Tierärztliche Hochschule Hannover Das Lipidmuster der caninen ...

Tierärztliche Hochschule Hannover
Das Lipidmuster der caninen Epidermis – Untersuchungen zum
Einfluss verschiedener Probenahmetechniken, Körperregionen und
ausgewählter Hauterkrankungen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Mandy Angelbeck-Schulze
Grevesmühlen
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
1. Univ.-Prof. Dr. R. Mischke
Klinik für Kleintiere
2. Apl.-Prof. Dr. W. Bäumer
Institut für Pharmakologie, Pharmazie und
Toxikologie
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke
Apl.-Prof. Dr. W. Bäumer
2. Gutachter: Univ.-Prof. a. D. Dr. W. Meyer
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2013
Diese Dissertation wurde von der „Gesellschaft zur Förderung Kynologischer
Forschung e.V.“ unterstützt.

Meiner Familie
- besonders meinen Eltern -

Teile dieser Arbeit wurden bei der folgenden Zeitschrift veröffentlicht:
• Veterinary Dermatology (online publiziert am 07.03.2013):
ANGELBECK-SCHULZE, M., J. STAHL, S. BRODESSER, K. ROHN, H.
NAIM, M. HEWICKER-TRAUTWEIN, M. KIETZMANN, W. BÄUMER und R.
MISCHKE (2013):
Comparison of three different sampling methods for canine skin lipids.
Veterinary Dermatology 24: 233-e251
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgenden
Fachtagungen präsentiert:
• 9th International Conference and Workshop on Biological Barriers – in vitro
and in silico Tools for Drug Delivery and Nanosafety Research, Saarbrücken
(29.02. – 09.03.2012):
Comparison of different methods for skin lipid sampling in the dog
M. Angelbeck-Schulze, J. Stahl, K. Rohn, M. Kietzmann, R. Mischke, W.
Bäumer
• 7th World Congress of Veterinary Dermatology, Vancouver, Canada (24. –
28.07.2012):
Comparison of three different sampling methods for canine skin lipids
M. Angelbeck-Schulze, J. Stahl, K. Rohn, M. Kietzmann, R. Mischke, W.
Bäumer

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung........................................................................................................... 11
2 Literaturübersicht............................................................................................... 14
2.1 Die Epidermis............................................................................................. 14
2.1.1 Aufbau und Funktion ........................................................................... 14
2.1.2 Die epidermalen Lipide - der „Mörtel“ der Hautbarriere....................... 15
2.1.2.1 Entstehung, Zusammensetzung und Barrierefunktion der
interzellulären Lipidlamellen........................................................................... 15
2.1.2.2 Die Ceramide des Stratum corneum............................................ 19
2.1.2.3 Physiologische Einflüsse.............................................................. 22
2.1.3 Hauterkrankungen mit veränderter Lipidzusammensetzung der
Epidermis .......................................................................................................... 28
2.2 Lipidanalytik ............................................................................................... 40
2.2.1 Probenahmetechniken ........................................................................ 40
2.2.2 Chromatographische Verfahren .......................................................... 47
2.2.3 Massenspektrometrie.......................................................................... 51
3 Material und Methoden...................................................................................... 54
3.1 Material ...................................................................................................... 54
3.1.1 Geräte ................................................................................................. 54
3.1.2 Chemikalien und Lösungsmittel .......................................................... 55
3.1.3 Verbrauchsmaterial und sonstige Materialien ..................................... 56
3.2 Studiendesign ............................................................................................ 57
3.3 Methodik..................................................................................................... 59
3.3.1 Tiere.................................................................................................... 59
3.3.2 Probenahme und -bearbeitung............................................................ 60
3.3.3 Lipidextraktion..................................................................................... 62
3.3.4 Standards............................................................................................ 63
3.3.5 Dünnschichtchromatographie.............................................................. 63
3.3.6 Densitometrie und Quantifizierung ...................................................... 64
3.3.7 Identifizierung der Ceramidbanden mittels Massenspektrometrie ...... 65

Inhaltsverzeichnis
3.3.8 Statistische Auswertung...................................................................... 66
4 Manuskript I....................................................................................................... 69
4.1 Abstract ...................................................................................................... 70
4.2 Introduction ................................................................................................ 71
4.3 Material and methods................................................................................. 72
4.4 Results ....................................................................................................... 78
4.5 Discussion.................................................................................................. 81
4.6 References................................................................................................. 84
4.7 Figures and tables...................................................................................... 89
5 Manuskript II...................................................................................................... 98
5.1 Abstract ...................................................................................................... 99
5.2 Introduction .............................................................................................. 100
5.3 Material and methods............................................................................... 101
5.4 Results ..................................................................................................... 105
5.5 Discussion................................................................................................ 108
5.6 References............................................................................................... 113
5.7 Figures and tables.................................................................................... 120
6 Diskussion ....................................................................................................... 124
7 Zusammenfassung.......................................................................................... 136
8 Summary ......................................................................................................... 139
9 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 141
10 Tabellarischer Anhang..................................................................................... 163
11 Danksagung .................................................................................................... 186

Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
% Prozent
Abb.
Abbildung
AMD automated multiple development (automatische
Mehrfachentwicklung)
bzw.
beziehungsweise
C
Kohlenstoffkette
CE
cornified envelope (Hornzellhülle)
Cer
Ceramide
CER
Ceramidklasse
ChE
Cholesterylester
Chol
Cholesterol
ChSO4
Cholesterolsulfat
CID collision induced dissociation (kollisionsinduzierte
Abspaltung)
cm
Zentimeter
cm²
Quadratzentimeter
corr
Korrelationskoeffizient
CXP
collision cell exit potential (Kollisionszellenausgangsspannung)
DP
Declustering Potential
EP
entrance potential (Eintrittsspannung)
ESI
Elektrospray-Ionisation
et al.
et alii (lateinisch für „und andere“)
FFA
free fatty acids (freie Fettsäuren)
FS
Fettsäure
g
Gramm
ggf.
gegebenenfalls
GlcCer
Glucosylceramide

Abkürzungsverzeichnis
HPLC
high-pressure liquid chromatography (Hochdruckflüssigchromatographie)
HPTLC high-performance thin-layer chromatography (Hochleistungsdünnschichtchromatographie)
kV
Kilovolt
LC
liquid chromatography (Flüssigchromatographie)
log
logarithmiert
mg
Milligramm
min
Minute
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mM
millimolar
mRNA
messenger ribonuclein acid (Boten-Ribonukleinsäure)
MS
Massenspektrometrie
MS/MS
Tandem-Massenspektrometrie
m/z
mass-to-charge ratio (Masse-Ladungs-Verhältnis)
o. g. oben genannte
p
Signifikanzniveau
PL
Phospholipide
PE
Phosphatidylethanolamin
psi
pound-force per square inch (physikalische Einheit für
Druck)
rpm
rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)
SB
Stratum basale (Keimschicht)
SC
Stratum corneum (Hornschicht)
sec
Sekunde
SG
Stratum granulosum (Körnerschicht)
s. o. siehe oben
SSp
Stratum spinosum (Stachelzellschicht)
St.
Staphylokokkus
Tab.
Tabelle

Abkürzungsverzeichnis
TG
Triglyzeride
TLC
thin-layer chromatography (Dünnschichtchromatographie)
u. und
u. a. unter anderem
UV
ultraviolett
V
Volt
v/v(/v)
Volumenverhältnisse
VC
Varianzkomponente
z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
ρ IC
Intraclass Korrelationskoeffizient
σ² Varianz
[A]
α-hydroxilierte Fettsäure
[dS]
Dihydrosphingosin
[EO]
veresterte ω-hydroxilierte Fettsäure
[H]
6-Hydroxysphingosin
[N]
nicht-hydroxilierte Fettsäure
[O]
ω-hydroxilierte Fettsäure
[P]
Phytosphingosin
[S]
Sphingosin

Einleitung
1 Einleitung
Die Forschung über die epidermalen Lipide des Hundes hat in den letzten Jahren
stetig an Bedeutung gewonnen. Beim Menschen ist schon seit Längerem bekannt,
dass die interzellulären Lipide des Stratum corneum eine wichtige Rolle in der
Barrierefunktion der Haut spielen (FARTASCH 1997; WERTZ 2000; FEINGOLD
2007). Hierbei scheint den Ceramiden, die im Stratum corneum in ungewöhnlicher
struktureller Vielfalt vorkommen (MASUKAWA et al. 2008), eine Schlüsselfunktion
zuzukommen (CHOI u. MAIBACH 2005; HOLLERAN et al. 2006).
Eine Veränderung der Zusammensetzung der epidermalen Lipide wird bei vielen
Hauterkrankungen als ursächlich diskutiert, denen eine gestörte Hautbarriere
zugrunde liegen könnte (CODERCH et al. 2003; NISHIFUJI u. YOON 2013). In
diesem Zusammenhang wurde bei Menschen mit atopischer Dermatitis ein Mangel
an Ceramiden nachgewiesen (IMOKAWA et al. 1991; YAMAMOTO et al. 1991;
MACHELEIDT et al. 2002), der auf Veränderungen im Lipidstoffwechsel der Haut
zurückzuführen sein könnte (JENSEN et al. 2004; IMOKAWA 2009). Auch zur
caninen atopischen Dermatitis, die derjenigen des Menschen klinisch sehr ähnlich ist
(MARSELLA et al. 2011), existieren bereits einige wenige Studien zur epidermalen
Lipidzusammensetzung (REITER et al. 2009; SHIMADA et al. 2009; POPA et al.
2011b; YOON et al. 2011; STAHL et al. 2012). Diese Studien bezogen sich
hauptsächlich auf die Unterschiede in Ceramidgehalt und -zusammensetzung
zwischen gesunden und atopischen Hunden, auf die übrigen Lipidfraktionen der
caninen Epidermis wurde kaum eingegangen. Studien zum epidermalen Lipidmuster
anderer Hauterkrankungen des Hundes sind selten (YOON et al. 2013).
Trotz der Existenz eines typischen Verteilungsmusters bei sowohl humaner als auch
caniner atopischer Dermatitis (MARSELLA u. SAMUELSON 2009) und obwohl für
den Menschen vergleichende Studien zum Lipidmuster verschiedener
Körperregionen durchgeführt wurden (LAMPE et al. 1983a; YOSHIKAWA et al.
1994), sind regionale Unterschiede in der Zusammensetzung der epidermalen Lipide
beim Hund bisher nicht untersucht worden. Allerdings wurde eine Studie bei
gesunden und atopischen Hunden durchgeführt, die regionale Unterschiede im
transepidermalen Wasserverlust fand (HIGHTOWER et al. 2010), sodass hier
11

Einleitung
Veränderungen der epidermalen Lipidzusammensetzung vermutet werden könnten.
Sollten Unterschiede im Lipidmuster zwischen Körperregionen, die prädisponiert für
die Entwicklung atopischer Hautveränderungen sind, und solchen, die gewöhnlich
keine atopischen Läsionen entwickeln, schon bei Hunden mit gesunder Haut
bestehen, wäre dies eine mögliche Erklärung für das typische Verteilungsmuster bei
caniner atopischer Dermatitis.
Obwohl bereits Studien zum epidermalen Lipidmuster des Hundes im Hinblick auf die
canine atopische Dermatitis existieren, wird ein direkter Vergleich dieser Studien
aufgrund unterschiedlicher verwendeter Probenahmetechniken erschwert.
Besonders im Hinblick auf die Ceramide werden auch Unterschiede in der Analytik
dieser Studien deutlich. Während SHIMADA et al. (2009) nur zwei Ceramidklassen
bestimmten, berechneten YOON et al. (2011) die Konzentrationen von zehn
Ceramidklassen. Doch gerade die Quantifizierung der Ceramide kann ein Problem
darstellen, da nicht für alle Ceramidklassen kommerzielle Standards erhältlich sind.
Aus diesem Grund widmete sich der erste Teil dieser Arbeit den methodischen
Aspekten der epidermalen Lipidanalytik, indem drei verschiedene
Probenahmetechniken (Hautbiopsie, Hautgeschabsel, Kombination aus
Lösungsmittelextraktion und Abrasion, „skin scrub“ genannt) an zwei verschiedenen
Körperstellen (inguinal, Kruppe) im Hinblick auf ihre Reproduzierbarkeit und
Praktikabilität untersucht wurden. Insbesondere wurde die „skin scrub“-Technik als
minimal invasive Methode evaluiert. Außerdem wurde der Einfluss des Einsatzes
verschiedener Ceramidstandards auf die Quantifizierung der Ceramidklassen
bestimmt.
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit lag in der Bestimmung des epidermalen
Lipidmusters an acht verschiedenen Körperstellen (Innenfläche der Pinna, Lefze,
palmarer Metakarpus, axillar, lateraler Thorax, laterales Abdomen, inguinal, Kruppe)
von Hunden mit gesunder Haut, um auf dieser Grundlage mögliche systematische
Veränderungen in der epidermalen Lipidzusammensetzung von Körperregionen, die
zur Entwicklung atopischer Läsionen neigen, gegenüber solchen, die hierfür nicht
prädisponiert sind, nachzuweisen. Im Vergleich zur unveränderten Haut wurden
außerdem Veränderungen des Lipidmusters von Hunden mit ausgewählten
12

Einleitung
Hauterkrankungen, besonders atopischer Dermatitis, untersucht. Hierfür kam die im
ersten Teil dieser Arbeit evaluierte minimal invasive „skin scrub“-Technik zum
Einsatz.
13

Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Die Epidermis
2.1.1 Aufbau und Funktion
Die Epidermis bildet als äußere Schicht der Haut die breiteste Kontaktfläche
zwischen Organismus und Umwelt, womit ihr wichtige Funktionen zukommen. Sie
verhindert das Austrocknen des Körpers, eine Grundvoraussetzung für Leben
außerhalb des Wassers (FEINGOLD 2007). Außerdem schützt sie vor chemischen
und physikalischen Einflüssen und stellt die erste Barriere gegen das Eindringen von
Mikroorganismen dar (DRAKE et al. 2008).
Histologisch besteht die Epidermis aus einem mehrschichtigen Plattenepithel,
welches sich aus dem Stratum basale (SB, Keimschicht), dem Stratum spinosum
(SSp, Stachelzellschicht), dem Stratum granulosum (SG, Körnerschicht) und dem
Stratum corneum (SC, Hornschicht) zusammensetzt (CREED 1958; SCOTT et al.
2001). Die Zellen der Keimschicht sind fest mit der Basalmembran verbunden und
sichern so die Ernährung der Epidermis, da Blutgefäße in der obersten Hautschicht
fehlen. Durch mitotische Zellteilung entstehen neue Keratinozyten, die im SSp
bereits den Anfangsprozessen der Keratinisierung unterliegen. Hier werden
Zytokeratine, Filaggrine und Lipide enthaltende membrane-coated granules (lamellar
bodies = Keratinosomen) gebildet (MATOLTSY 1976). Während der Wanderung der
Keratinozyten durch das SG werden die Zytokeratine mit den Filaggrinen über
Disulfidbrücken zu einem Filament-Matrix-Komplex verbacken, welcher sich parallel
zur Zelloberfläche ausrichtet. Die äußere Form der Zellen plattet sich allmählich ab
und die Zellorganellen degenerieren. Am Übergang zum SC wird der Inhalt der
Keratinosomen in den Interzellularraum entleert, woraus sich die die Korneozyten
verbindenden Lipidlamellen ausbilden (LANDMANN 1986). Das SC besteht
schließlich aus Stapeln von kernlosen, abgeflachten Korneozyten, die anstelle einer
Zellmembran einen cornified envelope (CE, bestehend aus Protein- und Lipidhülle)
als Zellhülle besitzen (LOPEZ et al. 2007) und durch interzelluläre Lipidlamellen
sowie wenige Desmosomen zusammengehalten werden. An der Oberfläche der
14

Literaturübersicht
Hornschicht, auch Stratum disjunctum genannt, kommt es durch proteolytischen
Abbau der Desmosomen und enzymatisch induzierte Lockerung der Lipidlamellen
zur allmählichen Abschilferung der Korneozyten. Ein vollständiger
Generationswechsel der Epidermiszellen dauert in gesunder Haut je nach Spezies
18–39 Tage (WEINSTEIN 1965; BAKER et al. 1973; LEPPER u. ANGER 1976;
ARCHAMBEAU u. BENNETT 1984; WEINSTEIN et al. 1984).
2.1.2 Die epidermalen Lipide - der „Mörtel“ der Hautbarriere
2.1.2.1 Entstehung, Zusammensetzung und Barrierefunktion der interzellulären
Lipidlamellen
Der Aufbau des SC der Säugetiere wird häufig mit einer Ziegelsteinmauer verglichen,
in der die Korneozyten die „Ziegelsteine“ und die interzellulären Lipidlamellen den
„Mörtel“ darstellen (NEMES u. STEINERT 1999). Um funktionelle interzelluläre
Lipidlamellen auszubilden, müssen mehrere regulatorische Prozesse ablaufen
(FEINGOLD u. JIANG 2011). Zunächst müssen in den Keratinozyten ausreichend
Fettsäuren vorliegen, damit aus diesen Phospholipide und Ceramide entstehen
können. Aus den Ceramiden werden Glucosylceramide gebildet. Phospholipide und
Glucosylceramide wiederum sind nötig, damit Keratinosomen geformt werden
können. In einem nächsten Schritt werden die Fette in die Keratinosomen
transportiert und später aus diesen in den Interzellularspalt sezerniert (FEINGOLD u.
JIANG 2011).
Mit Phospholipiden, Glucosylceramiden, Sphingomyelin und Cholesterol enthalten
die Keratinosomen die Vorstufen der interzellulären Lipide des SC (NISHIFUJI u.
YOON 2013). Besonders reich sind Keratinosomen an Acylglucosylceramid, das
einzigartig in verhornendem Epithel ist (MADISON 2003). Dieses Sphingolipid
besteht aus einer sehr langkettigen ω-Hydroxyfettsäure mit veresterter Linolsäure an
der ω-Hydroxylgruppe und fungiert als eine Art molekulare Niete innerhalb der
Keratinosomen, indem die lange Seitenkette mehrere Lipiddoppelschichten
umspannt und die Linolsäureseitenkette zwei Doppelschichten miteinander
verbindet, sodass sich der Inhalt der Keratinosomen Lamellen-artig anordnet
15

Literaturübersicht
(ABRAHAM et al. 1988). Zusätzlich zu den Lipiden enthalten die Keratinosomen
mehrere Enzyme des Lipidstoffwechsels, u. a. β-Glucocerebrosidase, saure
Sphingomyelinase, sekretorische Phospholipase A 2 und neutrale Lipasen (MADISON
2003; FEINGOLD 2007). Nach gemeinsamer Exozytose in den Interzellularraum
werden die sezernierten, relativ polaren Lipide durch diese Enzyme in eher unpolare
Lipide umgewandelt, welche dann in extrazelluläre Lipidlamellen angeordnet werden
(NISHIFUJI u. YOON 2013). Aus den Glucosylceramiden und Sphingomyelin
entstehen Ceramide, die Phospholipide werden zu freien Fettsäuren und Glycerin
umgewandelt. Letzteres spielt im SC eine Rolle als wasserbindendes Molekül,
welches wichtig für die Hydratation des SC ist (FEINGOLD 2007). Hierdurch wird die
Haut flexibel und geschmeidig gehalten.
Damit die interzellulären Lipidlamellen ihre Funktion als „Mörtel“ der Hautbarriere
erfüllen können, müssen sie mit den Korneozyten in Verbindung stehen. Laut
WERTZ (2000) sind zwei Drittel des Acylglucosylceramids in der Membran der
Keratinosomen und ein Drittel im Inneren lokalisiert. Bei der Fusion der
Keratinosomenmembran mit der Zellmembran am Übergang zum SC erfolgt eine
Umwandlung des Acylglucosylceramids durch Deglykosylierung und Abspaltung von
Linolsäure, wodurch ein ω-Hydroxyceramid entsteht, das zusammen mit freien
Fettsäuren eine Monolage als Lipidhülle um die Korneozyten bildet (WERTZ 2000).
Diese Lipidhülle wird fest mit den Korneozyten verankert, indem die ω-
Hydroxyceramide und die freien Fettsäuren kovalent an die die Korneozyten
umgebende Proteinhülle gebunden werden. Aus diesen beiden Schichten setzt sich
der CE zusammen, der die Zellmembran im SC vollständig ersetzt und den
undurchlässigsten Teil des SC bildet (NEMES u. STEINERT 1999). Die Proteinhülle
des CE entsteht im Zuge der Verhornung durch Polymerisation spezifischer
Zellproteine wie Involucrin, Loricrin, Desmoplakin, Envoplakin, Periplakin und
Periphilin, die sich untereinander vernetzen und parallel zur Zellmembran ausrichten
(NEMES u. STEINERT 1999). Die freien Fettsäuren werden mit den Serinresten von
Loricrin verestert, die ω-Hydroxyceramide über die Hydroxylgruppe an die
Glutaminreste von Involucrin gebunden (LOPEZ et al. 2007). Auf diese Weise bleibt
die Sphingosinseitenkette frei für die Bindung an die interzellulären Lipidlamellen
16

Literaturübersicht
(MADISON 2003), sodass die Lipidhülle des CE als Schablone für die Anordnung der
interzellulären Lipidlamellen fungiert und diese mit den Korneozyten verbindet
(NISHIFUJI u. YOON 2013).
Die extrazelluläre Matrix des SC besteht aus Stapeln von Doppelschichten mit
mäanderförmigem Verlauf, die sich falten bzw. entfalten bei Hydratation bzw.
Dehydratation (IWAI et al. 2012). Ceramide, Cholesterol und langkettige freie
Fettsäuren in annähernd äquimolarem Verhältnis sind die Hauptbestandteile der
Lipide im SC und damit die kritischen Zutaten für den „Mörtel“ der Hautbarriere
(NISHIFUJI u. YOON 2013). In kleineren Mengen kommen Cholesterolsulfat,
Cholesterylester und Glucosylceramide vor (WERTZ et al. 1992). Eine ähnliche
Zusammensetzung der SC-Lipide konnte auch für den Hund bestätigt werden
(STAHL et al. 2009).
Innerhalb der Doppelschichten richten sich die Ceramide mit ihren sphingoiden
Teilen zueinander aus. Cholesterol und die freien Fettsäuren sind asymmetrisch
verteilt, wobei sich Cholesterol im sphingoiden Teil der Ceramide anordnet, während
sich die Fettsäuren dem Fettsäuren-Teil der Ceramide anlagern (IWAI et al. 2012).
Da sowohl die freien als auch die an die Ceramide gebundenen Fettsäuren sehr
langkettig sind und der polare Kopf der Lipidlamellen in Relation zur Kettenlänge
sehr klein ist, liegen die Lipide hauptsächlich in fest-kristalliner oder in kristalliner
(Gel-)Phase vor. In diesem Zustand ermöglicht eine Membran kaum eine laterale
Diffusion, was die geringe Durchlässigkeit der Haut gegenüber Wasser sowie
hydrophilen und lipophilen Substanzen erklärt (CODERCH et al. 2003). Das Derivat
des Acylglucosylceramids, Acylceramid, spielt ebenso wie sein Vorläufer eine
besondere Rolle bei der Ausbildung der Lamellen, indem die lange Seitenkette eine
komplette Lipiddoppelschicht umspannt und die Linolsäurenseitenkette an die
benachbarte Doppelschicht bindet (MADISON 2003).
Mehrere Studien beweisen, dass jeder der drei Hauptbestandteile nötig ist, um
regelmäßige Lipidlamellen auszubilden (HOLLERAN et al. 1993; MAO-QIANG et al.
1995; BEHNE et al. 2000). Liegen die Lipidspezies in unausgewogenem Verhältnis
vor, kommt es zur Bildung veränderter Keratinosomen und damit zu unregelmäßigen
Lipidlamellen im SC, was zu einer gestörten Hautbarriere führt (FEINGOLD 2007).
17

Literaturübersicht
Die Regulation der Prozesse, die für die Differenzierung des SC und die Ausbildung
regelrechter Lipidlamellen verantwortlich sind, erfolgt teilweise durch die Lipide des
SC selbst (FEINGOLD u. JIANG 2011). Freie Fettsäuren und Metaboliten von
Cholesterol stimulieren über die Aktivierung von nukleären Hormonrezeptoren
sowohl die Keratinisierung als auch die Lipidsynthese und die Bildung der
Keratinosomen, sie steigern die Sekretion der letzteren und die extrazelluläre
Lipidverarbeitung zu Lamellen-artig angeordneten Membranen. Ceramide stimulieren
die Differenzierung der Korneozyten und hemmen deren Proliferation.
Cholesterolsulfat stimuliert die Bildung der Proteinhülle und verschiedener
Substanzen, die für die Keratinisierung vonnöten sind (FEINGOLD u. JIANG 2011).
Außerdem stellt die Hydrolyse von Cholesterolsulfat die Voraussetzung für die
Desquamation der Korneozyten dar (MADISON 2003), wodurch der Gehalt an
Cholesterolsulfat im SC von innen nach außen sinkt. Eine Störung des
enzymatischen Abbaus von Cholesterolsulfat führt zu höheren Konzentrationen
dieses Lipids im SC, was eine abnorme Korneozytenretention und ein verdicktes SC
zur Folge hat (FEINGOLD u. JIANG 2011).
Defekte im Stoffwechsel der epidermalen Lipide führen nicht nur zu einer gestörten
Barrierefunktion, sondern auch zu einer verzögerten Reparation der Hautbarriere.
Durch Verletzung des SC kommt es zu vermehrtem Wasserverlust, was mit
Abschwemmung des extrazellulären Kalziums aus der Körnerschicht in Richtung
Hautoberfläche einhergeht. Durch die erniedrigte Kalziumkonzentration in ihrer
Umgebung werden die Keratinozyten des SG dazu angeregt, den Inhalt der
Keratinosomen in den Extrazellularraum zu entleeren (FEINGOLD 2007). Die
vermehrte Bildung und Sekretion der Keratinosomen bleibt solange erhöht, bis die
Barrierefunktion sich wieder normalisiert (FEINGOLD 2007). Ist nun der Stoffwechsel
einer Lipidspezies defekt, kommt es zu einer geringeren Produktion von
Keratinosomen oder solchen mit verändertem Inhalt, was zu einer verzögerten bzw.
gestörten Ausbildung von Lipidlamellen führt.
Die interzellulären Lipide werden als die einzige fortlaufende Domäne des SC
betrachtet, was sie zum wichtigsten Pfad für die Diffusion von Substanzen in den
18

Literaturübersicht
Körper macht (NOVOTNY et al. 2010). Vor allem im Hinblick auf Hauterkrankungen
wird versucht, diesen Pfad für topisch verabreichte Medikamente zu nutzen.
2.1.2.2 Die Ceramide des Stratum corneum
Ceramide werden auch als N-Acylsphingosine bezeichnet und gehören zur Klasse
der Sphingolipide, die eine komplexe Gruppe innerhalb der Lipide darstellen
(NOVOTNY et al. 2010). Sie bestehen aus einer Sphingoidbase und einer Fettsäure,
welche durch eine Amidbindung zwischen der Carboxyl-Gruppe der Fettsäure und
der Amino-Gruppe der Base miteinander verbunden sind (NISHIFUJI u. YOON
2013). Die Ceramide gehören zu den wasserabweisendsten Lipiden in Membranen,
was ihr reiches Vorkommen im SC erklären mag (NOVOTNY et al. 2010). Ihre
Zusammensetzung wird als wesentlich für die Struktur der interzellulären
Lipidlamellen erachtet (ABRAHAM et al. 1988; BEHNE et al. 2000; BOUWSTRA et
al. 2000). Bei mehreren Säugetierspezies werden Veränderungen des
Ceramidmusters in Zusammenhang mit dem Auftreten unregelmäßiger Lipidlamellen
gebracht, was einen erhöhten transepidermalen Wasserverlust zur Folge hat
(IMOKAWA et al. 1991; MONTEIRO-RIVIERE et al. 2001; BAK et al. 2011).
Aus diesem Grund waren die epidermalen Ceramide Gegenstand zahlreicher
Studien (CODERCH et al. 2003; CHOI u. MAIBACH 2005; HOLLERAN et al. 2006;
FEINGOLD 2007; OLIVRY 2011; NISHIFUJI u. YOON 2013). Die Diversität der
Ceramide spiegelt sich auch in ihrem chromatographischen Verhalten wider, was zu
ihrer Einteilung nach ihrer Laufstrecke in Normalphasen-
Dünnschichtchromatographie und somit nach ihrer Polarität führte (WERTZ 2000).
Ceramid 1 war das unpolarste und hatte damit die weiteste Laufstrecke. MOTTA et
al. (1993) waren die ersten, die eine Nomenklatur der Ceramide des menschlichen
SC nach strukturellen Eigenschaften vorschlugen. Diese Einteilung beruhte zunächst
auf 5 Klassen, je nachdem, welche Sphingoidbase (Sphingosin [S] oder
Phytosphingosin [P]) vorlag und ob die gebundene Fettsäure α- [A], ω- [O] oder
nicht-hydroxyliert [N] war. Ceramid 1 wurde als CER[EOS] bezeichnet, da die ω-
Hydroxyfettsäure zusätzlich mit Linolsäure verestert war (MOTTA et al. 1993).
Ceramid 2, 3, 4 und 5 wurden jeweils als CER[NS], CER[NP], CER[AS] und CER[AP]
19

Literaturübersicht
bezeichnet. Mit der Strukturbeschreibung von 6-Hydroxysphingosin [H] als
Sphingoidbase in Ceramiden der menschlichen Epidermis erfolgte die Erweiterung
dieser Nomenklatur um CER[AH] und CER[EOH] (ROBSON et al. 1994), die
Nummerierung der nun sieben bekannten Klassen wurde nach ihrer Polarität neu
geordnet, sodass CER[EOH] nun Ceramid 4, CER[AS] Ceramid 5, CER[AP] Ceramid
6 und CER[AH] Ceramid 7 war. Mit der Entdeckung, dass bei
dünnschichtchromatographischer Auftrennung der menschlichen SC-Ceramide die
korrespondierende Bande von CER[AS] auch CER[NH] enthält, musste die
Nummerierung der Ceramidklassen einmal mehr erneuert werden (STEWART u.
DOWNING 1999). Diese Neuordung setzte sich allerdings nicht durch, denn
CER[NH] wurde nach seiner Entdeckung und mit der Beschreibung der neunten
Ceramidklasse, CER[EOP], meist als Ceramid 8 angesprochen (PONEC et al. 2003).
Mit der Entdeckung weiterer Ceramidklassen hat die Nummerierung nach Polarität
daher zunehmend ihren Bezug verloren, da Ceramid 9 (CER[EOP]) z. B. nach
chromatographischer Auftrennung zwischen Ceramid 2 und 3 liegt. Die Nomenklatur
nach MOTTA et al. (1993) scheint somit zeitgemäßer, zumal sie gleichzeitig
Informationen zur strukturellen Zusammensetzung liefert. Die Ceramide der caninen
Epidermis besitzen das gleiche chromatographische Laufverhalten und können in die
gleichen Klassen aufgetrennt werden wie diejenigen des Menschen (POPA et al.
2010).
Heute sind 11 verschiedene Ceramidklassen im menschlichen (MASUKAWA et al.
2008) und caninen (YOON et al. 2011) SC bekannt (Abb. 1), wovon sieben
ausschließlich im SC vorkommen (NISHIFUJI u. YOON 2013). Aufgrund der
zahlreichen Kombinationsmöglichkeiten und Kettenlängen sowohl der
Sphingoidbasen als auch der ungewöhnlich langkettigen Fettsäuren ([N], C 16-30 ,
meist Lignocerinsäure; [A], C 16-30 , meist 2-Hydroxy-Lignocerinsäure; [O], C 28-32 )
(NOVOTNY et al. 2010) wurden insgesamt 342 Arten von Ceramiden aus der
Hornschicht des Menschen isoliert (MASUKAWA et al. 2008). Alle
Fettsäurenseitenketten außer der veresterten Fettsäure in CER[EOS], CER[EOH]
und CER[EOP] waren gesättigt.
20

Literaturübersicht
Zusätzlich kommen drei Klassen nicht-veresterter ω-Hydroxyceramide (CER[OS],
CER[OH] und CER[OP]) vor, welche kovalent an die Proteinhülle binden und eine
Lipidhülle um diese bilden (BEHNE et al. 2000). Beim Menschen sind dies
hauptsächlich CER[OS] und CER[OH] (FARWANAH et al. 2007), während beim
Hund hauptsächlich CER[OS] und CER[OP] diese Aufgabe erfüllen (POPA et al.
2010).
Sphingoidbasen
Sphingosin [S] Phytosphingosin [P] 6-Hydroxysphingosin [H] Dihydrosphingosin [dS]
amidgebundene Fettsäure
nicht hydroxiliert [N]
CER[NS] CER[NP] CER[NH] CER[NdS]
α-hydroxiliert [A]
CER[AS] CER[AP] CER[AH] CER[AdS]
ω-hydroxiliert verestert [EO]
CER[EOS] CER[EOP] CER[EOH] CER[EOdS]*
Abb. 1: Ceramidklassen des Stratum corneum (freie Ceramide), erweiterte Nomenklatur nach MOTTA
et al. (1993).
* bisher nur Hinweise auf das Vorkommen im Stratum corneum (VAN SMEDEN et al. 2011).
Die de novo-Synthese der Ceramide findet in allen Schichten der menschlichen
Epidermis statt, steigt aber mit deren Differenzierung (HOLLERAN et al. 2006). Die
Synthese erfolgt im endoplasmatischen Reticulum, von wo aus die Ceramide zum
Golgi-Apparat transportiert werden, um dort als Cerebroside (Glucosylceramide) und
Sphingomyelin gespeichert zu werden (CODERCH et al. 2003). Im Laufe der
Keratinisierung wird der Inhalt des Golgi-Apparates in die Keratinosomen
transportiert (FEINGOLD 2007), aus denen die Ceramid-Vorläufer am Übergang zum
SC in den Interzellularspalt sezerniert werden, um dort mittels β-Glucocerebrosidase
und Sphingomyelinase zurück zu Ceramiden degradiert zu werden (NISHIFUJI u.
YOON 2013). Nur zwei der Ceramidklassen (CER[NS] und CER[AS]) entstehen z. T.
21

Literaturübersicht
aus Sphingomyelinen, aber alle Ceramide aus Glucosylceramiden (HOLLERAN et al.
2006). Daher müssten ebenso viele Glucosylceramidarten in den Keratinosomen
vorliegen wie Ceramidarten im SC vorkommen.
Die strukturelle Vielfalt der Ceramide gilt als eine Grundvorraussetzung für eine
funktionelle Hautbarriere (NOVOTNY et al. 2010). Die Kopfgruppe der Ceramide ist
im Vergleich zu Phospholipiden klein und beinhaltet mehrere funktionelle Gruppen,
die laterale Wasserstoffbrückenbindungen zu benachbarten Ceramidmolekülen
ausbilden können (CHOI u. MAIBACH 2005). Ihre besonders langen gesättigten
Ketten üben starke hydrophobe Anziehungskräfte aus (NOVOTNY et al. 2010).
Somit sind grundsätzlich zwei Konformationen möglich: Die Haarnadelformation, in
der beide Seitenketten in die gleiche Richtung zeigen, und die ausgebreitete
Formation, in der die Ketten in entgegengesetzte Richtungen zeigen (NOVOTNY et
al. 2010). Die Glucosylceramide nehmen in den Keratinosomen die Haarnadelform
ein, wobei ein Übergang dieser Konformation der Ceramide während der
Entwicklung der SC-Lamellen in die ausgebreitete Formation zu erfolgen scheint
(IWAI et al. 2012). Letztere ist vorteilhafter, da diese Formation eine höhere
Kohäsion der durch die Ceramidketten verbundenen Lamellen und die Abwesenheit
von quellfähigen hydrophilen Grenzflächen erlaubt (NOVOTNY et al. 2010).
Um ein Abschilfern der Zellen des oberen SC zu erlauben, ist eine Lockerung der
interzellulären Lipidlamellen notwendig. Durch Ceramidasen werden die Ceramide
gespalten, wodurch freie Sphingosine, Dihydrosphingosine, Phytosphingosine und 6-
Hydroxysphingosine entstehen. Diese langkettigen Basen sind potente
antimikrobielle Substanzen (DRAKE et al. 2008), die zur Aufrechterhaltung einer
gesunden mikrobiellen Flora auf der Haut beitragen.
2.1.2.3 Physiologische Einflüsse
Im Hinblick auf Barrierefunktion und kosmetische Eigenschaften der Haut existieren
mehrere Untersuchungen zum Einfluss von Geschlecht, Alter, Jahreszeiten oder
Körperregion auf die Zusammensetzung des SC und seiner Lipide bei verschiedenen
Spezies. Um einen Zusammenhang zwischen Barrierefunktion und
Lipidzusammensetzung nachzuweisen, verglichen LAW et al. (1995) das SC der
22

Literaturübersicht
Epidermis mit verschiedenen Regionen der Maulschleimhaut (Zahnfleisch, Gaumen,
Backenschleimhaut, Mundboden) vom Schwein. SC und Backenschleimhaut
beinhalteten eine ähnlich große Lipidmenge im Vergleich zu anderen Regionen, es
existierte jedoch keine Korrelation zwischen Lipidmenge und Wasserdurchlässigkeit.
Allerdings konnten in dieser Studie eine starke positive Korrelation zwischen
Ceramidgehalt und Barrierefunktion und eine negative Korrelation zwischen
Triglyzeridgehalt und Barrierefunktion festgestellt werden (LAW et al. 1995).
In einer anderen Studie wurden die Zellschichten des SC vom Menschen mit
folgender Reihenfolge bestimmt: Ferse > Sohle und Handfläche > Gliedmaßen >
Rumpf > Kopfhaut > Nacken > Gesicht > Genitalbereich (YA-XIAN et al. 1999). Dies
korreliert mit der Tatsache, dass die letzteren beiden Regionen empfindlicher auf
Irritationen reagieren und häufiger von Kontaktdermatitis betroffen sind. Es konnte
ein Zusammenhang zwischen Anzahl der Zellschichten und transepidermalem
Wasserverlust hergestellt werden: je weniger Zellschichten, desto höher der
transepidermale Wasserverlust. Insgesamt bestanden große inter-individuelle
Unterschiede, es konnten keine Geschlechts-spezifischen Unterschiede und kaum
Veränderungen in Abhängigkeit vom Alter der Probanden festgestellt werden (YA-
XIAN et al. 1999).
Allgemein wird angenommen, dass Unterschiede in Lipidgehalt und -zusammensetzung
wichtiger sind als die Dicke des SC im Hinblick auf regionale Variationen der
Durchlässigkeit der Haut (CODERCH et al. 2003). So wurden beim Menschen bei
einem Vergleich der SC-Lipide von Gesicht, Abdomen, Bein und Sohle
unterschiedliche Lipidmengen gefunden, die sich umgekehrt proportional zur
Durchlässigkeit der jeweiligen Körperregionen verhielten (LAMPE et al. 1983a). Des
Weiteren wurden regionale Variationen im Gehalt an Cholesterolsulfat (Bein > Sohle
> Gesicht > Abdomen), Cholesterol (Sohle > Bein > Gesicht > Abdomen), freien
Fettsäuren (Gesicht = Abdomen > Bein > Sohle), Triglyzeriden (Abdomen > Bein >
Gesicht > Sohle) und Sphingolipiden (Sohle > Gesicht = Bein > Abdomen)
festgestellt (LAMPE et al. 1983a).
Auch eine japanische Studie fand regionale Unterschiede im Lipidgehalt beim
Menschen, und zwar den höchsten in der Stirn, gefolgt von Brust und
23

Literaturübersicht
Schulterbereich, den niedrigsten Gehalt in Sohle (YOSHIKAWA et al. 1994). Diese
regionalen Unterschiede korrelieren, ähnlich wie die Zellschichtdicke, mit der
Empfindlichkeit für die Entwicklung von Kontaktdermatitiden auf lipophile Antigene (z.
B. Giftefeu) oder hydrophile Antigene (z. B. Nahrungsmittel, Blumen) an lipidreichen
(z. B. Gesicht) bzw. lipidarmen (z. B. Handflächen, Sohlen) Regionen und erklären
das unterschiedlich starke Ansprechen der verschiedenen Körperregionen auf
fettlösliche topische Therapeutika (CODERCH et al. 2003). Außerdem erklärt der
niedrigere Lipidgehalt der Hände und Füße die höhere Empfindlichkeit dieser
Regionen für Tensid- und Heißwasser-induzierte Dermatitiden (CODERCH et al.
2003).
Im Winter konnte beim Menschen ein insgesamt erniedrigter Lipidgehalt festgestellt
werden (YOSHIKAWA et al. 1994). Der Ceramidgehalt war in dieser Studie im
Sommer in der Ellbogenbeuge am höchsten, im Winter wurde jedoch am Körper ein
höherer Gehalt als an den Gliedmaßen gefunden, wobei die distalen Gliedmaßen
den niedrigsten Gehalt aufwiesen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der
Beobachtung, dass die letztgenannten Körperregionen eher zu trockener Haut im
Winter neigen. Eine andere Studie konnte einen erniedrigten Lipidgehalt der Haut im
Winter bestätigen (CONTI et al. 1996). Sowohl der Cholesterol- als auch der
Ceramidgehalt waren im Winter reduziert. Während das Ceramidprofil unverändert
war, wurde eine Veränderung der mit CER[EOS] veresterten Fettsäuren festgestellt:
Der Gehalt an gebundener Linolsäure nahm ab, stattdessen lag ein erhöhter
Ölsäuregehalt vor, sodass sich die Ratio von Linolsäure zu Ölsäure von 1,74 im
Sommer auf 0,51 im Winter verringerte (CONTI et al. 1996). Dies wurde als eine
Erklärung für die besonders starke Ausprägung von Xerodermie im Winter vermutet
(CONTI et al. 1996). Eine weitere Erklärung für vermehrt trockene Haut der
Gliedmaßen könnte in der regional unterschiedlichen Verteilung der Talgdrüsen des
Menschen (Gesicht > Oberkörper > proximale Extremitäten > distale Extremitäten)
liegen (MCGINLEY et al. 1980).
Ähnliche Studien belegen einen Zusammenhang zwischen Veränderungen der
Lipidzusammensetzung und -menge und der vermehrt trockenen Haut im Alter beim
Menschen (IMOKAWA et al. 1991; ROGERS et al. 1996). Diese Veränderungen im
24

Literaturübersicht
Lipid- und Ceramidgehalt des alternden SC werden vermutlich anfangs durch eine
herabgesetzte Sphingomyelinase-Aktivität und später durch eine erhöhte
Ceramidase-Aktivität ausgelöst, während die β-Glucocerebrosidase-Aktivität
unverändert bleibt (CODERCH et al. 2003). Außerdem treten Veränderungen im
Ceramidprofil zwischen präpubertären, jungen und älteren Frauen auf, die vermutlich
durch hormonelle Einflüsse entstehen (CODERCH et al. 2003). Eine aktuellere
Studie konnte allerdings keinen Altersunterschied im Ceramidgehalt oder -profil
feststellen, allenfalls zeigten Frauen ein etwas höheres Ceramid/Cholesterol-
Verhältnis als Männer (JUNGERSTED et al. 2010b). Auch DE PAEPE et al. (2004)
fanden keinen Unterschied in der Gesamtlipidmenge zwischen Geschlecht, Alter und
Körperregion beim Menschen. Kaum einer Studie war es möglich, substantielle
Veränderungen im Ceramidprofil nachzuweisen (YOSHIKAWA et al. 1994; ROGERS
et al. 1996; WARREN et al. 2011). Hierbei sollte berücksichtigt werden, dass große
inter-individuelle Unterschiede in der Lipidzusammensetzung vorliegen, sodass
Unterschiede durch andere Einflüsse maskiert werden können (NORLEN et al.
1999).
UV-Strahlung ist ein weiterer Faktor, der die Zusammensetzung der SC-Lipide
dosisabhängig beeinflusst. In suberythematösen Dosen steigt die Lipidmenge,
insbesondere die der Ceramide, zunächst an, die Barrierefunktion verbessert sich
sogar. Bei hohen Dosen kommt es jedoch zu einer geschädigten Hautbarriere mit
Entzündung und schuppiger Haut begleitet von erhöhtem transepidermalem
Wasserverlust (CODERCH et al. 2003). BAK et al. (2011) konnten bei Mäusen
zeigen, dass auch eine länger andauernde suberythematöse UV-Einstrahlung zu
einer gestörten Hautbarriere führt. Zunächst kam es zur Steigerung der Ceramid-,
Cholesterol- und Fettsäuren-Synthese, vermutlich als Reparaturmechanismus der
Hautbarriere. Bei anhaltender Einstrahlung fiel die Synthese dann ab, nach
mehrwöchiger Einstrahlung sanken die Fettsäuren-, Cholesterol- und insbesondere
die Ceramidspiegel in der Epidermis stark ab, was zu einem erhöhten
transepidermalen Wasserverlust führte (BAK et al. 2011). Dies sollte bei
jahreszeitlich-übergreifenden Untersuchungen zur Lipidzusammensetzung der
Epidermis berücksichtigt werden. Die Autorin vermutet, dass der Einfluss der UV-
25

Literaturübersicht
Einstrahlung aufgrund des schützenden Fells beim Hund keine allzu große Rolle
spielen sollte.
Zu all diesen Einflussfaktoren liegen beim Hund bisher kaum Untersuchungen vor.
Die älteste Studie aus dem Jahr 1982 untersuchte die Struktur, die Dicke und die
Zellschichten der caninen Epidermis anhand gefrorener Hautbiopsien (LLOYD u.
GARTHWAITE 1982). Die Proben wurden jeweils von der dorsalen Lendenregion,
des kranialen und kaudalen Abdomens sowie der Leistenregion genommen. Die
Oberfläche aller Proben war im Großen und Ganzen gleichförmig, allerdings mit
einer stärkeren Fältelung der dünneren und weniger behaarten Haut des Abdomens
und der Leistengegend (LLOYD u. GARTHWAITE 1982). Im Durchschnitt bestand
das SC aus 47,5 Zellschichten. Ähnlich wie in der humanmedizinischen Studie (YA-
XIAN et al. 1999) konnte auch hier kein Geschlechts-abhängiger Unterschied
festgestellt werden. Das SC der Leistengegend besaß die meisten Zellschichten, an
den anderen Körperstellen wurden keine Unterschiede in der Schichtzahl gefunden.
Die inter-individuelle Varianz war hingegen sehr hoch (LLOYD u. GARTHWAITE
1982).
DUNSTAN et al. (2002) fanden Alters- und Rasse-abhängige Unterschiede im
Lipidgehalt der Hautoberfläche und pH-Wert der Haut, indem sie Welpen von drei
verschiedenen Rassen (Sibirischer Husky, Labrador Retriever und Zwergpudel)
zwischen 10 und 81 Wochen untersuchten. Insgesamt nahm der Lipidgehalt der Haut
mit dem Alter zu. Während der prozentuale Anteil von Cholesterol, Triglyceriden und
freien Fettsäuren mit zunehmendem Alter abnahm, stiegen die prozentualen Werte
der Wachsester im Laufe der Untersuchungen an. Gleichzeitig sank der pH-Wert der
Haut weiter ab (DUNSTAN et al. 2002). Auch zwischen den Rassen wurden
bedeutende Unterschiede gefunden. So war der Gesamtlipidgehalt in der Haut der
Zwergpudel um ein Vielfaches niedriger als der der anderen beiden untersuchten
Rassen (DUNSTAN et al. 2002). Die oberflächlichen Hautlipide der Labrador
Retriever beinhalteten den größten Anteil an Cholesterol- und Wachsestern und den
niedrigsten Gehalt an Cholesterol. Der Haut-pH von Labrador Retriever und
Sibirischem Husky lag mit 8,0–9,0 im alkalischen Bereich, während der Haut-pH der
26

Literaturübersicht
Zwergpudel zwischen neutralen und leicht sauren Werten schwankte (DUNSTAN et
al. 2002).
Im Hinblick auf Untersuchungen der epidermalen Lipide beim Hund beschäftigten
sich die meisten Studien mit Unterschieden zwischen Hunden mit atopischer
Dermatitis und gesunden Kontrollhunden (REITER et al. 2009; SHIMADA et al. 2009;
HIGHTOWER et al. 2010; POPA et al. 2011b; YOON et al. 2011). Diese Erkrankung
besitzt ein spezifisches Verteilungsmuster von Läsionen auf der Haut (FAVROT et al.
2010; JAEGER et al. 2010) und häufig werden Veränderungen von betroffener und
klinisch unauffälliger Haut der atopischen Hunde miteinander verglichen. Um eine
Aussage bezüglich der Barriere-Eigenschaften dieser Hauttypen atopischer Hunde
zu treffen, untersuchten HIGHTOWER et al. (2010) den transepidermalen
Wasserverlust von zehn verschiedenen Körperregionen von atopischen und
gesunden Beagles in drei Altersgruppen. Acht der zehn Körperregionen waren
prädisponiert für atopische Symptome (Kinn, Innenseite der Ohrmuschel,
Augenumgebung, Ellbogenbeuge, axillar, inguinal und die Zwischenballenbereiche je
einer Vorder- und Hinterpfote). Die anderen beiden Körperregionen waren die
seitliche Brustwand und die dorsale Lendenregion. Die Werte der einzelnen
Körperstellen waren sowohl bei gesunden als auch bei den atopischen Hunden nicht
einheitlich, mit den höchsten transepidermalen Wasserverlusten an den Pfoten
(HIGHTOWER et al. 2010). Allerdings konnte in dieser Studie auch gezeigt werden,
dass sich die Barrierefunktion der Epidermis gemessen am transepidermalen
Wasserverlust zwischen normalen und atopischen Hunden unterscheidet, und zwar
an sechs Körperstellen (Kinn, Ohrmuschel, Augenumgebung, Ellbogenbeuge, axillar
und Brustwand), wovon fünf zu den für atopische Symptome prädisponierten zählten.
Diese Unterschiede waren besonders ausgeprägt in der Gruppe der Junghunde
(HIGHTOWER et al. 2010). Solche Unterschiede in der epidermalen Barrierefunktion
könnten wie beim Menschen in variierenden Lipidmustern der verschiedenen
Körperregionen des Hundes begründet sein und einen Hinweis auf den Ursprung der
Prädisposition von Körperstellen zur Ausprägung atopischer Läsionen liefern.
Allerdings liegen hierzu meines Wissens nach bisher keine Untersuchungen vor.
27

Literaturübersicht
2.1.3 Hauterkrankungen mit veränderter Lipidzusammensetzung der
Epidermis
In vielen inflammatorischen Hauterkrankungen mit ganzheitlich gestörter epidermaler
Differenzierung gibt es wahrscheinlich sekundäre Effekte sowohl auf die Korneozyten
als auch auf die Zusammensetzung und Funktion der interzellulären Lipidlamellen,
was zur Entstehung von Schuppen führt (MADISON 2003). Daher können
Erkrankungen unterschiedlicher Genese zu ähnlichen Krankheitsbildern führen.
Durch eine Unterversorgung mit essentiellen Fettsäuren z. B., zu denen auch
Linolsäure zählt, entsteht schuppige Haut mit erhöhtem Wasserverlust (DOWNING et
al. 1986). Hierzu kommt es, weil die Analoge zu Acylglucosylceramid und
Acylceramid zwar gebildet werden, diese aber Ölsäure statt Linolsäure enthalten,
was ausreicht, um die biologische Aktivität dieser Moleküle zu hemmen (DOWNING
et al. 1986). Als Folge werden Keratinosomen nur unzureichend gebildet und die
Interzellularräume sind weitgehend frei von Lipidlamellen. Dieser Defekt kann durch
die Zufuhr von Linolsäure ausgeglichen werden (DOWNING et al. 1986).
Ichthyose
Charakteristischerweise mit Verhornungsstörungen und sichtbaren Hautschuppen
einhergehend ist das Krankheitsbild der Ichthyose. Dieser Erkrankung liegen meist
verschiedene genetische Defekte zugrunde, die zu unterschiedlichen Ausprägungen
von Strukturveränderungen im SC führen (ELIAS et al. 2008). So wird die Harlekin-
Ichthyose z. B. durch einen Defekt des ABCA12-Proteins ausgelöst, welches für den
Transport von Glucosylceramiden in die Keratinosomen benötigt wird (HOLLERAN et
al. 2006). Die Folge sind eine gestörte Bildung der Keratinosomen, was letztlich zu
einer dramatischen Reduktion der interzellulären SC-Lipide und damit einer
hochgradig gestörten Hautbarriere führt (NISHIFUJI u. YOON 2013). Letzteres dürfte
als Grundursache für den oft tödlichen Verlauf dieser Erkrankung anzusehen sein. Im
Gegensatz dazu stellt die X-chromosomal-rezessive Ichthyose eine sehr mild
verlaufende Verhornungsstörung dar. Ihr liegt ein Defekt im Steroid-Sulphatase-Gen
zugrunde (NISHIFUJI u. YOON 2013), der zu einem Mangel an dem entsprechenden
Enzym führt und damit den Abbau von Cholesterolsulfat im SC behindert
28

Literaturübersicht
(CODERCH et al. 2003). Dadurch ist der Gehalt an Cholesterolsulfat in der
Hornschicht betroffener Patienten zehnmal höher als in derjenigen gesunder
Menschen, was zu einer abnormen Korneozytenretention und verdickten Hornschicht
führt (FEINGOLD u. JIANG 2011).
Auch beim Hund wurden Formen der Ichthyose beschrieben (NISHIFUJI u. YOON
2013). Bei Golden Retrievern mit dieser Erkrankung wurde ein Defekt in dem Gen
nachgewiesen, welches das eine Phospholipase-Domäne enthaltende Protein 1
(PNLPA1) kodiert. Dieses Protein synthetisiert Glycerophospholipide oder gestaltet
diese um, ein wichtiger Schritt für die epidermale Barrierefunktion (NISHIFUJI u.
YOON 2013).
Psoriasis
Eine ebenfalls hyperproliferative Erkrankung der humanen Epidermis ist die
Psoriasis, die durch eine abnorme epidermale Reifung charakterisiert ist, welche
aufgrund des unvollständigen Differenzierungsprozesses zu einer missgebildeten
Hornschicht mit defekter Hautbarriere führt (CODERCH et al. 2003). Strukturell ist
das SC bei Psoriasis durch sehr enge interzelluläre Zwischenräume mit wenigen
abnormen Lipidlamellen zwischen einer großen Anzahl parakeratotischer
Korneozyten gekennzeichnet (FARTASCH 1997).
In betroffener Haut wurden Veränderungen im Ceramidmuster beim Menschen
gefunden, die in Zusammenhang mit einem erhöhten transepidermalen
Wasserverlust gebracht werden (CHOI u. MAIBACH 2005). Konkret wurden
herabgesetzte prozentuale Anteile an CER[EOS], CER[NP] und CER[AP] sowie
erhöhte Anteile an CER[NS] und CER[AS] beschrieben, während kein Unterschied
im relativen Gehalt an Gesamtceramiden zu gesunden Menschen gefunden wurde
(MOTTA et al. 1993). Auch war das Ceramidmuster bei allen Psoriasis-Patienten
gleich, unabhängig von der klinischen Variante, dem Alter oder der beprobten
Körperregion. Auffallend war, dass der Gehalt an CER[EOS] trotz großer Mengen an
Linolsäure um ca. 40% vermindert war (MOTTA et al. 1993). Der Defekt in der
Barrierefunktion psoriatischer Haut wird dem reduzierten Gehalt an CER[EOS] und
CER[EOH] zugeschrieben (CODERCH et al. 2003). In einer anderen Studie wurde
29

Literaturübersicht
ein erniedrigter absoluter Ceramidgehalt in betroffener Haut beschrieben, der mit der
Schwere der Erkrankung korrelierte (LEW et al. 2006). Es wurde außerdem
nachgewiesen, dass der erniedrigte Ceramidgehalt mit einer Herabsetzung des
apoptotischen Signalwegs einhergeht und so zur epidermalen Proliferation beitragen
könnte (LEW et al. 2006).
Eine Erklärung für den erniedrigten Ceramidgehalt könnten sowohl eine in
psoriatischer Haut beschriebene herabgesetzte Sphingomyelinase-Aktivität (CHOI u.
MAIBACH 2005) als auch eine ebenso beschriebene reduzierte β-
Glucocerebrosidase-Aktivität (HOLLERAN et al. 2006) liefern. Auch in klinisch
unauffälliger Haut von Patienten mit Psoriasis wurde ein reduzierter absoluter
Ceramidgehalt gefunden, allerdings waren die Verhältnisse zwischen Ceramiden,
Cholesterol und freien Fettsäuren ähnlich wie die in gesunder Haut (FARWANAH et
al. 2005a). Im Unterschied zu betroffener Haut konnten hier keine Abweichungen im
Ceramidprofil festgestellt werden.
Atopische Dermatitis des Menschen
In derselben Studie wurde auch klinisch unauffällige Haut von Patienten mit
atopischer Dermatitis untersucht, wobei ebenfalls keine Unterschiede der relativen
Werte der epidermalen Hauptlipide oder der Ceramidklassen zu denen gesunder
Haut nachgewiesen werden konnten (FARWANAH et al. 2005a). Andere Studien
fanden ebenfalls keine Unterschiede in der proportionalen Lipidzusammensetzung
zwischen atopischen und gesunden Menschen (IMOKAWA et al. 1991; YAMAMOTO
et al. 1991), es wurden aber starke Reduktionen des Gesamtlipidgehalts und der
absoluten Ceramidmengen in betroffener und klinisch unauffälliger Haut von
atopischen Patienten gegenüber gesunden Kontrollen festgestellt, wobei Ceramid 1
am stärksten reduziert war (IMOKAWA et al. 1991). YAMAMOTO et al. (1991)
stellten zusätzlich einen erhöhten Gehalt an gebundener Ölsäure in Ceramid 1 fest,
korrespondierend zu erniedrigten Mengen an gebundener Linolsäure.
Bei dem Vergleich von Patienten mit und ohne atopische Läsionen mit gesunden
Menschen fiel auf, dass die Werte aller Lipidfraktionen bei Atopie-Patienten ohne
Läsionen zwischen denen von Patienten mit Läsionen und denen von gesunden
30

Literaturübersicht
Menschen lagen (DI NARDO et al. 1998). Erhöhte transepidermale Wasserverluste
wurden nur bei Patienten mit Läsionen nachgewiesen, wobei der Grad der Erhöhung
negativ mit dem Gehalt an CER[NP] korrelierte. Außerdem wurde eine Verringerung
des Ceramid-Cholesterol-Verhältnisses bei atopischen Patienten gegenüber der
gesunden Kontrollgruppe festgestellt, was auf einen erhöhten Cholesterolgehalt
zurückgeführt wurde (DI NARDO et al. 1998). Dies könnte einen
Reparaturmechanismus als Antwort auf den erhöhten transepidermalen
Wasserverlust darstellen (MELNIK et al. 1990). Zusätzlich zu Ceramiden wurden
stark reduzierte Mengen sehr langkettiger freier Fettsäuren in atopischer Haut
nachgewiesen, und zwar wurden Verringerungen auf 40% des Gehalts gesunder
Haut in klinisch unauffälliger Haut und sogar auf nur 25% in betroffener Haut
gefunden (MACHELEIDT et al. 2002). Die gleiche Studie zeigte eine ebenfalls stark
reduzierte de novo-Synthese der Glucosylceramide und Ceramide, wobei besonders
CER[EOH] und CER[NP] betroffen waren (MACHELEIDT et al. 2002).
Veränderungen der interzellulären Lipidzusammensetzung haben einen großen
Einfluss auf die Struktur der interzellulären Lipidlamellen (FEINGOLD 2007) und
damit auf die Barrierfunktion. Liegen jedoch bereits Veränderungen der de novo-
Synthese vor, so ist davon auszugehen, dass strukturelle Veränderungen der Lipide
schon in den Keratinosomen existieren, die wesentlich zu der veränderten
Zusammensetzung der interzellulären Lipide beitragen. In atopischer Haut wurden
verzögerte Sekretionsvorgänge der Keratinosomen beobachtet, sodass intakte
Keratinosomen innerhalb der Zellen verblieben und noch in den Hornzellen
nachzuweisen waren (FARTASCH et al. 1992). In der obersten Zellschicht des SG
von atopischen Patienten befanden sich noch immer 26% aller Keratinosomen im
Zytoplasma, was dreimal mehr als in gesunder Haut waren. Daraus folgt, dass in
atopischer Haut insgesamt weniger polare Lipide und Enzyme in den
Interzellularraum zwischen SG und SC abgegeben werden als in gesunder Haut
(FARTASCH et al. 1992), was eine plausible Erklärung für den reduzierten
Gesamtlipidgehalt des atopischen SC liefert. Folgerichtig bilden sich die typischen
langen Lipidlamellen nur vereinzelt aus, wodurch sich die gestörte Barrierefunktion
atopischer Haut erklären lässt, die mit einem eingeschränkten Reparaturvermögen
31

Literaturübersicht
einhergeht (FARTASCH et al. 1992). Dies wiederum führt zur Mobilisierung
immunologischer und inflammatorischer Mediatoren und lässt atopische Haut
empfindlicher auf Irritationen und Infektionen reagieren, wodurch sichtbare atopische
Ekzeme entstehen (FARTASCH et al. 1992).
PILGRAM et al. (2001) konnten beweisen, dass sich die Anordnung der SC-Lipide in
atopischer Haut verändert. Sie lagen mehr in der Gel-Phase vor als in der
kristallinen, wodurch das SC insgesamt durchlässiger wurde. Ein Grund hierfür
könnte der drastisch erhöhte Gehalt an Ceramiden mit extrem kurzer Kettenlänge in
klinisch unauffälliger atopischer Haut sein (JANSSENS et al. 2012), wobei die
Veränderungen der Eigenschaften der SC-Lipide mit der Schwere der Erkrankung
korrelieren (JANSSENS et al. 2012).
Die Veränderungen im Ceramidgehalt atopischer Haut könnten auf Veränderungen
im Stoffwechsel der Glucosylceramide und des Sphingomyelins zurückgehen,
allerdings konnten bisher keine Aktivitätsänderungen der β-Glucocerebrosidase oder
der Ceramidase festgestellt werden (CHOI u. MAIBACH 2005). Die Arbeitsgruppe
um IMOKAWA (2001) konnte einen veränderten Metabolismus der Ceramid-
Vorläufer nachweisen, der den niedrigen Ceramidgehalt in atopischer Haut erklärt.
Zunächst konnte eine sehr hohe Sphingomyelinhydrolyse in atopischer Haut
nachgewiesen werden, durch die jedoch Sphingosylphosphorylcholin und freie
Fettsäuren anstelle von Ceramiden und Phosphorylcholin entstanden. Das
verantwortliche Enzym wurde als Sphingomyelin-Deacylase bezeichnet (MURATA et
al. 1996). Dieses Enzym zeigte sowohl in betroffener als auch in klinisch unauffälliger
Haut atopischer Patienten eine höhere Aktivität als in gesunder Haut, wohingegen
die Enzymaktivität bei Patienten mit Kontaktdermatitis vergleichbar zu derjenigen bei
gesunden Patienten war (HARA et al. 2000). Diese Abweichung im Sphingomyelin-
Metabolismus schien also spezifisch für die atopische Dermatitis zu sein.
Kurz darauf wurde dann festgestellt, dass Sphingomyelin-Deacylase auch in der
Lage ist, Glucosylceramide zu spalten. Durch diesen Prozess werden
Glucosylsphingosin und freie Fettsäuren gebildet, was zur Umbenennung des
Enzyms in Glucosylceramid-Sphingomyelin-Deacylase führte (HIGUCHI et al. 2000).
Auch bei diesem alternativen Abbauweg für Glucosylceramide war die Enzymaktivität
32

Literaturübersicht
höher in betroffener und klinisch unauffälliger Haut atopischer Patienten, und in
beiden Hauttypen wurde auch ein höherer Gehalt an Glucosylsphingosin gefunden
als in gesunder Haut (ISHIBASHI et al. 2003). Die Höhe der Glucosylsphingosin-
Menge verhielt sich umgekehrt proportional zum Ceramidgehalt in betroffener Haut
und zum Gehalt an Ceramid 1 in betroffener und klinisch unauffälliger Haut
(ISHIBASHI et al. 2003).
Ebenso wurde ein erhöhter Gehalt an Sphingosylphosphorylcholin in atopischer Haut
festgestellt mit der gleichen Beziehung zum Ceramidgehalt: je höher die
Konzentration von Sphingosylphosphorylcholin, desto niedriger die
Ceramidkonzentration (OKAMOTO et al. 2003). Weiterhin wurde eine signifikante
positive Korrelation zwischen Sphingosylphosphorylcholin und Glucosylsphingosin
festgestellt, aber keine Korrelation zwischen Sphingosylphosphorylcholin und
Sphingosin gefunden (OKAMOTO et al. 2003). Die Autorin meint, dass diese
Beobachtung dafür spricht, dass es sich um ein und dasselbe Enzym handelt. Bisher
ist jedoch noch immer nicht sicher, ob es sich bei dieser Deacylase um ein Enzym
mit zwei Substraten oder um zwei verschiedene Enzyme handelt (HOLLERAN et al.
2006). Da in atopischer Haut keine höheren Spiegel von Sphingomyelin oder
Glucosylceramiden vorliegen, wurde vermutet, dass die erhöhte Enzymaktivität der
Glucosylceramid-Sphingomyelin-Deacylase die Ursache des reduzierten
Ceramidgehalts atopischer Haut ist und damit wesentlich zur gestörten
Barrierefunktion beiträgt (IMOKAWA 2009).
Allerdings wurde auch über eine herabgesetzte Aktivität der sauren
Sphingomyelinase in atopischer Haut berichtet, die mit dem reduzierten
Ceramidgehalt und der gestörten Barrierefunktion korrelierte (JENSEN et al. 2004).
Da in atopischer Haut die Aktivität der Sphingomyelin-Deacylase erhöht ist und beide
Enzyme das gleiche Substrat haben, könnte der reduzierte Sphingomyelin-Spiegel
die Ursache für die Aktivitätsminderung der Sphingomyelinase sein (JENSEN et al.
2004). Zusätzlich zum vermehrten Abbau des Sphingomyelins durch die Deacylase
würde die Bereitstellung von Ceramiden durch eine herabgesetzte Aktivität der
Sphingomyelinase noch weiter vermindert (JENSEN et al. 2004). Hiervon wären
jedoch ausschließlich CER[NS] und CER[AS] betroffen, da nur diese beiden Klassen
33

Literaturübersicht
aus Sphingomyelin gebildet werden (HOLLERAN et al. 2006), diese aber auch
mengenmäßig am stärksten vertreten sind (CODERCH et al. 2003).
Es wurde weiterhin über eine herabgesetzte Aktivität der neutralen
Sphingomyelinase in atopischer Haut berichtet, und zwar in stärkerem Maße an
betroffenen Stellen als an klinisch unauffälligen (JENSEN et al. 2004). Diese
Veränderung korrelierte mit der gestörten Synthese der Proteine, die die Proteinhülle
der Korneozyten bilden. Die Folge waren erniedrigte Spiegel von Involucrin und
Filaggrin, während der Spiegel von Loricrin erhöht war (JENSEN et al. 2004), was als
die Ursache für die von MACHELEIDT et al. (2002) nachgewiesenen erniedrigten
Konzentrationen der ω-Hydroxyceramide und erhöhten Spiegel der ω-
Hydroxyfettsäuren in atopischer Haut vermutet wurde (JENSEN et al. 2004). Durch
die gestörte Bildung der Proteinhülle wird also die Ausbildung einer regelrechten
Lipidhülle verhindert, welche wiederum ein defekte Schablone für die interzellulären
Lipidlamellen bildet. Laut der Meinung der Autorin wird dieser Zusammenhang
dadurch verdeutlicht, dass eine negative Korrelation zwischen der Konzentration von
ω-Hydroxyceramiden und der Schwere der Erkrankung bestand (MACHELEIDT et al.
2002).
Mit der Aktivitätsminderung der neutralen Sphingomyelinase kam es auch zu einer
veränderten Expression der Keratine in atopischer Haut, was zu Proliferation und
Inflammation der Epidermis führte und ihre Differenzierung hemmte, begleitet von
einer deutlichen Verschlechterung der betroffenen Haut (JENSEN et al. 2004). Als
Auslöser für diese Vorgänge wurden Veränderungen in der Signalübertragung
vermutet (JENSEN et al. 2004). Letztlich steht die gestörte Barrierefunktion
atopischer Haut offensichtlich in Zusammenhang mit vielen verschiedenen
Veränderungen der Epidermis und verhält sich, gemessen an der Höhe des
transepidermalen Wasserverlusts, proportional zur Ausprägung der atopischen
Symptome (MARSELLA et al. 2011).
Die gestörte Barrierefunktion spiegelt sich auch in der häufigen Vergesellschaftung
atopischer Haut mit Sekundärinfektionen wider, die besonders häufig durch
Staphylococcus aureus (St. aureus) verursacht werden (MELNIK 2006). Als Schutz
vor solchen Infektionen ist die Epidermis u. a. mit einer Reihe antimikrobiell
34

Literaturübersicht
wirksamer Lipide ausgestattet, deren effektivste Klassen freie Fettsäuren,
Glucosylceramide und freie Sphingosine bilden (MELNIK 2006). Unter den freien
Fettsäuren ist dies besonders für Linolsäure bestätigt worden, deren Gehalt in
atopischer Haut reduziert zu sein scheint (YAMAMOTO et al. 1991). Auch cis-6-
Hexadecensäure besitzt als Bestandteil der Hautlipide des Menschen eine
spezifische antibakterielle Aktivität (TAKIGAWA et al. 2005). Die Reduktion ihrer
Konzentration in atopischer Haut korrelierte signifikant mit der Anzahl von St. aureus-
Kolonien auf der Haut, wobei die topische Applikation einer Lotion mit cis-6-
Hexadecensäure die bakterielle Überbesiedlung in sechs von acht Patienten
beseitigte (TAKIGAWA et al. 2005). Die Sphingosine besitzen ein breites
antimikrobielles Spektrum gegen gram-positive und -negative Bakterien, Candida
albicans und Dermatophyten (MELNIK 2006; DRAKE et al. 2008). Durch
Phosphorylierung von Sphingosin entsteht Sphingosin-1-phosphat, welches ebenfalls
bakterizide Effekte hat (MELNIK 2006). In atopischer Haut kommt es zu einer
erhöhten Expression von Sphingosin-1-phosphat-Lyase, wodurch Sphingosin-1-
phosphat schneller und vermehrt abgebaut wird als in gesunder Haut (NISHIFUJI u.
YOON 2013). Da in atopischer Haut weniger Ceramide gebildet werden, ist auch der
Gehalt ihrer Abbauprodukte, der Sphingosine, reduziert (DRAKE et al. 2008).
Zwischen dem Sphingosin- und Ceramidgehalt sowie der reduzierten Ceramidase-
Aktivität konnte eine signifikante Korrelation nachgewiesen werden (ARIKAWA et al.
2002). Die Absenkung des Sphingosin-Spiegels um das Zweifache in atopischer
Epidermis hatte einen Zweihundertfachen Anstieg der Besiedlung mit St. aureus zur
Folge. Daher wurde postuliert, dass ein reduzierter Sphingosin-Spiegel zu einer
gestörten antimikrobiellen Aktivität der atopischen Epidermis beiträgt (ARIKAWA et
al. 2002).
Canine atopische Dermatitis
Die atopische Dermatitis gilt auch als eine häufige Erkrankung des Hundes
(NISHIFUJI u. YOON 2013) und scheint viele klinische und immunologische
Gemeinsamkeiten mit derjenigen des Menschen zu besitzen (MARSELLA u.
35

Literaturübersicht
SAMUELSON 2009). So ist auch die canine atopische Dermatitis durch eine gestörte
Barrierefunktion der Epidermis gekennzeichnet (OLIVRY 2011).
Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten unregelmäßige und lückenhafte
Lipidlamellen im SC klinisch unauffälliger Haut atopischer Hunde (INMAN et al. 2001;
PIEKUTOWSKA et al. 2008). Eine neuere Studie beschrieb die unvollständige
Exozytose der Keratinosomen in der Epidermis von atopischen Hunden anhand von
experimentell gegen Hausstaubmilben sensibilisierten Beagles (MARSELLA u.
SAMUELSON 2009). Manche der Keratinosomen verblieben innerhalb der Zellen
des SC auch in äußeren Lagen, ähnlich wie von FARTASCH et al. (1992) bei der
atopischen Dermatitis des Menschen beschrieben. Nach der Exposition zu
Allergenen konnte eine massive Abgabe des Inhalts von Keratinosomen in den
Interzellularspalt beobachtet werden, als ob die Epidermis versuchen wollte, die
Verletzung der Integrität der Hautbarriere zu kompensieren, indem sie mehr Lipide
für die Wiederherstellung der Barriere zur Verfügung stellt (MARSELLA u.
SAMUELSON 2009). Allerdings erfolgte die Lipidabgabe nicht in Form von
Lamellenstapeln, sondern als ungeordnetes Material, was die Bildung
unregelmäßiger und lückenhafter Lipidlamellen zur Folge hatte. Damit konnte die
Antwort als ineffektiv angesehen werden, um dem durch die Allergenexposition
verursachten Schaden in der Hautbarriere entgegenzuwirken (MARSELLA u.
SAMUELSON 2009).
Diese Strukturänderungen des SC bei Hunden mit atopischer Dermatitis stehen - wie
beim Menschen - in Zusammenhang mit einem erhöhten transepidermalen
Wasserverlust, der sich nach Allergenexposition weiter erhöht, wie an einem Modell
mit experimentell gegen Hausstaubmilben sensibilisierten Beagles nachgewiesen
werden konnte (HIGHTOWER et al. 2010). Durch eine Untersuchung betroffener und
klinisch unauffälliger Haut von atopischen Hunden konnte gezeigt werden, dass
diese erhöhten transepidermalen Wasserverluste mit einem Mangel an Ceramiden
korrelieren (SHIMADA et al. 2009). In dieser Studie waren die relativen Anteile an
CER[AS] und CER[NS] an den Gesamtlipiden sowohl in betroffener als auch in
klinisch unauffälliger Haut atopischer Hunde gegenüber gesunden Hunden erniedrigt,
36

Literaturübersicht
während keine Veränderungen der relativen Anteile von Cholesterol und freien
Fettsäuren gefunden wurden.
Wenige weitere Studien untersuchten die epidermalen Ceramide atopischer Hunde
im Vergleich zu gesunden Kontrollhunden, von denen eine Studie eine signifikante
Reduktion von zwei (CER[EOS] und CER[EOP]) von fünf beim Hund
nachgewiesenen Ceramidklassen in klinisch unauffälliger Haut atopischer Hunde
gegenüber gesunden Kontrollhunden, die rasse- und altersspezifisch passend zu
den atopischen Hunden ausgewählt worden waren, feststellte (REITER et al. 2009).
Im Gegensatz zu der vorher genannten Studie (SHIMADA et al. 2009) wurden hier in
atopischer Haut erhöhte prozentuale Anteile an Cholesterol gefunden, sodass das
Cholesterol-Ceramid-Verhältnis in atopischer Haut signifikant höher ausfiel als in der
Haut gesunder Hunde (REITER et al. 2009).
In einer aktuelleren Studie wurde über eine deutliche Anreicherung von
Glucosylceramiden in atopischer Hundehaut berichtet, die auch unter den Proteingebundenen
Lipiden auffiel (POPA et al. 2011b). Vor allem die Menge an Proteingebundenen
Ceramiden war stark erniedrigt. Da diese Ceramide hauptsächlich
CER[OS] und CER[OP] entsprechen (POPA et al. 2010), würde diese Beobachtung
zu einer Reduktion der verwandten freien Ceramidklassen CER[EOS] und
CER[EOP] passen (OLIVRY 2011).
Eine weitere Studie, die erstmals alle 11 der beim Menschen beschriebenen
Ceramidklassen in caniner Epidermis nachweisen konnte, berichtete über signifikant
niedrigere absolute Werte der Ceramide in betroffener und klinisch unauffälliger Haut
von Hunden mit atopischer Dermatitis verglichen mit gesunden Hunden, die in Bezug
auf Rasse und Alter passend zu den atopischen Hunden ausgewählt worden waren
(YOON et al. 2011). Unter den verschiedenen Ceramidklassen konnten signifikant
niedrigere Werte für CER[EOS], CER[NS+NdS], CER[EOP], CER[NP] und
CER[AS+NH] in atopischer Hundehaut gefunden werden. Zwischen betroffener und
klinisch unauffälliger Haut wurden innerhalb der Ceramidkonzentrationen jedoch
keinerlei signifikante Unterschiede nachgewiesen (YOON et al. 2011).
Zu ähnlichen Ergebnissen führte auch ein Versuch mit experimentell gegen
Hausstaubmilben sensibilisierten Hunden, von denen Hautproben vor und nach
37

Literaturübersicht
Allergenexposition entnommen wurden (STAHL et al. 2012). Sowohl in betroffener
als auch in klinisch unauffälliger Haut sanken die Konzentrationen an Ceramiden
inklusive aller gemessenen Ceramidklassen nach Allergenexposition im Vergleich zu
den Ausgangswerten ab, um zwei Monate später wieder zu den Ausgangswerten
zurückzukehren. Auch hier konnte kein Unterschied zwischen betroffener und
klinisch unauffälliger Haut festgestellt werden. Diese Beobachtung führte zu dem
Schluss, dass sich der reduzierte Ceramidgehalt und damit die gestörte
Barrierefunktion sekundär zur Entzündungsreaktion auf die Allergenexposition hin
entwickeln (STAHL et al. 2012).
Für diese Hypothese sprechen auch diejenigen Studien, die zeigen konnten, dass
die Supplementierung der fehlenden Lipide zu einer signifikant verbesserten
Barrierefunktion führt (PIEKUTOWSKA et al. 2008; POPA et al. 2011a; POPA et al.
2012). Sowohl die systemische Zufuhr essentieller Fettsäuren (POPA et al. 2011a)
als auch die topische Applikation einer aus Hautlipiden bestehenden Lotion scheinen
in der Lage zu sein, die Menge und Zusammensetzung der interzellulären SC-Lipide
(POPA et al. 2012) und damit auch die Struktur des SC (PIEKUTOWSKA et al. 2008)
atopischer Hunde zu verbessern. Auch aus immunologischer Sicht könnte die
Substitution essentieller Fettsäuren zur Linderung der atopischen Symptomatik beim
Hund beitragen (SCHLOTTER et al. 2010). Ein weiterer therapeutischer Ansatz
könnte die Substitution mit Sphingosin-1-phosphat darstellen, da dessen Spiegel in
der Haut von Hunden mit atopischer Dermatitis ähnlich wie in atopischer Haut des
Menschen nachweislich erniedrigt sind (BÄUMER et al. 2011). In einer Studie hierzu
konnte gezeigt werden, dass die topische Behandlung mit dieser Substanz die
Immunreaktion in einem Mäusemodell mit Kontaktdermatitis deutlich positiv
beeinflusst (REINES et al. 2009).
Weitere Hauterkrankungen des Hundes
Zu anderen Hauterkrankungen des Hundes gibt es bezüglich der epidermalen
Lipidzusammensetzung bisher nur vereinzelt Untersuchungen. In einer aktuellen
Studie wurden die Hautlipide von Shih Tzus mit Seborrhoe im Vergleich zu gesunden
Shih Tzus untersucht (YOON et al. 2013). In seborrhoeischer Haut wurden höhere
38

Literaturübersicht
relative Konzentrationen an Wachsestern und Triglyzeriden gefunden als in gesunder
Haut, während die der freien Fettsäuren und Ceramide in seborrhoeischer Haut
herabgesetzt waren. Die absoluten Mengen der Ceramide unterschieden sich nicht
zwischen den beiden Gruppen, jedoch wies das Ceramidmuster in seborrhoeischer
Haut spezifische Veränderungen auf (YOON et al. 2013). Die Konzentrationen von
CER[EOS], CER[EOP], CER[EOH] und CER[AS+NH] waren signifikant niedriger als
in gesunder Haut. Außerdem konnten in seborrhoeischem SC durch dünnschichtchromatographische
Auftrennung zwei unbekannte Banden zwischen den bekannten
Ceramid-Banden entdeckt werden, die zusammen ca. 20% der Gesamtceramide
ausmachten (YOON et al. 2013). Mittels Massenspektrometrie wurde zusätzlich
festgestellt, dass die Ceramidklassen CER[NdS], CER[NS], CER[AS], CER[NH] und
CER[AP] in seborrhoeischer Epidermis Subspezies mit Kettenlängen unter 40
Kohlenstoffatomen enthielten, die in gesunder Hundehaut nicht vorkamen. Da die
Kettenlänge die Polarität von Ceramiden beeinflussen kann, wurde die Vermutung
aufgestellt, dass es sich bei den zwei unbekannten Ceramidbanden um Ceramide
bekannter Klassen mit verkürzter Kettenlänge handeln könnte (YOON et al. 2013).
Ähnlich wie bei atopischer Dermatitis könnten die Veränderungen des Lipidmusters
der Epidermis von Hunden mit Seborrhoe zu einer strukturellen Veränderung des SC
und damit zu einer gestörten Barrierefunktion führen (YOON et al. 2013). Die Autorin
vermutet, dass das häufige Auftreten von Entzündungssymptomen und Juckreiz bei
Hunden mit Seborrhoe möglicherweise eine Reflexion dieser epidermalen
Veränderungen darstellt. Die sich oftmals entwickelnden Pyodermien könnten durch
ein Ungleichgewicht der Mikroflora auf der seborrhoeischen Haut ausgelöst und
durch eine beeinträchtigte Hautbarriere begünstigt werden. So konnten bei Hunden
mit Seborrhoe 50fach erhöhte Keimzahlen auf der Haut gegenüber gesunden
Hunden festgestellt werden, die mit einer Verschiebung von koagulase-negativen zu
den pathogeneren koagulase-positiven Staphylokokken einhergingen (IHRKE et al.
1978). Schon damals wurde vermutet, dass die bakterielle Überwucherung sowohl
durch quantitative als auch qualitative Unterschiede in der Talgproduktion der
seborrhoeischen Hunde begünstigt werden könnte (IHRKE et al. 1978).
39

Literaturübersicht
2.2 Lipidanalytik
2.2.1 Probenahmetechniken
Die Analyse der SC-Lipide, besonders der Ceramide, kann eine Herausforderung
sein, wobei die Gewinnung dieser Lipide aus der Haut den ersten wichtigen Schritt
zu einer erfolgreichen Analyse darstellt (RAITH et al. 2004). Zu diesem Zweck sind
verschiedene Techniken beschrieben worden, Methoden zur Gewinnung der
vollständigen Epidermis (Blister [Saugblasen-Methode], ex vivo Biopsie), der
oberflächlichen Epidermis (Klebestreifen- oder Cyanoacrylat-Abriss) oder des
oberflächlichen SC (Lösungsmittelextraktion) (DE PAEPE et al. 2004). Je nach Art
der Probenahmetechnik werden dementsprechend unterschiedliche Ergebnisse
erhalten (RAITH et al. 2004), sodass bei einem Vergleich mehrerer Studien die Art
der Probenahmetechnik berücksichtigt werden sollte (DE PAEPE et al. 2004).
Unter diesen Methoden haben minimal invasive Probenahmetechniken den Vorteil
dass sie mit weniger Beschwerden und weniger Risiken für die Probanden
verbunden sind und daher in vivo angewendet werden können (WANG u. MAIBACH
2011). Zwar werden auch invasivere Methoden an lebenden Individuen durchgeführt,
doch sind sie auch meist weniger praktikabel. So benötigen Blister-Techniken (durch
ein an einen Hohlkörper auf der Haut angelegtes Vakuum hebt sich die Epidermis als
Blase von der Dermis ab) z. B. mehr Zeit und können zu Hautschäden führen,
während Hautbiopsien aufwendiger und mit mehr Risiken, wie z. B. Infektionen,
verbunden sind (WANG u. MAIBACH 2011). Außerdem werden Biopsien oft nur
durch medizinisch notwendige chirurgische Eingriffe gewonnen, wodurch die
Auswahl an Körperstellen, die untersucht werden können, erheblich eingeschränkt
wird (YA-XIAN et al. 1999; DE PAEPE et al. 2004). Im Hinblick auf die Lipidanalytik
besteht bei der Entnahme der Hautbiopsien und deren weiterer Bearbeitung die
Möglichkeit der Kontamination durch Lipide tieferer Hautschichten bzw. des
subkutanen Fetts (JUNGERSTED et al. 2010a).
Zu den minimal invasiven Probenahmemethoden zählen zweifellos die Hautabriss-
Techniken (WANG u. MAIBACH 2011). Diese Methoden arbeiten mit Klebestreifen,
die auf die Haut gepresst und dann abgezogen werden. Da verschiedene
40

Literaturübersicht
Klebestreifen-Arten zum Einsatz kommen und kein einheitliches Protokoll existiert
(WANG u. MAIBACH 2011), ist auch hier Vorsicht geboten beim Vergleich
verschiedener Studien. Zumindest der Druck, mit dem das Tape auf die Haut
gepresst wird, kann z. B. mit Hilfe von Metallzylindern mit einem bestimmten Gewicht
standardisiert werden. BASHIR et al. (2001) untersuchten die Probenahme der Haut
mittels dreier verschiedener Klebestreifen-Arten an zwei verschiedenen Körperstellen
mit einer ansonsten standardisierten Methodik (Klebefläche, Druck, Zeit). Alle drei
Klebestreifen extrahierten ähnliche Mengen des SC, allerdings waren nur zwei
Sorten in der Lage, nach 40 Abrissen den transepidermalen Wasserverlust zu
erhöhen. Das dritte Tape erreichte auch nach 40 Anwendungen die hierfür nötige
Tiefe des SC nicht, sodass doch von Unterschieden in der abgelösten SC-Menge
zwischen verschiedenen Klebestreifen ausgegangen werden muss (BASHIR et al.
2001).
Ein Vorteil des Klebestreifenabrisses ist, dass das hiermit gewonnene Material mit
verschiedenen Methoden analysiert werden kann, je nachdem, was untersucht
werden soll (z. B. Lipide, Proteine, mRNA) (WANG u. MAIBACH 2011). Ein weiterer
Vorteil dieser Methode ist, dass mittels Klebestreifenabriss die Hornschichten Schritt
für Schritt entfernt werden können und so die Lipidzusammensetzung in
Abhängigkeit von der Hauttiefe untersucht werden kann (RAITH et al. 2004).
Allerdings liefert Tape-Stripping der Haut nur sehr kleine Lipidmengen pro Streifen
(DE PAEPE et al. 2004), was die weitere Analyse des gewonnenen Materials
erschweren kann. Außerdem kann die Co-Extraktion von Klebestreifenbestandteilen
die Ergebnisse verfälschen (CONTI et al. 1996; RAITH et al. 2004). In einer Studie
war es möglich, Kontaminationen durch das Klebeband durch die Extraktion der
Lipide mit Ethylacetat/Methanol 20:80 aus dem Klebestreifen zu minimieren
(WEERHEIM u. PONEC 2001). Anhand von Hautbiopsien wurde in dieser Studie
überprüft, dass die Ergebnisse dieser Lipidextraktion vergleichbar mit denen der
Lipidextraktion durch Chloroform und Methanol waren, welche der Standardmethode
nach BLIGH und DYER (1959) entspricht. Die Trennung der verbleibenden
Klebestreifenkomponenten im Lipidextrakt von den zu analysierenden SC-Lipiden
war durch eine Anpassung des Laufmittelsystems für die
41

Literaturübersicht
Dünnschichtchromatographie möglich (WEERHEIM u. PONEC 2001). Als Ergebnis
dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die oberen SC-Schichten der
menschlichen Haut hauptsächlich freie Fettsäuren enthielten, während in den
unteren SC-Schichten die Ceramide mit 60–70% die vorherrschende Lipidfraktion
darstellten. Das Ceramidprofil hingegen änderte sich nicht in Abhängigkeit von der
SC-Tiefe (WEERHEIM u. PONEC 2001).
Eine weitere Methode zur Untersuchung des SC ist der Cyanoacrylat-Abriss, welcher
ursprünglich in den 70er Jahren als sogenannte Hautoberflächenbiopsie entwickelt
wurde (RAITH et al. 2004). Bei dieser Probenahmetechnik wird das SC in einem
Schritt entfernt, und zwar inklusive der Talgdrüsen, sodass die Talglipide nicht von
den SC-Lipiden getrennt werden können (RAITH et al. 2004). Eine Validierung dieser
Methode für die Lipidanalytik wurde von JUNGERSTED et al. (2010a) durchgeführt,
indem die durch Cyanoacrylat-Abriss erhaltenen Ergebnisse mit denen durch
Hautgeschabsel gewonnenen verglichen wurden. Es wurden keine signifikanten
Unterschiede im Ceramid-Cholesterol-Verhältnis oder im Ceramidprofil zwischen den
beiden Probenahmetechniken gefunden. Außerdem war die intra-individuelle Varianz
bezüglich der Proben, die mit Cyanoacrylat-Abriss genommen wurden, signifikant
kleiner als die inter-individuelle Varianz (JUNGERSTED et al. 2010a), was auf eine
gute Reproduzierbarkeit dieser Probenahmetechnik hindeutet. Insgesamt betrachtet
sind die Hautabriss-Techniken einfach in der Durchführung, minimal invasiv, und
Kontaminationen mit Lipiden anderer Hautschichten können minimiert werden
(WANG u. MAIBACH 2011), allerdings erfordern die so gesammelten Proben eine
etwas aufwendigere weitere Bearbeitung zur Vorbereitung auf die Lipidanalytik.
Eine weitere wenig invasive Probenahmetechnik stellt die Oberflächenextraktion mit
organischen Lösungsmitteln dar, wobei die Zusammensetzung der gemessenen
Lipide stark von der Art des verwendeten Lösungsmittels abhängt (RAITH et al.
2004). Die klassische Methode zur Lipidextraktion in vitro stammt von BLIGH und
DYER (1959), sollte aber nicht in vivo angewendet werden, da die Mixtur aus
Chloroform und Methanol zu Hautnekrosen führt (LAVRIJSEN et al. 1994).
Mischungen aus Hexan und Alkoholen hingegen werden besser von der Haut
vertragen (MONTEIRO-RIVIERE et al. 2001; FARWANAH et al. 2002). LAVRIJSEN
42

Literaturübersicht
et al. (1994) validierten eine Lösungsmittelextraktion mit Aceton/Diethylether, indem
die in vitro-Extraktion mit Chloroform/Methanol und die in vivo-Extraktion mit
Hautgeschabseln verglichen wurden. Die Lipidmengen, die mit Aceton/Diethylether
extrahiert werden konnten, waren sowohl in vitro als auch in vivo deutlich geringer
als mit den anderen Techniken. Keine Unterschiede zwischen den
Extraktionsmethoden wurden im Ceramidprofil gefunden (LAVRIJSEN et al. 1994).
Dennoch hat sich diese Probenahmetechnik nicht durchgesetzt, da Diethylether
aufgrund seines hohen Dampfdrucks unpraktisch in der Anwendung ist (RAITH et al.
2004). Ein Nachteil der Probenahme mittels Lösungsmittelextraktion ist, dass sich
Informationen lediglich über die Lipide des oberen SC gewinnen lassen. Sollen
hingegen die Lipide der tieferen Schichten gewonnen werden, müssen die oberen
Schichten vor der Extraktion mittels Klebestreifenabriss oder Geschabsel entfernt
werden (RAITH et al. 2004). Ein Vorteil der Probenahme durch
Lösungsmittelextraktion liegt in der Möglichkeit zur direkten Analyse ohne
aufwendige vorherige Bearbeitung der Proben (JUNGERSTED et al. 2010a).
Als Probenahmetechnik zur Gewinnung großer SC-Mengen wurde der „Azerbaijani
scrub“ entwickelt, bei dem große Hautareale nach einem 30minütigen Wasserbad mit
einem rauen Handschuh abgeschrubbt werden (PASLIN u. KRUG 2006). Andere
Abrasionstechniken wurden als sogenannte „cup scrub“-Techniken ursprünglich zur
Untersuchung der Bakterienflora entwickelt (WANG u. MAIBACH 2011). Hierbei wird
ein Detergenz in einem Glaszylinder auf der Haut verrührt und die Lösung
anschließend auf einen Agar zur Anlegung einer Bakerienkultur aufgetragen
(WILLIAMSON u. KLIGMAN 1965). Modifizierte Methoden dieser Technik arbeiten
nur mit Kontakt des Detergenz zur Hautoberfläche (ähnlich wie die
Lösungsmittelextraktionen, s. o.), wodurch nur die oberflächlichen Bakterien
gewonnen werden. Bei einem Vergleich dieser modifizierten mit der „cup scrub“-
Technik fiel auf, dass sich mittels letzterer Methode mehr Hornzellen von der Haut
waschen ließen, sich hierdurch also auch zelluläres Material gewinnen ließ (WANG
u. MAIBACH 2011). Der Einsatz einer solchen Methode zur Lipidanalytik auch
tieferer SC-Schichten wäre denkbar. Beim Hund wurde eine vergleichbare Technik
43

Literaturübersicht
bereits erfolgreich zur Untersuchung der kutanen Bakterienflora eingesetzt, ohne
allzu große Zwangsmaßnahmen anwenden zu müssen (IHRKE et al. 1978).
Der Vergleich verschiedener SC-Tiefen kann auch durch die Anwendung
verschiedener Probenahmetechniken erfolgen. BLECK et al. (1999) verglichen die
prozentualen Anteile von Cholesterol, Ceramiden und freien Fettsäuren in durch
Cyanoacrylat-Abriss und durch Hautbiopsien gewonnenem SC. Während die Anteile
dieser Lipide in von Hautbiopsien isoliertem SC annähernd gleich waren, wurden in
den Cyanoacrylat-Abriss-Proben nur ca. 10% Cholesterol, 26% Ceramide und 64%
freie Fettsäuren gefunden. Dies stimmt mit den Ergebnissen einer anderen Studie
überein, in der oberflächliche SC-Lipide mit denen des äußeren und inneren SC
verglichen wurden (NORLEN et al. 1999). Auch hier wurden prozentual weniger freie
Fettsäuren in den tieferen Schichten des SC als oberflächlich gefunden. Die
verschiedenen SC-Tiefen wurden durch Modifikationen von
Lösungsmittelextraktionen gewonnen, indem für die oberflächlichen SC-Lipide die
unbehandelte Haut beprobt wurde, während diese Lipide für die tieferen Schichten
mit einem in Cyclohexan getränkten Wattebausch entfernt wurden. Um an die
inneren Schichten des SC zu gelangen, wurden die oberen Schichten vor der
Probenahme durch mehrere Klebestreifenabrisse entfernt (NORLEN et al. 1999).
Eine ähnliche Vorgehensweise wurde für den Hund beschrieben, um die
Zugehörigkeit der Hautlipide zum Talg und zum SC zu bestimmen (YOON et al.
2013). Zunächst wurde die Haut von Hunden mit in Aceton getränkter Watte beprobt,
um die oberflächlichen Hautlipide zu gewinnen. An derselben Stelle wurde die Haut
anschließend mit Klebestreifen abgerissen, um das SC an sich zu beproben. Zum
Vergleich wurden die in Talgdrüsen enthaltenen Lipide untersucht, die aus
Hautbiopsien isoliert wurden (YOON et al. 2013). Während die Talglipide zu mehr als
80% aus Triglyzeriden, Wachsestern und Cholesterylestern bestanden, enthielten die
SC-Proben zu über 60% Ceramide und nur geringe Anteile der zuvor genannten
Lipide. Die oberflächlichen Hautextrakte spiegelten eine Mischung dieser beiden
Kompartimente in ihrer Lipidzusammensetzung wider, wobei die Ceramide mit fast
40% noch immer den größten Anteil ausmachten (YOON et al. 2013).
44

Literaturübersicht
Die ersten Daten zur epidermalen Lipidzusammensetzung des Hundes stammen aus
Untersuchungen der abdominalen Hundehaut ex vivo (STAHL et al. 2009). Hierfür
wurde die Epidermis mittels Hitzeseparation von der Dermis getrennt, aus welcher
dann die Lipide extrahiert wurden. Als Einzellipidfraktionen wurden hauptsächlich
Cholesterol, Cholesterylester und freie Fettsäuren isoliert, aber auch mehrere
unbekannte Banden, die den Ceramiden zugeordnet werden könnten, sowie geringe
Mengen an Glucosylceramiden, Phospholipiden, Cholesterolsulfat und Triglyceriden
wurden gefunden (STAHL et al. 2009). Bis dato ist diese Studie die einzige, die die
Lipide der kompletten Epidermis des Hundes untersucht hat.
Die meisten anderen Studien zur Lipidanalytik der Hundehaut untersuchten
Veränderungen im Lipidprofil atopischer Hunde und legten den Fokus auf die
Ceramide (REITER et al. 2009; SHIMADA et al. 2009; POPA et al. 2011b; YOON et
al. 2011; STAHL et al. 2012). Da diese Studien an lebenden Hunden durchgeführt
wurden, wurden minimal invasive Methoden verwendet, die, wie oben beschrieben,
unterschiedlich tiefe Schichten des SC erreichten. Ein direkter Vergleich der
Ergebnisse dieser Studien untereinander ist also kaum möglich.
SHIMADA et al. (2009) beprobten die Hundehaut mittels Lösungsmittelextraktion
unter Verwendung von Aceton und Diethylether und maßen 59% Cholesterol, 31%
Ceramide und 10% freie Fettsäuren in gesunder sowie 64% Cholesterol, 25%
Ceramide und 11% freie Fettsäuren in atopischer Hundehaut. Allerdings wurden in
dieser Studie nur zwei Ceramidklassen insgesamt gemessen, wodurch der wahre
Ceramidgehalt in beiden Hauttypen als höher eingestuft werden sollte.
In einer methodischen Studie der Arbeitsgruppe POPA et al. (2010) wurde die
abdominale Haut gesunder Hunde durch Klebestreifenabriss beprobt. Das
gewonnene Material wurde durch n-Hexan/Isopranol 4:1 (v/v) von den Klebestreifen
abgelöst, wodurch Kontaminationen durch Klebestreifenkomponenten minimiert
werden konnten (POPA et al. 2010). Analysiert wurden die freien und Proteingebundenen
Ceramide, wobei unter den freien Ceramiden acht Unterklassen und
unter den Protein-gebundenen wie beim Menschen drei Klassen nachgewiesen
werden konnten. Zwischen Hunden unterschiedlicher Rassen wurden große
Unterschiede in der Ceramidzusammensetzung nachgewiesen (POPA et al. 2010).
45

Literaturübersicht
Die prozentualen Anteile der einzelnen Ceramidklassen an den Gesamtceramiden
verteilten sich im Schnitt wie folgt: 8% CER[EOS], 29% CER[NS], 4% CER[EOP],
15% CER[NP], Spuren von CER[EOH], 33% CER[AS], Spuren von CER[NH], 5%
CER[AP], 4% CER[AH].
Eine aktuellere Studie verwendete ebenfalls den Klebestreifenabriss als
Probenahmetechnik unter der Verwendung von n-Hexan zur SC-Ablösung von den
Klebestreifen (YOON et al. 2011). In gesunder Haut wurden im Mittel 20 µg
Ceramide/mg SC nachgewiesen, während die Haut atopischer Hunde nur ca. 11 µg
Ceramide/mg SC enthielt. Die absoluten Werte der einzelnen Ceramidklassen pro
mg SC betrugen im Median: 2,8 µg CER[EOS], 6,1 µg CER[NS+NdS], 0,8 µg
CER[EOP], 1,9 µg CER[NP], 1,8 µg CER[EOH], 4,5 µg CER[AS+NH], 0,7 µg
CER[AP], 1,5 µg CER[AH] (zum besseren Vergleich mit o. g. Studie prozentual
ausgedrückt: 14% CER[EOS], 30% CER[NS+NdS], 4% CER[EOP], 10% CER[NP],
9% CER[EOH], 22% CER[AS+NH], 4% CER[AP], 7% CER[AH]) (YOON et al. 2011).
Auch der Cyanoacrylat-Abriss wurde schon bei Hunden zur Gewinnung von SC-
Proben zur Ceramidanalytik eingesetzt (REITER et al. 2009; STAHL et al. 2012),
wobei diese Methode als wenig geeignet für die Extraktion der Protein-gebundenen
Ceramide angesehen wird (POPA et al. 2010). Die Studie von REITER et al. (2009)
ist schwierig mit anderen Studien zu vergleichen, da hier nur fünf Ceramidklassen
gemessen werden konnten und deren Konzentrationen als prozentualer Anteil aller
gemessener Ceramide plus Cholesterol ausgedrückt wurden. Der Vollständigkeit
halber seien sie hier für die gesunde Hundehaut dennoch erwähnt: 14% Cer1
(CER[EOS]), 30% Cer2 (CER[NS]), 5% Cer3 (CER[NP]), 11% Cer5 (CER[AS+NH]),
13% Cer9 (CER[EOP]), 27% Cholesterol. In der Studie von STAHL et al. (2012)
wurden experimentell sensibilisierte Hunde auf ihr Lipidprofil hin untersucht. Die
gemessenen Konzentrationen betrugen im Mittel pro cm² SC: 1,4 µg Phospholipide,
1,0 µg Cholesterolsulfat, 51,5 µg Ceramide, 85,1 µg Cholesterol, 15,6 µg freie
Fettsäuren, 10,5 µg Triglyzeride, 18,5 µg Cholesterylester sowie 8 µg Cer[EOS], 8 µg
CER[NS], 11 µg CER[EOP], 4 µg CER[NP], 2,5 µg CER[AS], 8 µg CER[AS+AP],
2,5 µg CER[AP], 7 µg CER[AH] (prozentual: 16% Cer[EOS], 16% CER[NS], 21%
CER[EOP], 8% CER[NP], 5% CER[AS], 16% CER[AS+AP], 5% CER[AP], 13%
46

Literaturübersicht
CER[AH]). Die Abweichungen des hier gemessenen Ceramidprofils im Vergleich zu
den vorher beschriebenen Studien sind wahrscheinlich dadurch erklärbar, dass hier
keine gesunden, sondern atopische Hunde untersucht wurden. Die
Probenahmetechnik könnte ebenfalls eine Rolle spielen, vor allem da in der Studie
von REITER et al. (2009) ebenfalls höhere Mengen an CER[EOP] gemessen wurden
als in den anderen Publikationen.
2.2.2 Chromatographische Verfahren
Unter den chromatographischen Methoden werden Dünnschicht-, Flüssig- und
Gaschromatographie unterschieden. Das Prinzip der chromatographischen Analyse
beruht auf der Auftrennung eines Stoffgemisches durch Wechselwirkungen zwischen
der stationären und der mobilen Phase. Bei allen Arten der Chromatographie wird
der Trennvorgang nach der Polarität der stationären Phase in
Normalphasentrennung (polare stationäre Phase) und Umkehrphasen(Reversed
phase)trennung (unpolare stationäre Phase) unterteilt. Da die SC-Lipide eine große
Bandbreite verschiedener Lipidklassen mit zahlreichen Subspecies unterschiedlicher
Kettenlängen enthalten, ist die Umkehrphasentrennung zur chromatographischen
Analyse von SC-Proben weniger geeignet, da die Kettenlänge der einzelnen
Moleküle hier einen starken Einfluss auf die Auftrennung hätte (RAITH et al. 2004).
Mittels Normalphasentrennung lassen sich die Lipidgemische nach Zugehörigkeit zu
ihren jeweiligen Klassen separieren (MYHER u. KUKSIS 1995), was vor allem im
Hinblick auf die Ceramide von Vorteil ist, da die Ceramidklassen nach Anzahl und
Position der enthaltenen Hydroxylgruppen aufgetrennt werden (RAITH et al. 2004).
Gaschromatographische Methoden werden in der epidermalen Lipidanalytik vor
allem zur näheren Charakterisierung der freien Fettsäuren bzw. nach Hydrolyse auch
der gebundenen Fettsäuren aus anderen Lipidklassen eingesetzt (WEERHEIM u.
PONEC 2001). Auf diese Weise können die Ceramide hinsichtlich ihrer
Sphingoidbasen und gebundenen Fettsäuren näher charakterisiert werden (MOTTA
47

Literaturübersicht
et al. 1993; YOSHIKAWA et al. 1994; ROGERS et al. 1996; RAITH et al. 2004;
POPA et al. 2010).
Die einfachste Methode zur chromatographischen Auftrennung eines SC-
Lipidgemisches stellt die Dünnschichtchromatographie dar (MYHER u. KUKSIS
1995). Diese Methode ist sehr robust und wird nicht so leicht durch co-extrahierte
Kontaminanten beeinträchtigt wie z. B. die Flüssigchromatographie (POOLE 1999;
RAITH et al. 2004). Weitere Vorteile liegen in der Möglichkeit der gleichzeitigen
Auftrennung mehrerer Proben und der Verfügbarkeit universeller
Nachweismethoden, wie z. B. das Färben der Platte mit einer Kupfersulfat- und
Phosphorsäure-haltigen Lösung und anschließendem Veraschen der Lipidbanden
bei großer Hitze (POOLE 1999; RAITH et al. 2004). Die Identifikation der
Lipidbanden in einer Probe erfolgt über die Zuordnung zu co-migrierten Standards.
Eine Quantifizierung der Probenlipide kann durch Standardkurven erfolgen, die durch
Messungen aufsteigender Konzentrationen der jeweiligen Standards berechnet
werden. Um Messfehler durch experimentelle Abweichungen zu reduzieren, sollten
Proben und Standards immer auf der gleichen Platte entwickelt werden (RAITH et al.
2004).
Da die stationäre Phase bei Normalphasentrennung polar ist, sollte die mobile Phase
eher unpolar sein. Auf diese Weise werden die Lipidklassen nach ihrer Polarität
aufgetrennt, indem polarere Lipide stärkere Wechselbindungen mit der stationären
Phase eingehen und daher weniger weit auf der Platte transportiert werden als
unpolarere Lipide (MYHER u. KUKSIS 1995). Die Zusammensetzung und
Laufstrecke der mobilen Phase muss sich also danach richten, welche Lipidklassen
analysiert werden sollen. Früher wurden die verschiedenen Lipidklassen meist
getrennt entwickelt (SCHMITZ et al. 1984), wofür die Lipidfraktionen oft mittels
Festphasenextraktion voneinander getrennt wurden, um bessere Ergebnisse zu
erhalten (MYHER u. KUKSIS 1995). MELNIK et al. (1989) entwickelten ein HPTLC-
System, mit dem alle Haupt-SC-Lipide auf einer Platte getrennt werden konnten.
Dafür wurde die Platte (20x10 cm) in drei aufeinanderfolgenden
Lösungsmittelsystemen entwickelt: 1) Methanol/Chloroform/Wasser 20:95:1 (v/v/v)
48

Literaturübersicht
über eine Länge von 6 cm, 2) n-Hexan/Diethylether/Eisessig 80:20:10 (v/v/v) über
eine Länge von 8,5 cm, 3) Petroleumbenzin über eine Länge von 10 cm. Mit dieser
Methode konnten allerdings nur vier Ceramidbanden identifiziert werden (MELNIK et
al. 1989). Durch die Methode von IMOKAWA et al. (1991) (2x
Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 [v/v/v]) konnten die Ceramide zwar sehr gut
in ihre Klassen aufgetrennt werden, jedoch war die Auftrennung der restlichen
Lipidfraktionen nicht zufriedenstellend. Diese Methode wurde ursprünglich von
WERTZ et al. (1985) zur Auftrennung der Ceramidklassen entwickelt und kam später
in vielen Entwicklungssystemen zum Einsatz (RAITH et al. 2004).
Ein wichtiger Schritt für die Dünnschichtchromatographie war die Entwicklung der
automatisierten Mehrfachentwicklung (AMD = automated multiple development),
wodurch manuelle experimentelle Einflüsse, wie die Auftragung der Proben, das
Mischen der mobilen Phase, die Entwicklung und Trocknung der Platten, minimiert
werden konnten (RAITH et al. 2004). Die erste AMD-HPTLC-Methode für Lipide war
in der Lage, alle SC-Lipidklassen auf einer Platte aufzutrennen, wobei die
Ceramidklassen allerdings sehr eng benachbart lagen (BONTE et al. 1995). Ein
modifiziertes AMD-HPTLC-Verfahren wurde von FARWANAH et al. (2002)
beschrieben, mit dem nicht nur alle Lipidfraktionen, sondern auch alle
Ceramidklassen des menschlichen SC auf einer Platte darstellbar waren.
BLECK et al. (1999) fanden durch den Vergleich zweier verschiedener HPTLC-
Entwicklungsverfahren (2x Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1,5 [v/v/v] versus
1x Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 [v/v/v] und anschließend
Diethylether/Hexan/Essigsäure 80:20:1,5 [v/v/v]) heraus, dass die
Entwicklungsprozedur einen Einfluss auf die Trennschärfe der Ceramidbanden hat.
Es kam zu signifikanten Unterschieden im erhaltenen Ceramidprofil gesunder Haut
zwischen den beiden Entwicklungsverfahren, mit signifikant höheren Werten für
CER[NS] und signifikant niedrigeren Werten für CER[EOS] und CER[AS] nach dem
zweiten Lösungsmittelsystem gegenüber dem ersten System (BLECK et al. 1999).
In den bisherigen Studien zur epidermalen Lipidanalyse des Hundes wurden recht
unterschiedliche Lösungsmittelsysteme zur HPTLC-Entwicklung eingesetzt. POPA et
al. (2011b) trennten die Lipidgemische vor der HPTLC-Analyse durch
49

Literaturübersicht
Festphasenextraktion mit Hilfe von Ammonium-Silica-Säulen auf. Anschließend
wurden die neutralen Lipide und freien Fettsäuren mittels
Hexan/Diethylether/Essigsäure 70:30:1 (v/v/v), die Ceramide mittels
Chloroform/Methanol 50:3 (v/v/v) und die Gluco- und Phospholipide mittels
Chloroform/Methanol/Wasser 65:25:4 (v/v/v) aufgetrennt. SHIMADA et al. (2009) und
YOON et al. (2011 und 2013) trennten die SC-Lipide jeweils mittels
Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 (v/v/v) auf. REITER et al. (2009) nutzten
dieses Lösungsmittelsystem innerhalb einer Dreifachentwicklung als zweite Stufe,
wobei Chloroform/Methanol/Wasser 40:10:1 (v/v/v) die erste und
Hexan/Ethylether/Essigsäure 70:30:1 (v/v/v) die dritte Stufe darstellten. Eine
Dreifachentwicklung wurde auch von STAHL et al. (2009 und 2012) durchgeführt: 1)
Chloroform/Ethanol/Essigsäure 80:18:2 (v/v/v), 2) Chloroform/Methanol/Essigsäure
91,4:4,3:4,3 (v/v/v) und 3) Hexan/Diethylether/Essigsäure 72,7:18,2:9,1 (v/v/v).
Auch flüssigchromatographische Verfahren wurden zur Analyse der SC-Lipide
beschrieben, bedürfen allerdings einer aufwendigeren Probenvorbereitung (POOLE
1999). Da die Säulen im Gegensatz zur Dünnschichtchromatographie wieder
verwendet werden, können in der Probe gelöste Kontaminanten die Analyse
empfindlich stören (POOLE 1999). Auch die Möglichkeiten zur Detektion sind
eingeschränkter als bei Dünnschichtchromatographie, sodass die Lipide entweder
vor der Analyse derivatisiert werden müssen oder die Empfindlichkeit oft nicht
ausreichend ist (RAITH et al. 2004).
Eine präparative Methode zur Auftrennung der einzelnen Ceramidklassen mittels
HPLC wurde von GILDENAST und LASCH (1997) beschrieben. Hierbei wurden die
Ceramide zunächst durch Flüssigchromatographie angereichert, indem sie von den
anderen Lipidfraktionen getrennt wurden. Dann wurden die einzelnen
Ceramidklassen durch HPLC aufgetrennt, welche wiederum mittels HPTLC
quantifiziert wurden. Durch die HPTLC-Entwicklung fiel auf, dass viele der HPLC-
Peaks mehr als eine Ceramidklasse enthielten und damit die HPLC-Auftrennung der
Ceramidklassen nicht ausreichend war (GILDENAST u. LASCH 1997). Eine bessere
Auftrennung der Ceramidklassen erreichten FARWANAH et al. (2003), indem
50

Literaturübersicht
Gradienten von Chloroform und Chloroform/n-Propanol/Essigsäure 80:20:2 (v/v/v)
benutzt wurden. Eine Detektion mittels Lichtstreuung war ausreichend sensitiv, wobei
die Kopplung des HPLC-Systems an ein Massenspektrometer bessere Ergebnisse
und zusätzlich mehr Informationen über die strukturellen Eigenschaften der
Ceramide lieferte (FARWANAH et al. 2003). Diese Kombination von
Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie ermöglichte die Identifizierung bis
dahin unbekannter Lipide und ist aus der heutigen Lipidanalytik nicht mehr
wegzudenken (RAITH et al. 2004).
2.2.3 Massenspektrometrie
Bei der Massenspektrometrie werden die Moleküle einer applizierten Probe nach
Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) aufgetrennt und graphisch auf einer Achse als
Intensitäts-Peaks dargestellt. Da kleine Moleküle, wie z. B. die meisten Lipide, nur
eine Elementarladung besitzen, bilden diese Moleküle Ionen, deren m/z-Wert ihrer
Masse entspricht. Durch das Filtern bestimmter Massen und wiederholte
Fragmentierungen lassen sich strukturelle Informationen über bestimmte Moleküle in
einer Probe gewinnen, wodurch die Identifizierung unbekannter Substanzen möglich
wird (RAITH et al. 2004). Dies beinhaltet auch die nähere Bestimmung von
unbekannten Banden in einem Chromatogramm, wenn z. B. keine Standards für
diese Lipidfraktionen verfügbar sind (MYHER u. KUKSIS 1995).
Da besonders die Ceramide des SC eine große Variabilität in ihrer
Zusammensetzung aufweisen, ist ihre massenspektrometrische Analyse oft eine
Herausforderung (RAITH et al. 2004). So können z. B. zwei Ceramidmoleküle, die zu
unterschiedlichen Ceramidklassen gehören, aufgrund der variablen Fettsäuren- und
Sphingoidkettenlängen dieselbe Masse haben (FARWANAH et al. 2005b). Ihre
Peaks würden sich also im Massenspektrum überlagern. Daher ist es sinnvoll, die
Ceramidklassen vor der massenspektrometrischen Analyse voneinander zu
separieren. Dies wird meist durch eine Flüssigchromatographie erreicht, an die ein
Massenspektrometer angeschlossen ist. Sowohl Normalphasentrennungen als auch
Umkehrphasentrennungen wurden für Ceramide beschrieben (VIETZKE et al. 2001;
51

Literaturübersicht
FARWANAH et al. 2007; FARWANAH et al. 2009; T'KINDT et al. 2011; VAN
SMEDEN et al. 2011).
Um genauere Informationen über die strukturelle Zusammensetzung der Ceramide
zu erhalten, sind Fragmentierungen nötig (FARWANAH et al. 2005b; VAN SMEDEN
et al. 2011). Hierbei können Produktionen aus dem positiven Ionenmodus Aufschluss
über die Kettenlänge der Sphingoidbase geben, während die Produktionen aus dem
negativen Modus Informationen über die Kettenlänge der amidgebundenen Fettsäure
liefern (MASUKAWA et al. 2008). Dadurch war es MASUKAWA et al. (2008) möglich,
alle Ceramidspecies des menschlichen SC zu charakterisieren. Alle theoretisch
möglichen Ceramidklassen außer CER[EOdS] wurden beschrieben, wobei
CER[AdS] erstmals beschrieben wurde. Insgesamt konnten 342 verschiedene
Ceramidspecies identifiziert werden (MASUKAWA et al. 2008). Ebenfalls durch
Massenspektrometrie konnte in einer aktuelleren Studie ein Hinweis auf CER[EOdS]
entdeckt werden (VAN SMEDEN et al. 2011), was die Bedeutung dieser Technik für
die Analytik der epidermalen Lipide unterstreicht. Eine Quantifizierung der Lipide ist
mit dieser Methode allerdings nicht ohne weiteres möglich (RAITH et al. 2004).
Für den Hund gibt es ebenfalls eine Studie, die durch eine Kombination aus
Normalphasen-Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie die 11 beim
Menschen bekannten Ceramidklassen im SC nachweisen konnte (YOON et al.
2011). Eine andere Studie nutzte die Massenspektrometrie im Zusammenhang mit
Dünnschichtchromatographie, um die Struktur des kovalent gebundenen CER[OS]
näher zu bestimmen (POPA et al. 2010). Hierfür wurde die entsprechende Bande
von der Dünnschichtplatte abgekratzt, zurückgelöst und diese Lösung dann
massenspektrometrisch analysiert. Das Fettsäuremuster des caninen CER[OS] war
fast identisch mit dem des humanen analogen Ceramids (POPA et al. 2010). Diese
Art der Kombination von Chromatographie und Massenspektrometrie ist nicht so weit
verbreitet, hat aber einige Vorteile, wie z. B. die moderaten Kosten oder die
Möglichkeit der zeitlichen oder räumlichen Trennung von Chromatographie und
Massenspektrometrie (WILSON 1999). Besonders geeignet scheint diese Methode
für Screening-Verfahren zu sein, da bei Dünnschichtchromatographie viele Proben
parallel laufen können und die Massenspekrometrie dann nur „bei Bedarf“ eingesetzt
52

Literaturübersicht
werden kann (WILSON 1999). Auf diese Weise können nicht nur unbekannte
Banden identifiziert, sondern auch Banden, zu denen kein Standard erhältlich ist, wie
z. B. bei einigen Ceramidklassen des SC, verifiziert werden (SOMSEN et al. 1995).
Letzteres kann besonders bei Änderungen des chromatographischen Verfahrens
(andere Platte, andere Lösungsmittel) notwendig werden.
53

Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte
AB SCIEX, Darmstadt
4000 QTrap ® Massenspektrometer
(kombiniertes Triple-Quadrupol / lineares Ionenfallen - Massenspektrometer)
Agilent, Waldbronn
Duale Pumpe eines 1200 Series LC Systems
B.Braun, Melsungen
Glashomogenisator Potter ®
Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
Transferpette ® Typ Fix
Braun GmbH, Kronberg/Taunus
Fön Silencio 1600
CAMAG Chemie-Erzeugnisse & Adsorptionstechnik AG & Co. GmbH, Berlin
- Entwicklungskammer aus Glas mit Glasdeckel (Nr. 022.5250)
- TLC-MS Interface
Eppendorf AG, Hamburg
- Einkanalpipette Research ® variabel 2-20 µl
- Einkanalpipette Research ® variabel 20-200 µl
- Einkanalpipette Research ® variabel 100-1000 µl
- Vakuumzentrifuge Concentrator Plus
54

Material und Methoden
Gerlinde Kisker, Mühlhausen
Rotations-Mischer
H. Hauptner und Richard Herberholz GmbH & Co. KG, Solingen
Anatomische Pinzette
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz (Schweiz)
Mikroliterspritze 701 N
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Reagenzglasschüttler Reax Top
Hewlett-Packard Company, PaloAlto (Kalifornien, USA)
Scanner Scanjet G3010
Kendro, Osterode
Zentrifuge Varifuge ® 3.0R
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach
Ofen Modell 600
Snijders Scientific B.V., Tilburg (Niederlande)
Heizplatte mit magnetischem Rührwerk
3.1.2 Chemikalien und Lösungsmittel
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
- Essigsäure 100%, Rotipuran ® 100%
- Ethanol absolut Rotisolv ® HPLC Gradient Grade, ≥99,9%
- Methanol Rotisolv ® HPLC, ≥99,9%
- n-Hexan Rotisolv ® HPLC, ≥98%
55

Material und Methoden
- Trichlormethan/Chloroform Rotisolv ® HPLC, ≥99,9%
Evonik Industries AG, Essen
- Ceramid I (CER[EOS])
- Ceramid III (CER[NP])
- Ceramid VI (CER[AP])
Fluka Chemie AG, Buchs (Schweiz)
- Cholesterol
- Cholesteryl-Stearat
Merck KgaA, Darmstadt
Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat EMSURE ® ACS
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
- Ceramid mit α-hydroxylierter Fettsäure, aus Rinderhirn, ≥99% (CER[AS])
- Ceramid mit nicht-hydroxylierter Fettsäure, aus Rinderhirn, ≥99% (CER[NS])
- Cholesterolsulfat (sodium cholesteryl sulfate)
- Diethylether ≥99,8%
- Galactocerebroside aus Rinderhirn ≥97% (TLC)
- Triolein (Glyceryl-Trioleat) ≥97% (TLC)
- Ölsäure
- Phosphatidylcholin (L-α-) aus Rinderhirn, Type XVI-E, ≥99% (TLC)
- Phosphatidylethanolamin (3-sn-) aus Rinderhirn, Type I, ≥98% (TLC)
- Phosphorsäure 85%
3.1.3 Verbrauchsmaterial und sonstige Materialien
Aesculap AG, Tuttlingen
Skalpellklinge B.Braun 10
56

Material und Methoden
B.Braun, Melsungen
Pottergefäße 5 ml mit Glaskolben
DURAN Group GmbH, Mainz
Reagenzgläser mit Schraubdeckel
kai Europe GmbH, Solingen
Biopsiestanzen 8.0 mm BP-80F
Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren
Spritzenfilter Chromafil ® AO-4513
Merck KGaA, Darmstadt
HPTLC Kieselgel-60-Platten 20x10 cm
Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht
- Reagiergefäße 1,5 ml
- Reagiergefäße 2,0 ml
- Pipettenspitzen gelb 200 µl
- Pipettenspitzen blau 1000 µl
3.2 Studiendesign
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden jeweils drei Stanzbiopsien, drei Hautgeschabsel
und drei „skin scrubs“ von der Inguinalregion sowie der Kruppe von fünf toten
Hunden genommen. Die Lipide der Proben wurden extrahiert und mittels
Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Die Analyse der resultierenden Banden
erfolgte mittels Densitometrie. Die Ceramidbanden wurden zusätzlich durch Tandem-
Massenspektrometrie untersucht, um die Identifikation der Banden über co-migrierte
Standards zu bestätigen. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Ceramidbanden
wurden vier Ceramidklassen zusätzlich mit anderen Standards als dem
57

Material und Methoden
entsprechenden gemessen und die Resultate mit dem Ergebnis, das durch die
Messung mit dem Ceramid-spezifischen Standard erhalten wurde, verglichen. Die
gemessenen Lipidfraktionen und Ceramidklassen wurden sowohl zwischen den
untersuchten Körperregionen als auch zwischen den verwendeten
Probenahmetechniken verglichen. Außerdem wurden die Probenahmetechniken
anhand der jeweils dreifachen Probenahme auf ihre Reproduzierbarkeit hin
überprüft.
Für den zweiten Teil der Studie wurden zunächst acht Körperregionen (Innenfläche
der Pinna, Lefze, palmarer Metakarpus, axillar, lateraler Thorax, laterales Abdomen,
inguinal und Kruppe) von acht toten Hunden mittels „skin scrub“ beprobt.
Lipidextraktion, -auftrennung und -messung wurden auf dieselbe Art und Weise wie
im ersten Teil der Arbeit durchgeführt. Die resultierenden Werte der Lipidfraktionen
und Ceramidklassen wurden zwischen den Körperregionen verglichen.
Hierauf aufbauend wurden Proben von lebenden Hunden mit atopischer Dermatitis
und ausgewählten weiteren Hauterkrankungen (Kontaktdermatitis,
Flohspeicheldermatitis, Sebadenitis) mittels „skin scrub“ gewonnen. Es wurde jeweils
eine betroffene und eine klinisch unauffällige Körperpartie beprobt. Die Bearbeitung
und Analyse der Proben erfolgte auf demselben Weg wie zuvor. Die gemessenen
Lipidfraktionen und Ceramidklassen wurden zwischen den betroffenen und klinisch
unauffälligen Körperpartien der Hunde mit Hauterkrankungen sowie den jeweils
passenden Lokalisationen der acht toten Kontrollhunde verglichen.
Das Vorhaben wurde dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und
Ernährungssicherheit im Voraus angezeigt (Registrier-Nr. 09A665).
58

