Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz
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Das Matching der Probanden erfolgte nach Alter und Rauchstatus der Probanden. Im Durchschnitt waren die<br />
Probanden 77 Jahre alt (73 - 81 Jahre). Insgesamt waren 32 Probanden Ex-Raucher und 28 Probanden<br />
Nie-Raucher.<br />
TB 01<br />
Ergebnisse<br />
4.2 HERSTELLUNG VON MICROARRAYS<br />
Auf die Epoxysilan-beschichteten Glasobjektträger Nexterion E (Schott) wurden mittels des Spotters Microgrid<br />
Compact (Biorobotics) die miRNA-Sonden als Triplikate gespottet. Insgesamt wurden aus dem Sondenset<br />
NCode Human microRNA Microarray Probe Set V3 (Life Technologies) 703 humane miRNA-, sowie 34<br />
nicht-validierte miRNA- und zwölf Kontroll-Sonden verwendet.<br />
4.3 QUALITÄTSKONTROLLE DER MICROARRAYS<br />
Nach der Entwicklung und Etablierung der Microarrays wurden zur Qualitätskontrolle zunächst eine bestrahlte<br />
und eine nicht-bestrahlte Blutprobe analysiert. Zu diesem Zweck wurde EDTA-Vollblut im BfS ex vivo mit einer<br />
Cs-137-Quelle (HWM 2000) mit 4 Gy bestrahlt, <strong>für</strong> sechs Stunden bei 37°C inkubiert und abschließend in ein<br />
PAXgene Tube überführt. Der Versand der Blutproben an das IPA erfolgte per Post. Die Probengewinnung<br />
und der Versand erfolgte analog zu den etablierten Methoden aus dem Projekt „Aufbau einer Bioproben-Bank<br />
von ehemaligen Beschäftigten der SAG/SDAG Wismut - Pilotstudie“ (3607S04532).<br />
4.4 MARKIERUNG DER GESAMT-RNA<br />
Die Markierung von 0,5 µg Gesamt-RNA pro Ansatz erfolgte mittels der Fluoreszenzfarbstoff-markierten Dinukleotide<br />
pCCp-Cy3 und pCCp-Cy5 (Eurogentec) nach dem miRNA Microarray System Protokoll (Agilent<br />
Technologies).<br />
4.5 HYBRIDISIERUNG UND SCANNEN<br />
Die Hybridisierung der Microarrays erfolgte in der automatischen Hybridisierungsstation HS 400 Pro (Tecan).<br />
Das anschließende Scannen der hybridisierten Microarrays wurde mit dem Axon GenePix Scanner 4000B<br />
(Molecular Probes) bei Wellenlängen von 532 nm <strong>für</strong> Cy3 und 635 nm <strong>für</strong> Cy5 durchgeführt.<br />
4.6 DATENANALYSE<br />
Die gewonnenen Daten wurden mit der Software GeneSpring GX 12.0 (Agilent Technologies) analysiert. Als<br />
potenzielle Biomarker wurden miRNAs mit einem sogenannten fold change von ≥ 3,0 ausgewählt und statistisch<br />
signifikante Unterschiede zwischen Hoch- und Niedrigexponierten wurden mittels des Mann-Whitney<br />
Tests inklusive der Benjamini-Hochberg False Discovery Rate zur p-Wert Korrektur berechnet.<br />
4.7 MICRORNA-VERIFIZIERUNG<br />
Sechs signifikant veränderte miRNAs als potenzielle Marker und zwei nicht veränderte miRNAs als potenzielle<br />
Referenzen wurden zur Verifizierung in Einzelmessungen mittels qRT-PCR in den 60 Proben erneut bestimmt.<br />
Die miRNA-Analyse erfolgte auf dem 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Life Technologies) mittels<br />
der kommerziellen TaqMan miRNA-Assays nach Angaben des Herstellers (Life Technologies).<br />
5. ERGEBNISSE<br />
5.1 QUALITÄTSKONTROLLE<br />
Die markierte Gesamt-RNA konnte erfolgreich auf den Microarrays hybridisiert werden. Insgesamt zeigten<br />
558 humane miRNAs eine veränderte Expression im Vergleich zwischen der bestrahlten und der nicht-bestrahlten<br />
Blutprobe. Davon waren 380 miRNAs in der bestrahlten Probe hochreguliert und 178 miRNAs in der<br />
bestrahlten Probe runterreguliert. Eine genauere Datenanalyse und eine statistische Auswertung auf signifikante<br />
Änderungen der miRNA-Expression ist allerdings auf Grund der geringen Probenzahl (N=1) nicht möglich.<br />
5.2 MICROARRAYS<br />
Generell war eine effiziente Markierung der Gesamt-RNA mit Cy5 nicht möglich, da die Syntheserate von pC-<br />
Cp-Cy5 unzureichend war. Die Markierung mit Cy3 hingegen verlief durchgehend zufriedenstellend.<br />
Ergebnisse der abgeschlossenen Forschungsvorhaben im Jahr <strong>2012</strong> - TB 01 5