Experimentelle intravaskuläre Gentherapie von malignen ZNS ...

1. Einleitung 8
1.3.4. Retrovirale Verpackungszellen
1.3.4.1. Retrovirale Vektoren
Erstmalig wurden virale Verpackungszellen, wie -2 (MANN et al., 1983) und -am (CONE
UND MULLIGAN, 1984), generiert, die einen Mo-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus)-
Provirus mit einer deletierten -Sequenz besitzen. Die -Sequenz, die downstream
zwischen der 5’ LTR(long terminal repeat)-Sequenz und des Startcodons für das gag-
Polyprotein liegt (MANN et al., 1983), ist erforderlich, um große RNA-Moleküle, die durch
rekombinate, retrovirale Konstrukte transkribiert werden können, und die genetische
Virusinformation in retrovirale Partikel zu verpacken (LINIAL UND MILLER, 1990). Das
Verpacken retroviraler RNA durch ein funktionales -Signal und die Produktion biologisch
aktiver Viruspartikel wird durch das Vorhandensein der viralen Proteine, die durch die Gene
gag (virale Capsid-Proteine und Virus-Core), pol (Reverse Transkriptase, andere
virusassoziierte Nukleasen) und env (Glykoproteine der viralen Lipidhülle) kodiert werden,
bestimmt. Jedoch verursachen diese Zelllinien sehr häufig die Produktion von Wildtyp-Virus,
da eine einzelne Rekombination zwischen dem Verpackungskonstrukt (gag, pol, env) und
dem Vektor, der das native -Signal trägt, ausreicht, um das Wildtyp-Genom zu produzieren
(MILLER et al., 1986; MUENCHAU et al., 1990). Um die Risiken der Erzeugung eines Wildtypund
replikationsfähigen Virus zu umgehen, wurde eine weitere Gruppe retroviraler
Vektorsysteme, die Mutationen in der LTR-Sequenz des Verpackungskonstruktes tragen,
konstruiert, so dass zusätzliche Rekombinationsereignisse erforderlich sind, bevor ein
replikationsfähiger Virus produziert werden kann. Die Verpackungszelllinie PA317 (MILLER
UND BUTTIMORE, 1986) trägt einen Provirus, der neben einer mutierten -Region zusätzlich
eine Deletion in der 5’-LTR-Sequenz aufweist. Der retrovirale Vektor enthält das Gen für die
Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) downstream der 5’-LTR-Sequenz gefolgt
von einem SV40-Promotor, wird von der retroviralen Zelllinie PA317 (Zelllinie GLI 328 in der
vorliegenden Arbeit) verpackt und kann auf NIH/3T3-Zellen titriert werden (RAM et al., 1997).
1.3.4.2. Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase
Eine ganze Reihe von viralen Vektoren, die vom Herpes-Simplex-Virus (HSV) abgeleitet
sind, wurden bereits in Tiermodellen angewendet, um bioaktivierende Transgene
(Suizidgene) oder Tumorsuppressorgene in Tumorzellen zu übertragen (BI et al., 1993;
BOVIATIS et al., 1994). Die Thymidinkinase (TK) des Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV1) ist