Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz
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damage) + SSBs (single-strand breaks) + DSBs);<br />
- Reagenzien: Wasserstoffperoxid (BD und SSBs), Topoisomerase I Inhibitor Topotecan (SSBs, Spaltungskomplexe)<br />
Enediyene-Antibiotikum Calicheamicin (DSBs, +Apurinic-site), Endonuklease I-SceI (DSBs).<br />
TB 03<br />
3.2 ZELLBIOLOGISCHE/MOLEKULARBIOLOGISCHE/IMMUNOLOGISCHE ANALYSE<br />
- Synchronisationsmethoden: Isoleucinentzug, Doppel-Thymidinblock;<br />
- Knock down/out: siRNA (small interfering ribonucleic acid), Dox (Doxycyclin)-induzierbare shRNA (short<br />
hairpin ribonucleic acid), TALENs® (Transcription Activator-Like Effector Nucleases);<br />
- Zellzyklusprogression: fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS), EdU (5-Ethynyl-2‘-desoxyuridin)-Einbau,<br />
Western Blot, Kinase-Aktivitätsmessung;<br />
- Identifizierung Zellzyklusposition: EdU-Einbau, CENP-F (centromer protein F) Färbung, <strong>für</strong> die Lebendzellbeobachtung<br />
FUCCI (Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)-System, PCNA-GFP (Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen<br />
- green fluorescent protein);<br />
- Expression und Modifikation: Western Blot, phosphorylierungsspezifische Antikörper, Massenspektrometrie;<br />
- Protein-Protein Interaktion: Immunpräzipitation (IP)-Western Blot Analyse;<br />
- Nachweis DNA-Schäden/Brüche: Detektion von H2AX mittels Immunfluoreszenzfärbung (IF) und<br />
Immunhistochemie, alkalischer Comet Assay;<br />
- Evaluierung von Reparaturzentren als Funktion der Zeit: Fluoreszenzmikroskopie, Konfokale Laser Mikroskopie<br />
mit statistischer Auswertung mittels semi-automatischer sowie automatischer (High-Content-zelluläre<br />
Bildgebung) Auszählung von H2AX-, Rad51-, 53BP1-, P-RPA-S33-Foci;<br />
- Rekrutierung von Reparaturfaktoren: Expression von Fluoreszenzprotein-gekoppeltem 53BP1, Mdc1,<br />
Rad52, Ku80;<br />
- Rekrutierung von Replikationsfaktoren: Detektion von Polymerasen mittels IF;<br />
- Replikationsprozesse: EdU- und/oder BrdU-Einbau, DNA Fiber Assay, Replikationssystem mit isolierten<br />
Zellkernen;<br />
- Nachweis von HR (Homologe Rekombination)-spezifischen Reparaturzentren: Charakterisierung generierter<br />
BRCA2 (breast cancer associated) spezifischer Antikörper;<br />
- Bestimmung der HR mittels Plasmid-Rekonstruktionsassay nach transienter und stabiler Transfektion<br />
des Reporterkonstruktes.<br />
4. DURCHFÜHRUNG<br />
4.1 ZELLSYSTEM UND INAKTIVIERUNG ENDOGENER KOMPONENTEN DER ATM/ATR-VER-<br />
MITTELTEN SCHADENSIGNALKASKADEN<br />
Für die Experimente wurde ein isogenes Zellsystem verwendet, bestehend aus der Wildtyp (wtp53) p53 CV-1<br />
Zelllinie (diploide, nicht transformierte Epithelnierenzelle der afrikanischen grünen Meerkatze) sowie der<br />
Doxycyclin (Dox)-induzierbaren wtp53 TO-CV-1-Flag-ATR kd Zelllinie (TO=„tet on“). Die Inhibition der Kinasen<br />
ATM und/oder Chk1 erfolgte durch Zugabe der entsprechenden Inhibitoren KU-55933 und/oder UCN-01. Die<br />
Zellen wurden mittels Isoleucinentzug in der frühen, mittleren und späten S-Phase synchronisiert. Auf Grund<br />
der suboptimalen Transfektionseffizienz der CV-1 Zelllinie wurden die Zelllinien U2OS, HeLa und HT1080 verwendet.<br />
Des Weiteren wurden htert (human telomerase reverse transcriptase)-immortalisierte humane Fibroblasten<br />
mit Gendefekten im ATM- oder Artemis-Gen verwendet [Wildtyp (1BR.3), ATM-defizient (AT1BR), Artemis-defizient<br />
(FO2-385, CJ179)].<br />
4.2 UNTERSUCHUNG DER MITTELS DNA SCHÄDIGUNG AKTIVIERTEN SIGNALKASKADEN<br />
ALS FUNKTION DER ZEIT UND IN RELATION ZUM ZELLZYKLUS<br />
Die Aktivierung von ATM und/oder ATR-vermittelter Signalkaskaden und deren Einfluss auf die Zellzyklusprogression<br />
wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach DNA-Schädigung mittels FACS, Western und IP-Western<br />
Blot sowie IF untersucht.<br />
142 Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit