasma auf die
Biofilme untersucht. Es wurde vermutet, dass beide Prüfmodelle geeignet sind, einen
antimikrobiellen Effekt des Plasmas nachzuweisen.
Beide Modelle eigneten sich zum Nachweis der antimikrobiellen Wirksamkeit des
Atmosphärendruckplasmas. Die kulturelle Auswertung ergab signifikante Unterschiede
beim Biofilmreaktor -verglichen zur Kontrollgruppe - bereits nach 90 s Bestrahlung, bei
der 24-Well-Platte nach 120 s Behandlung. Nach 180 s wurde die maximale
Wirksamkeit beim Biofilmreaktor mit einem RF von 0,6 log 10 KbE/ml und bei der
24-Well-Platte mit einem RF von 0,5 log 10 KbE/ml erreicht.
Im Vergleich dazu erzielten andere Studien mit Atmosphärendruckplasma höhere
antimikrobielle Effekte. Allerdings verwendeten diese andere Bakterienspezies, kürzere
Inkubationszeiten, andere Plasmazusammensetzungen und -quellen, differente
Behandlungseinstellungen, wie z.B. punktförmiges Bestrahlen oder einen geringeren
Proben-Plasmaquellen-Abstand. Zudem zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit,
dass in Übereinstimmung zur Literatur S. sanguinis einen stabilen, schwierig zu
eleminierenden Biofilm ausbildet.
Um S. sanguinis Biofilme besser eliminieren zu können, empfiehlt sich ein geringerer
Abstand zwischen Plasmaquelle und Biofilm sowie eine Sauerstoffbeimischung zum
Argon-Plasma zur Erhöhung der antimikrobiellen Wirksamkeit. Auch andere
Plasmaquellen wie HDBD und VDBD, mit denen in der Literatur hohe
Reduktionsfaktoren erzielt wurden, könnten an S. sanguinis Biofilmen getestet werden.
Jedoch sollte unter dem Aspekt der praktischen Anwendung in der Mundhöhle
berücksichtigt werden, dass HDBD und VDBD weniger geeignet sein dürften.
Für den Einsatz von Atmosphärendruckplasma zur Bekämpfung von Karies,
Parodontitis und Periimplantitis sind weitere Untersuchungen in vitro und in vivo
erforderlich, die eine höhere Eliminierung des Biofilms bewirken.

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Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 72
6 Anhang
1. Ergebnisse Modell A: Biofilmanzüchtung im Biofilmreaktor (Versuche 1-5)
Versuch 1:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
24 h >300 350 26,5 2,5 0 0 6,5
48 h >300 111,5 14 3 0 0 6,05
72 h >300 >300 >300 113,5 16,5 0 8,14
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 71,5 2,5 6,9
2 >300 175 25,5 7,3
3 >300 294 52 7,61
4 >300 196,5 21,5 7,31
5 >300 214 25 7,37
6 >300 253,5 16,5 7,32
7 >300 66,5 10 6,82
8 >300 197,5 14,5 7,3
9 >300 66 5,5 6,82
10 >300 290,5 25,5 7,44
11 >300 186 27 7,36
12 >300 248,5 17 7,32
13 >300 88 2 6,73
14 >300 83 2 6,71
15 >300 277,5 28,5 7,45
16 >300 122,5 4 7,09
17 >300 250 52,5 7,59
18 >300 116 49,5 7,49
19 >300 121,5 16,5 7,16
20 >300 162,5 25 7,31
21 >300 94 17 7,12
22 >300 212,5 31,5 7,42
23 >300 67 8,5 6,88
24 >300 63,5 12 6,96

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 73
Versuch 2:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6
0 h >300 >300 39 8 0 6,77
24 h >300 >300 28 4 0 6,53
48 h >300 >300 24 0 0 6,45
72 h >300 >300 >300 53,5 17 8,05
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 243,5 35 7,47
2 >300 256,5 37 7,5
3 >300 213 55 7,58
4 >300 63 12,5 6,97
5 >300 212 12 7,22
6 >300 187 17 7,25
7 >300 259 35 7,48
8 >300 289 53 7,61
9 >300 45 8 6,8
10 >300 67 3 6,69
11 >300 203 13 7,22
12 >300 196 25 7,34
13 >300 278 34 7,49
14 >300 199 21 7,31
15 >300 167 15 7,20
16 >300 189 22 7,31
17 >300 291 49 7,59
18 >300 222 22 7,34
19 >300 234 29 7,42
20 >300 90 3 6,78
21 >300 266 23 7,39
22 >300 191 18 7,27
23 >300 207 17 7,27
24 >300 85 8 6,92

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 74
Versuch 3:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6
0 h >300 >300 298 78 8 0 6,89
24 h >300 >300 >300 138 19 0 7,21
48 h >300 >300 >300 260 96 15 8,08
72 h >300 >300 >300 291 115 10 8,15
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 273 45 7,56
2 >300 >300 113 12 7,07
3 >300 258 34 6 6,67
4 >300 >300 215 22 7,34
5 >300 223 69 21 7,14
6 >300 >300 118 15 7,13
7 >300 >300 135 18 7,20
8 >300 >300 100 15 7,1
9 >300 >300 236 25 7,38
10 >300 >300 78 8 6,9
11 >300 >300 89 10 6,98
12 >300 >300 112 12 7,07
13 >300 >300 167 15 7,2
14 >300 >300 123 13 7,1
15 >300 >300 295 33 7,49
16 >300 >300 282 29 7,46
17 >300 >300 214 22 7,34
18 >300 296 45 7 6,76
19 >300 >300 167 18 7,24
20 >300 >300 190 21 7,3
21 >300 >300 244 21 7,36
22 >300 >300 117 12 7,07
23 >300 >300 109 11 7,04
24 >300 >300 263 29 7,44

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 75
Versuch 4:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 52 6 0 7,75
24 h >300 >300 >300 >300 100 12 2 8,04
48 h >300 >300 >300 47 6 0 0 6,73
72 h >300 >300 >300 >300 63 2 0 7,62
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 241 24 7,38
2 >300 >300 158 7,97
3 >300 170 24 7,31
4 >300 >300 57 7,64
5 >300 145 13 7,14
6 >300 >300 49 7,6
7 >300 >300 32 7,49
8 >300 >300 53 7,62
9 >300 234 24 7,37
10 >300 267 30 7,45
11 >300 178 21 7,29
12 >300 95 8 6,94
13 >300 >300 37 7,53
14 >300 >300 31 7,48
15 >300 257 26 7,41
16 >300 213 24 7,36
17 >300 209 16 7,27
18 >300 63 12 6,96
19 >300 98 9 6,97
20 >300 206 14 7,24
21 >300 >300 34 7,5
22 >300 >300 51 7,61
23 >300 123 10 7,04
24 >300 >300 24 7,43

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 76
Versuch 5:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 49 5 0 7,69
24 h >300 >300 >300 >300 12 2 0 7,2
48 h >300 >300 >300 >300 23 4 0 7,8
72 h >300 >300 >300 >300 >300 12 2 8,2
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 208 9 7,17
2 >300 164 41 7,46
3 >300 239 29 7,42
4 >300 >300 37 7,53
5 >300 >300 53 7,62
6 >300 >300 37 7,53
7 >300 239 22 7,36
8 >300 >300 38 7,53
9 >300 113 13 7,08
10 >300 175 12 7,17
11 >300 >300 85 7,76
12 >300 >300 22 7,41
13 >300 267 27 7,43
14 >300 198 15 7,24
15 >300 209 19 7,3
16 >300 176 39 7,45
17 >300 >300 29 7,47
18 >300 291 18 7,37
19 >300 >300 22 7,41
20 >300 >300 91 7,78
21 >300 279 43 7,55
22 >300 >300 22 7,41
23 >300 85 4 6,8
24 >300 275 95 7,79

Probe
Probe
Anhang 77
Photometrischer Nachweis des Biofilmwachstums (4 Versuche)
Versuch 1 Versuch 2
1 1,21 1 1,857
2 1,09 2 1,772
3 0,98 3 1,755
4 1,41 4 1,109
5 1,35 5 1,373
6 1,39 6 1,341
7 1,17 7 1,081
8 1,12 8 1,569
9 1,29 9 1,65
10 1,16 10 1,227
MW 1,217 MW 1,4734
SD 0,133195 SD 0,270375
Nullwert 0,035 Nullwert 0,03
Versuch 3 Versuch 4
1 1,144 1 1,312
2 1,344 2 1,535
3 1,316 3 1,236
4 1,397 4 1,29
5 1,201 5 1,586
6 1,408 6 1,196
7 1,52 7 1,153
8 1,169 8 1,583
9 1,377 9 1,116
10 1,449 10 1,452
MW 1,3325 MW 1,3459
SD 0,118546 SD 0,170225
Nullwert 0,032 Nullwert 0,032

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 78
2. Ergebnisse Modell B: Biofilmanzüchtung in der 24-Well-Platte (Versuche 6-10)
Versuch 6:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 78 12 0 8,0
24 h >300 >300 >300 >300 48 9 2 7,84
48 h >300 >300 >300 >300 71 9 0 7,91
72 h >300 >300 >300 113 14 0 0 7,1
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 17 3 6,37
2 >300 101 10 7,0
3 282 10 0 6,28
4 256 17 0 6,33
5 >300 181 18 7,26
6 >300 136 17 7,18
7 >300 144 25 7,29
8 >300 175 27 7,35
9 291 23 2 6,33
10 >300 16 3 6,36
11 >300 >300 48 7,59
12 >300 >300 92 7,79
13 97 7 0 5,92
14 >300 >300 41 7,55
15 >300 58 10 6,9
16 >300 88 8 6,92
17 >300 144 12 7,12
18 >300 98 10 7,0
19 >300 172 16 7,22
20 104 8 0 5,96
21 >300 278 25 7,42
22 >300 210 24 7,35
23 >300 259 22 7,37
24 >300 91 11 7,0

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 79
Versuch 7:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 52 2 0 7,56
24 h >300 >300 >300 >300 66 2 0 7,63
48 h >300 >300 >300 174 18 3 0 7,38
72 h >300 >300 >300 223 8 0 0 7,18
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 53 7,62
2 124 17 0 6,17
3 >300 >300 31 7,48
4 217 66 5 6,76
5 >300 60 7 6,81
6 >300 62 4 6,71
7 >300 97 16 7,11
8 >300 >300 9 7,29
9 >300 203 30 7,4
10 >300 112 24 7,25
11 >300 42 2 6,49
12 >300 233 20 7,34
13 >300 116 18 7,17
14 >300 112 10 7,03
15 49 11 0 5,9
16 289 38 4 6,59
17 267 27 6 6,64
18 >300 156 14 7,17
19 >300 124 12 7,09
20 >300 109 9 7,0
21 236 30 5 6,6
22 >300 >300 12 7,32
23 292 32 4 6,56
24 22 6 0 5,61

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 80
Versuch 8:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 261 22 6 8,61
24 h >300 >300 >300 147 15 2 0 7,24
48 h >300 >300 >300 226 76 6 0 7,83
72 h >300 >300 >300 254 32 3 0 7,49
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 135 68 7,61
2 >300 276 22 7,39
3 >300 >300 66 7,68
4 >300 63 5 6,75
5 >300 148 13 7,14
6 >300 56 6 6,76
7 >300 126 14 7,12
8 >300 114 10 7,03
9 >300 110 16 7,13
10 278 25 5 6,57
11 >300 239 24 7,38
12 279 38 3 6,64
13 >300 34 4 6,57
14 36 0 0 5,56
15 >300 287 29 7,46
16 231 29 2 6,38
17 246 23 1 6,22
18 >300 176 16 7,23
19 >300 195 20 7,3
20 288 31 2 6,41
21 271 29 6 6,65
22 193 18 1 6,15
23 >300 >300 51 7,61
24 264 29 3 6,47

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 81
Versuch 9:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 230 86 9 2 7,94
24 h >300 >300 >300 238 41 1 0 7,41
48 h >300 >300 >300 216 44 4 1 7,62
72 h >300 >300 >300 258 43 3 0 7,56
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 163 15 7,19
2 >300 297 20 7,4
3 >300 173 9 7,12
4 >300 234 22 7,36
5 >300 289 28 7,45
6 289 82 8 6,91
7 118 10 1 6
8 >300 267 27 7,43
9 293 49 6 6,74
10 >300 237 23 7,37
11 >300 290 25 7,43
12 >300 187 17 7,25
13 >300 103 10 7,0
14 >300 156 11 7,12
15 >300 >300 45 7,57
16 >300 41 3 6,55
17 272 26 0 6,42
18 >300 276 22 7,39
19 >300 43 0 6,56
20 >300 112 12 7,06
21 121 18 1 6,15
22 >300 105 10 7,01
23 295 29 9 6,77
24 251 24 0 6,39

Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 82
Versuch 10:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 125 10 4 8,4
24 h >300 >300 >300 162 16 0 0 7,21
48 h >300 >300 >300 107 10 0 0 7,01
72 h >300 >300 >300 123 13 0 0 7,1
Kultureller Nachweis:
Koloniezahlbestimmung des Biofilms nach 72 h (N = 24 Titanplättchen)
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 278 21 7,39
2 >300 96 10 6,99
3 >300 87 7 6,89
4 >300 >300 29 7,47
5 >300 36 1 6,36
6 253 21 6 6,61
7 >300 143 17 7,19
8 >300 250 19 7,34
9 >300 >300 26 7,45
10 >300 176 15 7,21
11 >300 65 8 6,86
12 276 29 4 6,54
13 >300 234 22 7,36
14 >300 91 8 6,93
15 >300 103 10 7
16 281 32 2 6,41
17 >300 16 2 6,26
18 >300 >300 41 7,55
19 189 19 1 6,16
20 >300 170 15 7,2
21 >300 47 4 6,64
22 >300 36 9 6,98
23 275 29 2 6,39
24 294 30 3 6,48

Probe
Kontrolle
Probe
Kontrolle
Anhang 83
Photometrischer Nachweis des Biofilmwachstums (4 Versuche)
Versuch 1
1 1,18 0,042
2 1,182 0,04
3 1,19 0,05
4 1,502 0,041
5 1,035 0,044
6 1,14 0,051
7 1,247 0,043
8 1,134 0,038
9 0,814 0,04
10 0,921 0,045
MW 1,1345 0,0434
SD 0,177 0,004
Nullwert 0,031
Versuch 2
1 1,05 0,056
2 1,029 0,123
3 0,983 0,117
4 1,437 0,094
5 1,048 0,041
6 0,901 0,068
7 1,52 0,09
8 1,121 0,087
9 1,275 0,067
10 0,895 0,099
MW 1,1259 0,0842
SD 0,205 0,0248
Nullwert 0,03

Probe
Kontrolle
Probe
Kontrolle
Anhang 84
Versuch 3
1 1,23 0,089
2 1,141 0,056
3 1,523 0,045
4 1,097 0,067
5 1,478 0,022
6 1,446 0,056
7 1,488 0,078
8 1,549 0,041
9 0,901 0,039
10 1,143 0,047
MW 1,2996 0,054
SD 0,213 0,0188
Nullwert 0,032
Versuch 4
1 1,41 0,067
2 1,523 0,043
3 1,36 0,064
4 1,4 0,089
5 0,976 0,052
6 0,965 0,041
7 1,412 0,039
8 1,551 0,068
9 1,327 0,073
10 1,215 0,054
MW 1,3139 0,059
SD 0,193 0,0152
Nullwert 0,032

Probe
Log
Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 85
3. Plasmaversuche-Ergebnisse Biofilmreaktor (Versuche 1-3):
Versuch 1:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 217 19 1 8,16
24 h >300 >300 >300 >300 220 60 8 8,85
48 h >300 >300 >300 234 21 1 0 7,19
72 h >300 >300 >300 272 26 2 0 7,36
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 92 5 6,85
2 >300 279 69 7,69
3 >300 143 10 7,08
4 >300 189 17 7,25
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 >300 67 7,69
2 >300 >300 >300 >300 120 19 7,19
3 >300 >300 >300 >300 271 28 7,44
4 >300 >300 >300 >300 >300 71 7,7
5 >300 >300 >300 >300 234 24 7,37
6 >300 >300 >300 >300 149 10 7,1

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 86
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 >300 71 7,7
2 >300 >300 >300 203 70 1 6,6
3 >300 >300 >300 254 32 5 6,61
4 >300 >300 >300 >300 >300 25 7,44
5 >300 >300 >300 >300 198 13 7,21
6 >300 >300 >300 264 20 6 6,6
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 61 4 6,7
2 >300 >300 >300 >300 66 4 6,72
3 >300 >300 >300 282 57 4 6,69
4 >300 >300 >300 >300 65 4 6,72
5 >300 >300 >300 >300 93 17 7,12
6 >300 >300 >300 >300 216 33 7,44
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 99 10 7,0
2 >300 >300 >300 297 91 12 7,02
3 >300 >300 >300 >300 72 10 6,93
4 >300 >300 >300 >300 67 8 6,86
5 >300 >300 >300 >300 42 5 6,66
6 >300 >300 >300 277 34 6 6,67

Dauer
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 87
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 130 10 7,06
2 >300 >300 >300 280 28 3 6,46
3 >300 >300 >300 272 30 5 6,6
4 >300 >300 >300 162 25 5 6,57
5 >300 >300 >300 197 34 4 6,43
6 >300 >300 >300 280 49 8 6,41
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 133 12 7,1
2 >300 >300 >300 >300 164 16 7,21
3 >300 >300 >300 >300 32 1 6,32
4 >300 >300 >300 >300 101 11 7,02
5 >300 >300 >300 >300 68 8 6,89
6 >300 >300 >300 228 88 0 6,74
Versuch 2:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 79 10 0 7,95
24 h >300 >300 >300 257 24 2 0 7,64
48 h >300 >300 >300 >300 81 15 0 8,06
72 h >300 >300 >300 86 18 4 0 7,46

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 88
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 195 18 7,27
2 >300 257 24 7,4
3 >300 204 20 7,31
4 >300 114 12 7,07
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 187 17 7,25
2 >300 >300 >300 >300 205 20 7,31
3 >300 >300 >300 >300 102 11 7,03
4 >300 >300 >300 >300 278 21 7,39
5 >300 >300 >300 >300 91 15 7,08
6 >300 >300 >300 >300 33 4 6,56
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 270 17 7,34
2 >300 >300 >300 296 36 6 6,68
3 >300 >300 >300 >300 110 12 7,06
4 >300 >300 >300 >300 182 15 7,22
5 >300 >300 >300 >300 169 13 7,17
6 >300 >300 >300 281 31 6 6,65

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 89
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 129 14 7,13
2 >300 >300 >300 >300 56 6 6,76
3 >300 >300 >300 >300 241 15 7,29
4 >300 >300 >300 >300 107 12 7,05
5 >300 >300 >300 >300 84 4 6,79
6 >300 >300 >300 >300 95 9 6,97
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 283 37 3 6,53
2 >300 >300 >300 >300 94 11 7,0
3 >300 >300 >300 >300 59 9 6,87
4 >300 >300 >300 >300 101 7 6,93
5 >300 >300 >300 >300 122 14 7,12
6 >300 >300 >300 >300 45 4 6,63
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 167 19 0 6,25
2 >300 >300 >300 >300 87 12 7,01
3 >300 >300 >300 296 26 0 6,44
4 >300 >300 >300 185 24 2 6,34
5 >300 >300 >300 >300 52 9 6,85
6 >300 >300 >300 294 28 3 6,46

Probe
Log
Dauer
Log
Probe
Log
Anhang 90
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 145 12 7,12
2 >300 >300 >300 >300 119 13 7,1
3 >300 >300 >300 >300 72 11 6,96
4 >300 >300 >300 >300 153 15 7,18
5 >300 >300 >300 >300 84 10 6,96
6 >300 >300 >300 >300 18 1 6,69
Versuch 3:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 41 4 1 7,85
24 h >300 >300 >300 272 28 2 0 7,38
48 h >300 >300 >300 134 10 0 0 7,07
72 h >300 >300 >300 206 19 1 0 7,16
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 189 17 7,25
2 >300 256 24 7,39
3 >300 75 8 6,89
4 >300 167 15 7,2

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 91
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 251 24 7,39
2 >300 >300 >300 >300 124 11 7,07
3 >300 >300 >300 >300 68 9 6,9
4 >300 >300 >300 >300 51 7 6,78
5 >300 >300 >300 >300 152 16 7,19
6 >300 >300 >300 >300 251 24 7,39
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 265 24 7,4
2 >300 >300 >300 194 19 2 6,29
3 >300 >300 >300 298 121 13 7,1
4 >300 >300 >300 256 56 6 6,76
5 >300 >300 >300 >300 103 19 7,17
6 >300 >300 >300 >300 69 9 6,9
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 278 42 5 6,66
2 >300 >300 >300 265 38 4 6,59
3 >300 >300 >300 291 39 3 6,54
4 >300 >300 >300 >300 171 18 7,24
5 >300 >300 >300 >300 125 14 7,12
6 >300 >300 >300 >300 108 12 7,06

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 92
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 134 13 7,12
2 >300 >300 >300 267 25 2 6,35
3 >300 >300 >300 >300 67 7 6,84
4 >300 >300 >300 289 29 3 6,47
5 >300 >300 >300 178 28 4 6,53
6 >300 >300 >300 >300 245 19 7,34
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 266 28 2 6,38
2 >300 >300 >300 181 23 2 6,33
3 >300 >300 >300 297 40 4 6,6
4 >300 >300 >300 >300 139 14 7,14
5 >300 >300 >300 >300 177 15 7,21
6 >300 >300 >300 >300 89 12 7,02
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 105 10 7,01
2 >300 >300 >300 >300 82 8 6,91
3 >300 >300 >300 >300 96 7 6,92
4 >300 >300 >300 >300 163 15 7,19
5 >300 >300 >300 >300 49 5 6,69
6 >300 >300 >300 >300 58 5 6,73

Probe
Log
Probe
Log
Dauer
Log
Anhang 93
4. Plasmaversuche-Ergebnisse 24-Well-Platte (Versuche 4-6):
Versuch 4:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Kolonizahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 110 9 1 8
24 h >300 >300 >300 256 35 5 0 7,63
48 h >300 >300 >300 201 68 2 0 7,64
72 h >300 >300 >300 144 31 2 0 7,41
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 123 14 7,12
2 >300 61 1 6,55
3 >300 176 16 7,23
4 >300 289 27 7,45
5 104 6 0 5,91
6 >300 251 42 7,53
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 244 12 7,26
2 >300 >300 >300 >300 38 5 6,64
3 >300 >300 >300 >300 172 5 7,05
4 >300 >300 >300 >300 65 6 6,8
5 >300 >300 >300 >300 53 12 6,94
6 >300 >300 >300 >300 63 3 6,67

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 94
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 78 5 6,81
2 >300 >300 >300 >300 49 5 6,69
3 >300 >300 >300 >300 122 10 7,05
4 >300 >300 >300 >300 23 4 6,5
5 >300 >300 >300 >300 30 6 6,65
6 >300 >300 >300 >300 121 13 7,1
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 147 9 7,07
2 >300 >300 >300 >300 97 12 7,04
3 >300 >300 >300 >300 89 9 6,95
4 >300 >300 >300 >300 22 4 6,49
5 >300 >300 >300 >300 37 2 6,45
6 >300 >300 >300 >300 132 15 7,15
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 44 6 6,72
2 >300 >300 >300 266 29 2 6,39
3 >300 >300 >300 212 19 0 6,3
4 >300 >300 >300 >300 18 1 6,38
5 >300 >300 >300 >300 56 6 6,75
6 >300 >300 >300 >300 171 10 7,13

Dauer
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 95
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 269 61 5 0 5,74
2 >300 >300 284 232 27 2 6,37
3 >300 >300 >300 >300 94 9 6,96
4 >300 >300 >300 209 18 1 6,29
5 >300 >300 >300 >300 49 10 6,87
6 >300 >300 >300 112 15 0 7,12
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 8 2 6,14
2 >300 >300 >300 >300 178 12 7,17
3 >300 >300 >300 >300 146 14 7,16
4 >300 >300 >300 >300 40 2 6,48
5 >300 >300 >300 94 10 0 5,99
6 >300 >300 >300 >300 122 35 7,37
Versuch 5:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 95 9 0 7,97
24 h >300 >300 >300 204 22 2 0 7,32
48 h >300 >300 >300 198 35 0 0 7,44
72 h >300 >300 >300 213 18 0 0 7,29

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 96
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 245 33 7,45
2 >300 85 10 6,97
3 >300 210 22 7,33
4 >300 176 17 7,24
5 121 8 0 6,0
6 >300 >300 46 7,58
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 167 15 7,2
2 >300 >300 >300 >300 135 10 7,1
3 >300 >300 >300 >300 91 8 6,93
4 >300 >300 >300 >300 58 9 6,87
5 >300 >300 >300 >300 24 7 6,67
6 >300 >300 >300 >300 183 17 7,25
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 56 6 6,76
2 >300 >300 >300 >300 87 9 6,95
3 >300 >300 >300 228 25 5 6,57
4 >300 >300 >300 >300 193 17 7,26
5 >300 >300 >300 >300 124 12 7,1
6 >300 >300 >300 >300 99 8 6,95

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 97
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 121 11 7,06
2 >300 >300 >300 >300 80 7 6,88
3 >300 >300 >300 >300 109 10 7,02
4 >300 >300 >300 >300 45 6 6,72
5 >300 >300 >300 >300 37 0 6,53
6 >300 >300 >300 >300 146 13 7,14
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 152 14 7,16
2 >300 >300 >300 >300 104 4 6,86
3 >300 >300 >300 278 26 3 6,45
4 >300 >300 >300 >300 59 4 6,69
5 >300 >300 >300 69 5 0 5,77
6 >300 >300 >300 >300 294 21 7,19
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 256 53 6 6,75
2 >300 >300 >300 178 15 1 6,1
3 >300 >300 >300 162 15 0 7,19
4 >300 >300 287 37 7 0 5,73
5 >300 >300 >300 >300 41 2 6,48
6 >300 >300 >300 >300 38 3 6,53

Probe
Log
Dauer
Log
Probe
Log
Anhang 98
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 147 12 7,13
2 >300 >300 >300 >300 198 11 7,19
3 >300 >300 >300 102 9 0 5,98
4 >300 >300 >300 >300 80 0 6,6
5 >300 >300 >300 >300 204 18 7,28
6 >300 >300 >300 >300 45 4 6,63
Versuch 6:
Ergebnisse vor Plasmabehandlung:
Koloniezahlbestimmung zum Nachweis des Biofilmwachstums
KbE / Verdünnung
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
0 h >300 >300 >300 >300 160 17 0 8,22
24 h >300 >300 >300 >300 108 12 0 8,1
48 h >300 >300 >300 189 23 4 0 7,5
72 h >300 >300 >300 >300 213 22 0 8,34
KbE-Bestimmung unbehandelter Proben nach 72 h
KbE / Verdünnung
10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 47 7,59
2 >300 121 16 7,15
3 >300 132 13 7,29
4 >300 29 6 6,65
5 >300 41 0 6,53
6 >300 >300 40 7,54

