Insertionslinien als Werkzeuge für funktionelle ... - BIOspektrum

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Arabidopsis thaliana
Insertionslinien als Werkzeuge für
funktionelle Genomforschung
GUNNAR HUEP, NILS KLEINBÖLTING, INGO APPELHAGEN, PRISCA VIEHÖVER,
BERND WEISSHAAR
UNIVERSITÄT BIELEFELD, CEBITEC UND FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE
Organisms with defect genes are important tools in biological research.
They allow the analysis of gene functions, given that they display characteristics
(phenotypes) that differ from that of „normal“ (wild type) organisms.
Defects in plant genes or knockout plants are often generated by
using T-DNA insertional mutagenesis. Large collections of T-DNA mutants
– like the GABI-Kat collection for the model plant Arabidopsis thaliana –
serve basic plant research since more than ten years.
DOI: 10.1007/s12268-013-0367-0
© Springer-Verlag 2013
jedoch völlig unabhängig vom Vorhandensein
dieser Gene. Für die Übertragbarkeit der
T-DNA sind hauptsächlich zwei Sequenzen
notwendig, die als left border (LB) und right
border (RB) bezeichnet werden und an den
Enden der T-DNA liegen. Es ist möglich, die
Sequenzabschnitte, die zwischen LB- und
RB-Sequenz liegen und für die Tumorinduktion
und Umprogrammierung des Stoffwechsels
notwendig sind, durch maßgeschneiderte
andere Sequenzen zu ersetzen [2]. Auf diese
Weise können Agrobakterien durch modifizierte
T-DNAs auf ihren Ti-Plasmiden
genutzt werden, um gezielt transgene Pflanzen
zu produzieren bzw. um Pflanzen zu
transformieren.
Reverse Genetik
ó In der biologischen Forschung dienen
revers-genetische Ansätze der Funktionsaufklärung
von Genen. Bei reverser Genetik werden
die phänotypischen Auswirkungen des
Ausfalls ausgewählter Gene untersucht. Dies
stellt den umgekehrten Weg dar, der bei klassischer
Vorwärtsgenetik erfolgt: Ausgehend
von einer Mutante und deren Phänotypen
werden die verursachenden Gene identifiziert.
Als Voraussetzung für reverse Genetik
dienen Knock-out-Mutanten, die für Bakterien
und viele tierische Organismen gezielt
mithilfe von homologer Rekombination im
ausgewählten Gen generiert werden können.
Da in höheren Pflanzen homologe Rekombination
als Werkzeug für die gezielte Mutagenese
in der Regel nicht zur Verfügung steht,
bedarf es in diesem Feld anderer Methoden.
Agrobakterien als genetisches
Werkzeug
Das als Pflanzenpathogen erkannte Bodenbakterium
Agrobacterium tumefaciens, welches
dikotyledone Pflanzen befallen kann, ist
das Hilfsmittel der Wahl für die Insertionsmutagenese.
A. tumefaciens ist natürlicherweise
für die Bildung von Wurzelhals-Gallen,
die tumorartigen Wucherungen gleichen, verantwortlich
[1]. Der Mechanismus der Gallenbildung
wurde bereits in den frühen
1980er-Jahren durch die Entdeckung der
Transfer-DNA (T-DNA) aufgeklärt [2]. Die T-
DNA wird von A. tumefaciens in das Pflanzengenom
übertragen. Sie programmiert dort
den Pflanzenstoffwechsel so um, dass die
Pflanzenzellen ungebremst spezielle Nährstoffe
produzieren, die nur von den Agrobakterien
aufgenommen und genutzt werden
können.
Die T-DNA befindet sich in Agrobakterien
auf dem Ti-Plasmid (Ti für Tumor-induzierend).
Sie enthält natürlicherweise die Gene,
die für die Tumorinduktion und die Umprogrammierung
des Pflanzenstoffwechsels nötig
sind. Die Fähigkeit von Agrobakterien, T-DNA
in das Pflanzengenom zu integrieren, ist
˘ Abb. 1: Aufbewahrung
von Arabidopsis
thaliana-Samen der
GABI-Kat-Kollektion.
Diese umfasst über
90.000 verschiedene
T-DNA-Insertionslinien,
die eine Quelle
für Knock-out-Mutanten
in A. thaliana
sind. Die Lagerung
der Samen erfolgt
unter kontrollierten
Bedingungen sortiert
in Papiertüten.
T-DNA-Insertionslinien
Die Transformation kann genutzt werden, um
Gene in das Pflanzengenom einzubringen,
die dort normalerweise nicht vorhanden sind.
Auf diese Weise entstehen Pflanzen mit neuen
Eigenschaften, die durch die Sequenzabschnitte
bedingt sind, die zwischen LB- und
RB-Sequenz in die T-DNA eingesetzt worden
sind. T-DNA-Insertionen weisen aber eine weitere
Eigenschaft auf, die ausgenutzt werden
kann, um Knock-out-Mutanten zu generieren.
Die Insertion von T-DNAs im Pflanzengenom
erfolgt weitgehend ungerichtet an zufälligen
Stellen. Wenn ein T-DNA-Insertionsort im
Leseraster eines Gens liegt, werden die entsprechenden
Genfunktionen in der Regel aus-
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A
B
um die Gesamtkollektion im Sinne der reversen
Genetik nutzen zu können.
A
˚ Abb. 2: Aufbau der flanking sequence tag(FST)-basierten Insertionslinienkollektion GABI-Kat.
A, schematische Darstellung der PCR-basierten Methode zur Generierung von FST. B, Die FST-
Sequenzen werden in eine Datenbank importiert, die für externe Nutzer über die Internetseite
www.gabi-kat.de abgerufen werden können. Passende GABI-Kat-Linien werden mit Einzelheiten
zur Insertionspositionsvorhersage und weiteren experimentellen Daten für das gewünschte Gen
angezeigt.
B
˚ Abb. 3: Arabidopsis thaliana-Mutanten mit veränderter Pigmentierung der Samenschale. A,
Übersicht des Flavonoidstoffwechsels bis zu den kondensierten Tanninen, die der Samenschale
(Testa) eine charakteristische Braunfärbung verleihen. Rot markiert sind die Mutanten von Enzymen
und Transportproteinen, deren Funktionsverlust zu einem transparent testa(tt)-Phänotyp
führt. B, braune Samen von A. thaliana-Wildtyppflanzen (WT) sowie von gelb bis hellbraunen
tt-Knock-out-Mutanten der in A gezeigten Schritte sowie von regulatorischen Genen.
geschaltet. Dadurch ist es möglich, große Kollektionen
von Pflanzenlinien zu erstellen, die
Knock-out-Mutanten für den größten Teil der
Gene einer Pflanze abdecken (Abb. 1, [3–5]).
Da die T-DNA-Insertionspositionen in verschiedenen
Linien zufällig im Genom verteilt
sind, ist es notwendig, diese Insertionspositionen
für jede einzelne Linie zu bestimmen,
Die Arabidopsis thaliana-Insertions -
linienpopulation GABI-Kat
In Pflanzen, deren Genom sequenziert ist,
kann eine Insertionspositionsvorhersage über
flanking sequence tags (FSTs) erfolgen [6]. Das
erste sequenzierte Pflanzengenom ist das der
Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand)
[7]. Die Sequenz liegt seit dem
Jahr 2000 vor, und das Genom beinhaltet nach
aktueller Genvorhersage 27.206 Protein-codierende
Gene auf der Zellkern-DNA. FSTs lassen
sich durch eine PCR-basierte Methode, ausgehend
von genomischer DNA (gDNA), generieren
(Abb. 2A). Bei diesem Verfahren wird
gDNA zunächst mit einem Restriktionsenzym
verdaut; an schließend werden synthetisch
hergestellte Adapter an die Enden der DNA-
Fragmente ligiert. Da die Adaptersequenz
sowie die Sequenz inserierter T-DNA bekannt
ist, können mittels PCR DNA-Fragmente
amplifiziert werden, die einen Teil T-DNA-
Sequenz und einen angrenzenden Teil gDNA-
Sequenz enthalten, der direkt benachbart zur
T-DNA im Genom der transformierten Pflanze
liegt. Durch Sequenzierung der PCR-Fragmente
und Abgleich mit der bekannten
Genomsequenz können anhand dieser Daten
Insertionspositionsvorhersagen gemacht werden.
Die GABI-Kat-Kollektion (www.gabi-kat.de)
ist – wie die SALK-Kollektion aus den USA
[9] – eine FST-basierte T-DNA-Insertionslinienpopulation
in A. thaliana [8]. Sie beinhaltet
89.746 unabhängige Linien, für die
FSTs generiert wurden. Für insgesamt 19.438
der 27.206 Protein-codierenden Gene in
A. thaliana finden sich potenzielle Insertionslinien
in der GABI-Kat-Kollektion. Informationen
zu den vorhandenen Linien werden
in einer Datenbank gespeichert, deren Nutzerinterface
SimpleSearch im Internet verfügbar
ist (Abb. 2B).
