Insertionslinien als Werkzeuge für funktionelle ... - BIOspektrum
Insertionslinien als Werkzeuge für funktionelle ... - BIOspektrum
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639<br />
Arabidopsis thaliana<br />
<strong>Insertionslinien</strong> <strong>als</strong> <strong>Werkzeuge</strong> <strong>für</strong><br />
<strong>funktionelle</strong> Genomforschung<br />
GUNNAR HUEP, NILS KLEINBÖLTING, INGO APPELHAGEN, PRISCA VIEHÖVER,<br />
BERND WEISSHAAR<br />
UNIVERSITÄT BIELEFELD, CEBITEC UND FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE<br />
Organisms with defect genes are important tools in biological research.<br />
They allow the analysis of gene functions, given that they display characteristics<br />
(phenotypes) that differ from that of „normal“ (wild type) organisms.<br />
Defects in plant genes or knockout plants are often generated by<br />
using T-DNA insertional mutagenesis. Large collections of T-DNA mutants<br />
– like the GABI-Kat collection for the model plant Arabidopsis thaliana –<br />
serve basic plant research since more than ten years.<br />
DOI: 10.1007/s12268-013-0367-0<br />
© Springer-Verlag 2013<br />
jedoch völlig unabhängig vom Vorhandensein<br />
dieser Gene. Für die Übertragbarkeit der<br />
T-DNA sind hauptsächlich zwei Sequenzen<br />
notwendig, die <strong>als</strong> left border (LB) und right<br />
border (RB) bezeichnet werden und an den<br />
Enden der T-DNA liegen. Es ist möglich, die<br />
Sequenzabschnitte, die zwischen LB- und<br />
RB-Sequenz liegen und <strong>für</strong> die Tumorinduktion<br />
und Umprogrammierung des Stoffwechsels<br />
notwendig sind, durch maßgeschneiderte<br />
andere Sequenzen zu ersetzen [2]. Auf diese<br />
Weise können Agrobakterien durch modifizierte<br />
T-DNAs auf ihren Ti-Plasmiden<br />
genutzt werden, um gezielt transgene Pflanzen<br />
zu produzieren bzw. um Pflanzen zu<br />
transformieren.<br />
Reverse Genetik<br />
ó In der biologischen Forschung dienen<br />
revers-genetische Ansätze der Funktionsaufklärung<br />
von Genen. Bei reverser Genetik werden<br />
die phänotypischen Auswirkungen des<br />
Ausfalls ausgewählter Gene untersucht. Dies<br />
stellt den umgekehrten Weg dar, der bei klassischer<br />
Vorwärtsgenetik erfolgt: Ausgehend<br />
von einer Mutante und deren Phänotypen<br />
werden die verursachenden Gene identifiziert.<br />
Als Voraussetzung <strong>für</strong> reverse Genetik<br />
dienen Knock-out-Mutanten, die <strong>für</strong> Bakterien<br />
und viele tierische Organismen gezielt<br />
mithilfe von homologer Rekombination im<br />
ausgewählten Gen generiert werden können.<br />
Da in höheren Pflanzen homologe Rekombination<br />
<strong>als</strong> Werkzeug <strong>für</strong> die gezielte Mutagenese<br />
in der Regel nicht zur Verfügung steht,<br />
bedarf es in diesem Feld anderer Methoden.<br />
Agrobakterien <strong>als</strong> genetisches<br />
Werkzeug<br />
Das <strong>als</strong> Pflanzenpathogen erkannte Bodenbakterium<br />
Agrobacterium tumefaciens, welches<br />
dikotyledone Pflanzen befallen kann, ist<br />
das Hilfsmittel der Wahl <strong>für</strong> die Insertionsmutagenese.<br />
A. tumefaciens ist natürlicherweise<br />
<strong>für</strong> die Bildung von Wurzelh<strong>als</strong>-Gallen,<br />
die tumorartigen Wucherungen gleichen, verantwortlich<br />
[1]. Der Mechanismus der Gallenbildung<br />
wurde bereits in den frühen<br />
1980er-Jahren durch die Entdeckung der<br />
Transfer-DNA (T-DNA) aufgeklärt [2]. Die T-<br />
DNA wird von A. tumefaciens in das Pflanzengenom<br />
übertragen. Sie programmiert dort<br />
den Pflanzenstoffwechsel so um, dass die<br />
Pflanzenzellen ungebremst spezielle Nährstoffe<br />
produzieren, die nur von den Agrobakterien<br />
aufgenommen und genutzt werden<br />
können.<br />