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 99
Ergebnisse nach Plasmabehandlung:
0,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 >300 85 7,76
2 >300 >300 >300 >300 >300 27 7,45
3 >300 >300 >300 >300 45 3 6,57
4 >300 >300 >300 >300 120 10 7,04
5 >300 >300 >300 >300 >300 68 7,69
6 >300 >300 >300 >300 >300 52 7,61
1 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 228 32 7,44
2 >300 >300 >300 >300 215 15 7,26
3 >300 >300 >300 228 22 0 6,35
4 >300 >300 >300 >300 >300 42 7,56
5 >300 >300 >300 >300 268 28 7,43
6 >300 >300 >300 >300 187 25 7,34
1,5 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 >300 25 7,43
2 >300 >300 >300 >300 191 11 7,17
3 >300 >300 >300 >300 274 26 7,43
4 >300 >300 >300 >300 13 1 6,06
5 >300 >300 >300 >300 107 10 7,01
6 >300 >300 >300 >300 58 5 6,73

Probe
Log
Probe
Log
Probe
Log
Anhang 100
2 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 52 3 6,61
2 >300 >300 >300 >300 98 10 7,0
3 >300 >300 >300 256 34 4 6,57
4 >300 >300 >300 >300 149 12 7,12
5 >300 >300 >300 >300 127 9 7,04
6 >300 >300 >300 277 27 1 6,27
3 min Plasmabehandlung:
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 132 9 7,05
2 >300 >300 >300 245 29 4 6,54
3 >300 >300 >300 >300 158 7 7,06
4 >300 >300 >300 190 20 0 6,29
5 >300 >300 >300 273 26 2 6,36
6 >300 >300 >300 298 48 6 6,73
Kontrollgruppe (Gas):
KbE / Verdünnung
10 -0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
1 >300 >300 >300 >300 32 0 6,49
2 >300 >300 >300 >300 259 20 7,36
3 >300 >300 >300 >300 210 12 7,22
4 >300 >300 >300 >300 78 0 6,73
5 >300 >300 >300 >300 83 0 6,75
6 >300 >300 >300 >300 35 0 6,51

Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass
eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Datum
Unterschrift

Danksagung
Mit dem Abschluss dieser Dissertation gilt mein ganz besonderer Dank
Herrn Professor Dr. A. Kramer, der es mir ermöglichte, die Arbeit an seinem
Institut zu erstellen und mir mit vielen sehr guten Hinweisen half.
Ich danke allen Mitarbeitern des Hygiene- und Mikrobiologielabors. Insbesondere
danke ich Frau I. Koban und Herrn R. Matthes für die Hilfe bei der Durchführung und
Auswertung der Experimente.
Ich danke Herrn Professor Dr. T. Kocher und Herrn Dr. N-O. Hübner für die
Unterstützung.
In Bezug auf die Organisation danke ich Frau B. Sümnicht.
Mein Dank gilt Herrn OA. Dr. A. Welk, der mir zu dieser Doktorarbeit verhalf, mich
gut betreute und motivierte.
Ich danke meinen lieben Eltern, die es mir ermöglicht haben, Zahnmedizin zu studieren,
mich während der gesamten Studienzeit finanziell unterstützt haben und immer für mich
da waren. Besonders danke ich meiner Mama, die immer bemüht war mir eine sehr gute
Ausbildung, inklusive den Wechsel nach Greifswald, zu ermöglichen und die mich mit
vielen guten Ratschlägen und voller Kraft unterstützt hat.
Ich danke meiner lieben Schwester Bine, die mir geholfen hat, anfangs meine großen
Hürden vor dem Schreiben zu überwinden, mir mit Rat und Tat zur Seite stand und
immer für mich da war, auch wenn uns tausende Kilometer trennten.
Meinem lieben Freund Lars danke ich, dass er immer an meiner Seite war und mich
unterstützt hat.