Anwendung von GABI-Kat-Linien am
Beispiel des Flavonoidmetabolismus
Knock-out-Linien können für funktionelle
Analysen kompletter Stoffwechselwege eingesetzt
werden. Wenn Gene ausgeschaltet
werden, die für Enzyme codieren, welche am
Beginn eines Stoffwechselweges liegen, kann
dies Auswirkungen auf alle später normalerweise
im Stoffwechselweg auftretenden Metabolite
haben.
Ein in Pflanzen inzwischen gut untersuchter
Stoffwechselweg ist die Flavonoid-Bio-
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synthese (Abb. 3A, [10]). Flavonoide sind
sekundäre Pflanzenstoffe, die in vielen
Pflanzen für die Farbe von Blüten, Früchten
und Samen verantwortlich sind. Untergruppen
der Flavonoide sind unter anderem
Flavonole, Anthocyane und Proanthocyanidine
(kondensierte Tannine). Flavonole
absorbieren Licht im UV-Spektrum
und können Pflanzen dazu dienen, ihre
Zellen vor Schäden durch UV-Strahlung
zu bewahren. Anthocyane rufen in Blüten
und Früchten eine rote, violette bis blauschwarze
Färbung hervor, die bestäubende
Insekten anzieht. Oxidierte Proanthocyanidine
weisen eine braune Färbung auf
und akkumulieren in der Samenschale vieler
Pflanzen. Sie dienen dort unter anderem
dazu, den Samen vor Herbivoren und
Pathogenen zu schützen.
Gene, die im Flavonoidmetabolismus
von A. thaliana eine Rolle spielen, wurden
schon früh über eine hellere Samenfarbe
in entsprechenden Mutanten erkannt.
Wenn entscheidende Gene für den Flavonoidmetabolismus
ausgeschaltet sind, können
keine Proanthocyanidine mehr gebildet
werden und die Samenschale wird
transparent, was zu einem gelben bis hellbraunen
Erscheinungsbild der Samen
führt (transparent testa/ tt-Phänotyp) [11].
In Abbildung 3B ist dies anhand von GABI-
Kat-Linien veranschaulicht. Verschiedene
T-DNA-Insertionslinien von tt-Genen, die
nicht nur einen Samenschalen-Phänotyp
aufweisen, sondern auch in der Anthocyan-
und Flavonol-Biosynthese Ver än de -
rungen zeigen, konnten zur Aufklärung
des Flavonoid-Stoffwechselweges beitragen
[12].
Der Musterfall „Flavonoidmetabolismus“
veranschaulicht die prominente Rolle von
T-DNA-Insertionslinien-Populationen in
der funktionellen Genomforschung, die
ein nicht zu ersetzendes Hilfsmittel in den
molekularen Pflanzenwissenschaften sind.
Danksagung
Das Projekt GABI-Kat wird über den Projektträger
Jülich (PtJ) vom BMBF gefördert
(Pkz 0313855), wofür wir uns auch im
Namen unserer vielen Tausend nationalen
und internationalen Nutzer bedanken
möchten. Weiterhin bedanken wir uns bei
allen ehemaligen Mitarbeitern des Projekts
sowie bei Eliane Quittschau, Helene
Schellenberg und Andrea Voigt für die
technische Unterstützung.
ó
Literatur
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crown gall-inducing ability. Nature 252:169–170
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Gene 484:61–68
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Bernd Weisshaar
Universität Bielefeld
Fakultät für Biologie
Lehrstuhl für Genomforschung
D-33594 Bielefeld
Tel.: 0521-106-8720
Fax: 0521-106-6423
genomforschung@uni-bielefeld.de
www.gabi-kat.de
AUTOREN
Das GABI-Kat-Team des Lehrstuhls für Genomforschung
wird von Bernd Weisshaar
(links) geleitet. Wissenschaftliche Mitarbeiter
sind Ingo Appelhagen, Gunnar Huep, Nils
Kleinbölting und Prisca Viehöver (von links).
Das Projekt GABI-Kat wurde 1999 von Bernd
Weisshaar am Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung
initiiert und wird seit 2007
an der Universität Bielefeld weitergeführt.
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