Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz
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RAD51-Überexpression auf eine erhöhte genomische Instabilität zurückzuführen ist. Die RAD51-Überexpression<br />
führte zu einer Verlangsamung der Replikationsprozesse und zu einer vermehrten Aktivierung von Replikationsursprüngen.<br />
Diese vermehrte „Origin“-Aktivierung ist auf eine verminderte Auslösung des Intra-S-Arrests<br />
zurückzuführen, betont durch eine verminderte Chk1-Aktivierung, und wurde nach Bestrahlung und Induktion<br />
der singulären Schäden beobachtet. Darüber hinaus zeigten Zellen mit einer hohen RAD51-Expression,<br />
eine verringerte HR-Kapazität im Plasmid-Rekonstruktionsassay. Diese verminderte Rekombinationsfähigkeit<br />
äußerte sich auch in einer erhöhten Empfindlichkeit nach Behandlung mit in der S-Phase schädigenden<br />
Agenzien. Die Beobachtungen im Modellsystem konnten in Tumorzelllinien mit endogenem unterschiedlich<br />
exprimierten RAD51 verifiziert werden. Zelllinien mit einer mittleren RAD51-Expression erwiesen sich als<br />
effektiv in allen untersuchten Assays, während eine geringe oder hohe Expression sich deutlich auf die Replikationsprozesse,<br />
HR-Kapazität und zelluläre Empfindlichkeit auswirkten. Die Befunde zeigen, dass nur<br />
eine ausbalancierte Expression von Reparaturproteinen eine fehlerfreie Reparatur gewährleistet. Dieser Befund<br />
trifft auch <strong>für</strong> Trägerinnen einer heterozygoten PALB2-Mutation zu. Die auf Grund der Haplosuffizienz<br />
beobachtete Reduktion der PALB2-Expression äußerte sich in deutlichen Effekten auf die Replikationsprozesse<br />
und Intra-S-Signaltransduktion. Die Arbeit liegt zurzeit bei Nature Communications zur zweiten Begutachtung<br />
vor.<br />
TB 03<br />
5.3 LEBENDZELLBEOBACHTUNG IN DER S-PHASE (AG FRIEDL)<br />
Verschiedene Methoden zur Synchronisierung von gut transfizierbaren Zelllinien wie HeLa, U2OS und<br />
HT1080 wurden getestet und optimiert. Es zeigte sich, dass sich auch nach Optimierung höchstens 70% der<br />
Zellen in der gewünschten Phase befinden. Dies ist <strong>für</strong> die weiteren Analysen auf Einzelzellniveau nicht ausreichend.<br />
Daher wurde auf die Etablierung und Nutzung von zellzyklusspezifischen Lebendzellmarkern umgeschwenkt.<br />
Verschiedene Linien, die Marker <strong>für</strong> G1 (Cdt1), S/G2 (Geminin) oder G2 (Cyclin B) exprimieren,<br />
sind inzwischen vorhanden, z. T. auch in Kombination mit fluoreszenz-markierten DSB-Response-Faktoren<br />
(s. u.). Analysen des Wachstumsverhaltens und der Schadensantwort in diesen Linien werden gegenwärtig<br />
komplettiert. Als spezifischer S-Phase-Marker, der auch die Unterscheidung von früher und später S-Phase<br />
ermöglichen sollte, sollte PCNA-GFP genutzt werden. Es stellte sich jedoch heraus, dass sich durch die <br />
PCNA-Überexpression artifizielle Komplexe bilden können, die nicht von dem typischen Signal in der späten<br />
S-Phase unterscheidbar sind, so dass die Phasenzuordnung nicht eindeutig ist. Gegenwärtig wird getestet,<br />
ob sich durch PCNA-Chromobodies das Problem lösen lässt. Des Weiteren konnte eine LET-Abhängigkeit<br />
der Rekrutierung von Mdc1, aber nicht von 53BP1 gezeigt werden. Als fluoreszenz-markierter Schadensmarker<br />
liegt inzwischen neben 53BP1 und Mdc1 auch Rad52 (als Marker <strong>für</strong> homologe Rekombination) vor. Vorversuche<br />
zur Eignung von Ku80-GFP oder XRCC4 als focibildender Marker <strong>für</strong> NHEJ-Reparatur zeigten, dass<br />
diese Proteine unter den Bedingungen ionisierender Bestrahlung im Gegensatz zur Laserbestrahlung keine<br />
detektierbaren Foci bilden (Kooperation W. Dirks und C. Mielke). Gegenwärtig wird ein experimentelles System<br />
entwickelt, das nach gezielter Protonenbestrahlung in geometrischen Mustern eine Unterscheidung von<br />
a) direkt strahleninduzierten DSB, b) sekundären DSB, die sich während der S-Phase aus anderen strahleninduzierten<br />
DNA-Schäden entwickeln, und c) replikationsbedingten DSB, die unabhängig von der Strahlenwirkung<br />
auftreten, ermöglichen soll. Des Weiteren wird untersucht, ob in der sogenannten H2AX-Domäne<br />
aktive Replikation stattfindet. Erste Ergebnisse deuten auf eine Anti-Korrelation von H2AX und aktiver Replikation<br />
hin.<br />
5.4 STRAHLENWIRKUNGEN BEI DER REPLIKATIONSINITIATION (AG GROßE/POSPIECH)<br />
Es wurden Fragmente des menschlichen BRCA2 in Escherichia coli rekombinant exprimiert und <strong>für</strong> die Immunisierung<br />
von Kaninchen und Mäusen verwendet. Es konnten jeweils acht polyklonale und monoklonale<br />
Antikörper (Ak) gegen drei Regionen des menschlichen BRCA2-Proteins produziert werden. Zwei monoklonale<br />
Ak zeigen hohe Spezifität im Western Blot, ein polyklonaler Ak eignet sich <strong>für</strong> die IF. Die Antikörper erkennen<br />
neben humanen BRCA2 auch BRCA2 aus CV-1-Affenzellen. Die Antikörper stehen allen Teilprojekten<br />
zur Verfügung und wurden bereits erfolgreich eingesetzt. Die Analyse der direkten Auswirkungen einer<br />
ionisierenden Bestrahlung auf die Replikationinitiationsaktivität in Hinsicht auf Chromatinbindung, Regulation<br />
durch Phosphorylierung und Interaktionsmuster ist in vollem Gange. Die Arbeiten konzentrierten sich vor allem<br />
auf Cdc45, da dieses Protein als limitierender Faktor der Replikationsinitiation auch als Ziel der Schadensantwort<br />
hohe regulatorische Bedeutung hat. Das Cdc45-Phosphorylierungsprofil vor und nach Bestrahlung<br />
wurde durch massenspektrometrische Analyse bestimmt. Die Relevanz einzelner, neu identifizierter<br />
Phosphorylierungsstellen wird gegenwärtig durch phospho-mimetische und phosphorylierungsresistente<br />
Aminosäureaustausche <strong>für</strong> die strahleninduzierte Schadensantwort untersucht. Cdc45 induzierbare CV-1-<br />
und HeLa-Zelllinien wurden charakterisiert. Die Überexpression von Cdc45 führt zum „Feuern“ vieler neuer<br />
„Origins“, zur verlangsamten Elongation der neu gestarteten Replikationsgabeln, einer starken Zunahme vor-<br />
144 Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit