Experimentelle intravaskuläre Gentherapie von malignen ZNS ...

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1. Einleitung 2 Hirntumortherapie etablieren. Da gepulster 2 MHz-US den Schädel durchdringt, wurde im Folgenden der Effekt von Kontrastmittel auf die Transfektionseffizienz und die Viabilität der Hirntumorzellen getestet und charakterisiert. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Säugerzellen mit Alginat in Alginat-poly- L - Lysin-Alginat(APA)-Mikrokapseln zu immobilisieren, um diese hinsichtlich ihrer physikalischen und biologischen Eigenschaften, wie Perlenformation, Alginatbeschichtung, mechanische Stabilität der APA-Mikrokapseln sowie Wachstum und Langzeitüberleben von normalen, Tumor- (neoplastischen) und transgenen (gentechnisch veränderten) Zellen in definierten Mikrokapselgrößen (Durchmesser
1. Einleitung 3 (VERMA UND SOMIA, 1997). Aufgrund der polaren Ladungen sind kationische Liposomen fähig, die negativ geladene DNA, unabhängig von ihrer Größe, zu binden und Liposomen- DNA-Komplexe (Lipoplexe) zu bilden, die mit der Zellmembran fusionieren. Die Plasmid- DNA kann so direkt in das eukaryontische Zytoplasma übertragen werden (HUG UND SLEIGHT, 1991). Liposomen aus unterschiedlich zusammengesetzten Lipiden weisen unterschiedliche DNA-Transfereffizienzen in Zellkultur und in vivo auf (FELGNER et al., 1994; HUG AND SLEIGHT, 1991; SAN et al., 1993). Die meisten Liposomen, die zum Gentransfer eingesetzt werden, setzen sich aus einem kationischen Lipid und einem neutralen Helferlipid zusammen, die Lipoplexe ausbilden, wenn sie mit Plasmid-DNA komplexiert werden (NABEL et al., 1993; RAINOV et al., 1999). Die erste Beschreibung solcher Verbindungen wurde durch FELGNER und Kollegen (1987) geliefert, die zur Transfektion eines Reportergens in kultivierte Zellen Lipoplexe aus DOTMA/DOPE verwendeten. Seitdem wurden zahlreiche kationische Liposomen mit dem neutralen Lipid DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) synthetisiert und zum aktiven DNA-Transfer in verschiedene Zelltypen angewendet (BEHR et al., 1989; FELGNER et al., 1994; GAO AND HUANG, 1991; HAWLEY-NELSON et al., 1993; LEE et al., 1996; LEVENTIS AND SILVIUS, 1990; ROSE et al., 1991; SOLODIN et al., 1995). Weiterhin wurde beschrieben, dass die Transfereffizienz kationischer Liposomen in Verbindung mit neutralen Helferlipiden, wie DOPE, höher ist als die der kationischen Lipide allein (FELGNER et al., 1994; LIU UND SONG, 1998). Andere Studien ergaben, dass Cholesterol ebenfalls die Transfektionsaktivität kationischer Liposomen verbessert (BENNETT et al., 1995; HONG et al., 1997; TEMPLETON et al., 1997). Die relativ einfache Herstellung und die biologisch sichere Anwendung (keine vektoreigenen Gene) kationischer Liposomen ist von großer Bedeutung für die Gentherapie. Durch ihre biologische Sicherheit ist gewährleistet, dass nur die genetische Information der Plasmid-DNA übertragen wird. Zur Evaluierung des Liposomen vermittelten Gentransfers bietet das grün autofluoreszierende Protein GFP, das ursprünglich aus der biolumineszenten Qualle Aequorea vitoria isoliert wurde (SHIMOMURA et al., 1962), aus 238 Aminosäuren besteht (PRASHER et al., 1992), mittels UV oder blauem Licht angeregt wird (395 – 470 nm) und bei 508 nm grünes Licht emittiert, eine exzellente Möglichkeit. Denn in zahlreichen Studien wird und wurde GFP als Reporter- oder Markermolekül eingesetzt, um Genexpressionen und die Proteinlokalisation in lebenden Zellen zu kontrollieren (CHALFIE et al, 1994), da es in Säugerzellen keine Toxizität hervorruft oder Enzymaktivitäten von Fusionsproteinen, die mit GFP markiert wurden, inhibiert (VALDEZ et al., 1998). Außerdem benötigt die intrazelluläre Detektion von GFP keine exogen zugeführten Substrate oder Kofaktoren wie für
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