Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

3.2 MIKROKERN-TEST (MN)
Der Test wurde mit der Zytokineseblock-Technik unter Verwendung von Cytochalasin B (CB) durchgeführt,
um durch die Auswertung binukleärer Zellen eine hohe Spezifität und Sensitivität zu erhalten. Neben einer
15-stündigen Befeldung wurde auch eine 72-stündige Befeldung durchgeführt, um sicherzustellen, dass sich
die Exposition über alle Phasen des Zellzyklus erstreckte. Als Positivkontrolle diente die Chemikalie Colcemid.
Die Ergebnisse wurden per Zentromermarkierung mit CREST 1) -Antiserum ausgewertet.
TB 08
Ergebnisse
3.3 NUMERISCHE CHROMOSOMENABERRATIONEN (CA)
Um aneugenen Störungen nachzugehen, wurde in Ergänzung zur CREST-Analytik bei Giemsa-gefärbten
Metaphasespreitungen die Chromosomenzahl mikroskopisch bestimmt. Als Positivkontrolle diente
das Spindelgift Colcemid.
Auf Grund der zu geringen Sensitivität im Nachweis von Aneuploidien bei den primären dermalen Fibroblasten
wurde im Verlauf des Projektes die numerische CA durch CREST-Mikrokerntests mit fünffachem Stichprobenumfang,
entsprechend 10 000 Binukleaten je Dosis je Proband, ersetzt.
3.4 OXIDATIVE DNA-SCHÄDEN
Der oxidative Basenschaden 8-oxo-Guanin sollte in der DNA zunächst unter Verwendung eines monoklonalen
Antikörpers durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Da die Erfahrung gezeigt hatte, dass käufliche
Antikörper gegen 8-oxo-Guanin oft mangelhaft sind, wurde von vornherein parallel der Comet-Assay mit
Fpg 2) -Inkubation geplant, um Fpg-sensitive Schäden als Maß für oxidative DNA-Schäden nachzuweisen. Dieser
Fpg-Comet-Assay wurde im Zuge des Projekts auch schlussendlich als analytischer Endpunkt für oxidative
DNA-Schäden durchgeführt.
3.5 APOPTOSE
Der Nachweis des programmierten Zelltods als Folge der Befeldung erfolgte mit Hilfe des TUNEL 3) -Assays.
3.6 ZELLZYKLUSANALYSEN
Die Zellzyklusverteilung der Zellen wurde in Ethanol-fixierten und mit Propidiumiodid gefärbten Zellsuspensionen
durchflusszytometrisch analysiert.
3.7 CODIERUNG DER PROBEN
Jedem Spender wurde in Fragebögen, die weder Adresse noch Namen des Spenders enthielten, eine Code-
Nummer zugeteilt. Die Codierung der Proben erfolgte willkürlich, so dass keines der Präparate im auswertenden
Labor einem Probanden oder einer Behandlung zugeordnet werden konnte. Die Codes bestanden aus
zwei Buchstaben und vier Ziffern; sie wurden an den verantwortlichen Biostatistiker übermittelt.
4. DURCHFÜHRUNG
4.1 BEFELDUNG UND ANALYSEN
In diesem Projekt wurde der Einfluss einer EMF-Befeldung (GSM 1 800) mit SAR-Werten von 0,2, 2 und
10 W/kg im Vergleich zu einer scheinexponierten Kontrolle sowie einer Positivkontrolle auf primäre humane
dermale Fibroblasten in vitro untersucht. Die Induktion von DNA-Schäden wurde unter Verwendung des Comet-Assays
nach 4, 16 und 24 h Befeldung untersucht. Des Weiteren wurde die Bildung von durch reaktive
Sauerstoffspezies induzierten DNA-Addukten wie 8-oxo-Guanin über einen Comet-Assay mit zusätzlicher
Fpg-Inkubation nach 72 h Befeldung detektiert. Die potenzielle Gentoxizität der EMF-Befeldung wurde über
den Mikrokerntest nach 15 und 72 h Exposition analysiert. Das Auftreten aneugener Ereignisse wurde darüber
hinaus durch eine zusätzliche CREST-Analytik in den Mikrokernen sowie der Bestimmung numerischer
Chromosomenaberrationen in Metaphasen untersucht. Ein Einfluss auf die Apoptoserate wurde über den
1) CREST: Spezieller Antikörper, der sich an die Spindelfaseransatzstellen (Kinetochore) in Chromosomen
bindet und zum Nachweis des Vorhandenseins dieser Kinetochore dient
2) Fpg: Formamido-pyrimidin-DNA-glykosylase, spezielles DNA-Reparaturprotein
3) TUNEL: TdT (terminal desoxyribonukleotidyl transferase) - mediated dUTP (Desoxynukleosidtriphosphat) -
biotin nick end labeling
Ergebnisse der abgeschlossenen Forschungsvorhaben im Jahr 2012 - TB 08 95