Material und Methoden
3.3 Methodik
3.3.1 Tiere
Die insgesamt dreizehn toten Hunde aus Teil 1 und 2 dieser Studie waren Patienten
der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und sind aus
verschiedenen Gründen euthanasiert worden, von denen keiner mit dieser Studie in
Zusammenhang stand (Tab. A1 + B1, Anhang). Die Besitzer gaben ihre Einwilligung,
die Körper der Tiere für Forschungszwecke verwenden zu dürfen. Die Hunde
gehörten unterschiedlichen Rassen und Altersgruppen (Teil 1: Median 11,4 Jahre
[4,0 – 14,7 Jahre]; Teil 2: Median 12,3 Jahre [4,2 – 13,3 Jahre]) an (Tab. A1 + B1,
Anhang). Die Haut aller Hunde war makroskopisch unauffällig, keiner der Hunde
zeigte Anzeichen für Hauterkrankungen in seiner Krankengeschichte oder wurde
zuvor mit Medikamenten behandelt, die die Zusammensetzung der Haut beeinflusst
haben könnten (insbesondere Kortikosteroide und lokale Therapeutika aller Art).
Hunde mit Endokrinopathien oder Leberwertveränderungen wurden von der Studie
ausgeschlossen. Die histologische Unversehrtheit der Haut dieser Hunde wurde
durch pathohistologische Untersuchungen zusätzlich entnommener Stanzbiopsien
bestätigt, die von Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein im Institut für Pathologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt wurden.
Die lebenden Hunde aus dem zweiten Teil der Studie waren ebenfalls Patienten der
Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die
Patientenbesitzer wurden ausführlich über die Methodik der Studie und die damit ggf.
verbundenen Risiken informiert. Eine Teilnahme der Hunde an der Studie erfolgte
ausschließlich nach schriftlicher Erlaubnis durch ihre Besitzer.
Zwölf Hunde mit atopischer Dermatitis, die verschiedenen Rassen und Altersgruppen
(Median 3,6 Jahre [1,0 – 10,5 Jahre]) angehörten (Tab. C1, Anhang), wurden
beprobt. Die Diagnose „canine atopische Dermatitis“ wurde anhand einer passenden
Anamnese und der diagnostischen Kriterien nach FAVROT et al. (2010) gestellt,
nachdem alle anderen in Frage kommenden Erkrankungen mittels der üblichen
diagnostischen Tests ausgeschlossen worden waren. Jeder Hund hatte sich einer
59

Material und Methoden
Eliminationsdiät über mindestens acht Wochen zu unterziehen. Schließlich
beinhalteten die 12 atopischen Hunde vier Hunde mit ausschließlich Futtermittelinduzierter,
vier Hunde mit teilweise Futtermittel-induzierter und vier Hunde mit
atopischer Dermatitis, bei der Futtermittel keine Rolle spielten.
Zusätzlich zu den 12 atopischen Hunden nahmen noch vier weitere Hunde mit
anderen Hauterkrankungen an der Studie teil. Dies waren ein 4,6 Jahre alter Chow-
Chow mit pathohistologisch bestätigter Sebadenitis, ein 8,9 Jahre alter
Pudelmischling mit Kontaktdermatitis sowie ein neun-jähriger Kleiner Münsterländer
und ein 1,5 Jahre alter Landseer mit Flohspeicheldermatitis (Tab. C1, Anhang).
Letztere wurde anhand der klinischen Symptome, des Findens von Flöhen oder
Flohkot im Fell des Hundes und des vollständigen Verschwindens von Symptomen
nach erfolgreicher Ektoparasitenbehandlung ohne zusätzliche Behandlungen
diagnostiziert.
Bei allen Hunden mit Hauterkrankungen mussten Behandlungen mit
antiinflammatorischen Medikamenten mindestens acht Wochen, solche mit
Shampoos mindestens eine Woche vor der Probenahme abgesetzt werden. Eine
Ausnahme bildete der Landseer mit Flohspeicheldermatitis, der vier Wochen vor der
Probenahme eine Injektion eines Depot-Kortikosteroids (Art und Dosierung
unbekannt) bekam. Dies wurde erst nach der Probenahme bekannt, die Probenahme
wurde vier Wochen später noch einmal wiederholt.
3.3.2 Probenahme und -bearbeitung
Von den toten Hunden wurden alle Proben innerhalb von drei Stunden post mortem
genommen. Um Kontaminationen mit Haaren zu vermeiden, wurden alle
Körperpartien vor der Probenahme vorsichtig geschoren.
Die Stanzbiopsien hatten einen Durchmesser von 8 mm und wurden direkt nach der
Entnahme vorsichtig von subkutanem Fett befreit. Die Gewinnung der Epidermis
erfolgte durch Hitzeseparation, wie zuvor von KLIGMAN u. CHRISTOPHERS (1963)
beschrieben und nach STAHL et al. (2009) modifiziert. Die Hautbiopsien wurden mit
der Epidermis nach unten auf eine Heizplatte gelegt und für 2 min bei 60°C erhitzt.
60

Material und Methoden
Anschließend wurde die Epidermis vorsichtig mit einer Pinzette von der Dermis
abgetrennt.
Die Hautgeschabsel wurden mittels einer Skalpellklinge gewonnen. Hierfür wurde
jeweils auf einem Hautareal von ca. 10x18 mm 30mal hintereinander geschabt.
Der „skin scrub“ ist eine Methode der Lösungsmittelextraktion, die mit Reibung
kombiniert wird (Abb. 2). Diese Technik wurde von einer Prozedur zur Gewinnung
der kutanen Bakterienflora beim Menschen adaptiert (WILLIAMSON u. KLIGMAN
1965), die zu diesem Zweck auch schon bei Hunden erfolgreich eingesetzt worden
ist (IHRKE et al. 1978; IHRKE et al. 1979). Ein in der Werkstatt des Instituts für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover angefertigter Metallzylinder von ca. 21 mm innerem Durchmesser wurde
auf der Haut platziert. In diesen wurde ein Milliliter eines organischen Lösungsmittels
(n-Hexan/Ethanol 2:1, v/v) eingefüllt und mit einem angerauten Glasstab mit leichtem
Druck für 30 sec auf der Haut verrührt. Anschließend wurde die Lösung in ein
Reagenzglas mit Schraubverschluss überführt. Diese Prozedur wurde für jede Probe
zweimal hintereinander durchführt. Unabhängig von der Gewinnungstechnik wurden
alle Proben direkt nach der Probenahme bei -80°C tiefgefroren.
Abb. 2: Probenahme mittels „skin scrub“-Technik bei
einem Dalmatiner mit atopischer Dermatitis,
gezeigt an der unauffälligen Haut am lateralen
Thorax.
61

Material und Methoden
3.3.3 Lipidextraktion
Die Lipide wurden nach der Methode, wie sie von BLIGH und DYER (1959)
beschrieben worden ist, extrahiert. Hierzu wurden die „skin scrubs“ zunächst in einer
Vakuumzentrifuge bei 60°C eingeengt. Die Epidermisproben und Hautgeschabsel
wurden in Pottergefäße überführt. Zu allen Proben wurden 0,8 ml Reinstwasser
hinzugefügt. Anschließend wurden die Proben mittels eines Glashomogenisators
eine Minute lang zerkleinert. Nach der Zugabe von 2 ml Methanol wurden die Proben
zwei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Eine erneute Homogenisierung
über eine Minute erfolgte nach Zugabe von 1 ml Chloroform. Da die „skin scrubs“
manuell homogenisiert wurden, wurden diese Proben zusätzlich für 30 sec mittels
eines Reagenzglasschüttlers gemischt. Die Epidermis- und Geschabsel-Proben
wurden in Reagenzgläser mit Schraubverschluss überführt. Anschließend wurden
alle Proben in einen Rotations-Mischer gestellt und für 30 min auf Stufe 8 durch
Rotation gemischt. Um Schwebstoffe und gröbere Bestandteile aus dem
Homogenisat zu entfernen, wurden die Proben nach der Mischung für 5 min bei 3000
rpm und 7°C zentrifugiert. Der Überstand wurde jeweils in ein neues Reagenzglas
überführt, das Pellet wurde verworfen. Zum Überstand wurden jeweils 1 ml
Chloroform und 1 ml Reinstwasser zugegeben, anschließend wurden die Proben
kurz geschüttelt und bei 7°C und 3000 rpm für 10 min zentrifugiert, um eine
Phasentrennung in eine wässrige und eine organische Phase herbeizuführen. Die
obere wässrige Phase wurde vorsichtig abpipettiert und verworfen. Die Proben
bestanden nun aus der verbleibenden organischen Phase und wurden bei 60°C in
einer Vakuumzentrifuge eingeengt. In einem letzten Schritt der Lipidextraktion
wurden die Proben in 1 ml Chloroform/Methanol 1:1 (v/v) gelöst, die Proben im
ersten Teil der Arbeit durch einen Spritzenfilter gefiltert, und in Reagiergefäße
überführt. Nach erneuter Einengung wurden die Proben bis zur weiteren
Verwendung bei -20°C gelagert.
62

Material und Methoden
3.3.4 Standards
Zur Identifikation der aufgetrennten Lipidbanden wurden die folgenden Standards
verwendet: Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Cholesterolsulfat,
Galactocerebroside, Ceramid mit α-hydroxilierter Fettsäure (CER[AS]), Ceramid mit
nicht-hydroxilierter Fettsäure (CER[NS]), Ceramid I (CER[EOS]), Ceramid III
(CER[NP]) und Ceramid VI (CER[AP]), Ölsäure, Triolein, Cholesterol und
Cholesteryl-Stearat. Von allen Standards wurden Standardkurven mit zehn
aufsteigenden Konzentrationen von 10 – 300 µg/ml bestimmt. Die Standardkurven
verliefen jeweils nicht linear, sondern folgten einer Michaelis-Menten-Gleichung, wie
schon zuvor beschrieben (GILDENAST u. LASCH 1997; RAITH et al. 2004). Daher
wurden Standardgemische in sechs aufsteigenden Konzentrationen hergestellt.
Diese sechs Standardgemische wurden immer zusammen mit den Proben auf die
Kieselgelplatten aufgetragen, um anhand der Wertekurven die jeweiligen
Lipidbanden quantifizieren zu können.
3.3.5 Dünnschichtchromatographie (HPTLC)
Um möglichst alle relevanten Lipidfraktionen auf einer Platte aufzutrennen, wurde die
Methode nach STAHL et al. (2009) modifiziert.
Zunächst wurden die HPTLC-Platten zur Vorwäsche in eine Glaskammer mit 100 ml
Chloroform/Methanol 1:1 (v/v) gestellt, bis das Lösungsmittel die Platten komplett
durchzogen hatte, und nach Trocknung in einem Ofen bei 110°C aktiviert. Die
Proben wurden in jeweils 200 µl (Epidermis- und Geschabsel-Proben) bzw. 500 µl
(„skin scrubs“) Chloroform/Methanol 1:1 (v/v) gelöst. Jeweils 10, 5 und 3 µl der
Proben sowie je 10 µl der Standardgemische wurden mit 1 cm Abstand zueinander
sowie zum unteren Plattenrand mittels einer Mikroliterspritze unter Heißluft
punktförmig aufgetragen. Die Lipide in den Proben wurden nacheinander in vier
verschiedenen Entwicklungskammern aufgetrennt, die mit jeweils 50 ml der
folgenden Lösungsmitteln gefüllt waren: 1) Chloroform/Methanol/Essigsäure 80:18:2
(v/v/v) über eine Strecke von 4 cm, 2) Chloroform/Methanol/Essigsäure 91,4:4,3:4,3
(v/v/v) über eine Strecke von 8 cm, 3) n-Hexan/Diethylether/Essigsäure 72,7:18,2:9,1
(v/v/v) über eine Strecke von 9,5 cm, 4) n-Hexan über eine Strecke von 10 cm. Vor
63

Material und Methoden
dem Wechsel in die nächste Kammer wurden die Platten für jeweils ca. 30 sec unter
einem Heißluftstrom getrocknet. Um die aufgetrennten Lipidbanden sichtbar zu
machen, wurden die trockenen Platten für 5 sec in eine wässrige Kupfersulfat-
Lösung (75 g/l) mit 8,5% Phosphorsäure getaucht und anschließend in einem Ofen
bei 170°C für 15 min verascht.
3.3.6 Densitometrie und Quantifizierung
Die Platten wurden mit einem Flachbettscanner digitalisiert und mittels des Software-
Programms ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij) densitometrisch ausgewertet. Die
verschiedenen Lipidfraktionen der Proben (Phospholipide [PL], Phosphoethanolamin
[PE], Cholesterolsulfat [ChSO4], Glucosylceramide [GlcCer], Ceramide [Cer],
Cholesterin [Chol], freie Fettsäuren [FFA], Triglyzeride [TG] und Cholesterylester
[ChE]) wurden sowohl anhand der co-migrierten Standards als auch anhand ihrer
Retardationsfaktoren identifiziert. Die Quantifizierung erfolgte durch die Berechnung
der jeweiligen Standardkurven, welche für jede Platte anhand der aufgetragenen
sechs Standardgemische neu berechnet wurden, um Messfehler aufgrund der
manuellen Methodik zu vermeiden. Für die einzelnen Ceramidfraktionen dienten die
folgenden Standards zur Quantifizierung: der Standard von CER[AP] für die Banden
von CER[AH] und CER[AP], der Standard von CER[AS] für die Bande von
CER[AS+NH], der Standard von CER[NP] für die Bande von CER[NP], der Standard
von CER[NS] für die Bande von CER[NS], der Standard von CER[EOS] für die
Banden von CER[EOH], CER[EOP] und CER[EOS]. Alle gemessenen Werte wurden
in µg Lipid / cm² beprobter Hautfläche umgerechnet. Für alle weiteren Berechnungen
wurde der Median der Dreifachmessungen bestimmt. Die Gesamtlipidmenge der
Proben berechnete sich aus der Summe aller gemessenen Lipidfraktionen, der
Gesamtceramidgehalt aus der Summe aller gemessenen Ceramidklassen. Um die
Lipid- und Ceramidprofile zwischen den verschiedenen Probenahmetechniken
vergleichen zu können, wurden die Prozentualwerte der einzelnen Lipidfraktionen
basierend auf der Gesamtlipidmenge sowie die Prozentualwerte der Ceramidklassen
basierend auf dem Gesamtceramidgehalt bestimmt. Zur Beantwortung der Frage
hinsichtlich des Einflusses des Gebrauchs verschiedener Ceramid-Standards zur
64

Material und Methoden
Quantifizierung der Ceramidbanden auf die resultierende Ceramidzusammensetzung
wurden die Banden von CER[AP], CER[AS+NH], CER[NP] sowie CER[NS] von 12
Proben (auf drei Platten) mit jedem der entsprechenden Standards gemessen und
die Ergebnisse miteinander verglichen.
3.3.7 Identifizierung der Ceramidbanden mittels Massenspektrometrie (MS)
Im ersten Teil der Studie wurde die Zuordnung der Ceramidklassen zu den
entsprechenden, durch die dünnschichtchromatographische Auftrennung
entstandenen Banden mittels Elektrospray-Ionisations-Tandem-
Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) verifiziert. Diese Untersuchungen wurden durch
Dr. Susanne Brodesser in der Einrichtung für Lipidanalytik des Instituts für
Medizinsche Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Uniklinik Köln, durchgeführt.
Hierfür wurde ein TLC-MS Interface benutzt, das an eine duale Pumpe und ein 4000
QTrap ® Massenspekrometer angeschlossen war.
Die Ceramidbanden einer Standardlösung und einer Probe wurden mittels einer
Lösung aus Chloroform und Methanol 1:1 (v/v) mit 5 mM Ammoniumazetat bei einer
Flussrate von 0,1 ml/min extrahiert. Anhand von Produkt- und Vorläufer-Ionen-
Analysen wurden die Ceramidklassen massenspektrometrisch identifiziert, indem als
Vorläufer-Ionen diejenigen gewählt wurden, die nach kollisionsinduzierter Abspaltung
(collision induced dissociation [CID]) die charakteristischen Ceramid-Fragmentionen
mit Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) 264 und 282 (Ceramide mit Sphingosin oder
Phytosphingosin als Sphingoidbase) oder m/z 280 und 298 (Ceramide mit 6-
Hydroxysphingosin als Sphingoidbase) produzieren. Die Geräte-Einstellungen
wurden wie folgt vorgenommen: Zerstäubergas (Gas 1) 50 psi, Heizergas (Gas 2) 55
psi, Trocknungsgas 20 psi und Kollisionsgas medium. Der Interface-Heizer war
eingeschaltet, für die Turbo V TM - Ionenquelle wurden eine Temperatur von 350°C
und eine Ionen-Spray-Spannung von 5,5 kV eingestellt. Für alle Vorläufer- und
Produkt-Ionen-Scans wurden die Werte für Declustering Potential (DP),
Eintrittsspannung (entrance potential [EP]) und Kollisionszellenausgangsspannung
(collision cell exit potential [CXP]) mit jeweils 80 V, 10 V und 10 V gewählt. Die
Kollisionsenergie schwankte zwischen 35 und 55 V.
65

Material und Methoden
Die resultierenden Massenspektren wurden auf ihre Übereinstimmung mit
berechneten Massen der Ceramide hin überprüft, wofür die Massen von theoretisch
möglichen Fettsäuren mit denen der jeweiligen C18-Sphingoidbasen addiert wurden
(Tab. 1).
Tab. 1: Berechnete Massen theoretisch möglicher Ceramide.
C-Kette
CER[NS] CER[NP] CER[NH] CER[AS] CER[AP] CER[AH]
FS
CER[EOS]
CER[EOP]
CER[EOH]
14 511 529 527 527 545 543 18:2 18:1 18:0 18:2 18:1 18:0 18:2 18:1 18:0
15 525 543 541 541 559 557 803 805 807 821 823 825 819 821 823
16 539 557 555 555 573 571 817 819 821 835 837 839 833 835 837
17 553 571 569 569 587 585 831 833 835 849 851 853 847 849 851
18 567 585 583 583 601 599 845 847 849 863 865 867 861 863 865
19 581 599 597 597 615 613 859 861 863 877 879 881 875 877 879
20 595 613 611 611 629 627 873 875 877 891 893 895 889 891 893
21 609 627 625 625 643 641 887 889 891 905 907 909 903 905 907
22 623 641 639 639 657 655 901 903 905 919 921 923 917 919 921
23 637 655 653 653 671 669 915 917 919 933 935 937 931 933 935
24 651 669 667 667 685 683 929 931 933 947 949 951 945 947 949
25 665 683 681 681 699 697 943 945 947 961 963 965 959 961 963
26 679 697 695 695 713 711 957 959 961 975 977 979 973 975 977
27 693 711 709 709 727 725 971 973 975 989 991 993 987 989 991
28 707 725 723 723 741 739 985 987 989 1003 1005 1007 1001 1003 1005
29 721 739 737 737 755 753 999 1001 1003 1017 1019 1021 1015 1017 1019
30 735 753 751 751 769 767 1013 1015 1017 1031 1033 1035 1029 1031 1033
31 749 767 765 765 783 781 1027 1029 1031 1045 1047 1049 1043 1045 1047
32 763 781 779 779 797 795 1041 1043 1045 1059 1061 1063 1057 1059 1061
33 777 795 793 793 811 809 1055 1057 1059 1073 1075 1077 1071 1073 1075
34 791 809 807 807 825 823 1069 1071 1073 1087 1089 1091 1085 1087 1089
35 805 823 821 821 839 837 1083 1085 1087 1101 1103 1105 1099 1101 1103
36 819 837 835 835 853 851 1097 1099 1101 1115 1117 1119 1113 1115 1117
Kettenlänge der Sphingoidbase wurde als C18 vorausgesetzt. Für die langkettigen, veresterten ω-
Hydroxyceramide sind die Varianten im Fall von Linolsäure-verestert (18:2), Ölsäure-verestert (18:1)
und Stearinsäure-verestert (18:0) aufgeführt. C, Kohlenstoff; FS, Fettsäure.
3.3.8 Statistische Auswertung
Im ersten Teil der Studie wurden die Werte der Gesamtlipide sowie der einzelnen
Lipidfraktionen und Ceramidklassen zwischen den verschiedenen
Probenahmetechniken und Körperregionen verglichen. Da der Einfluss der
wiederholten Probenahme an jeder der zwei Körperstellen mit jeder Technik als
zufällig angesehen werden kann, wurden von diesen Werten jeweils die Mittelwerte
gebildet.
Auf Normalverteilung der Modell-Residuen wurde jeweils mit dem Kolmogorov-
Smirnov-Test sowie graphisch mittels Q-Q-Plots getestet. Die Werte derjenigen
66

Material und Methoden
Parameter, die eine rechts-schiefe Verteilung zeigten, wurden für die weitere
Auswertung logarithmiert. Um eine graphische Darstellung dieser Werte zu
ermöglichen, erfolgte eine Potenzierung der logarithmierten Werte zurück zu den
Originalwerten.
Im Fall von normal-verteilten Werten (Gesamtlipide; prozentuale Werte von PE, Cer
und Chol) wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit
Messwiederholung durchgeführt. Ebenso wurde bei log-normal-verteilten Daten
(prozentuale Werte von PL, ChSO4, FFA, TG und ChE sowie CER[AS+NH],
CER[EOH], CER[EOP], CER[NS] und CER[EOS]) verfahren. Post hoc-Tests in Form
von multiplen paarweisen Vergleichen wurden im Fall von signifikanten Ergebnissen
des globalen Tests durchgeführt. Eine Alpha-Adjustierung führte nur selten zu
signifikanten Ergebnissen, was im Widerspruch zu den Ergebnissen der globalen
Tests stand. Daher wurde auf die Berücksichtigung der Alpha-Adjustierung
verzichtet. Für die statistische Auswertung der weder normal- noch log-normalverteilten
Daten (prozentuale Werte von GlcCer, CER[AH], CER[AP] und CER[NP])
wurde der Friedman-Test für verbundene Stichproben im Hinblick auf den Effekt der
Probenahmetechniken benutzt. Aufgrund der begrenzten Tierzahl in diesem Teil der
Arbeit war eine statistische Analyse des Effekts der Körperregion für diese vier
Variablen nicht möglich.
Um die Reproduzierbarkeit der einzelnen Probenahmetechniken zu überprüfen,
wurden die Varianzkomponenten für „Hund“ und „Probenwiederholung innerhalb
Hund“ berechnet, welche jeweils die inter-individuelle und intra-individuelle Varianz
beschrieben. Die Intra-Class-Korrelationskoeffizienten ρ IC (0 ≤ ρ IC ≤ 1) wurden
anhand folgender Formel
σ² d
VC (Hund)
corr(y ijk , y ijk’ )=ρ IC = =
σ² d + σ² e VC (Hund) + VC (Probe)
berechnet, stratifiziert nach Probenahmetechnik und Körperregion mit σ 2 d =
Varianzkomponente „Hund“ [VC (Hund)] und σ 2 e = Varianzkomponente
„Probenwiederholung“ [VC (Probe)].
67

Material und Methoden
Die Daten des zweiten Teils wurden ebenfalls anhand des Kolmogorov-Smirnov-
Tests sowie der graphischen Auswertung von Q-Q-Plots auf Normalverteilung hin
überprüft. Da ein Teil der Daten keine Normalverteilung aufwies, wurden hier alle
statistischen Berechnungen einheitlich mit nicht-parametrischen Tests durchgeführt.
Für die Vergleiche der verschiedenen Körperregionen der toten Hunde wurde der
Friedman-Test benutzt. Ergab dieser signifikante Ergebnisse, wurden paarweise
Vergleiche mit dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test durchgeführt. Da eine Alpha-
Adjustierung keinerlei signifikante Ergebnisse lieferte, wurde auch im zweiten Teil
dieser Arbeit auf ihre Anwendung verzichtet.
Der Vergleich zwischen den atopischen und hautgesunden Hunden wurde mittels
des Wilcoxon-Rangsummen-Tests durchgeführt. Die gemessenen Lipide der
betroffenen Körperregion (meist axillar) der atopischen Hunde wurden mit denen der
axillaren Region der acht toten Hunden verglichen, während die Lipide der
unauffälligen Körperstelle (thorakal) der atopischen Hunde mit denen des lateralen
Thorax der Kontrollhunde verglichen wurden. Für die Vergleiche zwischen den
betroffenen und den klinisch unauffälligen Körperregionen der atopischen Hunde
wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test verwendet.
Die Analysen wurden mit SAS 9.2 (SAS Institute Inc.; Cary, NC, USA) durchgeführt.
Im ersten Teil der Studie wurden die linearen Modelle mit den Programmen „Mixed“
und „Varcomp“ berechnet. Für die nicht-parametrischen Analysen wurde eine
Cochran-Mantel-Haenszel Statistik (basierend auf Rangsummen) mit der Prozedur
„Frequency“ berechnet (Friedman-Test).
Im zweiten Teil der Studie wurden für die Vergleiche zwischen den acht
verschiedenen Körperregionen ebenfalls Cochran-Mantel-Haenszel Statistiken
(basierend auf Rangsummen) mit der Prozedur „Frequency“ berechnet (Friedman-
Test). Die Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests wurden mit der Prozedur „Univariate“
berechnet. Für die Wilcoxon-Rangsummen-Tests wurde die Prozedur „Npar1way“
verwendet.
Das Signifikanzniveau für alle Tests wurde bis zu einer Irrtumswahrscheinlichkeit von
5% (p ≤ 0,05) festgelegt.
68

Manuskript I
4 Manuskript I
ANGELBECK-SCHULZE, M., J. STAHL, S. BRODESSER, K. ROHN, H. NAIM, M.
HEWICKER-TRAUTWEIN, M. KIETZMANN, W. BÄUMER u. R. MISCHKE (2013):
Comparison of three different sampling methods for canine skin lipids.
Vet Dermatol 24, 233-e251
Comparison of three different sampling methods for canine
skin lipids
Mandy Angelbeck-Schulze*, Jessica Stahl † , Susanne Brodesser ‡ , Karl Rohn § ,
Hassan Naim , Marion Hewicker-Trautwein**, Manfred Kietzmann † , Wolfgang
Bäumer † , Reinhard Mischke*
*Small Animal Clinic, † Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, § Department of
Biometry, Epidemiology and Information Processing, Department of Biochemistry, **Department of
Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30559 Hanover, Germany
‡ CECAD Cologne Platform Lipidomics, Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene,
University of Cologne, 50935 Cologne, Germany
Correspondence:
Reinhard Mischke, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation,
Buenteweg 9, 30559 Hanover, Germany
Sources of Funding: This study was supported by "Gesellschaft zur Förderung Kynologischer
Forschung e.V.".
Conflict of interest: None declared.
Short title: Sampling methods for canine skin lipids
Acknowledgements
We would like to thank Herbert Fuhrmann for the kind gift of the standard for CerEOS, originating from
Evonik Industries GmbH. Furthermore, we thank Graham Brogden for his editorial support.
69

Manuskript I
4.1 Abstract
Background − Epidermal lipids are of major interest in dermatological research,
especially in canine atopic dermatitis. Owing to the existence of several sampling
methods, interpretation of study results is often complicated.
Objectives − This study aimed to compare three different sampling methods and to
establish a minimally invasive method for collecting canine epidermal lipids.
Animals and Methods − Skin samples from five dogs with no obvious skin
abnormalities were taken from the caudal back and the inguinal region postmortem.
Samples consisted of heat-separated epidermis of three skin biopsies, three scrapes
and three skin scrubs. Lipids were analysed by high-performance thin-layer
chromatography; the resulting bands were identified by using corresponding
standards, retardation factors and mass spectrometry. The influences of the
sampling method, the body site and the ceramide standards were investigated.
Results − Between body sites, significant differences were found for cholesterol
sulphate, cholesteryl esters and triglycerides. Significant differences between
sampling methods were detected for all lipid fractions except for cholesterol sulphate
and glucosylceramides within the lipid profile, and for at least four ceramide classes
within the ceramide profile. The most obvious discrepancies were found between
heat-separated epidermis and skin scrub. The reproducibility was high for scraping
and skin scrub, but was lowest for heat-separated epidermis. Furthermore, this study
revealed a marked influence of ceramide standards on the results regarding the
ceramide profile.
Conclusions and clinical importance − Scraping and skin scrub are comparably
suitable methods for skin lipid sampling, whereas the analysis of heat-separated
epidermis may not be the method of first choice.
70

Manuskript I
4.2 Introduction
Epidermal lipids play an important role in mammalian skin barrier function, especially
the lipids building the intercellular lipid lamellae of the stratum corneum. 1-3 These
lipids are mainly composed of free fatty acids, cholesterol and ceramides with an
unique variability. 4,5 Changes in the ceramide profile have been shown to lead to
incomplete intercellular lipid lamellae and increased transepidermal water loss. 6-9
In humans, for certain skin diseases an underlying defective skin barrier is
suspected; consequently the stratum corneum lipids have been the subject of several
studies. 10-14 Regarding the similar skin abnormalities in human and canine atopic
dermatitis, 2,9 there are also a few studies dealing with canine skin lipids. 15-18
Unfortunately, the various different skin sampling methods complicate the
comparison of these studies. For the investigation of human as well as animal
epidermal lipids in vivo, a noninvasive sampling method is preferred. For this
purpose, a number of topical extraction methods using organic solvents have been
described. 11,14,19,20
Mixtures of hexane and alcohols have been used to extract
human and porcine epidermal lipids with minimal irritation. 8,11,13,19,21 Lipid extraction
using a 2:1 mixture of n-hexane and ethanol revealed ceramide profiles comparable
to results obtained by tape stripping. 11 The practicability of using topical extraction
procedures on dogs needs to be investigated because struggling during the exposure
time could lead to solvent loss.
Another challenge in studying epidermal lipids is the analytical procedure, particularly
for ceramides. 22,23 Owing to the great variability of ceramides in the stratum corneum,
a classification according to the molecular composition has been developed, 24,25
which has been extended by Masukawa et al. 26 . Briefly, the classification consists of
two letters; the second letter describes the sphingoid base (S, sphingosine; P,
phytosphingosine; H, 6-hydroxy-sphingosine; dS, dihydrosphingosine), while the first
letter describes the species of the fatty acid (N, nonhydroxy; A, α-hydroxy; O, ω-
hydroxy). In the case of an additional esterified fatty acid, an E is the first letter of
three. Based on this nomenclature, the following ceramides classes are possible:
CerEOS, CerEOP, CerEOH, CerEOdS, CerNS, CerNP, CerNH, CerNdS, CerAS,
CerAP, CerAH, CerAdS. In order to separate ceramide classes, normal phase high-
71

Manuskript I
performance thin-layer chromatography (HPTLC) is still the method of first choice. 23
In the last few years, protocols using normal-phase high-pressure liquid
chromatography (HPLC), in some cases coupled with mass spectrometry (MS), have
also been described. 23,27-30 When investigating ceramide classes with MS, one will
see highly heterogeneous spectra, owing to the varying fatty acids linked to the
sphingoid bases; 27,31 hence, overlapping spectra between different types of
ceramides are possible. 27,31 When coupling HPTLC and/or HPLC with MS, both, the
retention time and the mass should be used to identify ceramide classes
definitively. 23 However, the identification of ceramide subgroups is not the only
difficulty. The quantification can be problematic as well, because commercial
standards, containing defined amounts of purified ceramides, are available only for
CerEOS, CerNS, CerNP, CerAS and CerAP.
Consequently, the investigation of epidermal lipids remains a challenge, and all of the
factors mentioned above may influence the results. The use of different ceramide
standards for quantification, different ways to calculate the lipid contents and the
various sampling methods make the comparison of several studies rather difficult.
The aim of this study was to evaluate some of these factors which might have a
profound impact on accurate lipid determination. First, we investigated some
technical aspects regarding the identification and quantification of ceramides.
Second, we compared the lipid composition at two different body sites. The third and
most important aim of this study was the comparison of the accuracy, practicability
and reproducibility of three different sampling methods for canine skin lipids,
including the evaluation of a minimally invasive method for this purpose.
4.3 Material and methods
Study design
Three skin punch biopsies, three skin scrapings and three skin scrubs were taken
from the inguinal region and the caudal back from each of five dogs. Lipid fractions
were separated by HPTLC and analysed densitometrically. Additionally, identification
72

Manuskript I
of ceramide classes was verified by electrospray ionisation tandem mass
spectrometry (ESI-MS/MS).
Animals
The five dogs, which were cases in a university clinic for small animals and
euthanized for reasons not related to this study, were of different breeds (German
short-hair pointer, Bernese mountain dog, Dalmatian, two mix breeds) with a median
age of 11.4 years (range 4.0 - 14.7). The owners agreed to the use of the dogs for
research. None of the dogs had a history or clinical signs of skin disorders. No
medications that could possibly influence the skin composition, especially
corticosteroids, were given systemically for at least 8 weeks prior to euthanasia. Any
kind of topical application had to be stopped 2 weeks before sampling. The lack of
abnormalities of the skin was confirmed by a histological examination of additionally
taken skin punch biopsies.
Skin sampling and sample preparation
Samples were taken within 3 h postmortem. In order to avoid contamination by hairs,
the coat of each dog was carefully clipped at the caudal back and at the inguinal
region prior to the sampling.
The biopsy punches were 8 mm in diameter (kai Europe GmbH; Solingen, Germany).
All of the subcutaneous fat was removed immediately, and the epidermis was
harvested as described by Kligman and Christophers 32 and modified by Stahl et al. 33
The skin biopsies were heated on a plate heater at 60°C for 2 min. After removal of
the remaining hair, the epidermis was separated from the dermis carefully using a
pair of tweezers.
The scrapes were collected with a surgical blade (B. Braun 10; Aesculap AG,
Tuttlingen, Germany) from an area of approximately 10 mm x 18 mm. For each
sample, the skin was scraped consecutively 30 times.
The skin scrub technique was adapted from a method for collecting cutaneous
bacteria in humans 34 and dogs. 35,36 For this procedure, a metal cylinder of 21 mm
inner diameter was pressed tightly on the skin and filled with 1 mL of a mixture of n-
73

Manuskript I
hexane and ethanol (2:1 v/v). The solution was stirred by means of a roughened
glass rod with slight pressure applied for 30 s and transferred into a glass tube. This
procedure was done twice for each specimen. All skin samples were frozen at -80°C
immediately after collection.
Lipid extraction
Lipids were extracted as previously described by Bligh and Dyer. 37 Briefly, the
specimens were homogenized in a suspension of methanol, chloroform and distilled
water (2:1:0.8 v/v/v). Changing the ratio of the solvents to 2:2:1.8 (v/v/v) with
subsequent shaking resulted in phase separation. The upper hydrophilic phase was
carefully aspirated and discarded. The lipid containing lower phase was filtered
through a syringe filter (Chromafil AO-4513; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG,
Düren, Germany), dried in a SpeedVac (Concentrator Plus; Eppendorf, Hamburg,
Germany) at 60°C and stored at -20°C until analysis. All solvents used were of HPLC
grade (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany).
Lipid standards
The following lipids were used as standards for the respective lipid fractions:
phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sodium cholesteryl sulphate,
galactocerebrosides, α-hydroxy fatty acid ceramide (CerAS), nonhydroxy fatty acid
ceramide (CerNS), oleic acid and glyceryl trioleat (triolein; all from Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim, Germany), ceramide VI (CerAP), ceramide III (CerNP)
and ceramide I (CerEOS; all from Evonik Industries AG, Essen, Germany),
cholesterol and cholesteryl stearate (both from Fluka Chemie AG, Buchs,
Switzerland). For each standard, the lower limit of detection and standard curves
were assessed. The standard curves were not linear but followed a Michaelis-Menten
function as previously described. 38 The standards were mixed in six increasing
concentrations, where standard mix ‘0’ corresponding to the lower detection limit. In
order to avoid measurement errors due to the manual character of the method, the
six standard solutions were always applied additionally to the specimen extracts on
silica gel plates.
74

Manuskript I
High performance thin layer chromatography (HPTLC)
In order to separate all major epidermal lipid fractions simultaneously, we modified
the HPTLC procedure developed by Stahl et al. 33 The plates (HPTLC Silica gel 60,
20 cm x 10 cm; Merck KGaA, Darmstadt, Germany) were precleaned in a mixture of
chloroform and methanol (1:1 v/v) and activated in an oven (model 600; Memmert
GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany) at 110°C for 10 min. The extracts were
dissolved in 200 µl (heat-separated epidermis and scrapes) or 500 µl (scrubs) of a
mixture of chloroform and methanol (1:1 v/v). Ten, five and three microlitres of each
extract, as well as 10 µL of each standard solution, were applied using a microlitre
syringe (701 N; Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland). Lipids were
separated consecutively in four different developing chambers (CAMAG Chemie-
Erzeugnisse & Adsorptionstechnik AG & Co. GmbH, Berlin, Germany) filled with 50
mL of the following solution systems: (i) chloroform, methanol and acetic acid
(80:18:2 v/v/v) to 4 cm; (ii) chloroform, methanol and acetic acid (91.4:4.3:4.3 v/v/v)
to 8 cm; (iii) n-hexane, diethylether and acetic acid (72.7:18.2:9.1 v/v/v) to 9.5 cm; (iv)
n-hexane to the top. In order to obtain visible bands, the developed plates were
dipped in an aqueous solution of copper sulphate (75 g/L; copper (II) sulfatepentahydrate
GR; Merck KGaA) and phosphoric acid (8.5%; phosphoric acid 85%;
Sigma-Aldrich Chemie GmbH) for 5 s followed by charring in an oven at 170°C for 15
min. All solvents used were HPLC grade (Carl Roth GmbH & Co. KG).
Densitometry and quantification
The plates were scanned (Scanjet G3010; Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA,
USA) and evaluated using the software program ImageJ (software version 1.43u;
public domain, http://rsbweb.nih.gov/ij). Lipid fractions [phospholipids (PL),
phosphatidylethanolamine (PE), cholesterol sulphate (ChSO4), glucosylceramides
(GlcCer), ceramides (Cer), cholesterol (Chol), free fatty acids (FFA), triglycerides
(TG) and cholesteryl ester (ChE)] were identified by comparison of co-migrated
standards (Figure 1) as well as their retardation factors (R f values; ratio of the
migration distance of the analyte to the migration distance of the solvent front) and
quantified by calculation of respective standard curves. For the ceramide fractions,
75

Manuskript I
CerAP standard was used for the bands of CerAH and CerAP, CerAS standard for
the bands of CerAS+NH and CerEOH, CerNP standard for the band of CerNP,
CerNS standard for the band of CerNS, CerEOS standard for the bands of CerEOS
and CerEOP. All values were given as micrograms per square centimetre. For further
calculations, the median of the triple measurements was assessed. Total lipid
amount (Lip) was calculated by summation of all detected lipid fractions and total
ceramide amount (Cer) by summation of all measured ceramide classes. To
compare the lipid and ceramide profile, relative values of each lipid fraction and each
ceramide class were calculated based on the total lipid amount and total ceramides,
respectively. To answer the question regarding the influence of different ceramide
standards for the quantification of ceramides, the bands of CerAP, CerAS, CerNP
and CerNS of 12 samples (on three plates) were quantified by each standard,
respectively.
Identification of ceramides by mass spectrometry (MS)
Ceramides in the standard solution and a sample separated by HPTLC were further
characterized by ESI-MS/MS using a TLC-MS Interface (CAMAG Berlin, Germany)
coupled to the pump of a 1200 Series Binary LC System (Agilent, Waldbronn,
Germany) and to a 4000 QTrap triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer
(AB SCIEX, Darmstadt, Germany).
Ceramide bands were extracted using a mixture of chloroform and methanol (1:1 v/v)
with 5 mmol/L ammonium acetate at a flow rate of 0.1 mL/min. Ceramide subspecies
were identified in the positive ion mode by product ion scans as well as by precursor
ion scans monitoring precursor ions, which produce the characteristic ceramide
fragment ions of mass-to-charge ratio (m/z) 264 and 282 (ceramides with
sphingosine and phytosphingosine base) or m/z 280 and 298 (ceramides with 6-
hydroxysphingosine base) upon collision-induced dissociation. The m/z value is
defined as the ratio of the exact mass of an ion to the number of its elementary
charges (small molecules form ions that carry only one elementary charge, with the
m/z value of these ions being identical with their mass). The instrument settings for
nebulizer gas (Gas 1), turbogas (Gas 2), curtain gas and collision gas were 50 psi,
76

Manuskript I
55 psi, 20 psi and medium, respectively. The interface heater was on, the Turbo V
ESI source temperature set at 350 °C and the ionspray voltage adjusted to 5.5 kV.
For all precursor and product ion scans, the values for declustering potential,
entrance potential and cell exit potential were 80 V, 10 V, and 10 V, respectively. The
collision energies ranged from 35 to 55 V. The resulting masses were compared with
masses of ceramides calculated by the summation of theoretically possible fatty
acids coupled with C18-sphingoid bases.
Statistics
The absolute values of total lipids and the percentage values of all lipid fractions and
ceramide classes were compared between the different sampling methods and body
sites. Given that we assumed the influence of the sampling repetition to be random,
the values of the sampling repetitions were averaged.
The test for normal distribution of model-residuals was the Kolmogorov-Smirnov test
and visual assessment of Q-Q plots. Parameters that showed a right skewed
distribution were converted to logarithm values prior to calculation. However, results
from logarithm values were retransformed to their original scale for graphical
presentation.
In situations with normally distributed data (absolute values of Lip; percentage values
of PE, Cer and Chol), a repeated-measures two-way ANOVA was used. The same
procedure was used for log-normally distributed data (percentage values of PL,
ChSO4, FFA, TG and ChE as well as of CerAS/NH, CerEOH, CerEOP, CerNS and
CerEOS). Post hoc multiple pairwise comparisons were calculated in the case of
significant global test. An α-adjustment was not used because it resulted only very
occasionally in significant results, which seemed inappropriate in relation to the
results of the global tests. For the calculation investigating the effect of each
sampling method of neither normally nor log-normally distributed data (percentage
values of GlcCer, CerAH, CerAP and CerNP), the Friedman test for repeated
measurements was performed. Owing to the limited number of animals, a statistical
analysis of the effect regarding the body site was not possible for these four
variables.
77

