Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

Das Matching der Probanden erfolgte nach Alter und Rauchstatus der Probanden. Im Durchschnitt waren die
Probanden 77 Jahre alt (73 - 81 Jahre). Insgesamt waren 32 Probanden Ex-Raucher und 28 Probanden
Nie-Raucher.
TB 01
Ergebnisse
4.2 HERSTELLUNG VON MICROARRAYS
Auf die Epoxysilan-beschichteten Glasobjektträger Nexterion E (Schott) wurden mittels des Spotters Microgrid
Compact (Biorobotics) die miRNA-Sonden als Triplikate gespottet. Insgesamt wurden aus dem Sondenset
NCode Human microRNA Microarray Probe Set V3 (Life Technologies) 703 humane miRNA-, sowie 34
nicht-validierte miRNA- und zwölf Kontroll-Sonden verwendet.
4.3 QUALITÄTSKONTROLLE DER MICROARRAYS
Nach der Entwicklung und Etablierung der Microarrays wurden zur Qualitätskontrolle zunächst eine bestrahlte
und eine nicht-bestrahlte Blutprobe analysiert. Zu diesem Zweck wurde EDTA-Vollblut im BfS ex vivo mit einer
Cs-137-Quelle (HWM 2000) mit 4 Gy bestrahlt, für sechs Stunden bei 37°C inkubiert und abschließend in ein
PAXgene Tube überführt. Der Versand der Blutproben an das IPA erfolgte per Post. Die Probengewinnung
und der Versand erfolgte analog zu den etablierten Methoden aus dem Projekt „Aufbau einer Bioproben-Bank
von ehemaligen Beschäftigten der SAG/SDAG Wismut - Pilotstudie“ (3607S04532).
4.4 MARKIERUNG DER GESAMT-RNA
Die Markierung von 0,5 µg Gesamt-RNA pro Ansatz erfolgte mittels der Fluoreszenzfarbstoff-markierten Dinukleotide
pCCp-Cy3 und pCCp-Cy5 (Eurogentec) nach dem miRNA Microarray System Protokoll (Agilent
Technologies).
4.5 HYBRIDISIERUNG UND SCANNEN
Die Hybridisierung der Microarrays erfolgte in der automatischen Hybridisierungsstation HS 400 Pro (Tecan).
Das anschließende Scannen der hybridisierten Microarrays wurde mit dem Axon GenePix Scanner 4000B
(Molecular Probes) bei Wellenlängen von 532 nm für Cy3 und 635 nm für Cy5 durchgeführt.
4.6 DATENANALYSE
Die gewonnenen Daten wurden mit der Software GeneSpring GX 12.0 (Agilent Technologies) analysiert. Als
potenzielle Biomarker wurden miRNAs mit einem sogenannten fold change von ≥ 3,0 ausgewählt und statistisch
signifikante Unterschiede zwischen Hoch- und Niedrigexponierten wurden mittels des Mann-Whitney
Tests inklusive der Benjamini-Hochberg False Discovery Rate zur p-Wert Korrektur berechnet.
4.7 MICRORNA-VERIFIZIERUNG
Sechs signifikant veränderte miRNAs als potenzielle Marker und zwei nicht veränderte miRNAs als potenzielle
Referenzen wurden zur Verifizierung in Einzelmessungen mittels qRT-PCR in den 60 Proben erneut bestimmt.
Die miRNA-Analyse erfolgte auf dem 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Life Technologies) mittels
der kommerziellen TaqMan miRNA-Assays nach Angaben des Herstellers (Life Technologies).
5. ERGEBNISSE
5.1 QUALITÄTSKONTROLLE
Die markierte Gesamt-RNA konnte erfolgreich auf den Microarrays hybridisiert werden. Insgesamt zeigten
558 humane miRNAs eine veränderte Expression im Vergleich zwischen der bestrahlten und der nicht-bestrahlten
Blutprobe. Davon waren 380 miRNAs in der bestrahlten Probe hochreguliert und 178 miRNAs in der
bestrahlten Probe runterreguliert. Eine genauere Datenanalyse und eine statistische Auswertung auf signifikante
Änderungen der miRNA-Expression ist allerdings auf Grund der geringen Probenzahl (N=1) nicht möglich.
5.2 MICROARRAYS
Generell war eine effiziente Markierung der Gesamt-RNA mit Cy5 nicht möglich, da die Syntheserate von pC-
Cp-Cy5 unzureichend war. Die Markierung mit Cy3 hingegen verlief durchgehend zufriedenstellend.
Ergebnisse der abgeschlossenen Forschungsvorhaben im Jahr 2012 - TB 01 5