Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz
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2.3 CHARAKTERISIERUNG DER REPARATUR VON HETEROCHROMATISCHEN DNA-DOPPEL-<br />
STRANGBRÜCHEN (DSB) IN G1-PHASE ZELLEN<br />
Reparaturkinetiken heterochromatischer DSB in Abhängigkeit von der Anresektion der DSB-Enden in<br />
G1-Phase Zellen und Einflüsse auf die Reparatur in Bezug auf Chromosomenaberrationen (Translokationen)<br />
als Marker <strong>für</strong> eine Fehlreparatur werden untersucht.<br />
2.4 MOLEKULARE LOKALISATIONSMIKROSKOPIE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON CHRO-<br />
MATINSTRUKTUR- UND -KONFORMATIONSÄNDERUNGEN<br />
Strukturelle Veränderungen im Gesamt-, Eu- und Heterochromatin vor und nach -Bestrahlung werden mittels<br />
SPDM (Spektrale Präzisions-Distanz-Mikroskopie) erfasst. Verpackungsänderungen in Abhängigkeit von der<br />
Reparaturzeit werden statistisch analysiert und systematisch verglichen.<br />
3. METHODIK<br />
3.1 VERFEINERUNG DES SCD-MODELLS UND MODELLIERUNG VON CHROMOSOMALEN<br />
BRÜCHEN IN ZELLKERNEN NACH BESTRAHLUNG<br />
Um ein besseres Verständnis der Strukturen der 1Mbp-Domänen zu bekommen, wurden Monte Carlo Simulationen<br />
auf Nukleosomen-Ebene durchgeführt und bis zu 5 000 Nukleosomen getestet. Das DNA-Modell in<br />
PARTRAC wurde um eine Differenzierung zwischen hetero- und euchromatischen Regionen im Zellkern erweitert.<br />
Das DNA-Reparaturmodell wurde um eine fortlaufende Erfassung von DNA-Fragmenten mit interchromosomalen<br />
Fehlverbindungen ergänzt, um die Zusammensetzung der resultierenden CA am Ende des<br />
Reparaturprozesses im Detail zu charakterisieren.<br />
TB 03<br />
3.2 BEWEGLICHKEIT UND FEINSTRUKTUR VON SCHADENSINDUZIERTEN FOCI<br />
Nach Ionen-Mikrobestrahlung mit Ionen unterschiedlichen LETs soll die Beweglichkeit der Foci während der<br />
nachfolgenden Inkubation mittels Immunfluoreszenz und live-cell imaging bestimmt werden. Dazu werden unterschiedliche<br />
Bestrahlungsmuster mit 55 MeV Kohlenstoffionen (hoch-LET) und 20 MeV Protonen (niedrig<br />
LET) am Mikrostrahl SNAKE des Tandembeschleunigers in Garching appliziert und in Lebendzellexperimenten<br />
die Relativbewegung der durch die Bestrahlung induzierten Foci bestimmt. Durch die Relativmessungen<br />
werden systematische Fehler weitgehend unterdrückt. Um den Einfluss genetischer Faktoren auf die Foci-Beweglichkeit<br />
zu testen, sollen Kandidatengene durch Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) oder chemische Inhibitoren<br />
herunterreguliert werden. Die Feinstruktur Ionen-induzierter Foci soll mittels Lokalisationsmikroskopie<br />
bestimmt werden, wobei durch RNA-Interferenz die Focibildung <strong>für</strong> eine verbesserte Auflösung moduliert<br />
werden soll. Die Feinstruktur der Foci soll auch im Hinblick auf die Kolokalisation unterschiedlicher Reparaturfaktoren<br />
bestimmt und in unterschiedlichen Chromatinbereichen untersucht werden.<br />
3.3 CHARAKTERISIERUNG DER REPARATUR VON HETEROCHROMATISCHEN DNA-DOPPEL-<br />
STRANGBRÜCHEN (DSB) IN G1-PHASE ZELLEN<br />
RNAi-Technologie in Tumorzellen und primären Fibroblasten und zytogenetische Techniken, wie Premature<br />
Chromosome Condensation (PCC) in Kombination mit Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), wurden<br />
verfahrenstechnisch weiter entwickelt und werden zur Analyse chromosomaler Translokationen eingesetzt.<br />
Das Verfahren der Plasmidtransfektion wurde etabliert und mittels immunfluoreszenz-mikroskopischer Analyse<br />
wurden Reparaturstudien mittels H2AX-Kinetiken angefertigt.<br />
3.4 MOLEKULARE LOKALISATIONSMIKROSKOPIE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON CHRO-<br />
MATINSTRUKTUR- UND -KONFORMATIONSÄNDERUNGEN<br />
Über spezifische Antikörper werden hetero- und euchromatische Bereiche an etablierten stabil transfizierten<br />
HeLa-Zellen markiert, die das Fluoreszenzprotein-markierte Histon H2A oder H2B exprimieren. Die Zellen<br />
werden mittels SPDM vor und nach -Bestrahlung zu verschiedenen Reparaturzeiten untersucht. Konformationsänderungen<br />
während der Reparatur werden mittels Clusteranalyseverfahren und simulationsunterstützten<br />
Auswerteverfahren statistisch erfasst.<br />
Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit 137