Manuskript I
To answer the question regarding the reliability of measurement, the variance
components of ‘dog’ and ‘sampling repetitions within dogs’ were assessed,
describing the inter- and intra-individual variance, respectively. The intraclass
correlation coefficients ρ IC (0 ≤ ρ IC ≤ 1) were calculated using the following formula:
corr(y
ijk
, y
ijk'
) = ρ
IC
=
σ
2
d
σ
2
d
+ σ
2
e
=
VC (dog)
VC (dog) + VC (probe)
stratified by method and body site (σ² d = variance component ‘dog’ [VC (dog)] and
σ² e = variance component ‘measurement repetitions’ [VC (probe)].
Analyses were carried out with the SAS program (version 9.2; SAS Institute, Cary,
NC, USA). The linear models were calculated with the programs ‘Mixed’ and
‘Varcomp’. For nonparametric analysis, a Cochran-Mantel-Haenszel statistic (based
on rank scores) was calculated with the procedure ‘Frequency’ (Friedman test).
Significance was defined at P ≤ 0.05.
4.4 Results
Identification and quantification of ceramide classes
Using HPTLC, we were able to separate eight lipid bands probably containing
ceramide species. Five of these bands corresponded to the five co-migrated
ceramide standards (Figure 1). In the bands of the ceramide standards, as well as in
the corresponding bands of the samples, masses according to different ceramide
subspecies were found using MS. As shown in Table 1, the profile of subspecies
found within a ceramide class of a skin sample varied from that of the respective
standards. An example of the mass spectra is shown for CerAP in Figures 2a, b. In
the bands of CerEOP and CerEOH, masses were found that matched the
theoretically calculated masses of the respective ceramides. Unfortunately, the band
of CerAH could not be investigated by MS because the band was too close to the
band of CerAP. Minor peaks were detected for each band, which matched species of
neighbouring ceramide classes. For the bands corresponding to CerAS and CerNS,
78

Manuskript I
we were able to find a few masses that matched masses of CerAdS and CerNdS,
respectively.
Regarding the quantification of ceramide classes, Figure 3 shows the percentage
deviation of the ceramide measurements depending on the standard used for
quantification. Measuring CerAP with CerNS standard and vice versa gave median
differences of about 5% from the result using the corresponding standard. The
change of CerAS standard and CerNP standard for quantification of the respective
bands resulted in median differences of about 10%. All other combinations resulted
in values differing about 30% or even more than 40% from the measurements using
the corresponding standard.
Comparison of body sites
By ANOVA, significant differences between the caudal back and the inguinal region
were found for percentage values of ChSO4 and ChE (P < 0.05). For the other lipid
fractions, no significant differences were detected. However, there was a significant
interaction between sampling method and body site for percentage values of Chol
and TG, as well as for total lipids. Significantly higher amounts at the caudal back
were detected for ChSO4 in heat-separated epidermis (P < 0.05) and skin scrub (P <
0.05), for TG in scraping (P < 0.05) and skin scrub (P < 0.05) and for ChE in heatseparated
epidermis (P < 0.01) and scraping (P < 0.05; see Table S1a). In contrast,
pairwise comparisons revealed higher amounts at the inguinal region for total lipids in
heat-separated epidermis (P < 0.05) as well as for Chol in scraping (P < 0.01). Within
the ceramide profile, differences were only detectable for percentage values of
CerAH and CerAP with a higher concentration at the caudal back (see Table S1b).
Comparison of sampling methods
Lipid composition
Significant differences were detected for percentage values of PL, PE, Cer, FFA and
ChE (P < 0.01, ANOVA). The percentage values of PL were significantly higher in
heat-separated epidermis than in the other sampling methods (P < 0.01), whereas
the percentage values of ChE were significantly lower in heat-separated epidermis (P
79

Manuskript I
< 0.001). Significantly lower amounts were detected for percentage values of PE in
scraping (P < 0.01) and for percentage values of FFA in the skin scrub (P < 0.05).
The percentage values of Cer significantly differed between all sampling methods
with heat-separated epidermis < scraping < skin scrub (P < 0.05). The pairwise
comparisons are shown in Figure 4a.
Ceramide composition
Within the ceramide profile, no significant differences were detected between the
three sampling methods for percentage values of CerEOP and CerEOS by ANOVA
nor those of CerAH and CerAP by Friedman test (Figure 4b). Significant differences
were found for percentage values of CerAS+NH, CerEOH and CerNS (P < 0.05,
ANOVA). The percentage values of CerAS+NH were significantly higher in skin scrub
than heat-separated epidermis (P < 0.05). The percentage values of CerEOH were
significantly lower in skin scrub (P < 0.05), whereas the percentage values of CerNS
were significantly higher in skin scrub when compared with heat-separated epidermis
and scraping (P < 0.05). Furthermore, significant differences were found for
percentage values of CerNP (P < 0.001, Friedman test) with heat-separated
epidermis > scraping > skin scrub (Figure 4b).
Reproducibility
The assessment of the intraclass correlation coefficients revealed distinct differences
regarding the reproducibility of the different sampling methods. The coefficients of the
skin scrub were always >0.5, in most cases even >0.7. In contrast, the intraclass
correlation coefficients of the scrapings were occasionally lower, and those of the
heat-separated epidermis often lower than 0.5 (Figure 5a, b). In these cases, the
reproducibility was low, as the intraindividual variance was greater than the
interindividual variance.
80

Manuskript I
4.5 Discussion
This study was performed to investigate the intercellular lipid and ceramide
composition in canine skin by three different sampling methods. There are only a few
publications focusing mainly on canine skin ceramides, comparing healthy dogs and
those with atopic dermatitis. 15-18,39 Of these studies, only one was able to separate 11
ceramide classes by HPTLC and HPLC/MS. 17 Using the HPTLC procedure applied in
our study, it was possible to separate all major epidermal lipids, including the wellknown
eight bands of ceramides (Figure 1). By coupling HPTLC with MS, we were
able to verify the identification of the ceramide bands. This was an important step
because we used an uncommon procedure for HPTLC. In conclusion, we were able
to identify nine ceramide classes (EOS, NS, EOP, NP, EOH, NH, AS, AP and AH)
definitely using R f values and m/z values by coupling HPTLC and ESI-MS results.
Additionally, there were some minor peaks in the bands of CerAS+NH and CerNS
that could match CerAdS and CerNdS, respectively, as recently described by Yoon
et al. 17
Regarding the quantification of ceramides, we were able to show that the choice of
the ceramide standard used for quantification greatly influences the determined
ceramide composition, probably due to different degrees of charring. For the CerAP
and CerNP standards, for example, we found similar species using MS. However, the
corresponding masses of the CerAP species are higher than those of the CerNP
species. This could be a reason for the higher charring degree of the CerAP standard
compared to the CerNP standard. Thus, owing to the amount of carbon contained in
the long-chained CerEOS, CerEOP and CerEOH, the respective standard of CerEOS
should be used for quantification of these ceramide classes. The quantification of
CerNP with the standard of CerAS and vice versa seems to be possible, because the
median discrepancies between the respective measurements were not greater than
10%. For the same reason, the exchange of the standards of CerNS and CerAP for
quantification of the respective bands might be possible. However, there are still
standards missing for some ceramide classes, so quantification of these remains an
uncertain factor when an assessment of the whole ceramide composition is desired.
Conversely, measurements of only these ceramides with a corresponding standard
81

Manuskript I
may lead to incorrect results when information concerning the amount of total
ceramides is needed. All of these factors should be considered in the interpretation of
results dealing with ceramide composition.
There are numerous further factors influencing the outcome of epidermal lipid
studies. In humans, changes of different lipid fractions have been shown to vary with
the age of the study participants. 7,40 Regarding canine epidermal lipids, the breed is
an additional factor that probably influences the lipid composition. 41 Owing to the
exclusion criteria complicating the recruitment of dogs that could participate in this
study, we were not able to restrict the age or breed.
Another important factor is the body site of skin sampling. In human stratum
corneum, variations in lipid content between different anatomical sites have been
described 13,42 , but no differences within the ceramide composition were found. 40 To
the best of our knowledge, no investigations of different body sites have yet been
published for canine skin lipid composition. We investigated the lipid composition at
the inguinal region and at the caudal back for the following reasons. In dogs, the
inguinal region is the most common site to sample because clinical signs of atopic
dermatitis often manifest here. In contrast, the caudal back is usually not affected in
atopic dermatitis and is different from the inguinal region with respect to skin
thickness and the density of hair follicles. These anatomical differences might also
explain the differences in the lipid compositions between the two body sites,
especially regarding the higher percentage values of cholesterol sulphate, cholesteryl
esters and triglycerides at the caudal back. 43,44 Within the ceramide profile, our
results suggest differences between the body sites for the two ceramide classes of
CerAH and CerAP. According to the available literature, this would be the first time
that such differences have been observed. However, we were not able to draft
statistical statements regarding the significance of these differences owing to the
sample size of only five dogs. Hence, such differences might not exist with a study
using a larger number of dogs. This issue should be investigated in the future, as well
as the comparison of further body regions, especially regarding the local distribution
of clinical signs in canine atopic dermatitis.
82

Manuskript I
The comparison of the different sampling methods with respect to the lipid content
revealed the striking observation that the highest total lipids were obtained from heatseparated
epidermis. The explanation is obvious, in that the deeper epidermal layers
will not be harvested by the other two skin sampling methods. For that reason, it did
not make sense to compare the absolute values. However, a disadvantage of the
relative comparison is the influence of all values on each other. This might explain
the lower percentage amounts of ceramides, cholesterol and cholesteryl esters in
heat-separated epidermis. The percentage amounts of phospholipids, free fatty acids
and triglycerides are much higher in the biopsy samples, possibly due to
contaminations by subcutaneous fat or just due to harvesting deeper epidermal
layers, as mentioned above. Another source of variability is the difficult sample
preparation regarding the heat separation of the epidermis from the dermis, because
the biopsies were small and the separation of the epidermis was sometimes a
challenge. The low levels of the intraclass correlation coefficients point to the
problem of reproducibility.
Sampling skin lipids by the skin scrub method revealed a larger lipid amount per
square centimetre of skin than by scraping. Additionally, the percentage amount of
phospholipids (including PE) was higher in the samples collected by skin scrub.
These findings suggest that deeper layers than the stratum corneum were harvested
by scrubbing the skin with n-hexane and ethanol (2:1 v/v), because the content of
phospholipids increases in the deeper layers of the epidermis. 45 The lower
percentage values of total ceramides and cholesterol in the scrapings compared to
the skin scrubs might be due to the influence of the higher percentage amount of free
fatty acids in the scrapings.
Significant differences between the sampling methods within the ceramide profile
were rarely found. These differences may be less pronounced with a larger study
population. Nevertheless, our findings regarding the canine ceramide profile are
mainly in accordance with previous publications in dogs. Strikingly, we found
amounts of CerEOH in the range of 14−20%, whereas Popa et al. 41 could only find
traces. Yoon et al. 17 found about 9% of CerEOH. An explanation for such
discrepancies may be differing HPTLC procedures, as well as different ceramide
83

Manuskript I
standards used for quantification and different quantitative expressions (percentage
of sample content, micrograms per milligram of protein or micrograms per square
centimetre), but also the sampling method and the size of the study population might
have influenced the results.
Given that the reproducibility of both scraping and skin scrub is comparably high and
there are only little differences within lipid and ceramide profiles, both sampling
methods seem to be suitable for collecting skin lipids. However, when the
investigation of skin lipids in vivo is desired, some difficulties in both procedures may
occur. Scraping of lesional skin could lead to contamination by blood, resulting in
distorted lipid measurements. In contrast, struggling during skin scrubbing could lead
to solvent loss and therefore to a lower lipid yield. This problem can be minimized by
the use of sufficiently high-walled metal cylinders. Although the skin scrub method is
able to cause some irritation due to the alcohol-containing solvent, it is a less
invasive method than skin scraping. Although we have used the skin scrub technique
only on dead dogs and although the practicability of using the skin scrub on live dogs
remains to be proved, this should be the preferred method.
In conclusion, we demonstrated that several factors have to be considered in the
interpretation of results of skin lipid measurements, particularly concerning the
ceramides. Apart from the sampling method, the standards used for quantification
have a great influence on the lipid composition determined. Additionally, the
anatomical site might affect the results of canine skin lipid studies. Furthermore, this
study revealed scraping and skin scrubbing as suitable and comparable sampling
methods for canine epidermal lipids, whereas the analysis of heat-separated
epidermis should not be the method of first choice, owing to poor reproducibility.
Whether the investigation of canine epidermal lipids collected by skin scrub in vivo
will be suitable for the detection of variations in skin diseases remains to be proved.
4.6 References
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of the healthy human skin: factors affecting the design of a control population. Skin
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ceramides by tape stripping of stratum corneum from dogs. Arch Dermatol Res 2010;
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45. Lampe MA, Williams ML, Elias PM. Human epidermal lipids:
characterization and modulations during differentiation. J Lipid Res 1983; 24: 131-
140.
88

Manuskript I
4.7 Figures and tables
Figure 1. High-performance thin-layer chromatography (HPTLC) plate of a canine
skin scrub sample and corresponding standards. Abbreviations: Cer, ceramide; ChE,
cholesteryl esters; CholST, cholesteryl stearate; ChSO4, cholesterol sulphate; FFA,
free fatty acids; GlcCer, galacto-cerebrosides; PC, phosphatidyl-g-choline; PE,
phosphatidylethanolamine; PL, phospholipids; Std-Mix, standard mix; TG,
triglycerides.
89

Manuskript I
Table 1. Comparison of detected mass-to-charge ratios of ceramide classes in canine skin samples and corresponding
standards by HPTLC/ESI-MS.
Chain length of
the amidelinked
fatty
CerAP CerAS+NH CerNP CerNS
CerEOS
acid standard sample standard sample standard sample standard sample standard
sample
18:2 18:1 18:0 18:2 18:1 18:0
15 559
16 573 573 555 555 557 557 539
17 587 569 569 553
18 601 601 583 583 585 567 845
19 597 863
20 629 611 611 613 595 875
21 643 889
22 639 623 903 905
23 653 637
24 685 667 667 669 651 651
25 699 681 683 665 665
26 713 695 695 697 679 959
27 709 711 693 971 973 973
28 741 723 725 707 985
29 755 721 1001 1003 1001
30 735 1013 1015 1017 1013
31 1029
32 1043
33
34
35 1085 1083
36
Chain length for the sphingoid bases is presumed to be C18. CerAP, band of alpha-hydroxy fatty acid - phytosphingosine - ceramide; CerAS+NH,
band of alpha-hydroxy fatty acid - sphingosine - ceramide and nonhydroxy fatty acid - 6-hydroxy-sphingosine - ceramide; CerEOS, band od omegahydroxy
fatty acid - sphingosine - ceramide with additional esterified fatty acid; CerNP, band of nonhydroxy fatty acid - phytosphinosine - ceramide;
CerNS, band of nonhydroxy fatty acid - sphingosine - ceramide.
90

Manuskript I
(a)
(b)
Figure 2. Mass spectrum of CerAP standard (a) and the corresponding band of a
skin sample (b). Abbreviation: m/z, mass-to-charge ratio.
91

Manuskript I
Figure 3. Percentage deviation of measurements of canine ceramide classes by
using different ceramide standards. The percentage deviation was calculated using
the following formula: (y – x) / x *100, where x is the measurement using the
corresponding standard and y the measurement using another ceramide standard.
This was done for 36 measurements. Abbreviations: [AP], band of CerAP was
measured; [AS], band of CerAS+NH was measured; [NP], band of CerNP was
measured; [NS], band of CerNS was measured; and Std., standard.
92

Manuskript I
Figure 4a. Comparison of the quantity of total lipids and the relative amounts of lipid
fractions obtained by heat-separated epidermis, scraping and skin scrub at the
inguinal region and the caudal back from normal skin of five dogs. Abbreviations: B1,
body site 1 = inguinal region; B2, body site 2 = caudal back; Cer, ceramides; ChE,
cholesteryl esters; Chol, cholesterol; ChSO4, cholesterol sulphate; FFA, free fatty
acids; GlcCer, glucosylceramides; M1, method 1 = heat-separated epidermis; M2,
method 2 = scraping; M3, method 3 = skin scrub; PE, phosphatidylethanolamine; PL,
phospholipids; TG, triglycerides; * P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.001. #No statistical
statement for pairwise comparisons was possible, but global comparison of sampling
methods for percentage values of GlcCer resulted in nonsignificant differences
(Friedman test).
93

Manuskript I
Figure 4b. Comparison of ceramide classes given as percentage values related to
total ceramides obtained by heat-separated epidermis, scraping and skin scrub at the
inguinal region and the caudal back from normal skin of five dogs. Abbreviations: B1,
body site 1 = inguinal region; B2, body site 2 = caudal back; M1, method 1 = heatseparated
epidermis; M2, method 2 = scraping; M3, method 3 = skin scrub; * P <
0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.001. #No statistical statement for pairwise comparisons
was possible, but global comparison of sampling methods for percentage values of
NP resulted in significant differences with P < 0.001 and in nonsignificant differences
for percentage values of AH and AP (Friedman test); the comparison of the inguinal
region and the caudal back suggest differences for percentage values of CerAH and
CerAP.
94

Manuskript I
(a)
(b)
Figure 5. Intraclass correlation coefficients of lipid fractions (a) and ceramide classes
(b) obtained by heat-separated epidermis, scraping and skin scrub at the caudal back
and the inguinal region. The coefficients were calculated by setting the interindividual
variance in relation to the sum of inter- and intraindividual variance. The variances
were assessed relative to the absolute values (in micrograms per square centimetre).
Spots greater than 0.5 are indicative of a lower intraindividual variance than the
interindividual variance and therefore indicate high levels of reproducibility. In
contrast, the spots lower than 0.5 suggest a low reproducibility.
95

Manuskript I
Table S1a. Comparison of the lipid fractions between the inguinal region and the
caudal back stratified by sampling method.
Total
lipids a 612 ±
148
Heat-separated epidermis Scraping Skin scrub
Inguinal
Caudal
back
Stat.
comp.
Inguinal
Caudal
back
Stat.
comp.
Inguinal
Caudal
back
486 ±
116
0.02
145 ±
44
206 ±
63
ns
206 ±
69
293 ±
65
Stat.
comp.
ns
PL b 8.35
+ 2.13/
- 1.70
PE a 2.76
± 1.07
ChSO4 b 0.66
+ 0.43/
- 0.26
GlcCer c 1.66
(0.56 -
3.52)
Cer a 13.94
± 5.01
Chol a 10.69
± 3.18
FFA b 24.75
+ 12.43/
- 8.28
TG b 28.56
+28.46/
- 14.26
ChE b 2.07
+ 0.81/
- 0.58
9.93
+ 4.07/
- 2.89
3.24
± 1.16
1.19
+ 0.81/
- 0.48
2.33
(1.59 -
4.96)
16.69
± 5.57
12.62
± 2.07
27.30
+ 8.85/
- 6.68
17.76
+ 6.84/
- 4.94
5.22
+ 5.10/ -
2.58
ns
ns
0.03
*
ns
ns
ns
ns
0.01
2.01
+ 1.79/
- 0.95
1.27
± 0.72
0.76
+ 0.60/
- 0.34
1.97
(1.49 -
3.45)
27.06
± 9.37
15.25
± 2.33
28.47
+15.78/
- 10.15
6.10
+ 2.34/
- 1.69
12.15
+ 9.76/
- 5.41
2.76
+ 2.13/
- 1.20
1.76
± 0.80
1.13
+ 0.75/
- 0.45
1.76
(1.73 -
3.33)
22.58
± 1.66
11.18
± 1.39
20.80
+ 15.25/
- 8.80
10.99
+ 2.96/
- 2.33
22.17
+ 9.08/
- 6.44
ns
ns
ns
*
ns
0.01
ns
0.03
0.03
3.21
+ 2.88/
- 1.52
2.45
± 0.60
0.88
+ 0.15/
- 0.13
1.86
(1.57 -
3.30)
34.02
± 5.86
17.95
± 1.66
17.87
+ 8.81/
- 5.90
4.55
+ 1.32/
- 1.02
14.80
+ 4.18/
- 3.26
4.72
+ 2.57/
- 1.66
3.51
± 0.92
1.89
+ 0.73/
- 0.53
2.23
(1.17 -
2.34)
30.66
± 3.60
15.28
± 0.99
11.66
+ 4.22/
- 3.10
8.85
+ 1.64/
- 1.38
20.27
+ 2.06/
- 1.87
ns
ns
0.01
*
ns
ns
ns
0.02
ns
Lipid fractions given as percentage values related to total lipids; PL, phospholipids; PE,
phosphatidylethanolamin; ChSO4, cholesterol sulfate; GlcCer, glucosylceramides; Cer, ceramides;
Chol, cholesterol; FFA, free fatty acids; TG, triglycerides; ChE, cholesteryl esters; a arithmetic mean ±
standard deviation; b geometric mean + upper standard deviation/ - lower standard deviation; c median
and range; stat. comp., statistical comparison; ns, non-significant with p ≤ 0.05 defined as significant; *
no statistical statement possible.
96

Manuskript I
Table S1b. Comparison of the ceramide classes between the inguinal region and the
caudal back stratified by sampling method.
EOS b 7.22
+ 2.38/
- 1.79
NS b 9.48
+ 2.18/
- 1.77
EOP b 4.29
+ 0.90/
- 0.74
NP c 17.89
(16.96 -
24.98)
EOH b 21.01
+ 6.48/
- 4.95
AS/NH b 25.42
+ 6.40/
- 5.11
AP c 6.88
(5.69 -
8.84)
AH c 4.76
(3.87 -
5.86)
Heat-separated epidermis Scraping Skin scrub
Inguinal
Caudal
back
Stat.
comp.
Inguinal
Caudal
back
Stat.
comp.
Inguinal
Caudal
back
9.11
10.46 11.41
11.33 8.26
+ 4.08/ ns + 2.44/ + 3.62/ Ns + 5.84/ + 5.73/
- 2.82
- 1.98 - 2.75
- 3.85 - 3.38
10.39
+ 2.66/
- 2.12
4.53
+ 2.59/
- 1.65
16.17
(15.80 -
20.89)
19.91
+ 8.81/
- 6.11
20.53
+ 2.36/
- 2.11
9.21
(6.54 -
10.27)
6.43
(4.83 -
10.28)
ns
ns
*
ns
ns
*
*
10.80
+ 3.89/
- 2.86
5.41
+ 1.90/
- 1.41
14.41
(12.94 -
23.86)
18.90
+ 9.00/
- 6.10
23.50
+ 7.85/
- 5.89
7.71
(6.02 -
8.24)
4.66
(2.25 -
5.31)
12.49
+ 3.53/
- 2.75
5.10
+ 1.34/
- 1.06
14.12
(11.22 -
15.11)
17.57
+ 4.78/
- 3.76
22.80
+ 3.24/
- 2.84
9.80
(6.90 -
10.68)
7.20
(4.33 -
8.11)
Ns
Ns
*
Ns
Ns
*
*
15.85
+ 2.09/
- 1.84
5.27
+ 0.98/
- 0.82
12.05
(9.23 -
13.80)
13.56
+ 2.21/
- 1.90
28.47
+ 3.88/
- 3.42
7.66
(5.12 -
10.27)
5.07
(3.43 -
5.76)
14.37
+ 1.11/
- 1.03
4.18
+ 1.11/
- 0.88
11.31
(5.75 -
12.78)
15.55
+ 0.74/
- 0.71
27.91
+ 4.63/
- 3.97
9.42
(8.40 -
12.44)
8.55
(5.14 -
10.80)
Stat.
comp.
ns
ns
ns
*
ns
ns
*
*
Ceramide classes given as percentage values related to total ceramides; b geometric mean + upper
standard deviation/ - lower standard deviation; c median and range; stat. comp., statistical comparison;
ns, non-significant with p ≤ 0.05 defined as significant; * no statistical statement possible.
97

Manuskript II
5 Manuskript II
Canine epidermal lipid sampling by skin scrub revealed
variations between different body sites and normal and
atopic dogs
Mandy Angelbeck-Schulze 1 , Reinhard Mischke 1 , Karl Rohn 2 , Marion Hewicker-
Trautwein 3 , Hassan Y. Naim 4 , Wolfgang Bäumer 5
1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30559 Hanover,
Germany
2 Department of Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine
Hannover, Foundation, 30559 Hanover, Germany
3 Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30559 Hanover,
Germany
4 Department of Biochemistry, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30559
Hanover, Germany
5 Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary Medicine
Hannover, Foundation, 30559 Hanover, Germany
Correspondence:
Reinhard Mischke, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation,
Buenteweg 9, 30559 Hanover, Germany
Sources of Funding: This study was supported by "Gesellschaft zur Förderung Kynologischer
Forschung e.V.".
98

Manuskript II
5.1 Abstract
In a previous study, we evaluated a minimally-invasive epidermal lipid sampling
method called skin scrub, which was highly reproducible and produced comparable
results to tape stripping. The present study aimed the investigation of regional
variations in canine epidermal lipid composition and the suitability testing of the skin
scrub technique for sampling of dogs with certain skin diseases. Eight different body
sites, five of which with high and three of which with low predisposition to atopic
lesions, of eight control dogs as well as lesional and non-lesional skin of 12 atopic
dogs and of four dogs with other skin diseases were sampled by the skin scrub
technique. Lipid fractions were separated by high performance thin layer
chromatography and analysed densitometrically. Contrary to the lipid composition, no
significant differences in total lipid content were found between the body sites tested
of the control dogs. The pinna, the flew and the caudal back contained significantly
lower concentrations of ceramides, whereas the palmar metacarpus and the axillary
region contained significantly higher amounts of ceramides and cholesterol than most
other body sites. The amounts of total lipids and ceramides including all ceramide
classes were significantly lower in both lesional and non-lesional skin of atopic dogs
compared to normal skin, the reduction being more pronounced in lesional skin. The
sampling by the skin scrub technique was relatively painless and caused only slight
erythema at the sampled areas, but no oedema. In conclusion, the present study
revealed certain regional variations in the epidermal lipid and ceramide composition
of dogs without skin abnormalities, but no relations between the lipid composition and
predilection sites for canine atopic dermatitis lesions were detected. The skin scrub
technique turned out to be a practicable sampling method for canine epidermal lipids
and revealed satisfying results regarding alterations of skin lipid composition in
canine atopic dermatitis. This sampling method might be suitable for epidermal lipid
investigations of further canine skin diseases.
99

Manuskript II
5.2 Introduction
During the last years, research on canine epidermal lipids attracted increasing
interest, especially concerning canine atopic dermatitis (AD). Since ceramides (CER)
are a major stratum corneum (SC) lipid fraction and thought to be responsible for skin
barrier homeostasis in mammals (CODERCH et al. 2003; HOLLERAN et al. 2006),
the focus of most studies was on this group of sphingolipids. Eleven classes of CER
were described in human and canine SC until now (MASUKAWA et al. 2008; YOON
et al. 2011). Consistently, the different CER classes are denominated according to
their chemical structure (MOTTA et al. 1993), a sphingoid base - sphingosine (S),
dihydrosphingosine (dS), 6-hydroxysphingosine (H) or phytosphingosine (P) -, which
is amide linked to a long-chained non- (N), α- (A) or ω-hydroxylated (O) fatty acid. In
free ceramides, the ω-hydroxylated fatty acid is further esterified (E), most often with
linoleic acid (NOVOTNY et al. 2010). The 11 classes are CER[EOS], CER[NdS],
CER[NS], CER[EOP], CER[NP], CER[EOH], CER[AdS], CER[AS], CER[NH],
CER[AP] and CER[AH] with increasing polarity.
In human and canine AD, there is evidence of a defective cutaneous permeability
barrier (CHOI and MAIBACH 2005; OLIVRY 2011; NISHIFUJI and YOON 2013),
partially related to decreased amounts of CER (IMOKAWA 2001; REITER et al.
2009; SHIMADA et al. 2009; POPA et al. 2011; YOON et al. 2011). Structural
differences in the SC of atopic dogs do not only exist in affected body areas but also
in unaffected skin (MARSELLA et al. 2011). Despite the impaired barrier function
seems to be an overall feature in patients suffering from AD, both human and canine
AD are characterised by a classic distribution of lesions (MARSELLA and
SAMUELSON 2009). Differences in lipid composition of specific body sites of healthy
individuals may be an explanation for site predispositions for atopic lesions. In
humans, regional variations of skin lipid composition and barrier function were
described (LAMPE et al. 1983b; YOSHIKAWA et al. 1994; NORLEN et al. 1999;
KLEESZ et al. 2012), but there was no correlation between lipid composition and
barrier properties (NORLEN et al. 1999). Furthermore, no relations between lipid
composition and body sites predisposed for atopic lesions were detected
100

Manuskript II
(YOSHIKAWA et al. 1994). In dogs, regional variations of permeability barrier
properties were described as well (HIGHTOWER et al. 2010), but there are no
studies investigating the lipid composition of more than two different body regions
until now. With regard to existing site predispositions for canine AD (JAEGER et al.
2010), the investigation of the lipid composition of these predisposed sites versus
usually unaffected sites in normal dogs might reveal interesting facts about the
nature of site predispositions.
In a previous study, we were able to show that a minimally-invasive method
designated as skin scrub is a suitable method for sampling canine epidermal lipids
(ANGELBECK-SCHULZE et al. 2013). Furthermore, we detected some differences in
epidermal lipid composition between the inguinal region und the caudal back normal
canine skin. The present study aimed at the determination of regional variations in
lipid and particularly ceramide composition of eight different body sites in normal
dogs. Another important purpose of this study was to test the suitability of the skin
scrub technique concerning the detection of deviations in epidermal lipid composition
of certain skin diseases.
5.3 Material and methods
Study design
Samples from eight different body sites (concave pinna, flew, palmar metacarpus,
axillary, lateral thorax, lateral abdomen, inguinal, caudal back) were taken by skin
scrub from each of eight dogs with normal skin post mortem. Additionally, skin scrubs
were taken from variable lesional and non-lesional areas of 12 atopic dogs as well as
of four dogs with selected skin disorders other than atopic dermatitis. Lipids were
analysed using high performance thin layer chromatography. The Lower Saxony
State Office for Consumer Protection and Food Safety was informed about the study
protocol in advance (Reference number 09A665).
101

Manuskript II
Animals
All dogs participating in this study were client-owned. Client consent for study
performance was obtained.
The eight dogs with normal skin were euthanized for reasons not related to this study
and of different breeds (Labrador retriever, Border collie, Dalmatian, Cairn terrier,
four mixes) with a median age of 12.3 years (4.2–13.3 years). None of the dogs had
a history of skin disease or any skin lesions. Dogs with administrations of
corticosteroids less than eight weeks or any topical treatments less than one week
prior to the sampling were ruled out. The integrity of the skin was confirmed by
histological examinations of skin biopsies.
The 12 dogs with AD were of different breeds (Jack Russell terrier, German
shepherd, Golden retriever, two French bulldogs, American pit bull terrier, Rhodesian
ridgeback, Magyar Vizsla, Dalmatian, three mixes) with a median age of 3.6 years
(1.0–10.5 years). The diagnosis of canine AD was based on appropriate history and
clinical criteria according to FAVROT et al. (2010). Flea bite hypersensitivity,
ectoparasite infestation, hormonal imbalances and secondary bacterial or yeast
overgrowth were ruled out by the common tests or trial therapies. Each dog had to
perform a food elimination diet for at least eight weeks. Finally, the 12 atopic dogs
included four dogs with solely food-induced AD, four dogs with non-food-induced AD
and four dogs with partly food-induced AD.
Additionally to the 12 atopic dogs, four dogs with other skin diseases participated in
this study: A Chow Chow with histologically confirmed sebaceous adenitis, a poodlemix
with contact dermatitis as well as a Small Munsterlander and a Landseer with
flea bite hypersensitivity. The flea bite hypersensitivity was diagnosed by compatible
clinical signs, the finding of fleas or their excrements on the coat and the complete
vanishing of clinical signs after a suitable ectoparasite treatment.
None of the atopic and non-atopic dogs with skin disorders was treated with antiinflammatory
medications for at least eight weeks or shampoos for one week prior to
the sampling. One exception was the Landseer with flea bite hypersensitivity, which
was treated with a depot methylprednisolone four weeks prior to the sampling. Thus,
the sampling was repeated another four weeks later.
102

Manuskript II
Lipid sampling and extraction
Samples of the dead dogs were taken within three hours post mortem from the body
sites as described above. The atopic dogs were sampled from a lesional - in nine
cases axillary, in two cases inguinal, one abdominal - and a non-lesional - always
lateral thorax - area. The remaining four dogs were also sampled from a lesional and
a non-lesional area, the Chow-Chow both from the caudal back, the poodle-mix from
the ventro-lateral abdomen and the lateral thorax and the Small Munsterlander and
the Landseer from inguinal and the lateral thorax, respectively. Each body site was
sampled once by skin scrub, as described previously (ANGELBECK-SCHULZE et al.
2013). Briefly, a metal cylinder of 21 mm inner diameter was placed tightly on the
skin after clipping the coat cautiously. The epidermal lipids were collected by stirring
one millilitre of n-hexane and ethanol 2:1 (v/v) with a roughened glass rod with slight
pressure for 30 sec, followed by aspirating the extract into a glass tube. This
procedure was done twice on the same area and the samples were pooled.
Immediately after the sampling, the concerned skin areas were washed and a skin
lipid complex (Allerderm; Virbac, Glattbrugg, Switzerland) was applied. The
specimens were dried in a SpeedVac (Concentrator Plus; Eppendorf, Hamburg,
Germany) at 60°C. Lipid extraction was performed according to BLIGH and DYER
(1959) by homogenisation of the specimens in methanol, chloroform and distilled
water 2:1:0.8 (v/v/v). Adding of one millilitre of chloroform and distilled water,
respectively, led to phase separation. The upper hydrophilic phase was discarded,
the lower lipophilic phase was dried and stored at -20°C until analysis. All solvents
used were of HPLC grade (Carl Roth, Karlsruhe, Germany).
High performance thin layer chromatography (HPTLC)
For chromatographical analysis, HTPLC-plates (silica gel 60, 20 x 10 cm, Merck;
Darmstadt, Germany) were pre-cleaned in chloroform and methanol 1:1 (v/v) and
activated in an oven at 110°C for 10 min. The specimens were dissolved in 500 µl of
chloroform and methanol 1:1 (v/v), respectively. Ten, five and three microlitres of
each specimen as well as ten microlitres of each of six standard mixtures containing
103

Manuskript II
increasing concentrations of corresponding lipid standards were applied by a
microlitre syringe (N 701, Hamilton; Bonaduz, Switzerland) in one centimetre
distance to the bottom of the plate. The following lipid standards were used:
phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sodium cholesteryl sulphate,
galactocerebrosides, α-hydroxy fatty acid ceramide (CER[AS]), non-hydroxy fatty
acid ceramide (CER[NS]), oleic acid and glyceryl trioleat (triolein) from Sigma-Aldrich
(Steinheim, Germany), Ceramide VI (CER[AP]), Ceramide III (CER[NP]) and
Ceramide I (CER[EOS]) from Evonik Industries AG (Essen, Germany), cholesterol
and cholesteryl stearate from Fluka Chemie AG (Buchs, Switzerland). Adapting the
method described by STAHL et al. (2009) to our HPTLC-System, the lipids were
separated consecutively in four different development chambers (CAMAG; Berlin,
Germany) filled with 50 ml of the following solution systems: 1) chloroform, methanol
and acetic acid 80:18:2 (v/v/v) to 4 cm, 2) chloroform, methanol and acetic acid
91.4:4.3:4.3 (v/v/v) to 8 cm, 3) n-hexane, diethylether and acetic acid 72.7:18.2:9.1
(v/v/v) to 9.5 cm, 4) n-hexane to the top. All solvents were of HPLC grade and
purchased from Carl Roth and Sigma-Aldrich. The plates were dipped in an
aquaeous solution of copper sulphate (75 g/L; Merck) and phosphoric acid (8.5%;
Sigma-Aldrich) for 5 sec, charred in an oven at 170°C for 15 min and scanned
(Scanjet G3010, Hewlett-Packard Company; Palo Alto, CA, USA) to allow
densitometric analysis using the software program ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).
Standard curves obtained by the six standard mixtures, which were applied together
with the specimens on each plate as described above, were used for the
quantification of the respective lipid fractions.
Statistical analysis
Data-distribution was determined by Kolmogorov-Smirnov test and visual
assessment of Q-Q plots. Since part of the data did not show standard normal
distribution, all data were calculated with non-parametrical tests.
Comparisons of the different body sites were done by Friedman test. In case of a
significant result, pairwise comparisons were performed by Wilcoxon signed rank
test. Due to the fact that the application of an alpha-adjustment did not result in any
104

Manuskript II
significant differences, which was inappropriate regarding the results of the global
test, its usage was waived.
For the comparison between atopic and normal dogs, Wilcoxon two sample test was
used. The epidermal lipids of the lesional area of the atopic dogs (mostly axillary)
were compared to the epidermal lipids of the axillary region of the dead dogs with
normal skin, whereas the epidermal lipids of the non-lesional area (thoracical) were
compared to the epidermal lipids of the lateral thorax of the normal dogs.
Comparisons of lesional and non-lesional areas of the atopic dogs were done by
Wilcoxon signed rank test.
All analyses were performed using SAS 9.2 (SAS Institute Inc.; Cary, NC, USA).
Significance level was set at P < 0.05.
5.4 Results
Comparison of different body sites in normal skin
No significant differences were detectable for total lipid content between the eight
tested body sites (Table 1). In contrast, significant differences of the absolute
amounts of CER were found among six of the eight body sites tested (P < 0.01,
Friedman test) with higher amounts metacarpal, axillary and thoracical and the lower
amounts at the pinna, the flew and the caudal back, in each case with significant
differences compared to most other body sites (Table 1). The ceramide classes also
significantly differed in content between the body sites except for CER[NP] (Table 1).
Significant differences in ceramide classes occurred between canine AD predilection
sites, such as pinnae and metacarpus, as well as between non-predilection sites,
such as the lateral thorax and the caudal back. No significant differences in ceramide
classes were found between the palmar metacarpus, the axillary region and the
lateral thorax or between the axillary and inguinal region, for example (Table 1). Most
differences were found for CER[AS+NH] (P < 0,001) with significantly lower levels at
the pinna, the flew and the caudal back compared to most other sites. The levels of
CER[EOS] were significantly lower at the pinna and the flew when compared to the
105

Manuskript II
metacarpus, the axillary and the inguinal region, whereas the levels of CER[EOP]
were significantly lower at the caudal back than at most other body sites (Table 1).
Among the remaining lipid fractions, no significant differences were found between
the body sites in the concentrations of glucosylceramides and free fatty acids. The
absolute values of phospholipids, phosphatidylethanolamin, cholesterol sulphate,
cholesterol and cholesteryl esters significantly differed between the tested body sites
(P < 0.01, Friedman test) as well as the amounts of triglycerides did (P < 0.0001,
Friedman test; Table 1). The pinna contained significantly lower amounts of
cholesterol sulphate, cholesterol and cholesteryl esters but significantly higher
amounts of triglycerides than most other body sites. For the flew region, significantly
higher concentrations of phospholipids including phosphatidylethanolamin and
cholesterylesters were found compared to most other sites. The skin at the palmar
metacarpus was characterised by significantly lower amounts of phospholipids
including phosphatidylethanolamin and significantly higher amounts of cholesterol
sulphate and cholesterol compared to most other sites. Axillary and thoracic skin
contained significantly higher concentrations of cholesterol and
phosphatidylethanolamin than most other body sites, respectively. We found
significantly lower amounts of cholesterol sulphate and triglycerides at both sites
abdominal and inguinal compared to most other sites, whereas the inguinal region
also contained significantly lower amounts of cholesteryl esters than most other body
regions. At the caudal back, the concentrations of phosphatidylethanolamin and
cholesteryl esters were significantly higher compared to most other body sites.
The ratio of ceramides to cholesterol was significantly lower at the caudal back
compared to the inguinal region and the pinnae (data not shown).
Differences between atopic and normal dogs
The total lipid amount was significantly lower in both lesional and non-lesional areas
of atopic dogs compared to normal canine skin (Figure S1a). In a similar manner, the
contents of most lipid fractions (except for free fatty acids, triglycerides and
cholesteryl esters) were significantly reduced in atopic dogs. Samples of the lesional
regions contained significantly lower amounts of all lipid fractions compared to the
106

Manuskript II
samples of the non-lesional regions, except for phospholipids and free fatty acids
(Figure S1a). In contrast, we only rarely found significant differences in the
percentage lipid composition between atopic and control dogs (Figure S1b). No
differences were detectable between the ratios of ceramides to cholesterol of atopic
and normal skin (data not shown).
The skin of atopic dogs contained significantly lower amounts of all ceramide classes
than normal canine skin (Figure 1a). Additionally, the contents of CER[AH], CER[AP],
CER[AS+NH] and CER[NP] were significantly reduced in lesional skin compared to
non-lesional skin. The differences between lesional and normal skin were more
pronounced than between non-lesional and normal skin (Figure 1a). In contrast,
there were just a few differences regarding the ceramide profile (Figure 1b).
A visual comparison of graphical presentation revealed no differences in lipid
composition between the three subgroups of canine AD divided as defined above
(data not shown).
Lipid composition of selected further skin disorders
Total lipid content and the amounts of all lipid fractions and ceramide classes were
markedly reduced in the lesional skin of the dog with contact dermatitis compared to
its non-lesional skin or to normal skin, whereas only the total ceramides and all
ceramide classes were reduced in its non-lesional skin compared to normal skin
(Table S1).
In the two dogs with flea bite hypersensitivity, the contents of total ceramides, all
ceramide classes and cholesterol were reduced in both lesional and non-lesional skin
compared to normal skin, without differences being detected between lesional and
non-lesional skin (Table S1).
The lesional skin of the dog with sebaceous adenitis contained lower amounts of total
lipids as well as lower amounts of free fatty acids, triglycerides and cholesteryl esters
than its non-lesional skin or normal skin, the amount of cholesteryl esters in the
lesional skin being even merely one tenth of that in the non-lesional skin of this dog.
Total ceramides and ceramide classes did not show any differences to normal skin
(Table S1).
107

Manuskript II
Additionally there were decreased levels of total ceramides, all ceramide classes and
cholesterol in both lesional and non-lesional skin of the Landseer with flea bite
hypersensitivity eight weeks after the systemic administration of a time-released
corticosteroid compared to four weeks after the administration. At the latter time of
sampling, the quantities of all lipid fractions were comparable to these of normal skin
(Tab. C5, Anhang).
Tolerance of the skin scrub technique
The sampling was viable without sedation and with relatively low restraint of the
dogs, excessive struggling did not occur. After the sampling, the skin of the dogs
tested in our study was erythematous but no oedema was visible. A few dogs were
itching at the sampled areas for one to two days. In some cases the sampled area of
non-lesional skin developed a crusty circle that vanished a few days after.
5.5 Discussion
Canine AD is characterised by a classic distribution of lesions (MARSELLA and
SAMUELSON 2009). Typical affected body sites in canine AD are the face, pinnae,
paws, axillary, inguinal and flexural regions (FAVROT et al. 2010; JAEGER et al.
2010). To determine a possible predisposition of such sites for the development of
lesions in canine AD, we investigated the epidermal lipids of dogs with normal skin at
eight different body sites, five of which are typically affected in canine AD (concave
pinna, flew, palmar metacarpus, axillary and inguinal region) and three of which are
usually not affected (lateral thorax and abdomen, caudal back). However, there were
neither any differences of the total lipid content between the body sites nor clear
relations between the groups of body sites mentioned above and the quantities of
particular lipid fractions, especially of ceramides or any ceramide class, detectable.
This finding matches the results of an equivalent study of human epidermal lipid
composition (YOSHIKAWA et al. 1994). For that reason, the site predispositions for
atopic lesions in dogs seem not to be related to a lower lipid or ceramide content per
108

Manuskript II
se, but to other factors such as lesser hair coat and higher mechanical stress of
these specific regions, probably leading to a more intensive allergen contact.
To the best of the authors’ knowledge this is the first study that compared the
quantities of lipid and ceramide fractions at more than two different body sites of
healthy canine skin. Despite no differences in lipid content were present, the lipid
composition was not uniform across the body sites. The variations in triglyceride and
cholesteryl ester content are explainable by regional variations of sebaceous glands
(PAVLETIC 2003), because these lipids are mainly derived from sebum (YOON et al.
2013). This was also confirmed by the lower amounts of triglycerides and cholesteryl
esters in the lesional skin of the dog with sebaceous adenitis compared to its nonlesional
skin.
Regional variations in epidermal lipid composition have been found in humans with
higher concentrations of cholesterol sulphate, cholesterol and sphingolipids at the
sole compared to other body sites (LAMPE et al. 1983a), which correlate with the
high concentrations of the same lipid fractions at the palmar metacarpus in the
present study. In addition, there is evidence that the lipid composition underlies
changes during the seasons, which further modifies the regional variations
(YOSHIKAWA et al. 1994). This aspect was not investigated in dogs so far and was
not taken into account in this study, but may be tested in a further study by the
minimally invasive skin lipid sampling method used in this study. In contrast, the wide
inter-individual variation, which is shown in Table 1 and which has also been
described in epidermal structure of dogs (LLOYD and GARTHWAITE 1982), is an
aspect that should be taken into account. Such wide variations between different
individuals are able to obliterate the effect of site dependences (NORLEN et al.
1999).
Despite no relationship between body sites being predisposed for atopic lesions and
the lipid composition of these body sites in normal dogs were found, there were such
differences between lesional and non-lesional skin in atopic dogs. Total lipids and
especially ceramide classes were significantly lower concentrated in lesional than in
non-lesional skin of the atopic dogs tested in the present study. However, this lipid
reduction might be due to inflammation processes in lesional skin. There is evidence,
109

Manuskript II
that allergen exposition leading to inflammation in the affected skin areas worsens
the epidermal barrier properties of experimentally sensitized dogs (HIGHTOWER et
al. 2010; STAHL et al. 2012). Apart from this, HIGHTOWER et al. (2010) detected a
higher transepidermal water loss (TEWL) at seven of ten body sites with six of these
sites being predisposed to AD lesions in the sensitized dogs compared to normal
dogs prior to the allergen challenge, i.e. prior to the development of skin lesions of
the sensitized dogs. Since SHIMADA et al. (2009) indicated a negative correlation
between TEWL and ceramide content in the skin of atopic dogs, one may assume
lower ceramide contents in canine AD predilection sites prior to allergen contact. This
altered lipid composition might trigger a more rapid inflammation leading to atopic
lesions more easily than in body sites that are not predisposed for AD lesions.
In contrast to former studies of canine epidermal lipids (SHIMADA et al. 2009; YOON
et al. 2011; STAHL et al. 2012), the present study revealed significant differences in
lipid composition between lesional and non-lesional skin of atopic dogs. In the former
studies, non-lesional skin was sampled at a neighboured area to the sampled
lesional skin region (SHIMADA et al. 2009; YOON et al. 2011; STAHL et al. 2012),
probably to avoid variations due to different body sites. This might be a reasonable
explanation for the lack of differences between lesional and non-lesional skin of
atopic dogs in these studies. Therefore we chose the lateral thorax for sampling of a
non-lesional area in atopic dogs. Since we found no substantial differences between
this body site and the axillary region, which was mostly sampled as reference of
lesional skin in atopic dogs, in normal dogs, the comparison between lesional and
non-lesional skin of the atopic dogs was made directly.
The possibility to compare the lipid composition at different body sites of the same
individuals, such as lesional and non-lesional skin, is an advantage of minimally
invasive sampling methods. The skin scrub technique is such a minimally invasive
method. Performed with a detergent instead of a solvent, this technique was
successfully applied to canine skin in order to determine the cutaneous bacterial flora
(IHRKE et al. 1978). In that study, tractable dogs were sampled without anaesthesia
by using minimal restraint. This is in accordance to our experience during the skin
lipid sampling of living dogs. Furthermore, mixtures of hexane and alcohols have
110

Manuskript II
been used to extract human and porcine epidermal lipids with minimal irritation
(BONTE et al. 1995; NORLEN et al. 1999; MONTEIRO-RIVIERE et al. 2001;
FARWANAH et al. 2005), which agrees with our observations. Thus, the skin scrub
technique seems to be a practicable, relatively painless method for skin lipid
sampling in living dogs.
Despite this fact, we decided to sample freshly dead dogs for control because of the
desire to compare eight different body sites, of which some would have been not
easy to be sampled in living dogs, namely the concave pinna, the flew and the
palmar metacarpus. A critical argument concerning our study results might be the
comparison of dead with alive dogs owing to a possibly less intensive scrubbing in
atopic (i.e. living) dogs than in normal (i.e. dead) dogs during skin sampling. In fact,
the sampling was always done by the same person, who took care to scrub with the
same pressure in each case. Another influencing factor that might have been argued
to distort our results was the distinctly higher median age of the control dogs
compared to the atopic dogs. There is only one study about the epidermal lipid
composition in dogs depending on age, which examined the skin surface lipids in
young dogs of the age of ten weeks to 81 weeks (DUNSTAN et al. 2002). To the best
of the authors’ knowledge, no literature about the skin lipid composition in older dogs
is available. Owing to the fact, that the lipid- and ceramide contents are decreased in
the aged skin of humans (IMOKAWA et al. 1991), one might assume the same for
canine aged skin. Thus, the amounts of total lipids and ceramides might be lower in
our control dogs compared to healthy dogs that would match the age of the atopic
dogs tested in the present study. In this case, the differences between atopic and
normal dogs would have been even more pronounced than they were anyway.
Conversely to our results, there are two studies that found significant changes
regarding the relative ceramide content or composition in atopic dogs (REITER et al.
2009; SHIMADA et al. 2009). A possible explanation for these deviations might be
the different determination of the ceramide content. Whereas we were able to identify
eight bands corresponding to nine ceramide classes by HPTLC, SHIMADA et al.
(2009) only measured two ceramide classes and REITER et al. (2009) only identified
five classes. The significantly reduced relative levels of total ceramides and ceramide
111

Manuskript II
classes found in these studies might be due to the missing ceramide fractions that
were not measured. Of course, the usage of different sampling methods may also
contribute to the deviant results.
In contrast to the relative comparisons, the present study revealed a marked
decrease of total lipids, in detail of all ceramide classes and most lipid fractions, in
both lesional and non-lesional skin of atopic dogs compared to normal dogs. These
results are mainly in accordance with a more recent study (YOON et al. 2011), which
exclusively investigated the ceramide composition of canine atopic skin compared to
normal controls and found significantly lower absolute amounts of total ceramides
and the ceramide classes CER[EOS], CER[NS+NdS], CER[EOP], CER[NP] and
CER[AS+NH] in both lesional and non-lesional skin of the atopic dogs. In accordance
to another recent study (STAHL et al. 2012), we did not detect higher amounts of
glucosylceramides in canine atopic skin which were described by POPA et al. (2011).
Due to this finding, we do not agree with their suggestion of a deficiency in β-
glucocerebrosidase-activity in canine atopic skin that might lead to the reduced
ceramide levels. The results of our study would be rather compatible with an
increased activity of sphingomyelin-glucosylceramide-deacylase being the underlying
mechanism for the ceramide deficiency in canine atopic skin as described for the
human counterpart (IMOKAWA 2009). Furthermore, our results are consistent with
human skin lipid studies that also detected decreased absolute amounts of total lipids
and total ceramides in atopic patients (IMOKAWA et al. 1991), but no differences in
relative lipid composition (IMOKAWA et al. 1991; YAMAMOTO et al. 1991).
However, the findings regarding the decreased lipid and/or ceramide contents do not
seem to be unique for AD. Similar alterations of the ceramide composition were also
detected in other human skin diseases, such as psoriasis (CODERCH et al. 2003). In
the present study, there are evidences for analogical observations regarding other
canine skin diseases, as we detected similarly decreased amounts of the ceramides
including all subclasses in the lesional and non-lesional skin of the poodle-mix with
contact dermatitis as well as of the two dogs with flea bite hypersensitivity compared
to normal skin. Although the validity of these results is doubtful owing to the individual
cases, such alterations of the epidermal lipid composition in further canine skin
112

Manuskript II
diseases may be indicative of changes secondary to (allergic or immunological
mediated) inflammation. This hypothesis is further confirmed by the observation of
STAHL et al. (2012), that the decreased ceramide levels after allergen challenge
returned back to prechallenge values within two month after lesion resolution in
house dust mite sensitized atopic Maltese-beagle dogs. As partly already indicated
by OLIVRY et al. (2011), these observations provide interesting aspects for further
studies.
In conclusion, we found regional variations in lipid composition of the canine
epidermis but no relation between the lipid or ceramide composition and canine AD
predilection sites. In comparison to body site-specific controls, we detected marked
alterations of lipid contents and composition, especially of ceramides, in lesional and
non-lesional skin of atopic dogs. The answer of the question, if the lipid alterations
and the resulting impaired barrier function of canine atopic skin are of primary or
secondary origin, remains open. Finally, the skin scrub technique turned out to be a
practicable sampling method for canine epidermal lipids and revealed reproducible
results regarding alterations of skin lipid composition in canine atopic dermatitis. This
sampling method might be suitable for epidermal lipid investigations of further canine
skin diseases.
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Regional analysis of ceramides within the stratum corneum in relation to seasonal
changes.
Dermatology 188, 207-214
119

Manuskript II
5.7 Figures and tables
a
b
Figure 1: Comparison of absolute (a) and relative (b) amounts of ceramide classes
between atopic and control dogs.
EOS, ceramide from sphingosine and esterified ω-hydroxy fatty acid (FA); NS, ceramide from
sphingosine and non-hydroxy FA; EOP, ceramide from phytosphingosine and esterified ω-hydroxy FA;
NP, ceramide from phytosphingosine and non-hydroxy FA; EOH, ceramide from 6-hydroxy
sphingosine and esterified ω-hydroxy FA; AS+NH ceramide from sphingosine and α-hydroxy FA and
ceramide from 6-hydroxy sphingosine and non-hydroxy FA; AP, ceramide from phytosphingosine and
α-hydroxy FA; AH, ceramide from 6-hydroxy sphingosine and α-hydroxy FA; Cer, total ceramides; * P
< 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
120

Manuskript II
a
b
Figure S1: Comparison of absolute (a) and relative (b) amounts of lipid fractions
between atopic and control dogs.
PL, phospholipids; PE, phosphatidylethanolamin; ChSO4, cholesterol sulphate; GlcCer,
glucosylceramides; Cer, ceramides; Chol, cholesterol; FFA, free fatty acids; TG, triglycerides; ChE,
cholesteryl ester; Lip, total lipids; * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
121

Manuskript II
Table 1: Comparison of epidermal lipid composition in µg/cm² epidermis (median, minimum – maximum) between
eight different body sites sampled by skin scrub.
Concave
Pinna A FlewB Metacarpus
palmar C AxillaryD Lateral Thorax E Lateral
Abdomen F InguinalG Caudal Back H Statistical
Significance
(Friedman)
Total lipids 219 (94 - 313) 276 (120 - 480) 280 (207 - 379) 281 (198 - 403) 254 (195 - 339) 233 (132 - 317) 249 (158 - 284) 277 (180 - 350) ns
Pairwise
Comparisons
(Wilcoxon's signed rank)
PL 7.3 (1.5 - 20) 12 (6.6 - 36) 5.3 (3.9 - 7.3) 8.7 (4.7 - 15) 9.1 (4.6 - 25) 8.1 (2.9 - 13) 8.0 (3.8 - 12) 10 (2.9 - 26) p = 0.0034
PE 4.0 (1.1 - 13) 6.5 (3.0 - 32) 3.6 (2.8 - 4.1) 5.4 (3.3 - 7.9) 7.1 (3.6 - 19) 5.4 (2.4 - 7.6) 4.9 (3.9 - 7.8) 7.8 (3.3 - 30) p = 0.0026
ChSO4 2.5 (1.1 - 5.3) 3.9 (1.3 - 5.4) 4.6 (3.1 - 6.3) 3.6 (2.0 - 4.9) 3.4 (2.4 - 5.3) 2.3 (1.1 - 4.0) 2.0 (1.2 - 3.8) 3.2 (1.8 - 6.3) p = 0.0042
AB** BC** BD* BE* BF*
BG* CD* CE* CG* CH*
AB** BC** BF* CD* CE*
CF* CG** CH* DE** EF**
AC* CF** CG** DF**
DG** EF** EG**
GlcCer 7.2 (2.4 - 13) 9.0 (3.9 - 24) 7.8 (3.6 - 13) 7.8 (0.6 - 14) 10 (4.8 - 13) 6.7 (4.0 - 11) 8.2 (4.8 - 15) 8.7 (4.8 - 14) ns
CER 53 (23 - 79) 51 (20 - 114) 81 (50 - 89) 69 (42 - 123) 71 (34 - 99) 57 (34 - 97) 70 (50 - 80) 49 (26 - 92) p = 0.0044 AC** BD* DH** EH**
- [EOS] 5.7 (2.7 - 8.8) 5.5 (2.1 - 9.1) 6.9 (4.2 - 12) 7.0 (4.5 - 11) 6.8 (2.8 - 11) 5.9 (3.4 - 13) 7.8 (2.8 - 10) 6.4 (3.3 - 11) p = 0.0292 AC* AG* BD* BG**
- [NS] 9.1 (3.7 - 14) 6.9 (3.4 - 21) 11 (8.2 - 15) 12 (8.2 - 21) 10 (6.8 - 19) 11 (7.0 - 18) 11 (9.5 - 13) 7.8 (4.3 - 15) p = 0.0054 AC** BD* BE* DH** EH*
- [EOP] 2.2 (0.8 - 3.0) 1.9 (0.95 - 4.9) 2.7 (1.9 - 3.6) 3.2 (1.4 - 4.8) 2.9 (1.4 - 3.8) 2.7 (1.6 - 3.7) 3.1 (2.2 - 3.7) 1.6 (0.9 - 2.7) p = 0.0116 AD* DH** EH** FH* GH*
- [NP] 5.9 (2.4 - 12) 7.3 (1.9 - 18) 8.9 (4.6 - 14) 7.1 (5.5 - 16) 8.1 (3.5 - 15) 6.5 (3.6 - 13) 6.8 (4.9 - 11) 6.8 (2.8 - 15) ns
- [EOH] 7.4 (3.7 - 11) 6.6 (3.0 - 15) 9.6 (5.4 - 12) 7.6 (5.0 - 16) 7.9 (3.8 - 10) 5.7 (4.0 - 11) 6.9 (4.3 - 9.4) 6.3 (4.6 - 11) p = 0.0483 AC** CF** CG* CH*
- [AS+NH] 11 (3.7 - 16) 10 (5.0 - 24) 18 (12 - 26) 20 (9.9 - 34) 20 (7.2 - 23) 19 (8.1 - 22) 21 (13 - 25) 12 (5.3 - 19) p = 0.0003
- [AP] 5.2 (1.9 - 8.6) 5.4 (1.9 - 10) 7.3 (3.9 - 9.9) 6.0 (3.4 - 10) 7.1 (4.1 - 9.5) 4.9 (2.8 - 8.2) 4.9 (3.9 - 8.6) 4.1 (2.0 - 8.0) p = 0.0349
- [AH] 6.2 (2.3 - 8.8) 5.1 (1.5 - 12) 8.2 (4.3 - 10) 6.0 (3.3 - 11) 8.0 (3.1 - 10) 5.0 (2.3 - 8.0) 4.6 (3.3 - 7.0) 5.1 (2.5 - 10) p = 0.0042
Chol 24 (10 - 31) 29 (11 - 60) 39 (32 - 50) 39 (20 - 55) 35 (19 - 44) 34 (21 - 39) 30 (25 - 42) 30 (18 - 40) p = 0.0038
AC** AD* AE* AF* AG**
BC* BD* BE* BG* CH*
DH** EH** FH* GH**
AC* CH* DF* DH* EF**
EG* EH**
AC* CF** CG** DF**
EF** EG*
AC** AD* AE* AG* CG**
CH* DE** DF* DH*
FFA 44 (26 - 70) 55 (15 - 104) 57 (28 - 77) 63 (36 - 94) 59 (35 - 74) 54 (30 - 73) 65 (33 - 75) 57 (22 - 66) ns
TG 49 (13 - 88) 28 (5.9 - 41) 25 (11 - 36) 16 (8.8 - 55) 22 (4.5 - 35) 13 (2.5 - 24) 9.7 (5.2 - 16) 21 (12 - 40) p < 0.0001
ChE 30 (10 - 64) 81 (6.3 - 96) 73 (23 -127) 69 (36 - 89) 49 (12 - 89) 52 (7.5 - 74) 41 (19 - 84) 80 (45 - 105) p = 0.0024
AE* AF* AG** AH* BF**
BG* CF** CG** DF* DG**
EG* FH** GH**
AB* AC* AD** AH** BF*
CG* DG* EH* FH* GH*
PL, phospholipids; PE, phosphatidylethanolamin; ChSO4, cholesterol sulphate; GlcCer, glucosylceramides; CER, ceramides; [EOS], ceramide from
sphingosine and esterified ω-hydroxy fatty acid (FA); [NS], ceramide from sphingosine and non-hydroxy FA; [EOP], ceramide from
phytosphingosine and esterified ω-hydroxy FA; [NP], ceramide from phytosphingosine and non-hydroxy FA; [EOH], ceramide from 6-hydroxy
sphingosine and esterified ω-hydroxy FA; [AS+NH] ceramide from sphingosine and α-hydroxy FA and ceramide from 6-hydroxy sphingosine and
non-hydroxy FA; [AP], ceramide from phytosphingosine and α-hydroxy FA; [AH], ceramide from 6-hydroxy sphingosine and α-hydroxy FA; Chol,
cholesterol; FFA, free fatty acids; TG, triglycerides; ChE, cholesteryl ester; ns, non-significant; * p < 0.05; ** p < 0.01.
122

Manuskript II
Table S1: Epidermal lipid composition in µg/cm² epidermis (median, minimum – maximum) of individual dogs with
contact dermatitis, flea bite hypersensitivity or sebaceous adenitis in comparison with body site matched
controls.
Control Contact dermatitis (n=1) Flea bite hypersensitivity (n=2) Sebaceous adenitis (n=1) Control
(inguinal) lesional non-lesional lesional non-lesional lesional non-lesional (caudal back)
Total lipids 249 (158 - 284) 91 259 160 (99 - 222) 193 (180 - 206) 182 295 277 (180 - 350)
PL 8.0 (3.8 - 12) 0.81 5.2 2.7 (2.3 - 3.1) 7.8 (3.8 - 12) 7.7 7.1 10 (2.9 - 26)
PE 4.9 (3.9 - 7.8) 0.72 6.5 2.84 (2.72 - 2.96) 7.7 (4.5 - 11) 6.2 5.4 7.8 (3.3 - 30)
ChSO4 2.0 (1.2 - 3.8) 0.48 2.2 1.02 (0.69 - 1.35) 2.35 (2.11 - 2.59) 1.96 2.23 3.2 (1.8 - 6.3)
GlcCer 8.2 (4.8 - 16) 1.6 6.4 3.7 (1.8 - 5.5) 6.9 (6.6 - 7.2) 9.1 11.9 8.7 (4.8 - 15)
CER 70 (50 - 80) 13 43 32 (27 - 38) 35 (27 - 43) 59 47 49 (26 - 92)
- [EOS] 7.8 (2.8 - 11) 1.6 4.1 4.8 (4.2 - 5.3) 3.8 (2.9 - 4.6) 6.8 7.2 6.4 (3.3 - 11)
- [NS] 11.3 (9.5 - 13.4) 2.1 8.6 6.6 (4.3 - 9.0) 7.13 (6.87 - 7.39) 11 8.3 7.8 (4.3 - 16)
- [EOP] 3.1 (2.2 - 3.7) 0.91 1.9 1.44 (1.17 - 1.71) 2.7 (1.4 - 3.9) 2.2 1.6 1.6 (0.9 - 2.7)
- [NP] 6.8 (4.9 - 11) 0.54 4.2 2.84 (2.46 - 3.23) 2.5 (0.1 - 4.8) 7.67 7.64 6.8 (2.8 - 15)
- [EOH] 6.9 (4.3 - 9.4) 1.4 5.4 3.9 (3.1 - 4.7) 4.3 (1.8 - 6.8) 7.0 5.9 6.3 (4.6 - 11)
- [AS+NH] 21 (13 - 25) 5.5 12 8.8 (7.4 - 10) 10.6 (9.3 - 11.8) 12.4 8.9 12 (5.3 - 19)
- [AP] 4.9 (3.9 - 8.5) 0.65 3.8 2.1 (1.83 - 2.37) 2.3 (1.2 - 3.4) 5.8 4.2 4.1 (2.0 - 8.0)
- [AH] 4.6 (3.3 - 7.0) 0.51 3.2 1.67 (1.10 - 2.24) 2.0 (0.2 - 3.8) 5.6 3.7 5.1 (2.5 - 10)
Chol 30 (25 - 42) 13 25 21 (14 - 28) 23.5 (20.8 - 26.1) 42 23 30 (18 - 40)
FFA 65 (33 - 75) 25 53 42 (21 - 63) 20 (3.0 - 37) 43 84 57 (22 - 66)
TG 9.7 (5.2 - 16) 5.9 15 10.2 (8.0 - 12.4) 18 (8.7 - 27) 3.7 12 21 (12 - 40)
ChE 41 (19 - 84) 31 103 46 (22 - 70) 72 (65 - 79) 9.6 102 80 (45 - 105)
PL, phospholipids; PE, phosphatidylethanolamin; ChSO4, cholesterol sulphate; GlcCer, glucosylceramides; CER, ceramides; [EOS], ceramide
from sphingosine and esterified ω-hydroxy fatty acid (FA); [NS], ceramide from sphingosine and non-hydroxy FA; [EOP], ceramide from
phytosphingosine and esterified ω-hydroxy FA; [NP], ceramide from phytosphingosine and non-hydroxy FA; [EOH], ceramide from 6-hydroxy
sphingosine and esterified ω-hydroxy FA; [AS+NH] ceramide from sphingosine and α-hydroxy FA and ceramide from 6-hydroxy sphingosine and
non-hydroxy FA; [AP], ceramide from phytosphingosine and α-hydroxy FA; [AH], ceramide from 6-hydroxy sphingosine and α-hydroxy FA; Chol,
cholesterol; FFA, free fatty acids; TG, triglycerides; ChE, cholesteryl ester.
123

Diskussion
6 Diskussion
Die Ergebnisse beider im Rahmen dieser Arbeit entstandener Studien zeigten im
Zusammenhang mit der epidermalen Lipidanalyse des Hundes interessante Aspekte
hinsichtlich des Einflusses der Probenahmetechnik, der beprobten Körperregion und
der Ceramidstandards, die zur Quantifizierung verwendet werden, auf, die bei der
Interpretation von Studien zu diesem Thema berücksichtigt werden sollten. Eine
minimal invasive Probenahmetechnik zur Gewinnung epidermaler Lipide des Hundes
konnte etabliert werden, unter deren Verwendung mögliche Zusammenhänge
zwischen der epidermalen Lipidzusammensetzung und Hauterkrankungen des
Hundes hergestellt werden konnten.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zunächst methodische Aspekte näher beleuchtet.
Das Ziel dieses Teils war es, drei verschiedene Probenahmetechniken zur
Gewinnung epidermaler Lipide hautgesunder Hunde miteinander zu vergleichen. Die
bisher zu diesem Thema erschienenen Studien verglichen meist die epidermalen
Lipide, und zwar hauptsächlich die Ceramide, gesunder Hunde mit denen von
Hunden mit Hauterkrankungen, hier vor allem atopischer Dermatitis (REITER et al.
2009; SHIMADA et al. 2009; POPA et al. 2011b; YOON et al. 2011; STAHL et al.
2012; YOON et al. 2013). Von diesen Studien waren nur zwei durch den Einsatz von
HPLC-MS in der Lage, alle der 11 beim Menschen bekannten Ceramidklassen zu
bestimmen (YOON et al. 2011; YOON et al. 2013). Mit der in der vorliegenden Studie
gewählten HPTLC-Methode konnte eine gute Auftrennung aller wichtigen
epidermalen Lipidfraktionen inklusive der acht wohlbekannten Ceramidbanden
erreicht werden. Da es nur zu fünf dieser Banden korrespondierende Standards gibt,
wurde die Identität aller Ceramidbanden massenspektrometrisch bestätigt. Diese
Kombination aus HPTLC und MS ermöglichte die Identifizierung von zumindest neun
Ceramidklassen in caniner Epidermis sowie Hinweise auf das Vorkommen von zwei
weiteren Klassen in der vorliegenden Studie.
Aufgrund fehlender Ceramidstandards muss die Quantifizierung der Ceramide als
problematisch angesehen werden. Manche Studien berechneten z. B. nur diejenigen
124

Diskussion
Ceramidklassen, für die auch korrespondierende Standards vorlagen (SHIMADA et
al. 2009; STAHL et al. 2009). Dieses Vorgehen kann zu
Interpretationsschwierigkeiten führen, wenn Aussagen über den
Gesamtceramidgehalt gemacht werden sollen. Andere Studien wiederum
quantifizierten alle Ceramidklassen nur anhand von einem oder zwei Standards
(POPA et al. 2010; YOON et al. 2011). Herauszufinden, inwieweit dies die
Ergebnisse beeinflussen kann, war ein Ziel der methodischen Versuche innerhalb
der vorliegenden Arbeit. Durch die Quantifizierung der Banden von CER[AP],
CER[AS+NH], CER[NP] und CER[NS] mit jedem der jeweiligen Standards konnten
Abweichungen der Ergebnisse von bis zu mehr als 40% vom Originalwert festgestellt
werden. Einzig die Berechnung von CER[NP] anhand des Standards von CER[AS]
und umgekehrt einerseits sowie die Berechnung von CER[NS] anhand des
Standards von CER[AP] und umgekehrt andererseits erschien möglich, da die
medianen Abweichungen dieser Berechnungen von den Ergebnissen, die durch die
korrespondierenden Standards erhalten wurden, unter 10% lagen. Dieser
bemerkenswerte Einfluss der verwendeten Ceramidstandards auf die Ergebnisse
könnte durch unterschiedliche Schwärzungsgrade der nach dem Kupfersulfat-
Phosphorsäure-Tauchbad veraschten Ceramide zustande kommen. So fanden wir
massenspektrometrisch z. B. ähnliche Subspecies in den Standards von CER[AP]
und CER[NP], allerdings waren die zugehörigen Massen der CER[AP]-Species viel
höher als diejenigen der CER[NP]-Species, was den höheren Schwärzungsgrad von
CER[AP] gegenüber CER[NP] erklärt. Aus diesem Grund sollten Ceramidbanden, zu
denen kein korrespondierender Standard erhältlich ist, mit demjenigen
Ceramidstandard quantifiziert werden, der ihrer Klasse am nächsten kommt. Für die
Berechnung der sehr langkettigen Ceramide [EOP] und [EOH] sollte der Standard zu
CER[EOS], für CER[AH] sollte aufgrund der ähnlichen Anzahl an Hydroxylgruppen
(NISHIFUJI u. YOON 2013) und Kettenlängen (YOON et al. 2013) der Standard zu
CER[AP] verwendet werden. Die unterschiedlichen Quantifizierungen könnten zum
Teil abweichende Ergebnisse dieser Arbeit gegenüber anderen Studien erklären,
auch im Hinblick auf den zweiten Teil dieser Dissertation.
125

Diskussion
Dass auch die Auswahl der Probenahmetechnik einen großen Einfluss auf die
Ergebnisse von Studien über die epidermale Lipidzusammensetzung haben kann,
bewiesen die Vergleiche zwischen den drei hier gewählten Methoden. So enthielten
die Proben aus Hitze-separierter Epidermis deutlich größere Lipidmengen als die
anderen Proben. Die Erklärung hierfür ist offensichtlich, da mit keiner der anderen
beiden Techniken die tieferen Schichten der Epidermis gewonnen werden konnten.
Aus diesem Grund machte ein Vergleich der absoluten Werte wenig Sinn, sodass die
drei Techniken ausschließlich anhand der prozentualen Werte der Lipidfraktionen
verglichen wurden. Dies beinhaltete allerdings wiederum den Nachteil der
gegenseitigen Beeinflussung aller Werte bei prozentualen Vergleichen, was die
Erklärung für die niedrigeren prozentualen Werte der Ceramide, des Cholesterols
und der Cholesterylester in Hitze-separierter Epidermis verglichen mit den anderen
Proben liefern könnte. Hingegen waren die prozentualen Konzentrationen an
Phospholipiden, freien Fettsäuren und Triglyzeriden in den Biopsieproben viel höher,
möglicherweise durch Kontaminationen von Lipiden aus der Dermis oder der
Subkutis oder einfach dadurch, dass Lipide tieferer epidermaler Schichten
mitgemessen wurden. Ersteres könnte durch die schwierige Probenaufbereitung der
Biopsien bedingt sein, da die Separation der Epidermis aufgrund der geringen Größe
der Biopsien oftmals eine Herausforderung darstellte. Dieses Problem wurde auch
durch die hohe Varianz innerhalb dieser Probenahmetechnik reflektiert, was in einer
niedrigen Reproduzierbarkeit resultierte.
Die Gewinnung epidermaler Lipide durch die „skin scrub“-Technik ergab größere
Lipidmengen pro Quadratzentimeter als durch Hautgeschabsel. Auch die
Konzentrationen an Phospholipiden waren in den „skin scrub“-Proben höher als in
den Hautgeschabseln. Dies lässt vermuten, dass durch „skin scrub“ tiefere Schichten
der Epidermis beprobt werden als durch Geschabsel, da der Phospholipidgehalt mit
der Tiefe der Epidermis zunimmt (LAMPE et al. 1983b). Die niedrigeren prozentualen
Werte von Ceramiden und Cholesterol in den Geschabseln verglichen mit den „skin
scrubs“ könnten durch den Einfluss der höheren prozentualen Werte von freien
Fettsäuren in den Geschabseln entstanden sein.
126

Diskussion
Signifikante Unterschiede im Ceramidprofil konnten zwischen den verschiedenen
Probenahmetechniken nur selten gefunden werden. Solche Unterschiede könnten
sich im Falle einer größeren Studienpopulation weniger ausprägen. Nichtsdestotrotz
stimmen die Ergebnisse der vorliegenden Studie bezüglich des caninen epidermalen
Ceramidprofils größtenteils mit denen anderer Studien beim Hund überein. Allerdings
fanden wir prozentuale Anteile von CER[EOH] zwischen 14 und 20%, wovon POPA
et al. (2010) nur Spuren fanden. YOON et al. (2011) isolierten ca. 9% CER[EOH].
Eine Erklärung für diese Abweichungen könnte sowohl in unterschiedlichen HPTLC-
Methoden, in unterschiedlich verwendeten Ceramidstandards zur Quantifizierung der
Ceramide als auch in unterschiedlichen Arten der Quantifizierung (prozentuale Werte
auf Gesamtceramidmenge bezogen [POPA et al. 2010], Mikrogramm pro Milligramm
Protein [YOON et al. 2011], Mikrogramm pro Quadratzentimeter [die vorliegende
Studie]) liegen. Natürlich können hierbei auch die Probenahmetechnik und die Größe
der Studienpopulation eine Rolle spielen.
Da die Reproduzierbarkeit von Hautgeschabsel und „skin scrub“ vergleichbar hoch
war und kaum Unterschiede im Lipid- und Ceramidprofil zwischen diesen
Probenahmetechniken bestanden, scheinen beide Methoden geeignet zur
Gewinnung epidermaler Lipide beim Hund zu sein. Allerdings könnten bei der
Probenahme durch Hautgeschabsel von entzündeten Hautarealen lebender Hunde
Kontaminationen mit Blut auftreten, was zu verfälschten Lipidmessungen führen
würde. Trotz möglicher Hautirritationen durch das Lösungsmittel während der „skin
scrub“-Prozedur kann diese Methode als weniger invasiv als Hautgeschabsel
angesehen werden. Weitere Vorteile der „skin scrub“-Technik sind die einfachere
Handhabbarkeit der Proben und die größere Proben- und damit auch Lipidmenge,
die mit dieser Methode gegenüber Hautgeschabseln gewonnen werden kann.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle Versuche des zweiten Teils dieser Arbeit mit
der „skin scrub“-Technik durchgeführt. Bereits im ersten Studienteil konnten
Hinweise auf Unterschiede im Lipidprofil zwischen der Inguinalregion und der Kruppe
gefunden werden. Im Hinblick auf Auswirkungen auf die Studienplanung bei
Untersuchungen des epidermalen Lipidmusters von Hunden mit Hauterkrankungen
127

Diskussion
sollte der Einfluss der Körperregion näher untersucht werden. Da zunächst acht
Körperregionen hautgesunder Hunde beprobt werden sollten, um Körperstellen, die
häufiger Läsionen bei caniner atopischer Dermatitis entwickeln, mit solchen, die dies
gewöhnlich nicht tun, zu vergleichen, wurde aufgrund der Art und Anzahl der
Lokalisationen entschieden, diese Untersuchungen an frisch toten Hunden
durchzuführen. Übereinstimmend mit einer ähnlichen Studie vom Menschen
(YOSHIKAWA et al. 1994) konnte kein Zusammenhang zwischen der
Gesamtlipidmenge oder der Konzentration einer bestimmten Lipidfraktion und der
Tendenz einer Körperregion, atopische Hautveränderungen zu entwickeln oder nicht,
bei gesunder Hundehaut hergestellt werden. Die Prädisposition mancher
Körperregionen, atopische Läsionen zu entwickeln, scheint also nicht durch einen
per se niedrigeren Lipid- oder Ceramidgehalt verursacht zu sein. Vielmehr könnten
andere Faktoren, wie z. B. die geringere Behaarung oder die stärkere mechanische
Belastung solcher Lokalisationen, zu einem intensiveren Allergenkontakt führen.
Trotz intensiver Literaturrecherche konnten bislang keine Studien entdeckt werden,
die regionale Einflüsse auf die Lipidzusammensetzung gesunder Hundehaut
untersucht haben. Obwohl keine Unterschiede im Gesamtlipidgehalt zwischen den
Körperregionen gefunden werden konnten, gab es doch Unterschiede in der
Lipidzusammensetzung. Die Variationen der Mengen an Triglyzeriden und
Cholesterylestern können durch die regional unterschiedliche Verteilung der
Talgdrüsen (PAVLETIC 2003) erklärt werden, da diese Lipide zu großen Teilen aus
dem Sebum stammen (YOON et al. 2013). Die geringeren Mengen an Triglyzeriden
und Cholesterylestern, die in der betroffenen Haut des Hundes mit Sebadenitis
verglichen mit seiner klinisch unauffälligen Haut gemessen wurden, scheinen dies
weiterhin zu bestätigen.
Auch beim Menschen wurden regionale Unterschiede in der epidermalen
Lipidzusammensetzung festgestellt, und zwar in Form von größeren Mengen an
Cholesterolsulfat, Cholesterol und Sphingolipiden in der Haut der Sohle als von
Gesicht, Bauch oder Beinen (LAMPE et al. 1983a), was mit den höheren
Konzentrationen der gleichen Lipidfraktionen am palmaren Metakarpus gegenüber
den anderen Körperstellen, die in der vorliegenden Studie gemessen wurden,
128

Diskussion
übereinstimmt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die Lipidzusammensetzung
der menschlichen Epidermis auch saisonalen Veränderungen unterliegt, welche
regional unterschiedlich ausgeprägt zu sein scheinen (YOSHIKAWA et al. 1994).
Dieser Aspekt wurde beim Hund bisher nicht untersucht und daher in dieser Arbeit
nicht berücksichtigt, könnte aber Gegenstand einer weiteren Studie unter
Verwendung der minimal invasiven „skin scrub“-Technik werden. Regionale
Abweichungen im epidermalen Lipidmuster können außerdem durch eine starke
inter-individuelle Streuung, wie sie in der vorliegenden Arbeit festgestellt und auch
hinsichtlich struktureller Eigenschaften der caninen Epidermis bereits beschrieben
werden konnte (LLOYD u. GARTHWAITE 1982), maskiert werden (NORLEN et al.
1999).
Im Gegensatz zu gesunder Hundehaut wurden Unterschiede zwischen betroffenen
und klinisch unauffälligen Körperregionen der in dieser Studie getesteten atopischen
Hunde durch signifikant niedrigere Konzentrationen der Gesamtlipide und besonders
der Ceramidklassen in betroffener gegenüber klinisch unauffälliger Haut reflektiert,
die durch die Entzündungsprozesse in betroffener Haut entstanden sein könnten.
Eine durch Allergenexposition ausgelöste Entzündungsreaktion verschlechterte die
epidermale Barrierefunktion der betroffenen Hautareale von experimentell
sensibilisierten Beagles (HIGHTOWER et al. 2010; STAHL et al. 2012). Außerdem
konnten HIGHTOWER et al. (2010) zeigen, dass bei sensibilisierten Hunden der
transepidermale Wasserverlust an sieben von zehn Körperstellen, wovon sechs
dieser Stellen prädisponiert für die Entwicklung atopischer Läsionen waren, schon
vor der Allergenexposition, also vor dem Auftreten sichtbarer Hautveränderungen,
gegenüber normalen Hunden erhöht war. Da SHIMADA et al. (2009) in ihrer Studie
eine negative Korrelation zwischen transepidermalem Wasserverlust und
epidermalem Ceramidgehalt andeuteten, könnte man annehmen, dass in
Körperregionen mit Prädisposition für atopische Läsionen auch schon vor dem
Allergenkontakt niedrigere Ceramidkonzentrationen vorliegen. Diese veränderte
Lipidzusammensetzung könnte eine schnellere Entzündungsreaktion triggern, die
wiederum die Entstehung atopischer Hautveränderungen gegenüber anderen
Körperregionen begünstigen würde.
129

Diskussion
Frühere Studien (SHIMADA et al. 2009; YOON et al. 2011; STAHL et al. 2012)
fanden im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit keine signifikanten Unterschiede
zwischen betroffener und klinisch unauffälliger Haut von atopischen Hunden, wofür
die Beprobung von klinisch unauffälliger Haut in der Nähe der betroffenen Haut ein
möglicher Grund sein könnte. Die Nähe der beiden zu beprobenden Stellen wurde
vermutlich gewählt, um Unterschiede im Lipidmuster aufgrund verschiedener
Körperpartien zu vermeiden. Da in der vorliegenden Arbeit der laterale Thorax als zu
beprobende klinisch unauffällige Hautpartie atopischer Hunde gewählt wurde und
keine wesentlichen Unterschiede zwischen dieser Körperregion und der
Achselregion - der häufigsten in dieser Studie beprobten betroffenen Stelle bei
atopischen Hunden - in gesunder Haut gefunden wurden, wurden die betroffenen
und die klinisch unauffälligen Körperstellen der atopischen Hunde direkt miteinander
verglichen.
Die Möglichkeit, die Lipidzusammensetzung verschiedener Körperregionen, wie z. B.
betroffener und klinisch unauffälliger Haut von Hunden mit Hauterkrankungen,
miteinander zu vergleichen, ist ein Vorteil minimal invasiver Probenahmetechniken.
Die „skin scrub“-Technik gehört zu diesen minimal invasiven Methoden. Diese
Methode wurde bereits unter Verwendung eines Detergenz statt eines
Lösungsmittels zur Gewinnung der bakteriellen Hautflora erfolgreich beim Hund
eingesetzt (IHRKE et al. 1978). Laut dieser Studie können umgängliche Hunde mit
der betreffenden Methode ohne Anästhesie und mit minimalen Zwangsmaßnahmen
beprobt werden, was mit den Erfahrungen der Autorin während der Probenahme von
lebenden Hunden übereinstimmt. Die durch das in der vorliegenden Studie
verwendete Lösungsmittel auftretenden Hautveränderungen erschienen tolerabel,
zumal sie innerhalb weniger Tage wieder abklangen. Die vergleichsweise hohe
Toleranz dieser Lösungsmittelkombination durch die Haut wurde schon zuvor durch
Studien bei Menschen und Schweinen belegt, in denen Mischungen aus Hexan und
Alkoholen zur Extraktion epidermaler Lipide angewendet wurden, ohne starke
Irritationen auszulösen (BONTE et al. 1995; NORLEN et al. 1999; MONTEIRO-
RIVIERE et al. 2001; FARWANAH et al. 2005a). Die „skin scrub“-Technik scheint
130

Diskussion
also eine praktikable, relativ schmerzlose Methode zur Gewinnung epidermaler
Lipide von Hunden zu sein.
Obwohl man an den Ergebnissen dieses Teils der Arbeit bemängeln könnte, dass die
epidermalen Lipide von lebenden atopischen Hunden mit denen toter Kontrollhunde
verglichen wurden, so sind diese Ergebnisse dennoch vergleichbar mit denen aus
humanen Hautlipidstudien, die ebenfalls geringere Mengen an Gesamtlipiden und
Ceramiden in der Haut atopischer Patienten (IMOKAWA et al. 1991), jedoch keine
Unterschiede in der prozentualen Lipidzusammensetzung finden konnten
(IMOKAWA et al. 1991; YAMAMOTO et al. 1991). Allerdings existieren zwei Studien,
die signifikante Veränderungen des relativen Ceramidgehalts bzw. des prozentualen
Ceramidprofils in der Epidermis atopischer Hunde nachwiesen (REITER et al. 2009;
SHIMADA et al. 2009). Eine mögliche Erklärung für diese Abweichungen könnte in
der unterschiedlichen Bestimmung der Ceramidkonzentrationen liegen. Während in
der vorliegenden Arbeit acht Banden, die wenigstens neun Ceramidklassen
beinhalteten, quantifiziert wurden, haben SHIMADA et al. (2009) nur zwei
Ceramidklassen gemessen und konnten REITER et al. (2009) nur fünf
Ceramidklassen identifizieren. Der signifikant reduzierte relative Gehalt an
Gesamtceramiden und Ceramidklassen könnte aufgrund der fehlenden
Ceramidfraktionen, die nicht gemessen wurden, entstanden sein. Natürlich können
auch die unterschiedlichen Probenahmetechniken zu den abweichenden
Ergebnissen beigetragen haben.
Im Gegensatz zu den prozentualen Vergleichen stimmen die Ergebnisse dieser
Studie hinsichtlich der Unterschiede der absoluten Lipidkonzentrationen zwischen
atopischer und normaler Hundehaut größtenteils mit denen einer neueren Studie
überein (YOON et al. 2011), die ausschließlich die epidermale Zusammensetzung
der Ceramide von atopischen mit gesunden Hunden verglich. Hierbei wurden
signifikant niedrigere absolute Mengen der Gesamtceramide sowie der
Ceramidklassen CER[EOS], CER[NS+NdS], CER[EOP], CER[NP] and CER[AS+NH]
in betroffener und klinisch unauffälliger Haut der atopischen Hunde gefunden.
Übereinstimmend mit einer weiteren aktuellen Studie (STAHL et al. 2012) konnten
auch in der vorliegenden Arbeit keine höheren Konzentrationen an
131

Diskussion
Glucosylceramiden in atopischer Hundehaut nachgewiesen werden, wie durch POPA
et al. (2011b) beschrieben. Aufgrund dessen kann von der vorliegenden Studie
ausgehend deren Postulierung eines möglichen Defizits der β-Glucocerebrosidase-
Aktivität in atopischer Hundehaut, welches zu den reduzierten
Ceramidkonzentrationen führen könnte, nicht zugestimmt werden. Vielmehr würden
die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu einer erhöhten Sphingomyelin-
Glucosylceramid-Deacylase-Aktivität als zugrunde liegendem Mechanismus für den
Ceramidmangel in caniner atopischer Dermatitis passen, wie für die menschliche
Erkrankung beschrieben (IMOKAWA 2009). Allerdings wurden hierzu bisher keine
Untersuchungen beim Hund durchgeführt.
Die bisher beschriebenen Ergebnisse hinsichtlich der reduzierten Lipid- oder
Ceramidmengen scheinen jedoch nicht allein bei atopischer Dermatitis ausgeprägt
zu sein. Ähnliche Veränderungen im epidermalen Ceramidmuster wurden auch für
andere Hauterkrankungen des Menschen beschrieben, wie z.B. für Psoriasis
(CODERCH et al. 2003). In der vorliegenden Studie wurden analoge Beobachtungen
für andere Hauterkrankungen des Hundes gemacht, indem hier ähnlich erniedrigte
Ceramidkonzentrationen in der betroffenen und klinisch unauffälligen Haut des
Pudelmischlings mit Kontaktdermatitis sowie der zwei Hunde mit
Flohspeicheldermatitis im Vergleich zu normaler Haut festgestellt werden konnten.
Obwohl die Aussagekraft dieser Ergebnisse aufgrund der nur exemplarischen
Beschreibung als zweifelhaft angesehen werden kann, so könnten solche
Veränderungen des Lipidmusters in weiteren Hauterkrankungen des Hundes auf
sekundäre Veränderungen zu einer (allergisch oder immunologisch vermittelten)
Entzündung hindeuten. Diese Hypothese wird auch durch die Studie von STAHL et
al. (2012) bestätigt, in welcher die nach Allergenexposition reduzierten
Ceramidkonzentrationen in der Haut experimentell auf Hausstaubmilben
sensibilisierter Hunde innerhalb von zwei Monaten nach Abschluss der Exposition
wieder ihre Ausgangswerte erreichten. Wie teilweise bereits von OLIVRY et al.
(2011) angeregt, stellen diese Beobachtungen interessante Aspekte für
weiterführende Studien dar.
132

Diskussion
Studien über Hunde mit atopischer Dermatitis konnten belegen, dass sowohl die
topische Applikation einer aus Hautlipiden bestehenden Lotion als auch die
systemische Zufuhr essentieller Fettsäuren zu einer strukturellen und inhaltlichen
Verbesserung der epidermalen Barriereeigenschaften führte (PIEKUTOWSKA et al.
2008; POPA et al. 2011a; POPA et al. 2012). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
lassen einen solch vorteilhaften Effekt nicht nur bei Hunden mit atopischer
Dermatitis, sondern auch bei Hunden mit anderen Hauterkrankungen, wie z. B.
Kontaktdermatitis oder Flohspeicheldermatitis, vermuten. Es existieren allerdings
bisher nur wenige Studien, die den klinischen Effekt solcher Supplementierungen
untersucht haben (OLIVRY 2011). Sollten die Defekte der Hautbarriere bei manchen
Hauterkrankungen, wie z. B. der caninen atopischen Dermatitis, primären Ursprungs
sein, ließen sich mit der Zufuhr spezifischer Lipidformulierungen vielleicht sogar
vorbeugende Maßnahmen ergreifen (MARSELLA et al. 2011). In einem solchen Fall
käme es auf die Zusammensetzung der Lipidmischung an, denn nur, wenn in der
Epidermis schließlich ein ausgewogenes Verhältnis der Lipide zueinander vorliegt,
verbessern sich die epidermalen Barriereeigenschaften (CODERCH et al. 2003). Da
in der vorliegenden Studie kaum Unterschiede in der prozentualen Verteilung der
epidermalen Lipide zwischen atopischer und normaler Hundehaut gefunden wurden,
sollte eine solche Lipidmischung die Hautlipide also im gleichen Verhältnis
beinhalten, wie sie in gesunder Hundehaut vorliegen, um bei caniner atopischer
Dermatitis einen positiven Effekt zu erzielen.
Abschließend betrachtet, konnte diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Forschung
über die epidermalen Lipide des Hundes leisten, indem sie demonstrierte, dass bei
der Interpretation bestehender Studien zu diesem Thema einige Faktoren
berücksichtigt werden sollten. Nicht nur die Probenahmetechnik, sondern besonders
auch die Ceramidstandards, die zur Quantifizierung eingesetzt werden, können einen
großen Einfluss auf die gemessene Lipid- und besonders Ceramidzusammensetzung
haben.
Auch die beprobte Körperregion kann die Ergebnisse beeinflussen, da bestimmte
regionale Unterschiede im Lipidmuster normaler Hundehaut existieren. Im Hinblick
133

Diskussion
auf die canine atopische Dermatitis konnten in prädisponierten Regionen keine
Besonderheiten der epidermalen Lipidzusammensetzung im Vergleich zu nichtprädisponierten
Körperstellen von Hunden ohne Hauterkrankungen nachgewiesen
werden. Durch den Vergleich zu Lokalisations-spezifischen Kontrollen wurden
ausgeprägte Veränderungen des Lipidgehalts und der -zusammensetzung,
besonders bezüglich der Ceramide, sowohl in betroffener als auch in klinisch
unauffälliger Haut atopischer Hunde festgestellt. Die Frage nach dem Ursprung der
Lipidveränderungen und der daraus resultierenden gestörten Barrierefunktion in der
atopischen Hundehaut (primär oder sekundär) bleibt auch weiterhin unbeantwortet.
Ein Hauptziel der vorliegenden Arbeit konnte erreicht werden, indem die „skin scrub“-
Technik als minimal invasive und praktikable Methode zur Gewinnung epidermaler
Lipide von Hunden bewertet werden konnte, deren Anwendung reproduzierbare
Ergebnisse im Hinblick auf Veränderungen im epidermalen Lipidmuster atopischer
Hunde erbrachte.
Wie bereits in dieser Arbeit angedeutet, lassen sich Veränderungen der epidermalen
Lipidzusammensetzung auch bei anderen Hauterkrankungen des Hundes
bestimmen. Hier bieten sich weiterführende Studien an, um möglicherweise
Veränderungen der Hautlipide zwischen den einzelnen Hauterkrankungen abgrenzen
zu können. Im Falle deutlicher Unterschiede könnten solche Untersuchungen in
Zukunft als diagnostische Hilfsmittel eingesetzt werden, v. a. wenn weitere Studien
beweisen würden, dass die Abweichungen im epidermalen Lipidmuster bei
bestimmten Hauterkrankungen primär vorliegen. Wie auch von MARSELLA et al.
(2011) und OLIVRY (2011) vorgeschlagen, könnten Studien über die epidermalen
Barriereeigenschaften vor und nach der Behandlung mit entzündungshemmenden
Medikamenten, die die Beurteilung klinischer Veränderungen der behandelten Hunde
beinhalten sollten, einen deutlichen Hinweis hierauf liefern. Wie in der vorliegenden
Arbeit sollten diese Studien die Untersuchung betroffener und klinisch unauffälliger
Hautpartien umschließen, da die Effekte sekundärer Veränderungen in betroffener
Haut sicherlich größer sind als in klinisch unauffälliger. Um solche Studien mit
ausreichend großer Patientenzahl durchführen zu können, sind minimal invasive
Probenahmetechniken erforderlich, deren Bearbeitung wenig aufwendig ist und die
134

Diskussion
verhältnismäßig große Lipidmengen und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Die
„skin scrub“-Technik scheint hierfür bestens geeignet zu sein.
135

Zusammenfassung
7 Zusammenfassung
Mandy Angelbeck-Schulze (2013)
Das Lipidmuster der caninen Epidermis - Untersuchungen zum Einfluss
verschiedener Probenahmetechniken, Körperregionen und ausgewählter
Hauterkrankungen
Die epidermalen Lipide sind von großem Interesse in der dermatologischen
Forschung im Veterinärbereich, ganz besonders mit Blick auf die canine atopische
Dermatitis. Die Existenz vieler verschiedener Probenahmetechniken erschwert die
Interpretation von Studienergebnissen in diesem Bereich. Daher war das Ziel des
ersten Teils dieser Arbeit, drei verschiedene Probenahmetechniken miteinander zu
vergleichen und eine minimal invasive Methode für die Gewinnung epidermaler
Lipide des Hundes zu etablieren. Im zweiten Studienteil wurden unter Verwendung
dieser minimal invasiven Probenahmetechnik regionale Unterschiede des
Lipidmusters von Hunden ohne Hauterkrankungen sowie Abweichungen der
epidermalen Lipidzusammensetzung von Hunden mit ausgewählten
Hauterkrankungen untersucht, um die Eignung dieser Methode für derartige
Untersuchungen zu prüfen.
Im ersten Teil wurden die Inguinalregion und die Kruppe von fünf Hunden ohne
Hautveränderungen postmortal beprobt. Die Proben jeder Körperregion beinhalteten
Hitze-separierte Epidermis von drei Stanzbiopsien der Haut, drei Hautgeschabsel
und drei „skin scrubs“. Die Lipide wurden durch
Hochleistungsdünnschichtchromatographie analysiert. Die entstandenen Banden
wurden über korrespondierende Standards, Retardationsfaktoren und
massenspektrometrische Analysen identifiziert. Untersucht wurden die Einflüsse der
Probenahmetechnik, der Körperregion und der zur Quantifizierung eingesetzten
Ceramidstandards auf die Ergebnisse. Die Kruppe enthielt signifikant höhere
prozentuale Anteile an Cholesterolsulfat, Cholesterylestern und Triglyzeriden
gegenüber der Inguinalregion. Zwischen den verschiedenen Probenahmetechniken
136

Zusammenfassung
wurden die deutlichsten Unterschiede zwischen Hitze-separierter Epidermis und
„skin scrub“ gefunden, mit signifikant höheren prozentualen Anteilen an
Phospholipiden, freien Fettsäuren und Triglyzeriden sowie an den Ceramidklassen
[EOH] und [NP] und signifikant niedrigeren prozentualen Anteilen an
Gesamtceramiden, Cholesterol und Cholesterylestern sowie an den Ceramidklassen
[AS+NH] und [NS] in ersterer gegenüber „skin scrubs“. Hautgeschabsel und „skin
scrub“ besaßen eine hohe Reproduzierbarkeit mit größerer inter-individueller als
intra-individueller Varianz, wohingegen die Ergebnisse der Hitze-separierten
Epidermis meist wenig reproduzierbar waren. Außerdem konnte in diesem Teil der
Studie ein bedeutender Einfluss der zur Quantifizierung verwendeten
Ceramidstandards auf das gemessene Ceramidprofil festgestellt werden, in einigen
Fällen in Form von medianen Abweichungen der Messwerte von bis zu 45% von den
Originalmesswerten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden acht verschiedene Körperregionen, von denen
fünf eine hohe (Innenfläche der Pinna, Lefze, palmarer Metakarpus, axillar, inguinal)
und drei eine niedrige Prädisposition zur Entwicklung atopischer Hautveränderungen
haben (lateraler Thorax, laterales Abdomen, Kruppe), von acht toten Kontrollhunden
sowie jeweils eine betroffene und eine klinisch unauffällige Körperstelle von 12
atopischen Hunden und vier Hunden mit anderen Hauterkrankungen mit der „skin
scrub“-Technik beprobt. Die Lipidfraktionen wurden ebenso wie im ersten Teil der
Studie mit Hochleistungsdünnschichtchromatographie aufgetrennt und
densitometrisch analysiert. Es konnten keine Unterschiede im Gesamtlipidgehalt der
Epidermis zwischen den acht Körperregionen der Kontrollhunde festgestellt werden.
Allerdings enthielten die Pinna, die Lefze und die Kruppe signifikant niedrigere
Konzentrationen an Ceramiden, wohingegen der palmare Metakarpus und die
Achselregion signifikant höhere Mengen an Ceramiden und Cholesterol als die
meisten anderen beprobten Regionen enthielten. Die Mengen an Gesamtlipiden und
-ceramiden inklusive aller Ceramidklassen waren signifikant niedriger sowohl in
betroffener Haut als auch in klinisch unauffälliger Haut der atopischen Hunde
verglichen mit normaler Haut, wobei die Reduktion in betroffener Haut ausgeprägter
war. Die Probenahme mit der „skin scrub“-Technik konnte an den lebenden Hunden
137

Zusammenfassung
ohne Sedation durchgeführt werden und verursachte kaum Irritationen an den
beprobten Hautstellen.
Zusammenfassend konnten bestimmte regionale Unterschiede im epidermalen
Lipidmuster bei Hunden ohne Hautveränderungen festgestellt werden, aber es ließen
sich keine Besonderheiten in der Lipidzusammensetzung mancher Körperregionen
mit höherer Prädisposition für atopische Hautveränderungen gegenüber solchen
ohne diese Prädisposition nachweisen. Die „skin scrub“-Technik erwies sich als eine
minimal invasive und praktikable Methode zur Gewinnung epidermaler Lipide von
Hunden, die vergleichbare Ergebnisse zum Hautgeschabsel lieferte und
reproduzierbare Ergebnisse bezüglich von Veränderungen im epidermalen
Lipidmuster atopischer Hunde erbrachte. Diese Methode scheint bestens zur
Untersuchung des epidermalen Lipidmusters auch anderer Hauterkrankungen des
Hundes geeignet zu sein, um auf dieser Grundlage gegebenenfalls neue
diagnostische und therapeutische Ansätze zu liefern.
138

Summary
8 Summary
Mandy Angelbeck-Schulze (2013)
The lipid profile of canine epidermis - Comparative investigations of different
sampling methods, body sites and selected skin diseases
Epidermal lipids are of major interest in veterinary dermatological research,
especially in canine atopic dermatitis. Due to several existing sampling methods,
interpretation of study results is often complicated. Thus, the first part of this study
aimed to compare three different sampling methods and to establish a minimally
invasive method for collecting canine epidermal lipids. The second part of this study
investigated regional variations in canine epidermal lipid composition and deviations
of skin lipid contents in dogs with certain skin diseases by using this minimally
invasive sampling method in order to test the suitability of this technique for such
examinations.
Skin samples from five dogs with no obvious skin abnormalities were taken from the
caudal back and the inguinal region post mortem. The samples of each site consisted
of heat-separated epidermis of three punch biopsies, three scrapes and three skin
scrubs. The lipids were analysed by high performance thin layer chromatography, the
resulting bands were identified by using corresponding standards, retardation factors
and mass spectrometry. The influences of the sampling method, the body site and
the ceramide standards used for quantification were investigated. The skin at the
caudal back contained significantly higher percentages of cholesterol sulphate,
cholesteryl esters and triglycerides compared to the inguinal region. Between the
three different sampling methods, the most pronounced discrepancies were found
between heat-separated epidermis and skin scrub with significantly higher
percentages of phospholipids, free fatty acids and trigycerides as well as of the
ceramide classes [EOH] and [NP] and significantly lower percentages of total
ceramides, cholesterol and cholesteryl esters as well as of the ceramide classes
[AS+NH] and [NS] in the former samples compared to skin scrubs. The
139

Summary
reproducibility was high for scraping and skin scrub, but was low for heat-separated
epidermis. Furthermore, this part of the study revealed a marked influence of
ceramide standards on the results regarding the ceramide profile. In some cases, the
median deviations of the measurements were even greater than 40 percent
compared to the original measurements.
For the second part of this study, eight different body sites, five of which with high
(concave pinna, flew, palmar metacarpus, axillary, inguinal) and three of which with
low predisposition to atopic lesions (lateral thorax, lateral abdomen, caudal back), of
eight dead control dogs as well as lesional and non-lesional skin of 12 atopic dogs
and of four dogs with other skin diseases were sampled by the skin scrub technique.
Lipid fractions were separated by high performance thin layer chromatography and
analysed densitometrically as described in the first part of this study. Contrary to the
lipid composition, no significant differences in total lipid content were found between
the body sites tested in the control dogs. Compared to most other body sites tested,
the pinna, the flew and the caudal back contained significantly lower concentrations
of ceramides, whereas the palmar metacarpus and the axillary region contained
significantly higher amounts of ceramides and cholesterol. The amounts of total lipids
and ceramides including all ceramide classes were significantly lower in both lesional
and non-lesional skin of atopic dogs compared to normal skin, the reduction being
more pronounced in lesional skin. The skin lipid sampling by skin scrub was possible
without sedation in living dogs and hardly caused irritations at the areas sampled.
In conclusion, certain regional variations were shown in the epidermal lipid and
ceramide composition of dogs without skin abnormalities, but no particular variations
of the lipid composition of body sites with higher predispositions to develop atopic
lesions compared to sites without this predisposition were detected. We were able to
evaluate the skin scrub technique as a minimally invasive and practicable epidermal
lipid sampling method, which produced comparable results to scrapings and provided
reproducible results regarding alterations of skin lipid composition in canine atopic
dermatitis. This method might be suitable for investigations of the epidermal lipid
composition in further canine skin diseases to possibly reveal new diagnostic and
therapeutic prospects.
140

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Tabellarischer Anhang
10 Tabellarischer Anhang
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Probenahmetechniken im ersten Studienteil untersuchten Hunde.
Hund Rasse Geschlecht
Alter
(in Jahren)
Euthanasiegrund
1 Deutsch Kurzhaar MK 14,7 Dyspnoe, V.a. Larynxparalyse
2 Berner Sennenhund W 4,0 Glomerulonephritis
3 Mischling MK 13,9 Parese nach Autounfall
4 Dalmatiner MK 9,6 V.a. Hämangiosarkom
5 Mischling MK 11,4 unbekannt, tot eingeliefert
MK: männlich-kastriert W: weiblich V.a.: Verdacht auf
163

Tabellarischer Anhang
Tab. A2a: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus Hitze-separierter Epidermis der fünf
toten Hunde aus dem ersten Studienteil.
Hund Körperregion Probe PC PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1 35 9,3 4,2 - - - - 101 - -
inguinal 2 51 17 7,7 7,9 87 63 109 369 - 712
1
3 46 15 6,1 - 79 43 78 472 - 738
1 45 14 15 32 109 77 159 101 44 595
Kruppe 2 40 14 9,0 15 81 32 77 55 16 339
3 42 13 9,8 - - - - - - -
1 53 18 3,7 15 93 73 127 31 15 428
inguinal 2 52 18 4,1 16 97 62 114 45 7,7 416
2
3 35 13 3,7 11 75 49 105 35 9,3 335
1 42 10 4,7 12 98 60 132 31 6,3 396
Kruppe 2 46 12 5,4 11 99 54 105 52 10 395
3 37 12 4,6 11 75 62 115 47 11 374
1 89 31 8,6 11 90 69 221 163 9,7 692
inguinal 2 73 28 6,9 13 66 51 246 155 7,5 648
3
3 22 4 1,6 7,9 47 46 263 180 8,3 579
1 47 12 5,5 14 69 67 258 159 13 644
Kruppe 2 43 13 3,2 12 63 66 276 304 29 809
3 29 6,6 3,3 14 58 68 297 108 25 608
1 45 9,4 1,8 5,3 61 51 97 279 13 562
inguinal 2 47 9,2 2,2 7,7 64 57 93 354 12 646
4
3 25 3,5 1,2 9,7 51 59 161 112 7,5 431
1 44 13 4,1 8,8 65 65 127 138 37 502
Kruppe 2 57 18 4,4 8,8 56 65 105 84 37 435
3 47 19 6,2 14 76 49 121 76 12 421
1 53 19 3,9 13 109 83 182 92 13 568
inguinal 2 56 22 2,6 12 104 75 182 317 28 799
5
3 66 25 4,6 19 103 92 252 325 19 907
1 59 19 4,6 7,5 72 58 98 133 53 504
Kruppe 2 65 22 4,8 7,1 65 60 70 57 62 414
3 64 19 4,9 6,0 58 57 80 34 58 382
PL: Phospholipide GlcCer: Glucosylceramide FFA: freie Fettsäuren ChE: Cholesterylester
PE: Phosphatidylethanolamin Cer: Ceramide TG: Triglyzeride Lip: Gesamtlipide
ChSO4: Cholesterolsulfat Chol: Cholesterol – : Fehlwerte (nicht auswertbare Messung)
164

Tabellarischer Anhang
Tab. A2b: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus Hitze-separierter Epidermis der fünf toten Hunde aus
dem ersten Studienteil.
Hund Körperregion Probe [AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
1 - - - - - - - 2,5
inguinal 2 6,2 8,6 33 10 12 3,8 9,1 4,5
1
3 3,1 6,1 29 12 16 4,7 3,5 4,3
1 11 11 22 13 16 10 15 11
Kruppe 2 8,6 8,4 19 8,6 13 6,9 7,4 8,7
3 - - - - - - - -
1 3,6 5,6 21 25 16 4,0 8,6 9,8
inguinal 2 4,1 6,1 24 23 16 4,8 10 8,9
2
3 3,0 5,7 17 20 15 2,3 5,7 6,6
1 4,8 5,6 16 23 20 4,6 7,6 17
Kruppe 2 4,5 5,7 16 21 20 4,9 9,2 18
3 4,8 6,1 16 19 11 3,0 6,8 8,5
1 4,3 6,1 26 15 11 5,2 10 11
inguinal 2 3,3 4,3 15 16 13 3,0 6,3 5,9
3
3 2,1 3,4 6,0 18 11 1,1 2,0 3,1
1 4,9 6,2 13 19 12 1,7 6,0 5,8
Kruppe 2 3,5 5,6 13 20 10 1,8 4,4 4,9
3 3,9 5,7 10 20 8,5 1,4 4,4 4,3
1 2,7 3,7 15 11 13 2,0 7,5 5,8
inguinal 2 2,6 3,9 17 12 15 1,8 7,5 4,7
4
3 1,6 2,5 7,9 14 16 1,8 3,8 3,4
1 3,4 5,9 14 12 14 1,8 8,9 4,5
Kruppe 2 2,7 4,8 12 11 12 2,0 8,3 2,8
3 3,3 6,1 20 15 15 4,0 8,8 3,7
1 7,0 9,3 28 25 22 3,7 10 3,7
inguinal 2 5,5 7,5 28 17 16 6,3 16 8,2
5
3 5,1 6,5 27 21 19 5,7 14 4,9
1 5,4 6,2 14 15 13 3,1 8,3 7,2
Kruppe 2 5,7 6,7 14 11 9,7 3,2 7,7 6,5
3 4,7 5,3 13 12 9,2 2,8 7,0 4,4
– : Fehlwerte (nicht auswertbare Messung)
165

Tabellarischer Anhang
Tab. A2c: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus Hautgeschabseln der fünf toten Hunde
aus dem ersten Studienteil.
Hund Körperregion Probe PC PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1 1,4 1,2 0,4 - 32 12 - - - -
inguinal 2 2,8 1,9 1,8 4,1 52 21 27 10 16 137
1
3 5,0 2,5 2,7 6,6 59 24 42 10 19 170
1 4,5 2,4 3,0 3,9 41 19 25 24 39 162
Kruppe 2 5,7 3,0 3,5 8,2 48 24 43 19 42 195
3 5,8 4,2 2,4 - 27 17 - - - -
1 1,7 0,9 0,4 1,7 22 12 39 13 18 109
inguinal 2 1,2 0,6 0,4 1,6 18 11 32 7,1 15 87
2
3 - - - - - - - - - -
1 2,2 1,3 0,6 1,9 25 16 47 11 23 128
Kruppe 2 2,5 1,5 0,7 2,6 29 17 46 10 24 135
3 1,5 1,1 0,8 2,3 31 16 42 14 19 127
1 0,8 0,7 0,5 1,8 20 18 63 4,1 6,6 116
inguinal 2 0,5 0,4 0,3 1,1 13 15 55 6,9 4,8 97
3
3 1,1 0,5 0,7 1,9 18 16 57 4,4 4,5 103
1 2,3 2,0 1,1 2,7 39 21 87 11 29 195
Kruppe 2 4,7 2,9 2,2 3,9 42 25 79 12 29 201
3 4,6 2,6 2,1 4,3 44 26 74 30 32 220
1 4,9 2,4 2,1 3,1 50 30 31 10 48 181
inguinal 2 7,6 2,9 2,7 4,2 53 33 43 13 41 200
4
3 6,3 3,0 3,2 5,4 54 34 51 12 58 228
1 7,5 5,7 3,9 5,2 71 30 41 50 88 302
Kruppe 2 10 7,1 3,7 5,5 65 29 41 41 98 300
3 6,7 6,1 3,9 4,7 68 29 33 43 93 288
1 6,0 3,8 1,0 1,7 53 28 30 8,6 19 152
inguinal 2 7,3 3,9 1,4 5,0 67 31 41 6,2 18 181
5
3 5,0 3,7 1,0 3,2 61 30 31 6,4 17 159
1 16 7,1 3,7 3,7 45 24 22 29 68 218
Kruppe 2 16 6,4 3,7 5,4 53 18 28 21 65 218
3 15 6,1 3,7 4,9 52 21 29 27 68 227
PL: Phospholipide GlcCer: Glucosylceramide FFA: freie Fettsäuren ChE: Cholesterylester
PE: Phosphatidylethanolamin Cer: Ceramide TG: Triglyzeride Lip: Gesamtlipide
ChSO4: Cholesterolsulfat Chol: Cholesterol – : Fehlwerte (nicht auswertbare Messung bzw. fehlende Probe)
166

Tabellarischer Anhang
Tab. A2d: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus Hautgeschabseln der fünf toten Hunde aus dem ersten
Studienteil.
Hund Körperregion Probe [AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
1 1,4 3,0 14 3,5 4,9 1,4 1,9 1,9
inguinal 2 2,7 3,7 13 7,1 6,9 5,2 6,3 7,3
1
3 3,2 3,9 15 7,5 5,9 5,1 8,2 9,4
1 3,4 3,5 9,1 6,7 3,5 3,4 5,1 6,6
Kruppe 2 3,4 3,5 12 7,0 3,7 3,5 5,9 8,8
3 1,7 2,7 8,5 4,2 4,7 1,7 2,0 1,3
1 0,5 1,3 3,7 6,1 4,6 0,8 1,5 3,1
inguinal 2 0,4 1,1 2,5 5,0 4,7 0,6 1,5 2,1
2
3 - - - - - - - -
1 1,3 1,9 5,0 6,6 2,9 1,0 2,1 4,2
Kruppe 2 1,1 1,9 5,1 7,9 4,3 1,2 3,0 4,7
3 1,2 2,0 5,5 7,3 5,0 1,3 3,2 5,5
1 0,6 1,5 4,3 5,4 3,6 1,0 1,7 1,8
inguinal 2 0,5 0,9 2,4 4,6 2,1 0,6 0,8 1,3
3
3 0,9 1,6 3,4 4,6 2,9 1,1 1,8 1,4
1 2,7 3,0 9,3 8,3 4,5 1,8 4,5 5,1
Kruppe 2 3,3 4,3 9,6 7,7 6,7 1,8 5,3 3,4
3 3,7 5,1 11 8,2 6,0 1,7 5,3 3,6
1 2,4 4,1 13 7,8 8,0 2,6 6,9 5,6
inguinal 2 2,5 4,3 14 8,2 7,5 2,7 7,8 5,9
4
3 2,5 4,5 14 9,9 7,1 2,3 7,9 5,9
1 3,4 7,2 16 9,6 10 3,9 13 7,6
Kruppe 2 3,2 6,1 15 10 9,0 3,1 12 7,1
3 3,2 6,8 15 9,3 9,7 3,7 13 7,3
1 2,6 4,1 16 7,2 7,0 3,5 8,1 4,4
inguinal 2 3,7 5,3 17 11 10 4,5 10 5,0
5
3 3,4 5,2 18 8,3 8,3 3,9 8,9 4,7
1 3,5 4,9 11 7,6 5,7 2,4 5,8 3,9
Kruppe 2 4,5 5,5 12 7,2 10 2,7 7,2 4,3
3 4,3 5,7 13 8,0 7,2 2,6 6,9 4,3
– : Fehlwerte (fehlende Probe)
167

Tabellarischer Anhang
Tab. A2e: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ der fünf toten Hunde aus
dem ersten Studienteil.
Hund Körperregion Probe PC PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1 1,4 2,1 1,0 4,6 45 24 31 6,1 13 127
inguinal 2 2,1 2,0 1,0 4,4 44 25 33 5,4 12 129
1
3 0,9 1,8 1,0 3,3 41 26 23 4,6 11 114
1 10 11 6,8 6,8 84 41 23 21 55 259
Kruppe 2 11 12 7,2 5,5 92 38 24 22 63 274
3 10 12 7,4 6,0 82 41 25 30 50 263
1 4,0 4,4 1,3 2,4 53 27 29 10 33 165
inguinal 2 5,6 4,4 1,6 4,1 77 31 35 13 31 204
2
3 4,7 3,3 1,5 2,4 77 35 26 13 28 191
1 5,8 4,1 2,0 2,1 56 28 34 16 32 180
Kruppe 2 7,5 5,6 2,8 2,7 54 33 - - - -
3 5,7 4,8 2,3 2,4 63 36 39 18 37 209
1 12 6,2 1,8 4,1 68 38 34 8,3 36 209
inguinal 2 5,7 4,1 2,4 4,1 79 40 35 10 44 225
3
3 10 5,2 2,4 3,8 77 40 34 8,0 34 214
1 19 12 5,9 6,8 108 44 36 21 73 325
Kruppe 2 16 11 5,5 6,1 107 44 32 21 72 315
3 20 11 5,5 8,6 113 53 27 24 60 322
1 12 5,3 2,0 3,6 25 23 72 4,0 13 160
inguinal 2 13 6,8 2,4 4,8 62 36 44 8,3 37 216
4
3 11 5,1 1,6 4,0 55 35 47 7,1 33 198
1 14 11 7,4 7,8 105 56 43 32 65 341
Kruppe 2 11 8,9 7,2 6,9 108 54 45 31 69 342
3 12 8,8 5,5 6,1 93 47 41 26 51 291
1 14 10 2,3 5,8 119 56 31 14 50 301
inguinal 2 8,3 7,7 2,2 5,0 123 54 35 17 53 305
5
3 15 11 2,7 6,7 129 58 31 17 59 330
1 27 14 6,9 8,7 83 45 41 38 89 353
Kruppe 2 34 16 7,0 7,9 82 51 32 34 80 346
3 37 17 9,7 8,7 101 55 30 47 74 379
PL: Phospholipide GlcCer: Glucosylceramide FFA: freie Fettsäuren ChE: Cholesterylester
PE: Phosphatidylethanolamin Cer: Ceramide TG: Triglyzeride Lip: Gesamtlipide
ChSO4: Cholesterolsulfat Chol: Cholesterol – : Fehlwerte (nicht auswertbare Messung)
168

Tabellarischer Anhang
Tab. A2f: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ der fünf toten Hunde aus dem ersten
Studienteil.
Hund Körperregion Probe [AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
1 1,9 2,2 11 4,4 6,1 2,6 8,6 7,9
inguinal 2 1,6 2,2 9,3 5,2 6,4 2,3 8,4 8,6
1
3 1,5 2,3 9,3 4,6 5,1 2,8 7,9 7,3
1 7,2 7,2 21 14 5,2 4,1 14 12
Kruppe 2 7,7 7,8 20 14 5,3 5,6 14 18
3 8,1 7,3 19 14 4,4 5,5 11 13
1 1,7 3,3 17 8,9 5,9 3,1 6,9 6,4
inguinal 2 2,8 4,6 20 10 10 5,4 11 14
2
3 2,7 4,3 21 9,7 9,3 4,6 11 14
1 2,9 4,5 15 9,8 6,4 2,3 7,3 8,0
Kruppe 2 3,6 5,2 18 7,0 6,1 2,2 6,8 4,7
3 3,4 4,8 17 11 7,0 2,5 8,3 8,9
1 3,7 6,3 21 8,6 6,5 2,8 11 7,8
inguinal 2 5,0 9,1 24 9,7 7,2 3,0 13 8,9
3
3 3,7 7,8 24 9,8 6,9 3,5 13 8,1
1 9,6 13 38 15 10 3,2 14 4,9
Kruppe 2 9,6 11 36 16 9,8 3,6 16 5,2
3 8,8 14 25 19 12 5,6 21 8,5
1 1,5 2,3 7,7 4,5 3,8 1,9 2,3 1,1
inguinal 2 2,9 4,4 18 9,9 8,4 2,2 11 5,4
4
3 2,4 3,7 17 8,5 7,2 1,9 9,9 4,7
1 6,0 9,9 36 15 14 3,4 16 4,8
Kruppe 2 6,0 11 37 17 13 3,4 16 5,3
3 3,9 8,3 30 16 11 2,8 15 5,7
1 6,7 12 38 16 13 6,5 19 9,2
inguinal 2 7,2 11 39 17 14 6,7 19 9,9
5
3 7,4 12 39 20 14 6,9 20 10
1 8,7 9,9 20 13 10 3,7 12 5,3
Kruppe 2 9,7 11 20 11 9,9 4,0 11 4,6
3 10 12 26 14 14 4,5 13 6,9
169

Tabellarischer Anhang
Tab. A3a: Vergleich der Gesamtlipide in µg/cm² und der prozentualen Anteile der Lipidfraktionen, die jeweils mittels Hitze-separierter
Epidermis, Hautgeschabseln und „skin scrub“ von der Inguinalregion und der Kruppe von fünf Hunden gewonnen wurden.
Hitze-separierte Epidermis Geschabsel "skin scrub"
Inguinal A Kruppe B Inguinal C Kruppe D Inguinal E Kruppe F
Lip a 612 ± 148 486 ± 116 145 ± 44 206 ± 63 206 ± 69 293 ± 65
Statistik
AB* AC*** AE***
BD*** BF**
PL b 8,4
+ 2,1 / - 1,7
9,9
+ 4,1 / - 2,9
2,0
+ 1,8 / - 0,95
2,8
+ 2,1 / - 1,2
3,2
+ 2,9 / - 1,5
4,7
+ 2,6 / - 1,7
AC*** AE** BD***
BF*
PE a 2,8 ± 1,1 3,2 ± 1,2 1,3 ± 0,7 1,8 ± 0,8 2,5 ± 0,6 3,5 ± 0,9 AC* CE*
ChSO4 b 0,66
+ 0,43 / - 0,26
1,19
+ 0,81 / -0,48
0,76
+ 0,60 / - 0,34
1,13
+ 0,75 / - 0,45
0,88
+ 0,15 / - 0,13
1,9
+ 0,7 / - 0,5
AB* EF*
GlcCer c 1,7
(0,6 - 3,5)
2,3
(1,6 - 5,0)
2,0
(1,5 - 3,5)
1,8
(1,7 - 3,3)
1,9
(1,6 - 3,3)
2,2
(1,2 - 2,3)
#
Cer a 14 ± 5,0 17 ± 5,6 27 ± 9,4 23 ± 1,7 34 ± 5,9 31 ± 3,6
Chol a 11 ± 3,2 13 ± 2,1 15 ± 2,3 11 ± 1,4 18 ± 1,7 15 ± 1,0
AC** AE*** BF**
DF*
AC** AE*** CD*
DF**
FFA b 25
+ 12 / - 8,3
27
+ 8,9 / - 6,7
28
+ 16 / - 10
21
+ 15 / - 8,8
18
+ 8,8 / - 5,9
12
+ 4,2 / - 3,1
BD** CE* DF*
TG b 29
+ 28 / - 14
18
+ 6,8 / - 4,9
6,1
+ 2,3 / - 1,7
11
+ 3,0 / - 2,3
4,6
+ 1,3 / - 1,0
8,9
+ 1,6 / - 1,48
AC*** AE*** CD*
DF* EF*
ChE b 2,1
+ 0,8 / -0,6
5,2
+ 5,1 / - 2,6
12
+ 9,8 / - 5,4
22
+ 9,1 / - 6,4
15
+ 4,2 / - 3,3
20
+ 2,1 / - 1,9
AB** AC*** AE***
BD*** BF*** CD*
Lip: Gesamtlipide Cer: Ceramide a: arithmetrischer Mittelwert ± Standardabweichung
PL: Phospholipide Chol: Cholesterol b: geometrischer Mittelwert + obere / - untere Standardabweichung
PE: Phosphatidylethanolamin FFA: freie Fettsäuren c: Median und Range
ChSO4: Cholesterolsulfat TG: Triglyzeride #: statistische Aussage aufgrund zu geringer Tierzahl nicht möglich
GlcCer: Glucosylceramide ChE: Cholesterylester * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
170

Tabellarischer Anhang
Tab. A3b: Vergleich der prozentualen Anteile der Ceramidklassen, die jeweils mittels Hitze-separierter Epidermis, Hautgeschabseln
und „skin scrub“ von der Inguinalregion und der Kruppe von fünf Hunden gewonnen wurden.
CER Inguinal A Kruppe B Inguinal C Kruppe D Inguinal E Kruppe F
[EOS] b 7,2
+ 2,4 / - 1,8
[NS] b 9,5
+ 2,2 / - 1,8
[EOP] b 4,3
+ 0,9 / - 0,7
[NP] c 18
(17 - 25)
[EOH] b 21
+ 6,5 / - 5,0
[AS+NH] b 25
+ 6,4 / - 5,1
[AP] c 6,9
(5,7 - 8,8)
[AH] c 4,8
(3,9 - 5,9)
Hitze-separierte Epidermis Geschabsel "skin scrub"
9,1
+ 4,1 / - 2,8
10
+ 2,7 / - 2,1
4,5
+ 2,6 / - 1,7
16,2
(15,8 - 21)
20
+ 8,8 / - 6,1
21
+ 2,4 / - 2,1
9,2
(6,5 - 10,3)
6,4
(4,8 - 10,3)
10
+ 2,4 / - 2,0
11
+ 3,9 / - 2,9
5,4
+ 1,9 / - 1,4
14
(13 - 24)
19
+ 9,0 / - 6,1
24
+ 7,9 / - 5,9
7,7
(6,0 - 8,2)
4,7
(2,3 - 5,3)
11
+ 3,6 / - 2,8
12
+ 3,5 / - 2,8
5,1
+ 1,3 / - 1,1
14
(11 - 15)
18
+ 4,8 / - 3,8
23
+ 3,2 / - 2,8
9,8
(6,9 -10,7)
7,2
(4,3 - 8,1)
11
+ 5,8 / - 3,9
16
+ 2,1 / - 1,8
5,3
+ 1,0 / - 0,8
12
(9 - 14)
14
+ 2,2 / - 1,9
28
+ 3,9 / - 3,4
7,7
(5,1 - 10,3)
5,1
(3,4 - 5,8)
8,3
+ 5,7 / - 3,4
14
+ 1,1 / - 1,0
4,2
+ 1,1 / - 0,9
11
(5,8 - 13)
15,6
+ 0,74 / - 0,71
28
+ 4,6 / - 4,0
9,4
(8,4 - 12,4)
8,6
(5,1 - 10,8)
Statistik
AC* AE*
AE*** AC** BF**
ns
#
AE** CE*
BF*
#
#
CER: Ceramidklasse #: statistische Aussage aufgrund zu geringer Tierzahl nicht möglich
b: geometrischer Mittelwert + obere / - untere Standardabweichung * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
c: Median und Range ns: nicht signifikant
171

Tabellarischer Anhang
Tab. B1: Rasse, Geschlecht, Alter und Euthanasiegründe der für den Vergleich der
Körperregionen im zweiten Studienteil untersuchten Hunde.
Hund Rasse Geschlecht
Alter
(in Jahren)
Euthanasiegrund
1 Mischling M 12,3 Umfangsvermehrung Leber + Milz
2 Cairn Terrier M 12,2 V.a. Meningeom
3 Dalmatiner W 4,2 Magendrehung (verstorben)
4 Labrador Retriever WK 13,1 Krampfgeschehen
5 Mischling WK 6,4 Leberzellkarzinom (ohne Leberwertveränderung)
6 Mischling WK 13,3 Mammakarzinom
7 Mischling WK 13,3 Endokardiose
8 Border Collie WK 7,2 V.a. Lungentumor / Krampfgeschehen
M: männlich W: weiblich WK: weiblich-kastriert V.a.: Verdacht auf
172

Tabellarischer Anhang
Tab. B2a: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter
Hautfläche aus „skin scrubs“ von acht Körperregionen der acht toten
Hunde aus dem zweiten Studienteil.
Körperregion Hund PL PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1 1,5 1,1 1,1 2,4 23 10 26 13 16 239
2 7,0 3,6 2,2 5,6 47 26 38 20 32 379
Innenfläche
Pinna
Lefze
Metakarpus
palmar
Axillar
Lateraler
Thorax
Laterales
Abdomen
3 3,8 4,1 3,7 7,3 66 24 32 48 64 331
4 7,7 3,4 5,3 14 57 26 62 88 45 335
5 20 13 2,4 13 62 22 70 62 47 220
6 13 7,5 4,4 10 79 23 61 56 28 319
7 9,8 5,0 2,6 7,1 49 31 33 39 10 207
8 6,0 3,8 1,8 5,1 30 13 51 50 25 242
1 6,6 3,0 5,1 9,4 56 29 36 41 44 239
2 31 32 5,4 20 31 21 25 5,9 6,3 379
3 7,8 4,6 4,7 7,2 57 42 57 28 89 331
4 9,9 4,1 3,7 12 46 30 87 40 96 335
5 36 23 4,2 24 114 60 104 38 76 220
6 17 10 3,5 8,6 65 29 53 27 94 319
7 13 5,7 1,3 3,9 20 11 15 20 30 207
8 10 7,4 2,2 7,3 34 19 62 28 85 242
1 5,0 2,8 4,5 8,3 63 39 34 36 47 239
2 5,3 3,7 5,6 7,2 83 45 69 32 127 379
3 5,2 4,0 4,7 9,5 89 45 67 16 92 331
4 5,9 3,6 4,7 14 85 50 77 30 65 335
5 7,3 3,3 3,1 6,3 79 39 47 11 23 220
6 6,3 4,1 6,3 9,9 89 38 69 15 81 319
7 5,0 3,2 3,2 3,6 50 33 28 31 50 207
8 3,9 3,5 3,1 5,5 51 32 39 19 85 242
1 4,7 3,4 4,9 10 59 41 36 55 43 256
2 11 6,8 2,4 11 66 37 63 8,9 75 282
3 5,6 3,5 2,0 5,5 42 20 43 17 89 227
4 13 7,4 4,5 15 86 48 82 24 69 349
5 15 7,9 3,9 14 123 55 94 21 69 403
6 12 5,7 3,8 4,2 84 40 69 8,8 65 292
7 6,0 3,3 2,7 0,6 61 34 39 16 36 198
8 6,2 5,1 3,3 4,4 72 39 64 15 72 280
1 6,3 5,4 5,3 9,9 87 40 36 31 44 266
2 25 19 4,7 14 71 34 64 13 89 333
3 4,6 3,6 2,4 5,5 34 19 35 27 73 204
4 11 8,7 4,8 11 70 39 73 35 44 297
5 9,2 8,1 2,6 11 99 44 74 14 77 339
6 13 9,0 3,9 12 81 37 66 4,5 12 238
7 8,9 6,1 2,4 4,8 39 23 37 29 45 195
8 5,3 5,9 3,0 9,1 63 32 54 17 54 243
1 4,8 4,2 3,3 6,7 74 39 32 24 55 243
2 10 5,8 1,7 5,1 49 22 30 2,5 7,5 132
3 2,9 2,4 1,2 5,1 33 21 60 15 58 198
4 11 5,7 4,0 11 55 34 70 14 42 247
5 13 7,6 2,3 11 97 39 73 11 63 317
6 11 7,4 3,5 11 82 38 59 12 74 299
7 6,1 3,7 1,1 4,0 51 27 39 9 18 159
8 6,2 5,2 2,4 6,8 59 33 49 14 49 224
173

Tabellarischer Anhang
Fortsetzung Tab. B2a
Körperregion Hund PL PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1 5,6 3,9 1,8 7,0 63 30 37 12 41 201
2 5,8 4,6 1,4 6,7 74 34 65 7,4 84 284
3 7,8 5,8 2,0 9,4 50 28 67 16 81 268
Inguinal
4 12 7,8 3,8 16 80 42 75 10 37 284
5 8,2 4,5 1,2 8,4 73 25 64 6,2 42 232
6 9,1 5,6 3,1 8,3 75 33 68 5,2 36 243
7 8,9 3,9 2,1 4,8 51 27 33 9,0 19 158
8 3,8 5,2 2,2 8,0 68 30 63 14 61 255
1 5,3 3,8 3,1 4,8 46 25 22 26 45 180
2 26 30 6,3 15 64 37 51 14 78 321
3 2,9 3,3 1,8 6,9 26 18 65 33 105 262
Kruppe
4 11 8,7 4,8 14 50 34 59 40 65 286
5 17 10 3,4 13 92 40 66 16 92 350
6 9,3 5,0 2,0 7,9 47 22 54 17 67 232
7 13 6,8 2,8 6,7 38 26 59 12 103 267
8 8,5 8,7 4,0 9,4 60 35 55 29 83 292
PL: Phospholipide GlcCer: Glucosylceramide FFA: freie Fettsäuren Lip: Gesamtlipide
PE: Phosphatidylethanolamin Cer: Ceramide TG: Triglyzeride
ChSO4: Cholesterolsulfat Chol: Cholesterol ChE: Cholesterylester
174

Tabellarischer Anhang
Tab. B2b: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin
scrubs“ von acht Körperregionen der acht toten Hunde aus dem zweiten
Studienteil.
Körperregion Hund [AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
1 2,3 1,9 3,7 3,7 2,4 0,8 3,7 5,0
2 6,6 3,8 8,1 6,5 3,7 2,0 8,0 8,2
Innenfläche
Pinna
Lefze
Metakarpus
palmar
Axillar
Lateraler
Thorax
Laterales
Abdomen
3 7,0 6,7 12 8,3 9,7 2,1 14 5,3
4 6,0 5,7 13 7,5 6,9 2,3 10 6,1
5 5,3 4,6 12 10 11 2,5 11 6,0
6 8,8 8,5 16 11 12 3,0 11 8,8
7 6,4 6,9 10 7,3 4,9 3,0 7,5 2,8
8 3,3 2,5 8,4 4,2 3,0 1,0 5,4 2,7
1 6,6 6,6 11 9,3 7,1 2,1 6,6 7,1
2 4,0 3,2 6,7 3,1 2,7 0,9 4,6 5,3
3 5,8 6,1 13 7,3 7,5 1,9 9,8 5,7
4 4,4 4,6 9,4 6,0 7,9 1,8 7,2 4,4
5 12 10 24 15 18 4,9 21 9,1
6 7,3 6,4 12 7,2 13 2,4 9,0 9,0
7 1,5 1,9 5,0 3,0 1,9 1,3 3,4 2,1
8 3,0 3,1 9,8 4,3 4,0 1,3 5,5 3,0
1 7,0 6,0 13 8,7 7,5 2,8 9,2 9,0
2 10 9,9 22 9,4 7,2 2,8 12 9,8
3 9,6 9,3 23 9,8 10 2,7 16 7,4
4 7,9 7,1 26 9,9 10 3,6 14 6,4
5 8,5 7,5 19 12 13 2,2 12 5,6
6 9,3 9,0 16 12 14 3,1 13 12
7 5,1 5,7 11 7,6 4,6 2,6 8,6 4,2
8 4,2 3,9 16 5,4 5,2 1,9 8,2 5,4
1 8,1 5,5 13 7,9 6,9 1,7 8,1 7,7
2 5,8 5,8 21 7,2 6,3 2,5 11 7,5
3 3,3 3,5 9,9 5,0 5,5 1,4 8,2 5,0
4 6,2 7,0 28 9,8 10 3,9 15 6,1
5 11 10 34 16 16 4,8 21 9,5
6 7,2 7,1 19 9,4 13 3,5 13 11
7 4,5 6,2 18 7,3 5,8 3,7 11 4,5
8 4,1 5,3 27 6,4 7,3 2,9 13 6,5
1 10 9,5 23 9,9 9,8 2,9 13 8,9
2 8,3 6,5 20 8,3 6,8 2,3 10 8,0
3 3,1 4,1 7,2 4,3 3,6 1,4 6,9 3,9
4 7,7 8,9 18 7,5 9,4 2,9 11 5,0
5 9,3 9,0 21 10 15 3,4 19 12
6 9,0 7,6 21 9,2 11 3,8 12 7,8
7 3,9 4,4 12 3,8 3,5 2,2 6,8 2,8
8 4,5 5,0 21 6,8 6,3 3,1 11 5,7
1 5,9 5,9 22 7,5 7,5 2,2 13 9,8
2 4,9 4,1 16 5,1 3,9 1,9 7,0 6,2
3 2,3 2,8 8,1 4,1 3,6 1,6 7,1 3,9
4 5,2 5,4 15 6,3 7,6 2,2 8,8 5,3
5 8,0 8,2 22 9,9 13 3,7 18 14
6 6,6 7,0 19 11 11 3,4 13 9,7
7 3,6 4,4 18 4,4 4,8 3,3 9,7 3,4
8 2,8 3,9 21 5,0 5,6 3,2 12 5,5
175

Tabellarischer Anhang
Fortsetzung Tab. B2b
Körperregion Hund [AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
1 4,6 4,6 18 7,0 6,8 2,3 10 9,4
2 5,9 5,2 24 8,4 6,8 3,1 11 9,8
3 3,3 3,8 13 6,3 4,9 2,2 11 6,0
Inguinal
4 7,0 8,5 23 7,2 11 3,7 13 6,6
5 4,5 5,0 21 6,5 10 2,2 12 11
6 5,7 5,7 20 9,4 11 3,2 12 9,1
7 3,6 4,7 18 4,3 4,9 3,1 9,5 2,8
8 3,5 4,4 25 6,8 6,6 3,6 12 6,3
1 5,3 3,6 11 6,2 4,7 1,3 6,5 7,2
2 7,0 6,2 16 8,5 6,9 2,2 9,3 8,0
3 2,4 2,0 5,3 4,6 2,8 0,9 4,3 3,3
Kruppe
4 5,3 5,6 12 6,1 7,5 1,5 7,9 4,5
5 10 8,0 19 11 15 2,4 16 11
6 3,9 3,8 9,4 6,4 8,7 1,5 7,0 6,6
7 3,4 3,9 8,0 5,1 4,3 1,6 7,6 3,8
8 4,9 4,3 18 7,2 6,7 2,7 10 6,3
176

Tabellarischer Anhang
Tab. B3: Vergleich der Gesamtlipide, der Lipidfraktionen und der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche (Median und
Range), die mittels „skin scrub“ von acht verschiedenen Körperpartien von acht Hunden gewonnen wurden.
Innenfläche
Pinna A Lefze B Metakarpus
palmar C Axillar D Lateraler
Thorax E
Laterales
Statistische
Abdomen F Inguinal G Kruppe H Signifikanz
(Friedman-Test)
Lip 219 (94 - 313) 276 (120 - 480) 280 (207 - 379) 281 (198 - 403) 254 (195 - 339) 233 (132 - 317) 249 (158 - 284) 277 (180 - 350) ns
Paarweise Vergleiche
(Wilcoxon-Vorzeichen-Rang)
PL 7,3 (1,5 - 20) 12 (6,6 - 36) 5,3 (3,9 - 7,3) 8,7 (4,7 - 15) 9,1 (4,6 - 25) 8,1 (2,9 - 13) 8,0 (3,8 - 12) 10 (2,9 - 26) p = 0,0034
PE 4,0 (1,1 - 13) 6,5 (3,0 - 32) 3,6 (2,8 - 4,1) 5,4 (3,3 - 7,9) 7,1 (3,6 - 19) 5,4 (2,4 - 7,6) 4,9 (3,9 - 7,8) 7,8 (3,3 - 30) p = 0,0026
ChSO4 2,5 (1,1 - 5,3) 3,9 (1,3 - 5,4) 4,6 (3,1 - 6,3) 3,6 (2,0 - 4,9) 3,4 (2,4 - 5,3) 2,3 (1,1 - 4,0) 2,0 (1,2 - 3,8) 3,2 (1,8 - 6,3) p = 0,0042
AB** BC** BD* BE* BF*
BG* CD* CE* CG* CH*
AB** BC** BF* CD* CE* CF*
CG** CH* DE** EF**
AC* CF** CG** DF** DG**
EF** EG**
GlcCer 7,2 (2,4 - 13) 9,0 (3,9 - 24) 7,8 (3,6 - 13) 7,8 (0,6 - 14) 10 (4,8 - 13) 6,7 (4,0 - 11) 8,2 (4,8 - 15) 8,7 (4,8 - 14) ns
CER 53 (23 - 79) 51 (20 - 114) 81 (50 - 89) 69 (42 - 123) 71 (34 - 99) 57 (34 - 97) 70 (50 - 80) 49 (26 - 92) p = 0,0044 AC** BD* DH** EH**
- [EOS] 5,7 (2,7 - 8,8) 5,5 (2,1 - 9,1) 6,9 (4,2 - 12) 7,0 (4,5 - 11) 6,8 (2,8 - 11) 5,9 (3,4 - 13) 7,8 (2,8 - 10) 6,4 (3,3 - 11) p = 0,0292 AC* AG* BD* BG**
- [NS] 9,1 (3,7 - 14) 6,9 (3,4 - 21) 11 (8,2 - 15) 12 (8,2 - 21) 10 (6,8 - 19) 11 (7,0 - 18) 11 (9,5 - 13) 7,8 (4,3 - 15) p = 0,0054 AC** BD* BE* DH** EH*
- [EOP] 2,2 (0,8 - 3,0) 1,9 (0,95 - 4,9) 2,7 (1,9 - 3,6) 3,2 (1,4 - 4,8) 2,9 (1,4 - 3,8) 2,7 (1,6 - 3,7) 3,1 (2,2 - 3,7) 1,6 (0,9 - 2,7) p = 0,0116 AD* DH** EH** FH* GH*
- [NP] 5,9 (2,4 - 12) 7,3 (1,9 - 18) 8,9 (4,6 - 14) 7,1 (5,5 - 16) 8,1 (3,5 - 15) 6,5 (3,6 - 13) 6,8 (4,9 - 11) 6,8 (2,8 - 15) ns
- [EOH] 7,4 (3,7 - 11) 6,6 (3,0 - 15) 9,6 (5,4 - 12) 7,6 (5,0 - 16) 7,9 (3,8 - 10) 5,7 (4,0 - 11) 6,9 (4,3 - 9,4) 6,3 (4,6 - 11) p = 0,0483 AC** CF** CG* CH*
- [AS+NH] 11 (3,7 - 16) 10 (5,0 - 24) 18 (12 - 26) 20 (9,9 - 34) 20 (7,2 - 23) 19 (8,1 - 22) 21 (13 - 25) 12 (5,3 - 19) p = 0,0003
AC** AD* AE* AF* AG**
BC* BD* BE* BG* CH*
DH** EH** FH* GH**
- [AP] 5,2 (1,9 - 8,6) 5,4 (1,9 - 10) 7,3 (3,9 - 9,9) 6,0 (3,4 - 10) 7,1 (4,1 - 9,5) 4,9 (2,8 - 8,2) 4,9 (3,9 - 8,6) 4,1 (2,0 - 8,0) p = 0,0349 AC* CH* DF* DH* EF** EG*
EH**
- [AH] 6,2 (2,3 - 8,8) 5,1 (1,5 - 12) 8,2 (4,3 - 10) 6,0 (3,3 - 11) 8,0 (3,1 - 10) 5,0 (2,3 - 8,0) 4,6 (3,3 - 7,0) 5,1 (2,5 - 10) p = 0,0042
Chol 24 (10 - 31) 29 (11 - 60) 39 (32 - 50) 39 (20 - 55) 35 (19 - 44) 34 (21 - 39) 30 (25 - 42) 30 (18 - 40) p = 0,0038
AC* CF** CG** DF**
EF** EG*
AC** AD* AE* AG* CG**
CH* DE** DF* DH*
FFA 44 (26 - 70) 55 (15 - 104) 57 (28 - 77) 63 (36 - 94) 59 (35 - 74) 54 (30 - 73) 65 (33 - 75) 57 (22 - 66) ns
TG 49 (13 - 88) 28 (5,9 - 41) 25 (11 - 36) 16 (8,8 - 55) 22 (4,5 - 35) 13 (2,5 - 24) 9,7 (5,2 - 16) 21 (12 - 40) p < 0,0001
ChE 30 (10 - 64) 81 (6,3 - 96) 73 (23 -127) 69 (36 - 89) 49 (12 - 89) 52 (7,5 - 74) 41 (19 - 84) 80 (45 - 105) p = 0,0024
AE* AF* AG** AH* BF**
BG* CF** CG** DF* DG**
EG* FH** GH**
AB* AC* AD** AH** BF*
CG* DG* EH* FH* GH*
Lip: Gesamtlipide PL: Phospholipide PE: Phosphatidylethanolamin ChSO4: Cholesterolsulfat GlcCer: Glucosylceramide
CER: Ceramide Chol: Cholesterol FFA: freie Fettsäuren TG: Triglyzeride ChE: Cholesterylester
ns: nicht signifikant * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
177

Tabellarischer Anhang
Tab. C1: Rasse, Geschlecht, Alter und Diagnosen der beprobten Hunde mit
Hauterkrankungen aus dem zweiten Studienteil.
Alter
Hund Rasse
Geschlecht
Diagnose
(in Jahren)
1 Jack Russell Terrier WK 4,6 Atopie (nicht Futtermittel-induziert)
2 Deutscher Schäferhund M 5,2 Atopie (nicht Futtermittel-induziert)
3 Mischling MK 1,1 Atopie (Futtermittel-induziert)
4 Dalmatiner WK 2,3 Atopie (z.T. Futtermittel-induziert)
5 Magyar Vizsla W 1,0 Atopie (z.T. Futtermittel-induziert)
6 Französische Bulldogge M 2,7 Atopie (nicht Futtermittel-induziert)
7 Golden Retriever W 2,5 Atopie (nicht Futtermittel-induziert)
8 Mischling MK 5,6 Atopie (Futtermittel-induziert)
9 Rhodesian Ridgeback WK 5,0 Atopie (Futtermittel-induziert)
10 Mischling M 10,5 Atopie (Futtermittel-induziert)
11 Französische Bulldogge M 6,4 Atopie (z.T. Futtermittel-induziert)
12 American Pitbull Terrier WK 2,7 Atopie (z.T. Futtermittel-induziert)
13 Chow Chow W 4,6 Sebadenitis
14 Kleiner Münsterländer M 9,0 Flohspeichelallergie
15 Pudel-Mischling WK 8,9 Kontaktdermatitis
16 Landseer W 1,4 Flohspeichelallergie
M: männlich MK: männlich-kastriert W: weiblich WK: weiblich-kastriert z.T.: zum Teil
178

Tabellarischer Anhang
Tab. C2a: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ von betroffener und
klinisch unauffälliger Haut der 12 atopischen Hunde aus dem zweiten Studienteil.
Hund
Beschaffenheit der
beprobten Stelle
PL PE ChSO4 GlcCer Cer Chol FFA TG ChE Lip
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
betroffen
1,3
6,4
2,0
1,9
5,2
4,3
6,8
3,5
1,1
1,4
1,6
2,6
1,5
4,0
3,0
3,6
5,3
3,8
4,9
3,0
0,9
2,3
3,3
1,6
0,8
1,2
0,8
1,1
1,3
1,0
1,9
1,9
0,8
0,7
1,9
0,9
4,3
9,2
3,2
2,9
4,0
5,2
5,8
3,7
6,2
3,2
2,9
5,4
34
35
30
30
30
32
51
44
31
31
36
27
15
21
17
14
15
18
31
18
25
22
23
20
48
76
41
23
31
27
44
35
33
56
5,1
69
17
15
5,2
6,8
11
4,7
3,9
7,5
11
15
34
19
33
54
11
19
71
20
21
20
26
76
62
64
155
221
113
102
174
116
170
137
136
208
170
210
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
klinisch unauffällig
2,8
15
4,2
2,8
2,5
6,9
4,4
3,1
2,9
1,5
5,5
3,1
1,8
16
4,8
3,9
5,0
5,9
5,5
4,8
4,2
3,1
5,4
2,4
1,6
1,3
1,6
1,3
2,0
1,8
3,7
2,7
1,5
1,3
2,7
2,5
8,0
7,1
5,2
3,4
5,6
5,1
7,1
2,1
5,6
4,3
6,5
7,5
37
28
34
33
44
50
57
38
57
32
45
53
17
19
18
16
21
24
37
18
26
20
27
32
66
38
30
24
43
39
41
18
74
41
51
121
20
14
5,1
7,2
13
9,8
7,5
15
19
26
39
45
39
22
8,9
16
79
48
15
28
47
105
120
122
193
160
112
108
215
190
178
130
237
234
303
388
PL: Phospholipide ChSO4: Cholesterolsulfat Cer: Ceramide FFA: freie Fettsäuren ChE: Cholesterylester
PE: Phosphatidylethanolamin GlcCer: Glucosylceramide Chol: Cholesterol TG: Triglyzeride Lip: Gesamtlipide
179

Tabellarischer Anhang
Tab. C2b: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ von betroffener und klinisch unauffälliger
Haut der 12 atopischen Hunde aus dem zweiten Studienteil.
Hund
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Beschaffenheit der
beprobten Stelle
[AH] [AP] [AS+NH] [EOH] [NP] [EOP] [NS] [EOS]
betroffen 1,2 3,0 5,5 5,7 4,9 1,8 7,9 4,0
klinisch unauffällig 1,5 3,6 7,2 6,4 5,6 1,8 5,8 5,2
betroffen 2,1 3,4 7,4 3,3 5,1 1,3 7,6 4,5
klinisch unauffällig 1,8 3,5 7,8 1,9 4,6 0,7 5,2 2,6
betroffen 1,9 3,0 7,6 2,4 3,4 1,9 6,9 2,6
klinisch unauffällig 2,6 3,7 9,5 2,9 4,6 1,6 6,9 2,6
betroffen 2,2 2,2 7,1 3,1 2,9 2,6 6,6 3,4
klinisch unauffällig 3,2 2,4 8,4 3,7 3,4 2,1 6,0 3,3
betroffen 2,1 2,1 6,2 4,0 3,2 2,7 5,4 4,0
klinisch unauffällig 3,3 3,0 11 5,9 5,6 3,3 7,4 4,4
betroffen 1,8 2,6 7,5 4,7 2,8 1,6 7,6 3,5
klinisch unauffällig 4,7 4,9 18 4,4 5,2 1,9 8,1 2,5
betroffen 2,9 4,6 19 3,9 5,5 2,4 9,4 3,7
klinisch unauffällig 5,4 5,4 18 5,8 6,7 1,9 8,6 4,6
betroffen 3,3 3,5 17 5,1 4,3 1,5 6,7 3,0
klinisch unauffällig 3,1 2,3 14 4,5 4,3 1,2 6,1 2,3
betroffen 1,8 1,7 8,8 3,8 3,1 1,3 6,4 4,1
klinisch unauffällig 4,5 3,9 17 6,5 5,6 2,5 12 4,8
betroffen 1,5 1,6 7,9 4,3 3,0 1,2 8,1 3,7
klinisch unauffällig 1,3 1,9 8,9 4,2 3,4 1,0 7,4 3,6
betroffen 2,6 2,0 12 3,9 3,4 1,3 6,5 3,7
klinisch unauffällig 4,0 3,3 12 6,2 4,4 1,6 8,4 4,8
betroffen 1,3 2,1 7,2 3,1 2,9 0,8 6,2 3,9
klinisch unauffällig 4,3 5,4 12 8,3 5,6 1,4 9,0 7,4
180

Tabellarischer Anhang
Tab. C3a: Vergleich der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter
Hautfläche (Median und Range) aus „skin scrubs“ von betroffener und
klinisch unauffälliger Haut der 12 atopischen Hunde mit Lokalisationsspezifischen
Kontrollen aus dem zweiten Studienteil.
Lip
PL
PE
ChSO4
GlcCer
Cer
Chol
FFA
TG
ChE
Kontrolle Atopische Dermatitis (n=12) Kontrolle Statistik
(axillar) A betroffen B klinisch unauffällig C (thorakal) D
281 162 191 254
(198 - 403) (102 - 221) (108 - 388) (195 - 339)
8,7 2,3 3,1 9,1
(4,7 - 15) (1,1 - 6,8) (1,5 - 15) (4,6 - 25)
5,4 3,1 4,8 7,1
(3,3 - 7,9) (0,9 - 5,3) (1,6 - 16) (3,6 - 19)
3,6 1,0 1,7 3,4
(2,0 - 4,9) (0,7 - 1,9) (1,3 - 3,7) (2,4 - 5,3)
7,8 4,1 5,6 10
(0,6 - 14) (2,9 - 9,2) (2,1 - 8,0) (4,8 - 13)
69 32 41 71
(42 - 123) (27 - 51) (28 - 57) (34 - 99)
39 19 20 35
(20 - 55) (14 - 31) (16 - 37) (19 - 44)
63 38 41 59
(36 - 94) (5,1 - 76) (18 - 121) (35 - 74)
16 11,0 14 22
(8,8 - 55) (3,9 - 34) (5,1 - 45) (4,5 - 35)
69 30 43 49
(36 - 89) (12 - 76) (8,9 - 123) (45 - 105)
AB*** BC*
CD*
AB*** CD**
AB* BC*
CD*
AB*** BC**
CD**
AB* BC*
CD**
AB*** BC*
CD*
AB** BC*
CD*
Lip: Gesamtlipide PL: Phospholipide PE: Phosphatidylethanolamin
ChSO4: Cholesterolsulfat GlcCer: Glucosylceramide Cer: Ceramide
Chol: Cholesterol FFA: freie Fettsäuren TG: Triglyzeride
ChE: Cholesterylester * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
AB*
BC**
BC*
181

Tabellarischer Anhang
Tab. C3b: Vergleich der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche (Median und
Range) aus „skin scrubs“ von betroffener und klinisch unauffälliger Haut der
12 atopischen Hunde mit Lokalisations-spezifischen Kontrollen aus dem
zweiten Studienteil.
Kontrolle Atopische Dermatitis (n=12) Kontrolle Statistik
CER (axillar) A betroffen B klinisch unauffällig C (thorakal) D
[EOS]
[NS]
[EOP]
7,0
12
3,2
3,7
6,8
1,5
4,0
7,4
1,7
6,8
10
2,9
(4,5 - 11)
(8,2 - 21)
(1,4 - 4,8)
(2,6 - 4,5)
(5,4 - 9,4)
(0,8 - 2,7)
(2,3 - 7,4)
(5,2 - 12)
(0,7 - 3,3)
(2,8 - 11)
(6,8 - 19)
(1,4 - 3,8)
AB*** CD*
AB*** CD*
AB** CD*
[NP]
7,1 3,3 4,9 8,1 AB*** BC**
(5,5 - 16) (2,8 - 5,5) (3,4 - 6,7) (3,5 - 15) CD*
[EOH]
7,6 3,9 5,2 7,9
(5,0 - 16) (2,4 - 5,7) (1,9 - 8,3) (3,8 - 10)
AB*** CD*
[AS+NH]
[AP]
[AH]
20
6,0
6,0
7,5
2,4
2,0
11,0
3,6
3,2
20
7,1
8,0
AB** BC*
AB*** BC*
AB*** BC**
(9,9 - 34)
(3,4 - 10)
(3,3 - 11)
(5,5 - 19)
(1,6 - 4,6)
(1,2 - 3,3)
(7,2 - 18)
(1,9 - 5,4)
(1,3 - 5,4)
(7,2 - 23)
(4,1 - 9,5)
(3,1 - 10)
CD*
CD**
CD**
CER: Ceramidklasse * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
182

Tabellarischer Anhang
Tab. C4a: Messwerte der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ der vier Hunde mit
anderen Hauterkrankungen im Vergleich zu denen Lokalisations-spezifischer Kontrollen in µg/cm² beprobter Hautfläche
(Median und Range) aus dem zweiten Studienteil.
Lip
PL
PE
ChSO4
GlcCer
Cer
Chol
FFA
TG
ChE
Kontrolle
Kontaktdermatitis (n=1) Flohspeicheldermatitis (n=2) Sebadenitis (n=1)
betroffen
(abdominal)
klinisch unauffällig
(thorakal)
betroffen
(inguinal)
klinisch unauffällig
(thorakal)
betroffen
(Kruppe)
klinisch unauffällig
(Kruppe)
Kontrolle
(inguinal)
(Kruppe)
249 91 259 160 193 182 295 277
(158 - 284) (99 - 222) (180 - 206) (180 - 350)
8,0 0,8 5,2 2,7 7,8 7,7 7,1 10
(3,8 - 12) (2,3 - 3,1) (3,8 - 12) (2,9 - 26)
4,9 0,7 6,5 2,84 7,7 6,1 5,4 7,8
(3,9 - 7,8) (2,72 - 2,96) (4,5 - 11) (3,3 - 30)
2,0 0,5 2,2 1,0 2,35 2,0 2,2 3,2
(1,2 - 3,8) (0,69 - 1,35) (2,11 - 2,59) (1,8 - 6,3)
8,2 1,6 6,4 3,7 6,9 9,1 12 8,7
(4,8 - 16) (1,8 - 5,5) (6,6 - 7,2) (4,8 - 15)
70 13 43 32 35 59 47 49
(50 - 80) (27 - 38) (27 - 43) (26 - 92)
30 13 25 21 23 42 23 30
(25 - 42) (14 - 28) (21 - 26) (18 - 40)
65 25 53 42 20 43 84 57
(33 - 75) (21 - 63) (3,0 - 37) (22 - 66)
9,7 5,9 15 10 18 3,7 12 21
(5,2 - 16) (8,0 - 12) (8,7 - 27) (12 - 40)
41 31 103 46 72 9,6 102 80
(19 - 84) (21 - 70) (65 - 79) (45 - 105)
Lip: Gesamtlipide ChSO4: Cholesterolsulfat Chol: Cholesterol ChE: Cholesterylester
PL: Phospholipide GlcCer: Glucosylceramide FFA: freie Fettsäuren n: Anzahl beprobter Hunde
PE: Phosphatidylethanolamin Cer: Ceramide TG: Triglyzeride
183

Tabellarischer Anhang
Tab. C4b: Messwerte der Ceramidklassen in µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ der vier Hunde mit anderen
Hauterkrankungen im Vergleich zu denen Lokalisations-spezifischer Kontrollen in µg/cm² beprobter Hautfläche (Median
und Range) aus dem zweiten Studienteil.
CER
[EOS]
[NS]
[EOP]
[NP]
[EOH]
[AS+NH]
[AP]
[AH]
Kontrolle
Kontaktdermatitis (n=1)
betroffen klinisch unauffällig
(abdominal) (thorakal)
Flohspeicheldermatitis (n=2)
betroffen klinisch unauffällig
(inguinal) (thorakal)
betroffen
(Kruppe)
Sebadenitis (n=1)
klinisch unauffällig
(Kruppe)
Kontrolle
(inguinal)
(Kruppe)
7,8 1,6 4,1 4,8 3,7 6,8 7,2 6,4
(2,8 - 11) (4,2 - 5,3) (2,9 - 4,6) (3,3 - 11)
11 2,1 8,6 6,6 7,13 11 8,3 7,8
(9,5 - 13) (4,3 - 9,0) (6,87 - 7,39) (4,3 - 16)
3,1 0,9 1,9 1,4 2,7 2,2 1,5 1,6
(2,2 - 3,7) (1,2 - 1,7) (1,4 - 3,9) (0,9 - 2,7)
6,8 0,5 4,2 2,8 2,5 7,7 7,6 6,8
(4,9 - 11) (2,5 - 3,2) (0,13 - 4,8) (2,8 - 15)
6,9 1,4 5,4 3,9 4,3 7,0 5,9 6,3
(4,3 - 9,4) (3,1 - 4,7) (1,8 - 6,8) (4,6 - 11)
21 5,5 12 8,8 10,5 12 8,9 12
(13 - 25) (7,4 - 10) (9,3 - 11,8) (5,3 - 19)
4,9 0,6 3,8 2,1 2,3 5,8 4,2 4,1
(3,9 - 8,5) (1,8 - 2,4) (1,2 - 3,4) (2,0 - 8,0)
4,6 0,5 3,2 1,7 2,0 5,6 3,7 5,1
(3,3 - 7,0) (1,1 - 2,2) (0,22 - 3,8) (2,5 - 10)
CER: Ceramidklasse n: Anzahl beprobter Hunde
184

Tabellarischer Anhang
Tab. C5:
Messwerte der Gesamtlipide, Lipidfraktionen und Ceramidklassen in
µg/cm² beprobter Hautfläche aus „skin scrubs“ von betroffener und klinisch
unauffälliger Haut des Landseers mit Flohspeicheldermatitis vier und acht
Wochen nach der Injektion eines Depot-Kortikosteroids (post Kortison) im
Vergleich zu denen Lokalisations-spezifischer Kontrollen in µg/cm²
beprobter Hautfläche (Median und Range) aus dem zweiten Studienteil.
Kontrolle
Flohspeicheldermatitis (n=1)
Kontrolle
4 Wochen post Kortison 8 Wochen post Kortison
(inguinal) betroffen klinisch unauffällig betroffen klinisch unauffällig (thorakal)
Lip
PL
PE
ChSO4
GlcCer
Cer
- [EOS]
- [NS]
- [EOP]
- [NP]
- [EOH]
- [AS+NH]
- [AP]
- [AH]
Chol
FFA
TG
ChE
249
8,0
4,9
2,0
8,2
70
7,8
11
3,1
6,8
6,9
21
4,9
4,6
30
65
9,7
41
327
2,2
8,8
3,1
9,5
76
8,2
23
2,5
5,6
7,8
20
5,5
3,3
59
58
10
101
256
5,2
4,9
1,9
5,4
53
5,1
12
3,7
4,1
5,9
17
3,3
2,4
38
43
18
86
222
2,3
2,7
1,4
5,5
38
5,3
9,0
1,7
3,2
4,7
10
2,4
1,1
28
63
12
70
180
11,9
11,0
2,6
6,6
27
2,9
7,4
1,4
0,1
1,8
12
1,2
0,2
26
3
27
65
254
9,1
7,1
3,4
10
71
6,7
11
2,9
8,1
7,9
20
7,0
8,0
35
59
22
49
(158 - 284)
(3,8 - 12)
(3,9 - 7,8)
(1,2 - 3,8)
(4,8 - 16)
(50 - 80)
(2,8 - 11)
(9,5 - 13)
(2,2 - 3,7)
(4,9 - 11)
(4,3 - 9,4)
(13 - 25)
(3,9 - 8,5)
(3,3 - 7,0)
(25 - 42)
(33 - 75)
(5,2 - 16)
(19 - 84)
(195 - 339)
(4,6 - 25)
(3,6 - 19)
(2,4 - 5,3)
(4,8 - 14)
(35 - 99)
(2,8 - 12)
(6,8 - 19)
(1,4 - 3,8)
(3,5 - 15)
(3,8 - 10)
(7,2 - 23)
(4,1 - 9,5)
(3,1 - 10)
(19 - 44)
(35 - 74)
(4,5 - 35)
(12 - 89)
Lip: Gesamtlipide PL: Phospholipide PE: Phosphatidylethanolamin
ChSO4: Cholesterolsulfat GlcCer: Glucosylceramide Cer: Ceramide
Chol: Cholesterol FFA: freie Fettsäuren TG: Triglyzeride
ChE: Cholesterylester
n: Anzahl beprobter Hunde
185

Danksagung
11 Danksagung
Großer Dank gilt meinen wissenschaftlichen Betreuern Prof. Dr. Reinhard Mischke
und Prof. Dr. Wolfgang Bäumer für die Überlassung dieses interessanten Themas
und vor allem für die Unterstützung und Beratung bei der Fertigstellung dieser Arbeit.
Besonders möchte ich mich für die immer kurzfristig möglichen Gespräche
bezügliche auftretender Probleme und die binnen kurzem durchgeführten
Korrekturen bedanken.
Prof. Dr. Manfred Kietzmann und Dr. Jessica Stahl möchte ich für ihre wertvollen
Ratschläge bei Problemen in der Analytik danken. Dr. Jessica Stahl danke ich
außerdem für ihre Unterstützung bei der Postergestaltung.
Prof. Dr. Hassan Y. Naim möchte ich für seine Unterstützung und die Möglichkeit
danken, meine Messungen im Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover durchzuführen. Die Labmeetings haben mir einen
interessanten Einblick in weitere Bereiche der Lipidforschung ermöglicht.
Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein möchte ich für die histologische Untersuchung
der Biopsieproben danken.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Susanne Brodesser von der Uniklinik Köln, die mir bei
Fragen zur Ceramidanalytik jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand.
Dr. Karl Rohn danke ich für seine ausführliche Beratung hinsichtlich der statistischen
Auswertung, die wesentlichen Anteil an der Publikation des ersten Teils dieser Arbeit
hatte.
Den Mitarbeitern des Intituts für Physiologische Chemie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover danke ich für ihre Unterstützung bei der Labortätigkeit,
besonders Heike Kanapin. Franziska Schirmer und Dr. Michaela Landfried danke ich
186

Danksagung
für ihre ausführliche Einführung meinerseits in die Methodik. Den Master- und PhD-
Studenten sowie Doktoranden des Instituts danke ich für ihre Ratschläge und
aufmunternden Worte, besonders auch Graham Brogden, der mich außerdem bei
der englischen Korrektur des ersten Manuskripts unterstützt hat.
Bei allen Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule
Hannover, die mich bei der Probenahme unterstützt und mich über in Frage
kommende Fälle informiert haben, möchte ich mich dafür recht herzlich bedanken.
Besonders danke ich Dr. Ramona Saba-Buttkewitz für Ihre fachliche Beratung und
Unterstützung, die aufmunternden Worte und die leckeren Kekspausen. Ich hätte mir
keine bessere Lehrerin für die dermatologische Ausbildung wünschen können.
Meinen Mitdoktoranden möchte ich für die vielen anregenden Gespräche, die
aufmunternden Worte und die lustigen Abende danken, die die Zeit hier sehr
bereichert haben. Ganz besonders gilt dies für Dr. Sonja Möller, Dr. Britta Bösing, Dr.
Katharina Imholt, Dr. Anne Rollmann, Liza Ahrend, Lysann Schneider, Karin Lucas,
Anne Sieslack, Julika Darmstadt, Birte Goldner, Judith Meyer, Lisa Harder, Sylvia
Christiansen, Jan Bach und Dr. Christina Witten. Liza Ahrend und Lysann Schneider
danke ich außerdem für die wertvolle Zeit, die sie damit verbracht haben, auf mich zu
warten.
Mein größter Dank jedoch gilt meiner Familie und meinen Freunden, die mich zu
jeder Zeit unterstützt und wenn nötig wieder motiviert haben. Ganz besonders
möchte ich mich bei meinen Eltern und bei meinem Mann bedanken, die immer an
mich geglaubt und diesen Tag genauso herbeigesehnt haben wie ich. Ohne Euch
wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
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