Die T-DNA befindet sich in Agrobakterien<br />
auf dem Ti-Plasmid (Ti <strong>für</strong> Tumor-induzierend).<br />
Sie enthält natürlicherweise die Gene,<br />
die <strong>für</strong> die Tumorinduktion und die Umprogrammierung<br />
des Pflanzenstoffwechsels nötig<br />
sind. Die Fähigkeit von Agrobakterien, T-DNA<br />
in das Pflanzengenom zu integrieren, ist<br />
˘ Abb. 1: Aufbewahrung<br />
von Arabidopsis<br />
thaliana-Samen der<br />
GABI-Kat-Kollektion.<br />
Diese umfasst über<br />
90.000 verschiedene<br />
T-DNA-<strong>Insertionslinien</strong>,<br />
die eine Quelle<br />
<strong>für</strong> Knock-out-Mutanten<br />
in A. thaliana<br />
sind. Die Lagerung<br />
der Samen erfolgt<br />
unter kontrollierten<br />
Bedingungen sortiert<br />
in Papiertüten.<br />
T-DNA-<strong>Insertionslinien</strong><br />
Die Transformation kann genutzt werden, um<br />
Gene in das Pflanzengenom einzubringen,<br />
die dort normalerweise nicht vorhanden sind.<br />
Auf diese Weise entstehen Pflanzen mit neuen<br />
Eigenschaften, die durch die Sequenzabschnitte<br />
bedingt sind, die zwischen LB- und<br />
RB-Sequenz in die T-DNA eingesetzt worden<br />
sind. T-DNA-Insertionen weisen aber eine weitere<br />
Eigenschaft auf, die ausgenutzt werden<br />
kann, um Knock-out-Mutanten zu generieren.<br />
Die Insertion von T-DNAs im Pflanzengenom<br />
erfolgt weitgehend ungerichtet an zufälligen<br />
Stellen. Wenn ein T-DNA-Insertionsort im<br />
Leseraster eines Gens liegt, werden die entsprechenden<br />
Genfunktionen in der Regel aus-<br />
<strong>BIOspektrum</strong> | 06.13 | 19. Jahrgang
640 WISSENSCHAFT · SPECIAL: GENOMICS<br />
A<br />
B<br />
um die Gesamtkollektion im Sinne der reversen<br />
Genetik nutzen zu können.<br />
A<br />
˚ Abb. 2: Aufbau der flanking sequence tag(FST)-basierten <strong>Insertionslinien</strong>kollektion GABI-Kat.<br />
A, schematische Darstellung der PCR-basierten Methode zur Generierung von FST. B, Die FST-<br />
Sequenzen werden in eine Datenbank importiert, die <strong>für</strong> externe Nutzer über die Internetseite<br />
www.gabi-kat.de abgerufen werden können. Passende GABI-Kat-Linien werden mit Einzelheiten<br />
zur Insertionspositionsvorhersage und weiteren experimentellen Daten <strong>für</strong> das gewünschte Gen<br />
angezeigt.<br />
B<br />
˚ Abb. 3: Arabidopsis thaliana-Mutanten mit veränderter Pigmentierung der Samenschale. A,<br />
Übersicht des Flavonoidstoffwechsels bis zu den kondensierten Tanninen, die der Samenschale<br />
(Testa) eine charakteristische Braunfärbung verleihen. Rot markiert sind die Mutanten von Enzymen<br />
und Transportproteinen, deren Funktionsverlust zu einem transparent testa(tt)-Phänotyp<br />
führt. B, braune Samen von A. thaliana-Wildtyppflanzen (WT) sowie von gelb bis hellbraunen<br />
tt-Knock-out-Mutanten der in A gezeigten Schritte sowie von regulatorischen Genen.<br />
geschaltet. Dadurch ist es möglich, große Kollektionen<br />
von Pflanzenlinien zu erstellen, die<br />
Knock-out-Mutanten <strong>für</strong> den größten Teil der<br />
Gene einer Pflanze abdecken (Abb. 1, [3–5]).<br />
Da die T-DNA-Insertionspositionen in verschiedenen<br />
Linien zufällig im Genom verteilt<br />
sind, ist es notwendig, diese Insertionspositionen<br />
<strong>für</strong> jede einzelne Linie zu bestimmen,<br />
Die Arabidopsis thaliana-Insertions -<br />
linienpopulation GABI-Kat<br />
In Pflanzen, deren Genom sequenziert ist,<br />
kann eine Insertionspositionsvorhersage über<br />
flanking sequence tags (FSTs) erfolgen [6]. Das<br />
erste sequenzierte Pflanzengenom ist das der<br />
Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand)<br />
[7]. Die Sequenz liegt seit dem<br />
Jahr 2000 vor, und das Genom beinhaltet nach<br />
aktueller Genvorhersage 27.206 Protein-codierende<br />
Gene auf der Zellkern-DNA. FSTs lassen<br />
sich durch eine PCR-basierte Methode, ausgehend<br />
von genomischer DNA (gDNA), generieren<br />
(Abb. 2A). Bei diesem Verfahren wird<br />
gDNA zunächst mit einem Restriktionsenzym<br />
verdaut; an schließend werden synthetisch<br />
hergestellte Adapter an die Enden der DNA-<br />
Fragmente ligiert. Da die Adaptersequenz<br />
sowie die Sequenz inserierter T-DNA bekannt<br />
ist, können mittels PCR DNA-Fragmente<br />
amplifiziert werden, die einen Teil T-DNA-<br />
Sequenz und einen angrenzenden Teil gDNA-<br />
Sequenz enthalten, der direkt benachbart zur<br />
T-DNA im Genom der transformierten Pflanze<br />
liegt. Durch Sequenzierung der PCR-Fragmente<br />
und Abgleich mit der bekannten<br />
Genomsequenz können anhand dieser Daten<br />
Insertionspositionsvorhersagen gemacht werden.<br />
Die GABI-Kat-Kollektion (www.gabi-kat.de)<br />
ist – wie die SALK-Kollektion aus den USA<br />
[9] – eine FST-basierte T-DNA-<strong>Insertionslinien</strong>population<br />
in A. thaliana [8]. Sie beinhaltet<br />
89.746 unabhängige Linien, <strong>für</strong> die<br />
FSTs generiert wurden. Für insgesamt 19.438<br />
der 27.206 Protein-codierenden Gene in<br />
A. thaliana finden sich potenzielle <strong>Insertionslinien</strong><br />
in der GABI-Kat-Kollektion. Informationen<br />
zu den vorhandenen Linien werden<br />
in einer Datenbank gespeichert, deren Nutzerinterface<br />
SimpleSearch im Internet verfügbar<br />
ist (Abb. 2B).<br />
Anwendung von GABI-Kat-Linien am<br />
Beispiel des Flavonoidmetabolismus<br />
Knock-out-Linien können <strong>für</strong> <strong>funktionelle</strong><br />
Analysen kompletter Stoffwechselwege eingesetzt<br />
werden. Wenn Gene ausgeschaltet<br />
werden, die <strong>für</strong> Enzyme codieren, welche am<br />
Beginn eines Stoffwechselweges liegen, kann<br />
dies Auswirkungen auf alle später normalerweise<br />
im Stoffwechselweg auftretenden Metabolite<br />
haben.<br />
Ein in Pflanzen inzwischen gut untersuchter<br />
Stoffwechselweg ist die Flavonoid-Bio-<br />
<strong>BIOspektrum</strong> | 06.13 | 19. Jahrgang
synthese (Abb. 3A, [10]). Flavonoide sind<br />
sekundäre Pflanzenstoffe, die in vielen<br />
Pflanzen <strong>für</strong> die Farbe von Blüten, Früchten<br />
und Samen verantwortlich sind. Untergruppen<br />
der Flavonoide sind unter anderem<br />
Flavonole, Anthocyane und Proanthocyanidine<br />
(kondensierte Tannine). Flavonole<br />
absorbieren Licht im UV-Spektrum<br />
und können Pflanzen dazu dienen, ihre<br />
Zellen vor Schäden durch UV-Strahlung<br />
zu bewahren. Anthocyane rufen in Blüten<br />
und Früchten eine rote, violette bis blauschwarze<br />
Färbung hervor, die bestäubende<br />
Insekten anzieht. Oxidierte Proanthocyanidine<br />
weisen eine braune Färbung auf<br />
und akkumulieren in der Samenschale vieler<br />
Pflanzen. Sie dienen dort unter anderem<br />
dazu, den Samen vor Herbivoren und<br />
Pathogenen zu schützen.<br />
Gene, die im Flavonoidmetabolismus<br />
von A. thaliana eine Rolle spielen, wurden<br />
schon früh über eine hellere Samenfarbe<br />
in entsprechenden Mutanten erkannt.<br />
Wenn entscheidende Gene <strong>für</strong> den Flavonoidmetabolismus<br />
ausgeschaltet sind, können<br />
keine Proanthocyanidine mehr gebildet<br />
werden und die Samenschale wird<br />
transparent, was zu einem gelben bis hellbraunen<br />
Erscheinungsbild der Samen<br />
führt (transparent testa/ tt-Phänotyp) [11].<br />
In Abbildung 3B ist dies anhand von GABI-<br />
Kat-Linien veranschaulicht. Verschiedene<br />
T-DNA-<strong>Insertionslinien</strong> von tt-Genen, die<br />
nicht nur einen Samenschalen-Phänotyp<br />
aufweisen, sondern auch in der Anthocyan-<br />
und Flavonol-Biosynthese Ver än de -<br />
rungen zeigen, konnten zur Aufklärung<br />
des Flavonoid-Stoffwechselweges beitragen<br />
[12].<br />
Der Musterfall „Flavonoidmetabolismus“<br />
veranschaulicht die prominente Rolle von<br />
T-DNA-<strong>Insertionslinien</strong>-Populationen in<br />
der <strong>funktionelle</strong>n Genomforschung, die<br />
ein nicht zu ersetzendes Hilfsmittel in den<br />
molekularen Pflanzenwissenschaften sind.<br />
Danksagung<br />
Das Projekt GABI-Kat wird über den Projektträger<br />
Jülich (PtJ) vom BMBF gefördert<br />
(Pkz 0313855), wo<strong>für</strong> wir uns auch im<br />
Namen unserer vielen Tausend nationalen<br />
und internationalen Nutzer bedanken<br />
möchten. Weiterhin bedanken wir uns bei<br />
allen ehemaligen Mitarbeitern des Projekts<br />
sowie bei Eliane Quittschau, Helene<br />
Schellenberg und Andrea Voigt <strong>für</strong> die<br />
technische Unterstützung.<br />
ó<br />
Literatur<br />
[1] Van Larebeke N, Engler G, Holsters M et al. (1974)<br />
Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for<br />
crown gall-inducing ability. Nature 252:169–170<br />
[2] Hern<strong>als</strong>teens J, Van Vliet F, De Beuckeleer M et al.<br />
(1980) The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as a<br />
host vector system for introducing foreign DNA in plant<br />
cells. Nature 287:654–656<br />
[3] Azpiroz-Leehan R, Feldmann KA (1997) T-DNA insertion<br />
mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth.<br />
Trends Genet 13:152–156<br />
[4] Rios G, Lossow A, Hertel B et al. (2002) Rapid identification<br />
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[5] Sessions A, Burke E, Presting G et al. (2002) A highthroughput<br />
Arabidopsis reverse genetics system.<br />
Plant Cell 14:2985–2994<br />
[6] Strizhov N, Li Y, Rosso MG et al. (2003) High-throughput<br />
generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized<br />
Arabidopsis thaliana lines. Biotechniques 35:1164–<br />
1168<br />
[7] Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the<br />
genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.<br />
Nature 408:796–815<br />
[8] Kleinboelting N, Huep G, Kloetgen A et al. (2012)<br />
GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis<br />
thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Res 40:<br />
D1211–1215<br />
[9] Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ et al. (2003)<br />
Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.<br />
Science 301:653–657<br />
[10] Harborne JB, Williams CA (2000) Advances in flavonoid<br />
research since 1992. Phytochemistry 55:481–504<br />
[11] Koornneef M (1990) Mutations affecting the testa<br />
colour in Arabidopsis. Arabidopsis Info Serv 27:1–4<br />
[12] Appelhagen I, Jahns O, Bartelniewoehner L et al.<br />
(2011) Leucoanthocyanidin dioxygenase in Arabidopsis<br />
thaliana: characterization of mutant alleles and regulation<br />
by MYB-BHLH-TTG1 transcription factor complexes.<br />
Gene 484:61–68<br />
Korrespondenzadresse:<br />
Prof. Dr. Bernd Weisshaar<br />
Universität Bielefeld<br />
Fakultät <strong>für</strong> Biologie<br />
Lehrstuhl <strong>für</strong> Genomforschung<br />
D-33594 Bielefeld<br />
Tel.: 0521-106-8720<br />
Fax: 0521-106-6423<br />
genomforschung@uni-bielefeld.de<br />
www.gabi-kat.de<br />
AUTOREN<br />
Das GABI-Kat-Team des Lehrstuhls <strong>für</strong> Genomforschung<br />
wird von Bernd Weisshaar<br />
(links) geleitet. Wissenschaftliche Mitarbeiter<br />
sind Ingo Appelhagen, Gunnar Huep, Nils<br />
Kleinbölting und Prisca Viehöver (von links).<br />
Das Projekt GABI-Kat wurde 1999 von Bernd<br />
Weisshaar am Max-Planck-Institut <strong>für</strong> Züchtungsforschung<br />
initiiert und wird seit 2007<br />
an der Universität Bielefeld weitergeführt.<br />
<strong>BIOspektrum</strong> | 06.13 | 19. Jahrgang