Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

4. DURCHFÜHRUNG
4.1 VERFEINERUNG DES SCD-MODELLS UND MODELLIERUNG VON CHROMOSOMALEN
BRÜCHEN IN ZELLKERNEN NACH BESTRAHLUNG
Es wurden Monte-Carlo-Simulationen von Chromatin mit 100 bis 5 000 Nukleosomen durchgeführt. Um hohe
Rechenzeiten von derzeit Wochen bzw. Monaten um bis zu einen Faktor 10 zu reduzieren, wurde mit einer
Parallelisierung des Programms begonnen.
Hetero- und euchromatische Zellkernregionen wurden im DNA-Modell von PARTRAC auf der Basis von 2 Datensätzen
mit je 5 Chromatinfaserelementen in atomarer Auflösung beschrieben. Die Genomstruktur in einem
menschlichen Fibroblasten-Zellkern wurde aus SCD-Modelldaten anhand einer auf Isochorendaten basierenden
Verteilung von hetero- und euchromatischen Regionen konstruiert. Modellparameter zu initialen
DNA-Schäden, wie Scavenging von OH-Radikalen, und zu ihrer Reparatur, wie Verfügbarkeit von Enzymen
und Mobilität von DNA-Enden, wurden regionsabhängig definiert, anhand von Testrechnungen überprüft und
verifiziert. Die Ergebnisse zur CA-Bildung nach - und -Strahlung wurden mit experimentellen Daten und anderen
Modellrechnungen verglichen. Der Einfluss reduzierter Mobilität der DNA-Enden auf die CA-Ausbeute
wurde untersucht.
TB 03
4.2 BEWEGLICHKEIT UND FEINSTRUKTUR VON SCHADENSINDUZIERTEN FOCI
Im Berichtszeitraum wurde das Set an stabil transfizierten Zelllinien, die fluoreszenzmarkierte Focibildner exprimieren,
erweitert. Die Modulation von Focibildung durch RNA-Interferenz von Kandidatenproteinen oder
chemischen Inhibitoren wird gegenwärtig untersucht. Die experimentelle Methodik für die Untersuchung von
Foci durch hochauflösende Mikroskopie (SPDM, STED (Stimulated emission depletion)) wurde erfolgreich
optimiert.
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER REPARATUR VON HETEROCHROMATISCHEN DNA-DOPPEL-
STRANGBRÜCHEN (DSB) IN G1-PHASE ZELLEN
Die kombinierte Anwendung von PCC und FISH dient der Identifizierung von Translokationen in der G1-Phase
nach der Depletion von Faktoren, welche in der Endresektion involviert sind. Zur Analyse von H2AX-Reparaturstudien
wurden verschiedene Zelllinien (Tumorzellen, primäre Fibroblasten) mit siRNA (small interfering
RNA) und CtIP (c-terminal binding protein interacting protein)-Mutantenkonstrukten transfiziert und immunfluoreszenz-mikroskopisch
analysiert. Die PCC-Methode wurde für die Chromosomenstudien in humanen
Fibroblasten zur Anwendung in G1-Phase Zellen mittels Polyethylenglykol (PEG) etabliert.
4.4 MOLEKULARE LOKALISATIONSMIKROSKOPIE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON CHRO-
MATINSTRUKTUR- UND -KONFORMATIONSÄNDERUNGEN
Strukturelle Veränderungen im Gesamt-, Eu- und Heterochromatin wurden durch nanometergenaue Messung
des Nukleosomenmusters mittels SPDM erfasst. Dazu müssen je Bildausschnitt Zeitserien von bis zu 2 000
Einzelbildern erfasst und auf Blinkereignisse (reversibles Photobleichen) einzelner Farbstoffmoleküle untersucht
werden. Die Zellen wurden mit 0,5 Gy, 2 Gy und 4 Gy bestrahlt und nach 30 min oder 48 h mit Formaldehyd
fixiert. Mittels stabiler Transfektion konnten die Nukleosomen am H2A oder H2B mit GFP (green fluorescent
protein) oder YFP (yellow fluorescent protein) markiert werden. Hetero- und Euchromatin wurden
durch spezifische Antikörper identifiziert. Die resultierenden Zweifarbenbilder wurden einer Clusteranalyse
und simulationsgestützten Messungen lokaler Dichteverteilungen unterzogen.
5. ERGEBNISSE
5.1 VERFEINERUNG DES SCD-MODELLS UND MODELLIERUNG VON CHROMOSOMALEN
BRÜCHEN IN ZELLKERNEN NACH BESTRAHLUNG
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass ein Abweichen von der regelmäßigen „Nucleosome Repeat Length“ von
189 bp zu flexiblerem Chromatin führen kann, aber nicht muss.
Die hetero- und euchromatischen Strukturen zeigen die erwarteten Auswirkungen auf die modellierten Ausbeuten
bei verschiedenen biologischen Endpunkten. Jedoch lieferte der verwendete Ansatz einen zu großen
Beitrag von heterochromatischen Regionen zum Schadensbild. Die Ausbeute an dizentrischen CA durch -
und -Strahlung zeigte sehr gute Übereinstimmung hinsichtlich der Dosisabhängigkeit, während die absolu-
138 Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit