Der Einsatz mykorrhizierter Gehölze in biologischen ... - E-LIB

Der Einsatz mykorrhizierter Gehölze
in biologischen Sanierungsverfahren
unter dem Aspekt
TNT-belasteter Böden
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
vorgelegt dem Fachbereich 2
Biologie/Chemie
Universität Bremen
von
Ingo Dobner
Bremen 2003

Gutachter:
Prof. Dr. Wolfgang Heyser
Prof. Dr. Gunter-Otto Kirst

Inhalt
1. Einleitung...........................................................................................................1
1.1 Der Sprengstoff TNT.........................................................................................1
1.1.1 Herstellung und Vorkommen von TNT und Nebenprodukten....................1
1.1.2 Toxikologische Eigenschaften von TNT.........................................................3
1.1.3 Abbau von TNT unter natürlichen Bedingungen..........................................5
1.2 Bodenreinigung durch Pilze und Pflanzen.....................................................7
1.2.1 Bodenreinigung durch Weißfäulepilze............................................................7
1.2.2 Phytoremediation von Schadstoffen – Bodenreinigung
durch Pflanzen.................................................................................................10
1.2.3 Strukturen der Ektomykorrhiza; Bodenreinigung
durch Mykorrhizapilze .....................................................................................11
1.3 Fragestellung und Zielsetzung des Arbeitsvorhabens...............................13
2. Material und Methode...................................................................................16
2.1 Organismen in den Experimenten.................................................................16
2.1.1 Pilze ...................................................................................................................16
2.1.1.1 Kultivierung der Mykorrhizapilze auf Agarmedium.....................................16
2.1.1.2 Kultivierung der Weißfäulepilze auf Agarmedium ......................................16
2.1.1.3 Kultivierung der Weißfäulepilze auf Stroh und Weichholzschredder ......17
2.1.2 Pflanzen.............................................................................................................18
2.1.2.1 Anzucht der Kiefern.........................................................................................18
2.1.2.2 Herkunft der Pappeln ......................................................................................18
2.1.2.3 Mykorrhizierung der Kiefern in Rhizotronkulturen ......................................19
2.1.2.4 Mykorrhizierungen an Pappeln......................................................................19
2.2 Experimente......................................................................................................20
2.2.1 Kultivierung von Kiefern auf TNT-belasteten Boden
(Kiefernexperiment).........................................................................................20
2.2.2 Kultivierung von Pappeln auf TNT-belasteten Boden
(Pappelexperiment).........................................................................................22
2.2.3 Aufnahme des Radiotracers 14 C-TNT in Kiefernsämlinge ........................25
2.2.4 Phytotoxizitätstest mit Kiefern........................................................................26
2.2.4.1 Vorbereitung der Pflanzen..............................................................................27
2.2.4.2 Vorbereitung des Bodensubstrates ..............................................................27
2.2.4.3 Homogenitätskontrolle ....................................................................................27
2.2.4.4 Versuchsdesign und Probennahme..............................................................27
2.3 Methoden ..........................................................................................................29
2.3.1 Qualitativer Nachweis ligninolytischer Enzyme auf Agar-Festmedien....29
2.3.1.1 Nachweis der Mangan-Peroxidase-Aktivität................................................30
2.3.1.2 Nachweis der Lignin-Peroxidase-Aktivität ...................................................30
2.3.2 Extraktionsverfahren.......................................................................................30
2.3.2.1 Nitroaromatenextraktion aus den Bodenmischproben..............................30
2.3.2.2 Nitroaromatenextraktion aus Pflanzengeweben.........................................31
2.3.3 Nitroaromaten-Analytik ...................................................................................32
2.3.3.1 HPLC-Analytik..................................................................................................32
2.3.3.2 GC/MS-Analytik................................................................................................33
2.3.4 Quantifizierung der Radioaktivität durch Szintillationszählung.................35

2.3.4.1 Vorbereitung der Pflanzenproben.................................................................35
2.3.4.2 Aufnahme der Nährlösung .............................................................................36
2.3.4.3 Auswaschung des Kohlepapiers ...................................................................36
2.3.4.4 Ermittlung der Radioaktivität..........................................................................36
2.3.5 Angewandte Methoden für die Mikroautoradiographie..............................36
2.3.5.1 Gefriertrocknung der präparierten Wurzeln.................................................36
2.3.5.2 Kunststoffinfiltration.........................................................................................38
2.3.5.3 Schneiden der Proben am Ultramikrotom....................................................39
2.3.5.4 Mikroautoradiographie ....................................................................................39
2.3.6 Rasterelektronenmikroskopie (REM)............................................................39
2.3.7 Bestimmung des pH-Wertes von Bodenproben.........................................40
2.3.8 Fotografische Dokumentation........................................................................40
2.3.9 Ergebnisauswertung und Statistik.................................................................41
3. Ergebnisse.......................................................................................................42
3.1 Qualitativer Nachweis ligninolytischer Enzyme ..........................................42
3.2 TNT-Abbau-Experimente mit Kiefern...........................................................43
3.2.1 Entwicklung der TNT-Belastung im Boden..................................................43
3.2.2 Entwicklung der ADNT-Belastung im Boden...............................................46
3.2.3 Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Kiefern..................48
3.2.4 Zusammenfassung ..........................................................................................48
3.3 TNT-Abbauexperimente mit Pappeln als Phytoremediatoren..................49
3.3.1 Bodenanalytik...................................................................................................49
3.3.1.1 Entwicklung der TNT-Belastung im Boden..................................................50
3.3.1.2 Entwicklung der ADNT-Belastung im Boden...............................................53
3.3.1.3 Dinitrotoluole.....................................................................................................55
3.3.2 Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Pappeln................56
3.3.3 Zusammenfassung ..........................................................................................56
3.3.4 Nachweis des Nitroaromatentransfers aus dem Boden in die
Versuchspflanzen............................................................................................57
3.3.4.1 Quantitativer Nachweis von Nitroaromaten mittels GC/MS ......................59
3.3.4.2 Wiederfindungsraten für TNT in Pflanzenproben.......................................61
3.3.4.3 Zusammenfassung ..........................................................................................62
3.4 Aufnahme und Verteilung von 14 C-TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten
in Pinus sylvestris Sämlingen ........................................................................62
3.4.1 Mikroautoradiographische Untersuchungen von nicht-mykorrhizierten
und mykorrhizierten Kiefernwurzeln .............................................................63
3.4.2 Bestimmung der Radioaktivität in den einzelnen Pflanzenorganen
durch Szintillationszählung.............................................................................69
3.4.3 Bilanzierung ......................................................................................................72
3.4.3.1 Wiederfindung nach Dotierung einer hohen 14 C-TNT-Konzentration......72
3.4.3.2 Wiederfindung nach Dotierung einer niedrigen
14 C-TNT-Konzentration...................................................................................73
3.4.3.3 Verbleibende Radioaktivität in Kohlepapier und Düngelösung ................73
3.4.4 Zusammenfassung ..........................................................................................73
3.5 Toxizitätstest mit mykorrhizierten Kiefern in TNT-haltigem
Bodensubstrat ..................................................................................................74
3.5.1 Wiederfindung der TNT-Kontamination........................................................74
3.5.2 Ermittlung der Nitroaromatengehalte im Boden
und in der Bodenlösung ..................................................................................75

3.5.3 Ermittlung des Pflanzenwachstums in den Dotierungskategorien...........79
3.5.3.1 Gesamtüberblick..............................................................................................80
3.5.3.2 Pflanzenwachstum in Bezug zur Nitroaromatenkonzentration
in der Bodenlösung..........................................................................................82
3.5.4 Zusammenfassung ..........................................................................................87
4. Diskussion.......................................................................................................88
4.1 Wechselwirkungen zwischen Nitroaromaten und Bodenmatrix...............88
4.1.1 Adsorption an Tonmineralien.........................................................................88
4.1.2 Wechselwirkung mit Huminstoffen................................................................89
4.1.3 Reduktive TNT-Transformation in den Experimenten
und Wechselwirkungen mit Bodenbestandteilen........................................90
4.1.4 Einfluss von Bodenfaktoren auf die Bindungskinetik .................................91
4.1.5 Hydroxylaminodinitrotoluole (HADNT) als Intermediate
der TNT-Reduktion..........................................................................................93
4.1.6 Entstehung von Azoxyverbindungen bei der TNT-Transformation..........94
4.2 Dekontamination sprengstoffbelasteter Böden im Kiefernund
Pappelexperiment; ein Variantenvergleich ..........................................95
4.2.1 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden
der Kontrollvariante (Variante K)...................................................................98
4.2.2 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden
der Weißfäulepilzvariante (Variante C) ........................................................99
4.2.3 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden der
Versuchsvarianten mit mykorrhizierten Pflanzen (Varianten A und B) 100
4.2.3.1 Verwendete Organismen und ihre Fähigkeit zur
Nitroaromatentransformation...................................................................... 101
4.2.3.2 Mykorrhizapilze und ihr Einfluss auf die mikrobielle
Lebensgemeinschaft im Boden.................................................................. 102
4.2.4 Nitroaromatenabreicherung in Versuchsvariante D mit Weißfäulepilzen
und mit nicht-mykorrhizierten Pflanzen................................. 104
4.3 Nitroaromaten in Pflanzengeweben........................................................... 106
4.3.1 Aufnahme von Nitroaromaten aus dem Boden........................................ 106
4.3.2 Kiefern als Versuchspflanzen bei der Applikation mit 14 C-TNT............. 109
4.3.3 Nitroaromatenaufnahme in die Wurzeln.................................................... 110
4.3.4 Apoplastischer Transport............................................................................. 111
4.3.5 Symplastischer Transport............................................................................ 113
4.3.6 Metabolismus der aufgenommenen Nitroaromaten................................ 114
4.3.6.1 Orte der Metabolisierung ............................................................................. 114
4.3.6.2 Einbau von 14C-TNT und Metaboliten in die Zellwände........................ 117
4.3.6.3 Einbau von TNT-Metaboliten in die Ligninfraktion................................... 118
4.3.6.4 Festlegung an Zellwandbestandteilen der Wurzeloberfläche................ 119
4.3.7 Extraktion von Nitroaromaten aus Pflanzengeweben............................. 120
4.4 Toxizitätstest mit mykorrhizierten Kiefern in TNT-haltigem
Bodensubstrat ............................................................................................... 122
5. Zusammenfassung..................................................................................... 128

6. Phytoremediation am Standort ‚Werk Tanne’; Durchführung
und Beurteilung unter Berücksichtigung der Laborergebnisse.... 131
6.1 Kurze Beschreibung des Standortes ‚Werk Tanne’ ................................ 131
6.2 Verfahrenskonzept........................................................................................ 132
6.3 Einrichtung der Versuchsflächen................................................................ 132
6.4 Grenzen des Versuchsansatzes ................................................................ 133
6.5 Beurteilung des Phytoremediationsverfahrens in Hinblick seines
Sanierungerfolges unter Berücksichtigung der Ergebnisse
aus den Laborversuchen............................................................................. 134
6.6 Sanierung TNT-belasteter Flächen durch Phytoremediation;
Anwendungsbereiche und Machbarkeit.................................................... 137
6.6.1 Zeitrahmen und Art des Verfahrens........................................................... 138
6.6.2 Auswahl der Organismen............................................................................ 138
7. Literatur......................................................................................................... 140
8. Anhang.......................................................................................................... 159

Abkürzungen
ADNT
Aminodinitrotoluol
2-ADNT
2-Aminodinitrotoluol
4-ADNT
4-Aminodinitrotoluol
4-A-2-NT 4-Amino-2-nitrotoluol
4-A-2-HA-6NT 4-Amino-2-hydroxylamino-6-nitrotoluol
bar
Bar
BIA
Berufsgenossenschaftliches Institut für Arbeitssicherheit
bidest
bidestillata (bidestilliert)
BM
Biomasse
Bq
Becquerel
°C Grad/Celsius
CAS
Chemical Abstract Service
cm
Zentimeter
cpm
counts per minute
Da
Dalton
2,4-DAHAT 2,4-Diaminohydroxylaminotoluol
DANT
Diaminonitrotoluol
2,4-DANT 2,4-Diaminonitrotoluol
2,6-DANT 2,6-Diaminonitrotoluol
2,4-DAT
2,4-Diaminotoluol
DC
Dünnschichtchromatographie
DCM
Dichlormethan
DNT
Dinitrotoluol
2,4-DNT
2,4-Dinitrotoluol
2,6-DNT
2,6-Dinitrotoluol
dpm
disintegrations per minute (Zerfälle pro Minute)
Fa
Firma
FG
Frischgewicht
g
Gramm
GCP
Gelpermeationschromatographie
h
Stunde
HADNT
Hydroxylaminodinitrotoluol
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
k
Kilo
KAK eff
effektive Kationenaustauschkapazität
K ow
Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient
l
Liter
LUFA
Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer
m
Meter
mg
Milligramm
min
Minute
mm
Millimeter
mV
Millivolt

MS
PAK
rpm
Massenspektrometer
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
s
Sekunde
t
Zeit
TAT
2,4,6-Triaminotoluol
TB
Trockenboden
TM
Trockenmasse
TNT
2,4,6-Trinitrotoluol
W
Watt
µ Mikro

Abstract
The use of mycorrhizal plants in the bioremediation of TNT -
contaminated soils
The production and improper handling of the explosive 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) led
to the contamination of soil and groundwater at many former ammunition and military
sites in germany. This persistent organopollutant is very dangerous for the
environment, because of its toxicity to a large variety of organisms including animals
and humans.
Conventional ex situ remediation of TNT sites by chemico-physical treatment is costly
and an energy-intensive process. Alternatively, phytoremediation is an
environmentally acceptable in situ method and holds promise for low-cost
remediation. Phytoremediation is the use of plants to clean up soils contaminated
with a number of harzadous substances. This technique is also practical to remediate
TNT-contaminated soils.
The present work concentrates on the potential application especially of mycorrhizal
plants in remediation of TNT-contaminated soils. Provided that plants clean up soils
by a) release of exudates (sugars, organic acids etc.) and enzymes, that stimulate
microbial activity and biochemical dregadation in the rhizosphere ; b) furnishing the
host of the symbiosis with carbon sources, while mycorrhizal fungi are capable of
TNT biotransformation by extracellular enzymes; c) direct uptake of TNT and
degradation products and subsequent accumulation of non-phytotoxic products into
plant tissue, the following experiments were carried out.
The degradation of TNT in rhizosphere soil was tested in experiments with
ectomycorrhizal associations of Pinus sylvestris/Pisolithus tinctorius and Populus
tremula/Hebeloma spec., cultivated in rhizotron systems. The rhizotrons were filled
with soil from the ammunition site ‘Tanne’ at Clausthal Zellerfeld/Lower Saxony. In
addition, the investigations involved the ligninolytic white rot basidiomycete Pleurotus
ostreatus which is able to degrade TNT via excretion of lignin and manganese
peroxidase. The results indicated, that mycorrhizal plants can play an important role
for biotransformation of TNT and other nitroaromatic compounds. Contamination
levels were lowest in rhizotrons with mycorrhizal plants. In this context, it was
negligible whether rhizotrons were inoculated with white rot fungi or not.

Furthermore, uptake and translocation activity of TNT in mycorrhizal and nonmycorrhizal
plants (Pinus sylvestris/Pisolithus tinctorius) were examined using
ringlabelled 14 C-TNT. Most of the radioactivity was detected in the roots with only
small levels detected in stems and needles. A mycorrhiza effect was not observed,
mycorrhizal and non-mycorrhizal plants showed similar results.
Ectomycorrhiza can be used for effective remediation of soil provided plants and
fungi are tolerant or resistant to toxic contaminants. Because less is known of
phytotoxicity thresholds of TNT and its metabolites in soils. In this context the effects
of TNT and transformation products on growth and development of Pinus
sylvestris/Pisolithus tinctorius mycorrhiza were investigated. The results showed that
levels less than 50 mg TNT/kg 1 soil had no effects on mycorrhizal plants. Higher TNT
or ADNT concentrations up to 50 mg /kg 1 soil substantially delayed production of
shoot biomass. Although plant growth was inhibited, mycorrhizal plants might be able
to tolerate higher levels and kept a relevant potential of regeneration.
The studies allow the conclusion, that mycorrhizal plants have the capacity to
remediate TNT-contaminated soils. Most efficiency may be expected at sites with
shallow contamination, where TNT and metabolites were treated in the rhizosphere
by microbial activity and by root uptake. Uptake, accumulation and binding of TNT
and its transformation products into plants seem to be dependent on plant species
and plant organs. In this case, we need more information for a better understanding.
Therefore, further investigations are required.

Einleitung
1.Einleitung
1.1 Der Sprengstoff TNT
1.1.1 Herstellung und Vorkommen von TNT und Nebenprodukten
2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) wurde erstmalig im Jahre 1863 von J. Wilbrand in unreiner Form
synthetisiert. Als reine Verbindung gelang P. Hepp 1880 die Herstellung. Nach ersten
Sprengversuchen 1884 in Hanau wurde schließlich um 1900 die großtechnische Produktion
aufgenommen. Vor allem während des ersten und zweiten Weltkrieges wurden große Mengen TNT
hergestellt. Allein im Deutschen Reich lag die Produktion im zweiten Weltkrieg nach Schätzungen
über 800000 Tonnen (Preuß et al. 1988). Die Synthese von TNT erfolgt durch schrittweise
Nitrierung des Toluols. Außer TNT fielen bei der Produktion größere Mengen verschiedener
Nebenprodukte, wie Mononitrotoluole, Dinitrotoluole und auch TNT-Isomere an. Diese
unerwünschten Nebenprodukte ließen sich durch mehrmaliges Waschen mit Natriumsulfit-Lösung
aus dem Rohprodukt entfernen. Nach Neutralisierung mit Kalk wurden die Abwässer in der Regel
vor Ort in Vorfluter und Schlammteiche geleitet oder in Schluckbrunnen verpresst. Unfälle bei der
Produktion und unsachgemäße Handhabung haben zudem zur Kontamination der Böden zahlreicher
ehemaliger Produktionsstätten beigetragen. So lassen sich TNT und Folgeprodukte aufgrund ihrer
hohen Persistenz auch gegenwärtig noch an vielen Stellen in kristalliner Form im Boden nachweisen.
Die größten Sprengstofffabriken mit ihren damaligen monatlichen Kapazitäten waren nach Wolff
(1989) Stadtallendorf (5000 Tonnen), Hessisch Lichtenau (3500 Tonnen), Clausthal-Zellerfeld
(2800 Tonnen) Krümmel (2800 Tonnen) und Elsnig (2600 Tonnen). Aus zahlreichen Untersuchungen
geht hervor, dass neben dem TNT selbst auch verschiedene Neben- und
Zwischenprodukte aus der TNT-Herstellung sowie einige Transformationsprodukte, die aus der
TNT-Degradation hervorgehen, ein stark gesundheitsgefährdendes Potenzial aufweisen (BIA-Report
1998, Berufsgenossenschaftliches Institut für Arbeitssicherheit). Zahlreiche Verbindungen befinden
sich diesbezüglich derzeit noch in der Überprüfung. Häufig auf Rüstungsaltlasten nachgewiesene
Verbindungen sind u. a. 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2-ADNT, 4-ADNT, 2,4-DANT, 2,6-DANT, 2-NT,
4-NT und 3-NT. Nachstehend sind einige von ihnen
mit Formel und allgemeinen Angaben aufgeführt (Abbildung 1).
1

Einleitung
O 2 N
CH 3
NO2
2,4,6-Trinitrotoluol (TNT)
NO 2
CAS-Nr.: 118-96-7
Summenformel: C 7 H 5 N 3 O 6
Schmelzpunkt [°C]: 81
Wasserlöslichkeit [mg/l]: 120
Masse [g/mol]: 227,13
CH 3
CH 3
O 2 N
NH2
O 2 N
NO2
NO2
NH2
2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT)
CAS-Nr.: 35572-78-2
Summenformel: C 7 H 7 N 3 O 4
Schmelzpunkt [°C]: 173
Wasserlöslichkeit [g/l]: 2,8 (geschätzt)
Masse [g/mol]: 197,15
4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT)
CAS-Nr.: 19406-51-0
Summenformel: C 7 H 7 N 3 O 4
Schmelzpunkt [°C]: 171
Wasserlöslichkeit [g/l]: 2,8 (geschätzt)
Masse [g/mol]: 197,15
CH 3
NH 2
CH 3
NH 2
O 2 N
H 2 N
NH 2
NO2
2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DA-6-NT)
CAS-Nr.: 6629-29-4
Schmelzpunkt [°C]: 131
Wasserlöslichkeit [mg/l]: k. A.
Masse [g/mol]: 167,17
2,6-Diamino-4-nitrotoluol (2,6-DA-4-NT)
CAS-Nr.: 59229-75-3
Schmelzpunkt [°C]: 215
Wasserlöslichkeit [mg/l]: k. A.
Masse [g/mol]: 167,17
CH 3
NO 2
CH 3
O 2 N
NO2
NO2
2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT)
CAS-Nr.: 121-14-2
Summenformel: C 7 H 6 N 2 O 4
Schmelzpunkt [°C]: 68
Wasserlöslichkeit [mg/l]: 166
Masse [g/mol]: 182,14
2,6-Dinitrotoluol (2,6-DNT)
CAS-Nr.: 606-20-2
Summenformel: C 7 H 6 N 2 O 4
Schmelzpunkt [°C]: 65
Wasserlöslichkeit [mg/l]: 145
Masse [g/mol]: 182,14
Abb. 1: Chemische Struktur von TNT und Transformationsprodukten
2

Einleitung
In den meisten Fällen sind aromatische Nitroverbindungen anthropogenen Ursprungs und haben
somit Fremdstoffcharakter. Als natürliche Verbindungen kommen nitrierte Aromaten dagegen sehr
selten und lediglich mit einer Nitrogruppe substituiert vor. Zu nennen sind hier die Antibiotika
Chloramphenicol und Pyrrolnitrin, die von Streptomyces- und Pseudomonas-Stämmen gebildet
werden, sowie die dem Fraßschutz dienende und von den Pflanzen über den Sekundärmetabolismus
gebildete Aristolochiasäure (Pailer 1960). Der Pilz Lepista diemii Singer synthetisiert das 4-
Nitroanisol als Metabolit (Thaller & Turner 1972). Stabilität und seltenes natürliches Vorkommen
sind möglicherweise der Grund für die geringe biologische Abbaubarkeit (Abbildung 2).
O 2
N
OH
H
N
O
OH
Cl
Cl
H
N
Chloramphenicol
Cl
NO 2
Cl
Pyrrolnitrin
NO2
NO 2
COOH
O
O
OCH3
Aristolochiasäure
4-Nitroanisol
Abb. 2: Chemische Struktur verschiedener natürlich vorkommender Nitroaromaten
1.1.2 Toxikologische Eigenschaften von TNT
Nitroaromaten wie 2,4,6-Trinitrotoluol haben ein hohes Gefährdungspotenzial für Menschen und
Tiere und zeigen ein weites Spektrum toxischer Wirkungen (Martinetz & Rippen 1996). Akute
Symptome äußern sich insbesondere durch Reizungen der Augen und Schleimhäute der Atemwege,
Husten, Bindehautentzündungen, Erbrechen, Durchfall, Schwindel, Übelkeit, Kopfschmerzen,
3

Einleitung
Atemstörungen bis hin zum Blutdruckabfall, Kollaps und Koma. Als Folgekrankheiten treten u. a.
Hepatitis, Gelbsucht, Anämie und Nierenschäden auf. Als Symptome nach chronischer
Inkorporation werden neben zahlreichen anderen Erkrankungen Methämoglobinanämie,
Leberzirrhose, Nierenschäden und Trübung der Augenlinsen (TNT-Star) beschrieben (Ludewig &
Lohs 1991, Henschler 1988, Moeschlin 1986). TNT wird gut resorbiert. Über die Haut des
Menschen können innerhalb von acht Stunden zwischen 2,6 und 3,8 µg TNT/ cm 2 aufgenommen
werden (Henschler 1988). Weitere Aufnahmepfade sind Lunge, Schleimhäute und Verdauungstrakt.
Aufgrund einer zügigen Metabolisierung besteht trotz lipophiler Eigenschaften jedoch weniger die
Neigung zur Anreicherung im Fettgewebe (Koss et al. 1989). Die Halbwertzeit der Ausscheidung
bei Ratten nach gleichmäßiger Verteilung im Organismus beträgt 6,3 Stunden. Die Abgabe erfolgt
überwiegend mit dem Urin. Hauptmetaboliten im Harn sind 4-ADNT, 2-ADNT, 2,4-DANT, 4-
HADNT sowie das 2,4,6-TNT selbst (Henschler 1988). Von der Senatskommission zur Prüfung
gesund-heitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft wurde TNT bezüglich
seiner Kanzerogenität in Kategorie 3 eingestuft. Hiernach besteht die Möglichkeit einer
krebserregenden Wirkung beim Menschen. Jedoch liegen noch nicht genügend Informationen für
eine sichere Beurteilung vor (BIA-Report 1998). Allerdings lassen epidemiologische Studien
vermuten, dass Nitroaromaten starke Kanzerogene und Mutagene darstellen (Anderson et al. 1997).
Im Ames-Test ließ sich ein mutagenes Potenzial bei Konzentrationen zwischen 10 und 5000 µg TNT
bei Salmonella typhimurium TA 100 und anderen Stämmen feststellen (Spanggord et al. 1982).
Selbst Harnproben TNT-exponierter Arbeiter hatten bei Salmonella typhimurium TA 98 mutagene
Wirkung (Ahlborg et al. 1985). Als Luftgrenzwert wird eine Maximale Arbeitsplatzkonzentration von
0,1 mg TNT-Staub/m 3 Luft (MAK-Wert) angegeben, wobei aufgrund hautresorptiver Eigenschaften
des TNT die Einhaltung des Luftgrenzwertes für den Schutz der Gesundheit nicht ausreicht und beim
Umgang zusätzliche arbeitshygienische Maßnahmen getroffen werden müssen (BIA-Report 1998).
Die teilweise reduzierten Metabolite des TNT, die ADNTs und die DANTs sind bisher nicht
ausreichend untersucht, um sichere Aussagen über ihre toxikologische Einstufung machen zu können.
Die wenigen vorliegenden Informationen deuten auf eine Abnahme der Toxizität durch Reduktion der
Nitrogruppen zu Aminogruppen am TNT-Molekül hin (Martinetz & Rippen 1996). Im
Biolumineszenztest mit dem Bakterium Vibrio fischeri nahm das Toxizitätspotenzial der untersuchten
Nitroaromaten in der Reihenfolge TNT > 4-ADNT > 2-ADNT ab (Frische 2002).
Für Dinitrotoluole ist ein breites Spektrum toxischer Wirkungen beschrieben (Martinetz & Rippen
1996). Aus verschiedenen Kanzerogenitätsstudien lässt sich eine kanzerogene Potenz für 2,4-DNT
und auch für 2,6-DNT ableiten, wobei 2,6-DNT eine stärkere krebsauslösende Wirkung ausübt. In
der Grenzwertliste 1998 des BIA wurde 2,6-DNT in der Rubrik Kanzerogene Stoffe in die
Kategorie 2 eingestuft. Kategorie 2 gilt für Stoffe, die als krebserregend für den Menschen
4

Einleitung
angesehen werden. Die Annahmen beruhen insbesondere auf Langzeit-Tierversuchen. Der MAK-
Wert beträgt 0,05 mg/m 3 Luft.
1.1.3 Abbau von TNT unter natürlichen Bedingungen
Chemische Stabilität, Persistenz und Toxizität sind die wesentlichen Eigenschaften von TNT und
zahlreichen anderen Nitroaromaten. Trotzdem konnte inzwischen bei Bakterien und Pilzen
verschiedener Gattungen die Fähigkeit, TNT zu transformieren oder biologisch abzubauen,
nachgewiesen werden. Die mikrobielle Spaltung des Aromaten mit nachfolgender Mineralisierung
wurde bisher allerdings nur selten beschrieben. Angaben hierzu konzentrieren sich auf ligninolytische
Pilze, welche mit Hilfe ihres extrazellulären Enzymsystems Nitroaromaten oxidativ angreifen und
mineralisieren können (Scheibner et al. 1997). Der Abbau erfolgt jedoch erst nach initialer Reduktion
der Nitrogruppen des TNTs zu Aminogruppen (Van Aken et al. 2000, Fritsche et al. 2000),
wodurch das Elektronendefizit am aromatischen Ring herabgesetzt wird. Über die weiteren
Abbauwege der reduzierten Transformationsprodukte ist bisher noch wenig bekannt. Das TNT-
Molekül wird sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen durch schrittweise
Reduktion der Nitrogruppen transformiert. Als Zwischenprodukte entstehen Aminodinitrotoluole und
Diaminonitrotoluole (Abbildung 3).
5

Einleitung
O 2 N
CH 3
N 2 O
2,4,6-TNT
O 2 N
N 2 O
CH 3 CH 3
NO 2
O 2 N
NH 2
4-ADNT
NH 2
NO 2
2-ADNT
CH 3 CH 3
O 2 N
NH 2 H 2 N
NH 2
2,4-DANT
2,6-DANT
NH 2 NO 2
H 2 N
CH 3
NH 2
2,4,6-TAT
NH 2
Abb. 3: Vollständige reduktive Transformation des TNT und dessen Metaboliten
Der letzte Reduktionsschritt zum Triaminotoluol erfordert strikt anaerobe Verhältnisse. Die
Reduktion wird durch Nitroreduktasen katalysiert, die im Organismenreich eine weite und vielfache
bzw. ubiquitäre Verbreitung haben. Die Reduktion einer Nitrogruppe verläuft unter leicht sauren
Bedingungen in drei Stufen von der Nitro- über die Nitroso- und Hydroxylamin- zur Aminogruppe
(Martinetz & Rippen 1996). Der Sauerstoff der Nitrogruppen wird in Form von Wasser
6

Einleitung
abgespalten. Die nötigen Reduktionsäquivalente werden aus der Verwertung zusätzlicher C-Quellen
gewonnen. Nitroso- als auch Hydroxylaminoverbindungen reagieren schnell weiter, so dass die
Aminodinitrotoluole als erste relativ stabile Verbindungen anzusehen sind.
Für Mono- und Dinitroaromaten sind auch oxidative Initialangriffe in mikrobiellen Abbauprozessen
bekannt. Eine durch Bakterien erwirkte Dioxygenase-katalysierte Initialreaktion, die über den Weg
der Doppelhydroxylierung letztendlich zur Ringöffnung führt, wurde beim Abbau von 2,6
Dinitrotoluol festgestellt (Nishino et al. 2000b). Auch bei anderen Nitroaromaten, wie 1,3-
Dinitrobenzol, 2,4-Dinitrotoluol oder 3-Nitrobenzoat ließen sich Dioxygenase-katalysierte
Initialreaktionen nachweisen. Für 4-Nitrotoluol konnte über eine reduktive Initialreduktion der
Nitrogruppe zum 4-Hydroxylaminotoluol und nach-folgender Oxidation durch eine Dioxygenase
ebenfalls eine Ringöffnung mittels Bakterien beobachtet werden (verschiedene Referenzen in Lenke
2001).
Im Anschluss gilt die Aufmerksamkeit den Pilzen und Pflanzen, deren Remediationspotenzial beim
TNT-Abbau in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde.
1.2 Bodenreinigung durch Pilze und Pflanzen
1.2.1 Bodenreinigung durch Weißfäulepilze
Die saprophytischen Weißfäulepilze, wie beispielsweise die Arten Phanerochaete chrysosporium,
Trametes versicolor oder auch Pleurotus ostreatus leben im Holz und sind aufgrund ihrer
Enzymaustattung in der Lage, Lignin, Zellulose und Hemizellulose als Substrat zu nutzen und
abzubauen. Das Lignin als quantitativ wichtigste Substanz in der Natur kommt praktisch in allen
Pflanzenteilen vor und kann bis zu 30% der Zellwände ausmachen (Hüttermann et al. 1988, Reid
1995). Aufgrund seiner chemischen Struktur, es besteht überwiegend aus vielfach kondensierten
Benzolringen, gilt es als schwer angreifbar. Ligninpolymere setzen sich aus einer Mischung der drei
Monolignole p-Cumaryl-, Sinapyl- und Coniferylalkohol zusammen (Abbildung 4). Das Verhältnis
der drei Grundbausteine ist in verschiedenen Pflanzen sehr unterschiedlich. Während das Lignin der
Coniferen einen hohen Coniferylanteil hat, überwiegt in Getreidehalmen der Cumarylanteil. Die
Biosynthese erfolgt durch enzymatische Oxidation eines Monolignols unter Verwendung von H 2 O 2 zu
einem Phenoxyradikal. Die freien Phenoxyradikale als Zwischenprodukte verknüpfen sich schließlich
untereinander auf vielfältige Weise zu einem hochmolekularen Netzwerk. Es entsteht ein sowohl über
Ether- als auch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zusammengesetztes Biopolymer.
7

Einleitung
OH
OH
OH
OH
OH
OCH3 H 3 CO OCH3
OH
p-Cumarylalkohol Coniferylalkohol Sinapylalkohol
Abb. 4: Die Monolignole p-Cumaryl-, Sinapyl- und Coniferylalkohol dienen als Grundbau-steine der
Ligninmakromoleküle
Die wasserunlöslichen Lignin-Polymere können bei Abbauprozessen wegen ihrer Größe nicht von
den Zellen der Pilzhyphen aufgenommen werden. Zudem liegen sie oft fest eingebettet in Zelluloseund
Hemizellulosebestandteile der Zellwand vor (Reid 1995). Lignin ist kovalent gebunden mit
Zellulose verknüpft. Verschiedene Autoren vergleichen lignifizierte Zellwände mit Stahlbeton, wobei
die Zellulosefibrillen als Stahlgerüst und das Lignin als Beton angesehen werden. Deshalb sind seitens
der Weißfäulepilze besondere Strategien notwendig, um diesen weit verbreiteten Naturbaustein für
sich als Substrat erschließen zu können. Aus Studien mit den Weißfäuleerregern Trametes
versicolor und Phanerochaete chrysosporium geht hervor, dass bei der Biodegradation von
Weizenstroh zuerst Anteile weniger lignifizierter Gewebe angegriffen werden, während die in der
Regel stark lignifizierten Xylemelemente und Sklerenchymfasern einer verzögerten Attacke
unterliegen (Barrasa et al. 1995). Die extrazellulären Enzyme reagieren relativ substratunspezifisch
und können alle Verknüpfungen des Ligninmoleküls angreifen. In von Pilzhyphen infiziertem und sich
bereits im Holzfäuleprozess befindlichem Holzgewebe ließen sich lignocellulytische Lignin- und
Mangan-Peroxidasen am Plasmalemma, in der Zellwand und in den extrazellulären Schleimschichten
der Pilzhyphenzellen nachweisen. In den Sekundärwänden der Pflanzenzellen binden diese Enzyme
an bereits depolymerisierten Ligninfragmenten. Ähnlich verhält es sich mit den Laccasen. Zellulose
wird durch Cellulasen und ß-Glukosidasen angegriffen, welche, lokalisiert in intrazellulären Vesikeln,
in die äußere Schleimschicht des Pilzes diffundieren und an den Mikrofibrillen der pflanzlichen
Zellwand binden. Die lignocellulytischen Enzyme sind aufgrund ihrer Molekülgröße nicht fähig, durch
intakte pflanzliche Zellwände zu diffundieren. Eingeleitet wird der Abbauprozess durch
niedermolekulare, bewegliche Substanzen, wie Veratryalkohol-Kationradikale und Peroxid-radikale,
welche die Poren in den Zellwänden erweitern und somit das Eindringen der Enzyme ermöglichen
8

Einleitung
(Heinzkill 1995, nach Evans et al. 1994 u. 1991). Zu den wichtigsten von den Weißfäulepilzen ins
Substrat ausgeschiedenen Enzymen zählen Lignin-Peroxidase, Mangan-Peroxidase und Laccasen.
Lignin-Peroxidase (E.C. 1.11.1.14; Ligninase): das Enzym ist relativ substratunspezifisch und wird in
inaktivem Zustand durch H 2 O 2 oxidiert, in aktiver Form katalysiert die Lignin-Peroxidase über Ein-
Elektronen-Oxidationen die Bildung von Phenoxyradikalen. Auch nicht-phenolische Verbindungen
können oxidiert werden. Die monomeren N-und O-glykosylierten Proteine besitzen ein
Eisenprotoporphyrin IX als prosthetische Gruppe. Das Molekulargewicht liegt zwischen 38 und 43
kDa (De Jong 1993).
Mangan-Peroxidase (E.C. 1.11.1.13): hierbei handelt es sich ebenfalls um N- und O-glykosylierte
Proteine mit einem Eisenprotoporphyrin IX. Die Molekulargewichte betragen zwischen 43 und 49
kDa (De Jong 1993). Das Enzym oxidiert zunächst ein zweiwertiges Mangan-Atom unter Verbrauch
von H 2 O 2 . Das dreiwertige Mangan oxidiert wiederum phenolische Substrate (Reid 1995). Die
enzymatische Reaktion erfolgt demnach im Gegensatz zur Lignin-Peroxidase indirekt über das
dreiwertige Manganion.
Laccase (E.C. 1.10.3.2): bei diesen Enzymen handelt es sich um kupferhaltige Glykoproteine.
Allerdings benötigen sie kein H 2 O 2 als Cosubstrat (Reid 1995). Laccasen sind relativ
substratunspezifisch und katalysieren u. a. die Oxidation phenolischer Substrate unter Bildung freier
Phenoxyradikale.
Mit ihrer Enzymausstattung sind Weißfäulepilze auch zur Degradation aromatischer Xenobiotika
fähig. Eingesetzt werden sie beim Abbau von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen
(PAK), Dioxinen, Chlorphenolen und TNT (Majcherczyk et al. 1993, Stahl und Aust 1993a,
Scheibner et al. 1997). Die Metabolisierung des TNT ist anhand des Weißfäulepilzes
Phanerochaete chrysosporium mittlerweile genauer untersucht. Das TNT wird durch den Pilz
zunächst zu 4-ADNT bzw. 2-ADNT reduziert. Sich anschließende Acylierungsreaktionen führen zu
unterschiedlichen formylierten und acetylierten Zwischenprodukten (Hawari et al. 1999, Michels und
Gottschalk 1995). Eines dieser Zwischenprodukte, das formylierte 2-Amino-4-formamido-6-
nitrotoluol konnte als Substrat der Lignin-Peroxidase identifiziert werden (Michels und Gottschalk
1995). Auch die anderen Produkte werden unter ligninolytischen Bedingungen metabolisiert.
Scheibner et al. (1997a) gelang der Nachweis einer direkten Mineralisierung von 4-ADNT mit dem
Weißfäulepilz Nematoloma frowardii durch eine Mangan-Peroxidase.
9

Einleitung
1.2.2 Phytoremediation von Schadstoffen – Bodenreinigung durch Pflanzen
Die Phytoremediation als Teilbereich der Bioremediation ist definiert als Entgiftung
schadstoffbelasteter Böden durch Pflanzen. Außer Bakterien und Pilzen verfügen auch Pflanzen über
Mechanismen, Schadstoffe abzubauen. Bisher kommen biologische in-situ Verfahren wenig zur
Anwendung (Trapp & Karlson 2000) und konzentrieren sich in Deutschland hauptsächlich auf
schwermetallbelastete Flächen. Fortgeschrittener ist die Entwicklung in den USA, vor allem bei der
Sanierung von Standorten, die mit organischen Schadstoffen belastet sind (Rock 1999, Newmann et
al. 1998). Einen Überblick über den Anwendungsbereich der Phytoremediation geben die Artikel
von Schnoor et al. (1995) sowie Trapp et al. (2000), wonach insbesondere die Kontaminanten
Nitrobenzol, Trichlorethen, TNT, PAK, Pentachlorphenol u. a. im Mittelpunkt stehen. In jüngerer
Zeit fanden auch Mineralöle immer mehr Beachtung (Coats 1999). Bei der Phytoremediation greifen
verschiedene Mechanismen seitens der Pflanzen. Zunächst besteht die Möglichkeit der Aufnahme
von Stoffen in die Pflanzen mit nachfolgender Metabolisierung im Gewebe. Reinigungstechniken, die
auf solchen Prozessen basieren, werden allgemein unter dem Begriff Phytodegradation
zusammengefasst. Auch TNT und TNT-Metaboliten werden von Pflanzen aufgenommen und
abgebaut. Dies wurde sowohl für zahlreiche krautige Pflanzen (Cataldo et al. 1989, Görge 1994,
Sens 1998, Scheidemann 1998) als auch für einige Gehölze nachgewiesen (Thompson et al. 1998,
Schönmuth und Pestemer 2000). Gewichtiger sind jedoch die Einflüsse der Pflanzen, die indirekt
zum Abbau der Schadstoffe beitragen. So kann über eine Veränderung des Bodenmilieus zugunsten
von Bakterien und Pilzen deren Aktivität und dadurch auch der Abbau schädlicher Substanzen
verbessert werden. Effiziente Phytoremediation beruht also im Wesentlichen auf eine Assoziation
oder Gemeinschaft von Pflanzen, Bakterien und Pilzen im Wurzeleinzugsbereich. Solche Verfahren,
die sich auf den Abbau von Kontaminanten im Wurzelraum konzentrieren, sind durch den Begriff
Rhizodegradation definiert. Ein Phytoremediationsverfahren, das auf Rhizodegradation beruht, wurde
mittlerweile auf dem TNT-belasteten Standort ‚Werk Tanne’ in Clausthal-Zellerfeld erprobt
(Warrelmann et al. 2000). Durch Beeinflussung der Wasserbilanz und des Gashaushaltes in der
Rhizosphäre, durch Abgabe von Wurzelexsudaten und durch Beeinflussung des Boden-pH-Wert
schaffen Pflanzen für Mikroorganismen günstige Milieubedingungen. Bis zu 40% des
photosynthetisch gebundenen Kohlenstoff kann von den Wurzeln in Form von organischen Säuren,
Zucker und Alkoholen wieder an die Umgebung abgegeben werden (Yoshitomi & Shann 2001) und
steht somit dem mikrobiellen Metabolismus zur Verfügung. Die besondere Gemeinschaft der
Rhizosphärenorganismen kann aufgrund vielfältiger enzymatischer Reaktionen vorhandene
Xenobiotika entgiften. Mit den Wurzeln assoziierten Pilzen ist es zudem möglich, den Boden
weiträumig und feinmaschig mit ihren dünnen Pilzhyphen für sich und für die
Rhizosphärengemeinschaft zu erschließen. Im Wurzeleinzugsraum mit einem Abstand < 1mm zur
Wurzel beträgt die Anzahl der geschätzten Organismen ca. 1,2 x 10 11 Zellen je cm 3 , in 2 cm
10

Einleitung
Entfernung lediglich 1,3 x 10 10 (Paul & Clark 1989). Etwa 5-10 % der Wurzeloberfläche sind von
Bakterien besiedelt. Außerdem sind die Pilzhyphen der Mykorrhiza mit einem bakteriellen Biofilm
überzogen (Romantschuk et al. 2000). Weiterhin können durch schnellwüchsige und starkwurzelnde
Pflanzen die aktiven Mikroorganismen verstärkt im Boden verteilt werden. Pflanzen tragen also auf
vielfältige Weise zur Reinigung kontaminierter Böden bei. Entsprechendes trifft auch auf die mit den
Wurzeln der Pflanzen in Symbiose lebenden Mykorrhizapilze zu, deren Rolle in der Bodensanierung
im folgenden Abschnitt dargestellt wird.
1.2.3 Strukturen der Ektomykorrhiza; Bodenreinigung durch Mykorrhizapilze
Im Jahr 1885 prägte A. B. Frank den Begriff Mykorrhiza, mit dem er eine Symbiose zwischen Pilzen
und den Wurzeln verschiedener Landpflanzen beschrieb. Diese für beide Partner förderliche
Lebensgemeinschaft ist bei etwa 90% aller an Land lebenden Gefäßpflanzen verbreitet (Steffens et
al. 1994). Unterschieden wird heute aufgrund anatomischer Merkmale zwischen ekto-, ektendo- und
endotrophen Mykorrhizen. Die ektotrophe Form der Mykorrhiza bilden nur ca. 3% aller Arten der
Samenpflanzen aus. Die symbiontischen Pilze der Ektomykorrhiza gehören überwiegend zu den
Basidiomyceten und zu den Ascomyceten. Bei den Pflanzen mit ektotropher Mykorrhiza dominieren
die Bäume und Sträucher. Auch die im Rahmen der vorliegenden Arbeit in die Experimente
einbezogenen Pflanzen der Arten Pinus sylvestris und Populus tremula gehören zu den Vertretern
mit dieser Mykorrhiza-Form, wobei Populus tremula auch zu den endotrophen Mykorrhizabildnern
(VA-) gezählt wird (Harley & Harley 1987).
Auffällig ist das sehr einheitliche Bauprinzip von Ektomykorrhizastrukturen. Ein äußerer Mantel von
Pilzhyphen umschließt als dichtes Geflecht bevorzugt die Feinwurzeln der Wirtspflanzen. Folglich
müssen Stoffe aus dem Boden, wenn sie letztendlich in die Pflanzen gelangen sollen, den Weg über
die Pilzhyphen nehmen. Die durch die Ummantelung der Pilzhyphen allgemein in ihrem
Längenwachstum reduzierten und keulig verdickten Kurzwurzeln sind durch ein Geflecht von
Pilzhyphen zwischen ihren Rhizodermis- und Rindenzellen, dem sogenannten Hartigschen Netz,
gekennzeichnet. Das Hartigsche Netz entwickelt sich bei den verschiedenen Gattungen der
Wirtspflanzen unterschiedlich tief im Interzellularraum zwischen den Zellen, dringt aber nie in den
Zentralzylinder ein. Die Pilzhyphen mit ihren fingerförmigen Strukturen können die Zellen des
Wirtsgewebes nahezu vollständig umschließen und bilden mit den Wirtszellen durch engen Kontakt
ein ‘Interface’, eine gemeinsame Austauschzone für unterschiedlichste Nährstoffe (Kottke u.
Oberwinkler 1987, Massicotte et al. 1987).
Obwohl ektotroph mykorrhizierten Wurzeln aufgrund des sie umgebenden Hyphenmantels
Wurzelhaare fehlen, erfahren die Pflanzen durch den Pilzsymbionten eine verbesserte Nährstoff- und
Wasseraufnahme. Dem Mykorrhizapilz kommt hierbei eine Schlüsselrolle zu. Gegenüber nicht-
11

Einleitung
mykorrhizierten Feinwurzeln mit ihren Wurzelhaaren durchwachsen Pilzhyphen ein weitaus größeres
Bodenareal, aus dem sie Wasser und Nährstoffe entnehmen können. Die dünnen Hyphen haben
überdies den Vorteil, kleinste Interkapillarräume für ihren Wirtspartner erschließen zu können (Hilber
1992). Neben einer verbesserten Wasseraufnahme erfahren die mykorrhizierten Pflanzen vor allem
eine effizientere Versorgung mit Phosphor, Stickstoff und anderen Nährelementen (Werner 1987,
Hilber 1992). Besonders Phosphat steht den Pflanzen unter natürlichen Bedingungen im Boden oft
nur in sehr geringen Mengen zur Verfügung. Mykorrhizapilze besitzen die Fähigkeit, unter Abgabe
organischer Säuren fest im mineralischen Gestein gebundene Phosphate verstärkt in Lösung zu
bringen (Steffens et al. 1994). Über den Pilz gelangen die Phosphate schließlich in die Wurzeln.
Erschöpft sich die Phosphataufnahme durch die Mykorrhizen, können die Pflanzen von den seitens
der symbiontischen Pilze angelegten Phosphatspeichern partizipieren (Werner 1987). Im Gegenzug
profitiert der Pilz in erster Linie von Kohlenhydraten, aber auch von verschiedenen Aminosäuren und
Vitaminen, die er von der Pflanze erhält (Werner 1987, Steffens et al. 1994).
Die Bedeutung der Mykorrhiza in biologischen Verfahren zur Bodenreinigung wird zunehmend
erkannt. Das Spektrum an Xenobiotika, das durch den Einsatz dieser Pilz-Pflanze-Symbiose
wirksam reduziert werden kann, findet gegenwärtig eine ständige Erweiterung. Die
Nitroaromatenproblematik blieb hiervon allerdings weitgehend ausgeschlossen und das Potenzial
mykorrhizierter Pflanzen beim TNT-Abbau bisher unerforscht. Experimentelle Untersuchungen hierzu
wurden entweder mit Mykorrhizapilzen selbst oder mit Pflanzen, jedoch nicht unter dem Aspekt der
gemeinsamen Symbiose durchgeführt. Die Fähigkeit zur Nitroaromatendegradation ist u. a. für die
Mykorrhizapilzspezies Paxillus involutus, Pisolithus tinctorius und Suillus variegatus (Scheibner
et al. 1997, Meharg et al. 1997a, Meharg & Cairney 2000) nachgewiesen. Experimente mit
Paxillus involutus ergaben eine 100 %ige Metabolisierung von 250 µmol TNT innerhalb von 6
Tagen. Allerdings wurde nur etwa 1,6 % des dotierten 14 C-TNT vollständig mineralisiert (Scheibner
et al. 1997). Auch andere persistente organische Schadstoffe lassen sich durch Mykorrhizapilze
abbauen. Zum Schadstoffspektrum zählen verschiedene PAK (Gramss et al. 1999), Polychlorierte
Biphenyle (Donnelly & Fletcher 1995), 2,4-Dichlorphenol (Meharg 1997b) und Chlorpropham
(Rouillon et al. 1989). Durchaus vergleichbar mit den Weißfäulepilzen beruht die Fähigkeit der
Biodegradation bei Mykorrhizapilzen auf dem Besitz unspezifischer, extrazellulärer Enzymsysteme,
die oxidative Angriffe am Kohlenstoffring katalysieren können. Unter den Phenol oxidierenden
Enzymen konnten bei Mykorrhizapilzen bisher Tyrosinase, Catechol-Oxidase, Ascorbat-Oxidase
und Laccasen nachgewiesen werden. Außerdem fanden sich Lignin-Peroxidase und Mangan-
Peroxidase (Colpaert & van Laere, Gramss 1997, Timonen & Sen 1998, Griffiths & Caldwell
1992, Cairney & Burke 1998).
In taxonomischer Hinsicht wurden bisher nur relativ wenige Spezies auf ihre Fähigkeit zur
Biodegradation organischer Kontaminanten gescreent. Die große Artenvielfalt sowie die Variationen
12

Einleitung
innerhalb einer Spezies in physiologischer Hinsicht rechtfertigen die Annahme, dass noch zahlreiche
Mykorrhizapilze, insbesondere Arten, die auch als Streuzersetzer in Frage kommen, bei
bodenbiologischen Sanierungsvorhaben sinnvoll eingesetzt werden können. Eine maßgebliche
Förderung im Remediationsprozess könnte zusätzlich durch die oft vorherrschende hohe Diversität
mykorrhizierender Pilze im Boden erfolgen. So ließen sich in einem Hektar Waldboden über hundert
Morphotypen nachweisen (Jonsson et al. 1999).
1.3 Fragestellung und Zielsetzung des Arbeitsvorhabens
Vor dem Hintergrund des kurz dargestellten Wissensstand über die bestehenden Möglichkeiten,
Weißfäule- und Mykorrhizapilze sowie Pflanzen beim Abbau TNT-relevanter Verbindungen in
biologischen Bodensanierungsverfahren einzusetzen, blieb erstaunlicherweise ein gewichtiger Punkt
bisher unerforscht und unbeantwortet. Welches Sanierungspotenzial bietet eine Kombination dieser
Organismen in einem Phyto-remediationsverfahren zur Reinigung sprengstoffbelasteter Böden? Im
Mittelpunkt der hier durchgeführten Laboruntersuchungen standen daher Überlegungen für ein
modellhaftes Phytoremediationskonzept, das auf mikrobielle Degradation der
Sprengstoffverbindungen im Einzugsbereich ektotroph mykorrhizierter Wurzeln unter Beteiligung von
Bakterien, Pilzen und Pflanzen als Organismengemeinschaft beruht (Rhizosphärendegradation). In
mehreren Reaktionsschritten kommt es zunächst zu einer enzymatischen Reduktion des TNTs.
Abgesehen von den Rhizosphärenbakterien und Pilzen können an diesem Prozess auch die Pflanzen
beteiligt sein. Nach initialer Reduktion sollen enzymatische Oxidationen am Aromaten seitens der
Weißfäule- und Mykorrhizapilze letztendlich zu einer Ringspaltung in der Verbindung führen. Die
entstehenden stickstoffhaltigen Ringspaltungsprodukte können dann in weiteren Schritten von den
Bakterien verwertet (im Blickpunkt steht hier insbesondere der bakterielle Biofilm auf den Hyphen)
oder von den mit den Pflanzen assoziierten und im Boden weitverzweigten Mykorrhizapilzhyphen
aufgenommen und metabolisiert bzw. an die Wirtspflanze des Pilzes abgegeben werden. Ergänzend
hierzu erfährt die bakterielle Aktivität der Rhizosphäre durch Wurzelexsudation seitens der Pflanzen
und einer sich daraus ergebenden Verbesserung des Substratangebots für die Mikroorganismen eine
erhebliche Steigerung, so dass von einem zusätzlichen cometabolischen Umsatz der Kontaminanten
auszugehen ist. Reduzierte TNT-Metabolite können darüber hinaus eine Festlegung durch
Adsorption an Bodenbestandteilen erfahren. Von Adsorptionsprozessen sind neben den
Diaminonitrotoluolen hauptsächlich Triaminotoluole betroffen. Der Reduk-tionsschritt zum
Triaminotoluol erfolgt nur unter streng anaeroben Bedingungen. Infolge der mikroskopischen
Heterogenität des Rhizosphärenraumes kann allerdings schon über eine Distanz von wenigen
Millimetern ein Übergang von vollständiger Aerobie zu vollständiger Anaerobie erfolgen. Gerade eine
13

Einleitung
starke Mikroorganismentätigkeit an der Wurzeloberfläche kann mitunter zu semianaeroben
Bedingungen führen, in deren Folge anaerobe Prozesse ermöglicht werden (Gisi et al. 1990).
Im Blickpunkt der Versuche und bei der Wahl des experimentellen Versuchsdesigns steht die
Symbiose der Mykorrhiza. Wie bereits erwähnt wurde, können verschiedene Spezies der
Mykorrhizapilze TNT und TNT-Metabolite enzymatisch angreifen. Sie sind somit nicht nur
Verwerter der Ringspaltungsprodukte. Im Hinblick auf diese Tatsache erscheint die Frage berechtigt,
ob möglicherweise die ursprünglich in den Holzanteilen von Pflanzen und der Streuschicht
verbreiteten und wenig an das Bodenleben angepassten saprophytischen Weißfäulepilze von den
bodenbewohnenden Mykorrhizapilzen ergänzt oder ersetzt werden können. Die enge Assoziation
der Mykorrhizapilze mit den Pflanzen sowie deren Fähigkeit zur Ausbildung weiträumiger und
feinmaschiger Hyphengeflechte im Boden ermöglichen eine äußerst effiziente Besiedlung weiter
Bodenbereiche über den Wurzeleinzugsbereich hinaus. Außerdem ist eine Substratzugabe in den
Boden, wie es für Weißfäulepilze erforderlich ist, nicht notwendig. Dazu wird die Vitalität beider
Symbiosepartner durch die Mykorrhiza in der Regel gestärkt mit wiederum positiven Folgen für die
assoziierten Bakterien und deren metabolische Aktivität. Eine zentrale Bedeutung im angestrebten
Phytoremediationskonzept kommt zudem der Frage zu, ob und in welchem Ausmaß TNT und
Metaboliten von der Symbiose Pilz-Pflanze prinzipiell aufgenommen, akkumuliert oder metabolisiert
werden können. Die Voraussetzung für ein erfolgreiches Phytoremediationsverfahren ist entweder
durch eine umfassende Metabolisierung der Schadstoffe in der Rhizosphäre oder, falls es anteilig zur
Aufnahme kommt, durch eine grundlegende Detoxifizierung der Stoffe innerhalb der Symbionten
erfüllt.
Zusammenfassend sind die wesentlichen experimentellen Fragestellungen nachstehend aufgeführt:
Remediationsleistung: Können ektotroph mykorrhizierte Gehölze zur Reinigung sprengstoff-belasteter
Böden beitragen? Welche Bedeutung kommt dabei den jeweiligen Symbiose-partnern zu? Welche
Rolle spielen zubeimpfte Weißfäulepilze bei der Dekontamination TNT-belasteter Böden? Kann die
Aufgabe der Weißfäulepilze möglicherweise durch Mykor-rhizapilze übernommen werden?
Aufnahme und Akkumulationsverhalten: In welcher Größenordnung kommt es zur Aufnahme von
Nitroaromaten aus dem Boden in das System Mykorrhiza? Unterscheiden sich mykorrhizierte und
nicht-mykorrhizierte Pflanzen im Aufnahme- und Akkumulations-verhalten voneinander? Gibt es
einen Transfer aufgenommener Nitroaromaten in oberirdische Pflanzenteile? Liegt ein organ- oder
gewebespezifisches Akkumulationsverhalten vor, das Rückschlüsse auf Metabolisierungsvorgänge
innerhalb der Mykorrhiza zulässt?
14

Einleitung
Remediationspotenzial und Toxizität: Birgt der Kontakt der Wurzeln mit Nitroaromaten die Gefahr
toxischer Wirkungen auf die mykorrhizierten Pflanzen? Sind mit der Aufnahme der Schadstoffe in die
Pflanzen toxische Wirkungen auf die Pflanzen verbunden? Welche Schadstoffgehalte im Boden
können mykorrhizierte Gehölze tolerieren? Sind sie bezüglich ihres Toleranzverhaltens gegenüber
Nitroaromaten zur Remediation sprengstoffbelasteter Flächen geeignet?
Lassen sich die aus den Laborversuchen gewonnenen Erkenntnisse prinzipiell auf groß angelegte insitu
Phytoremediationsverfahren zur Sanierung Sprenstoff-kontaminierter Böden übertragen? Diese
Frage wird in einem sich der Diskussion anschließenden Kapitel am Ende der Arbeit diskutiert. In
diesem Zusammenhang können die aus einem kürzlich maßstabsgerecht erprobten
Phytoremediationsverfahren gewonnenen Erkenntnisse (Warrelmann 2000, Koehler 2001a und b) in
die Diskussion einfließen, da Verfahrens-konzepte von Laborversuchen und in-situ Verfahren
weitgehende Übereinstimmungen zeigen. Das hier erwähnte in-situ Freilandexperiment wurde vom
UFT Bremen (Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie) in enger Kooperation mit der
Firma Umweltschutz Nord GmbH & Co Ganderkesee auf dem Gelände des ehemaligen
Sprengstoffwerks ‘Tanne’ bei Clausthal-Zellerfeld erprobt. Die Vergabe des Projektes erfolgte als
Unterauftrag von Umweltschutz-Nord im Rahmen eines Verbundvorhabens. Die finanzielle
Förderung wurde durch das BMBF (Projektträger Abfallwirtschaft und Altlastensanierung, Berlin)
getragen. Umfassende Arbeiten zum wissenschaftlichen Begleitmonitoring konnten darüber hinaus mit
finanzieller Unterstützung durch den Senator für Bildung und Wissenschaft der Freien und Hansestadt
Bremen durchgeführt werden.
15

Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Organismen in den Experimenten
2.1.1 Pilze
In den Experimenten kamen sowohl saprophytische Weißfäulepilze als auch mit Pflanzen in
Symbiose lebende Mykorrhizapilze zum Einsatz. Alle hier verwendeten Arten werden den
Basidiomyceten zugeordnet.
2.1.1.1 Kultivierung der Mykorrhizapilze auf Agarmedium
Als Mykobionten für die Testpflanzen wurden folgende Pilzkulturen verwendet:
Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch; Kultur von I. Kottke, Universität Tübingen
Paxillus involutus (Batsch ex Fr.); Kultur von R. D. Finlay, Universität Lund
Paxillus involutus (Batsch ex Fr.) Fr. Paxi 2; Kultur von T. Günther, Universität Jena
Suillus bovinus (L.ex Fr.) Kuntze; Kultur von R. D. Finlay, Universität Lund
Die Kultivierung der Mykorrhizapilze erfolgte auf einem modifizierten Melin-Norkans-
Medium (MMN) nach Marx (1969) unter Zugabe von 2% Agar Agar (high gel strengh) in
Kunststoffpetrischalen (Durchmesser 9 cm) im Dunkeln und bei Raumtemperatur. Das Rezept
ist im Anhang aufgeführt (Tabelle 25). Zur Herstellung von Pilzinokulaten wurde mit einem
Korkbohrer aus dem Randbereich der Schalen Pilzmyzel ausgestochen (Durchmesser 1 cm)
und auf frisches MMN-Agar-Medium übertragen. Nach 5-10 Tagen entwickelten sich aus den
Pellets wattebauschartige Myzelien. Diese konnten schließlich als Inokulate für die
Beimpfung der Pflanzenwurzeln verwendet werden.
2.1.1.2 Kultivierung der Weißfäulepilze auf Agarmedium
Im Vorfeld der Arbeit und während der Versuche wurde mit insgesamt 4 verschiedenen
Weißfäulepilzarten experimentiert. Sämtliche Kulturen stammen von der DSM (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig).
Pleurotus ostreatus (Jacquin ex Fries), Stamm Nr.1833
Trametes versicolor (Linnè ex Fries), Stamm Nr.1977
Phanerochaete chrysosporium (Burdsall & Eslyn), Stamm Nr.1556
Heterobasidion annosum (Fries ex Fries), Stamm Nr.2728
16

Material und Methoden
Die Kultivierung der verschiedenen Pilzstämme erfolgte auf einem besonderen von der DSM
empfohlenen Malz-Pepton-Agar (Tabelle 26 im Anhang). Nach dem Beimpfen der Agar-
Platten mit zuvor ausgestochenen Pellets, wurden die Pilzkulturen im Dunkeln und bei
Zimmertemperatur aufbewahrt. Die vollständige Besiedlung der Oberflächen der
Kulturplatten durch die Myzelien erfolgte je nach Pilzart in unterschiedlichen Zeiträumen. P.
ostreatus und T. versicolor benötigten etwa 2-3, P. chrysosporium und H. annosum 3-4
Wochen für einen flächendeckenden Bewuchs in den Schalen. Die Pilzkulturen wurden alle
4-6 Wochen erneuert, dabei die Inokulate (Durchmesser 1cm) mit dem Korkbohrer aus dem
Randbereich des Myzels ausgestochen und auf frisches Agar-Medium überimpft.
2.1.1.3 Kultivierung der Weißfäulepilze auf Stroh und Weichholzschredder
Weißfäulepilze sind bezüglich ihrer Lebensraumansprüche keine typischen Bodenbewohner.
Sie leben hauptsächlich in Holzanteilen von Bäumen und Sträuchern und in der Streuschicht.
Dementsprechend galt es zunächst einmal für die Weißfäulepilze geeignete Bedingungen zu
schaffen, damit sie im Boden überleben können, um dort Nitroaromaten abzubauen. Gesucht
wurde ein lignin- und zellulosehaltiges Material, das sich von den Pilzen schnell besiedeln
ließ und nach Einarbeitung in den Boden in seiner Eigenschaft längerfristig als Ernährungsgrundlage
dienen würde. Als Substrat für die Pilze getestet wurden verschiedene
geschredderte Weichlaubhölzer und Weizenstroh. Letztendlich fiel die Wahl unter den Pilzen
auf Pleurotus ostreatus. Diese Pilzspezies zeigte die günstigsten Kultivierungs- und
Vermehrungseigenschaften. Von den Substraten erwies sich Weizenstroh am geeignetsten.
Die zerkleinerten und 60 min autoklavierten Strohhalme wurden etwa 6-8 Wochen nach
Animpfen von den Hyphen des Pilzes dicht überwachsen. Das Stroh/Pilzsubstrat konnte nun
mit dem kontaminierten Boden vermischt werden. Die Beimpfung des Strohs erfolgte mit
Pilzinokulaten, die mittels eines Korkbohrers aus den Myzelien der Kulturplatten
ausgestochen wurden. Als Gefäße für die Kultivierung fanden Weckgläser Verwendung.
17

Material und Methoden
Tabelle 1: Wachstum der Myzelien verschiedener Weißfäulepilze auf unterschiedlichen
Kultursubstraten; der Anteil des bewachsenen Substrats ist in % angegeben
Pilzkultur auf
Weichholz
Wachstum nach
8 Wochen
Wachstum nach
16 Wochen
P. ostreatus 10 20
T. versicolor 10 10
P. chrysosporium >5 >5
H. annosum >5 >5
Pilzkultur auf
Weizenstroh
P. ostreatus 80 100
T. versicolor 30 50
P. chrysosporium 10 10
H. annosum 10 10
2.1.2 Pflanzen
In den Experimenten wurden Pflanzen von Pinus sylvestris L. (Gemeine Kiefer oder Föhre)
und Populus tremula L. (Zitter-Pappel) verwendet.
2.1.2.1 Anzucht der Kiefern
Samen von Pinus sylvestris L. (Fa. Rahte, Wietze) wurden einen Tag in Leitungswasser
vorgequollen, davon die ersten 60 Minuten unter fließendem Wasser, und danach 30 min mit
H 2 O 2 (30%) oberflächensterilisiert. Anschließend wurden die Samen nochmals kurz mit
sterilem Leitungswasser nachgespült. Die Aussaat der keimungsfähigen Samen erfolgte in
einem feuchten und autoklavierten Sand/Perlite Gemisch (Perlite ist ein künstliches
Tonmineral). Unter kontrollierten, nicht-sterilen Bedingungen wuchsen die Pflanzen bis zur
weiteren Verwendung in besonderen Phytotron-Klimakammern heran (Tages-
/Nachtrhythmus: 14 h hell mit Lichtstärke 45 W m -2 / 10 h dunkel, 20°C/16°C, rel.
Luftfeuchtigkeit 70%). Gegossen wurde nach Bedarf mit Leitungswasser. Die Düngung
erfolgte etwa alle 4 Wochen mit einer besonderen Nährlösung nach Ingestad (1960), deren
Bestandteile im Anhang genannt sind.
2.1.2.2 Herkunft der Pappeln
Reife Pappelsamen bleiben nur wenige Tage keimfähig. Eine Erfolg versprechende Aussaat
ist kompliziert und mit aufwendigen Arbeitsschritten verbunden. Aus diesen Gründen wurden
die für die Experimente benötigten Pappeln nicht selbst angezogen, sondern als einjährige
Pflänzchen von der Pflanzenhandlung Bunk (Elmshorn/ Schleswig-Holstein) bezogen. Die
18

Material und Methoden
etwa handbreit hohen aus Stecklingen gezogenen Pappeln wurden dankenswerter Weise
unentgeldlich zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung der kleinen Pappeln erfolgte bis zur
weiteren Verwendung in den Experimenten in einem Sand/Torf Gemisch in Petrischalen
(Durchmesser 9 cm). Die Pflanzen standen ohne künstliche Beleuchtung in einer
geschlossenen Gewächshauskabine im Tageslicht (natürlicher Tag/Nacht Rhythmus), wobei
die Tag/Nacht Temperatur 20°C/16°C betrug. Die rel. Luftfeuchtigkeit lag bei 70%. Gegossen
wurde mit Leitungswasser nach Bedarf. Das Substrat wurde feucht, jedoch nicht nass
gehalten. Gedüngt wurde mit flüssigem Volldünger (Tabelle 30 im Anhang) gelöst in Gießwasser
während des Blattaustriebes einmal in 14 Tagen, sonst während der Vegetationsperiode
einmal in 4 Wochen.
2.1.2.3 Mykorrhizierung der Kiefern in Rhizotronkulturen
Ab einem Alter von 8 Wochen erfolgte die weitere Kultivierung der jungen Kiefern in den
Gewächshäusern des Biologischen Gartens der Universität wie unter Punkt 2.1.2.2
beschrieben. Nach einer Eingewöhnungszeit an die neuen Klimaverhältnisse von 4-6 Wochen
konnten die Pflanzen schließlich mit den entsprechenden Pilzsymbionten beimpft werden. Für
die Mykorrhizierung wurden die inzwischen 3-4 Monate alten Kiefern nach gründlichem
Spülen ihrer Wurzeln unter fließendem Leitungswasser in spezielle Rhizotrone überführt
(modifizierte Petrischalen, Durchmesser 9cm). Eine Lage steriles Aktivkohlepapier (Fa.
Schleicher und Schüll) trennte die Wurzeln in diesem Verfahren (abgewandelt nach Kottke et
al. 1987) von dem autoklavierten Perlite-Substrat. In den Petrischalen bildeten die kleinen
Kiefern nach 2-3 Wochen genügend junge Seiten- oder Feinwurzeln mit wachsender
Wurzelspitze aus. In der Regel sind im Wachstum befindliche Wurzeln leichter zu
mykorrhizieren. Die Pilzinokulate wurden vorsichtig an die auswachsenden Wurzeln angelegt.
Mykorrhizen etablierten sich nach 10-14 Tagen.
2.1.2.4 Mykorrhizierungen an Pappeln
Auf eine selbst durchgeführte Beimpfung der Pappeln mit Mykorrhizapilzen wurde verzichtet,
da die Feinwurzeln bei einem Teil der Setzlinge bereits unmittelbar nach Erhalt aus der
Baumschule etablierte Mykorrhizen aufwiesen. Die taxonomische Zugehörigkeit des an der
Mykorrhiza beteiligten Pilzes war nicht bekannt und sollte deshalb festgestellt werden.
Grundsätzlich bestand die Möglichkeit einer Mehrfachinfektion der Pappeln mit
verschiedenen Pilzen. Eine Identifizierung des oder der pilzlichen Symbionten lediglich
anhand charakteristischer äußerer Merkmale des Hyphenmantels durchzuführen ist schwierig
und unsicher. Die Bestimmung erfolgte daher mit genetischen Bestimmungsmethoden im
Labor für Bioanalytik der Universität Bremen, AG Prof. Hildebrandt. Für dieses Vorhaben
19

Material und Methoden
wurden mykorrhizierte Wurzelproben von etwa 1 cm Länge von den Pappeln geerntet,
lyophilisiert, homogenisiert und anschließend unter sterilen Bedingungen aus den Proben die
DNA extrahiert. Nach durchgeführter PCR (Polymerase Kettenreaktion) wurden die PCR-
Amplifikationen (Summe der in der PCR erzeugten DNA-Stränge) durch nachfolgende
Gelelektrophorese in ein charakteristisches DNA-Bandenmuster aufgetrennt. Durch einen
Abgleich mit den Bandenmustern bekannter Mykorrhizapilze bestand nun die Möglichkeit,
die unbekannte Spezies mit hoher Zuverlässigkeit taxonomisch einzuordnen (Methodenbeschreibung
nach persönlicher Mitteilung von Christoph Kulmann und Dr. Carsten Harms,
AG Prof. Hildebrandt, Universität Bremen).
Aus dem DNA-Bandenvergleich ging hervor, dass die untersuchten Pappelwurzeln mit zwei
Spezies der Gattung Hebeloma eine Symbiose eingegangen waren. Bei dem einen Pilz
handelte es sich entweder um H. helodes oder um H. cavipes. Der andere Pilz war entweder
mesophaeum oder H. collariatum zugehörig.
2.2 Experimente
2.2.1 Kultivierung von Kiefern auf TNT-belastetem Boden (Kiefernexperiment)
Mit der Durchführung dieses Experimentes sollte überprüft werden, ob und inwieweit durch
den Einsatz von mykorrhizierten Kiefern (Pinus sylvestris / Pisolithus tinctorius) unter
Einbeziehung des Weißfäulepilzes Pleurotus ostreatus die Transformation von Nitroaromaten
im Boden gefördert werden kann. Etwa 3-4 Monate alte Kiefernsetzlinge wurden in vier
Versuchsvarianten (mit jeweils 32 Parallelansätzen) auf einem TNT-belasteten Boden vom
Standort des ehemaligen Sprengstoffwerkes „Tanne“ (Clausthal-Zellerfeld/ Harz) kultiviert
und die Entwicklung der Nitroaromatengehalte im Boden untersucht. Vor dem Befüllen der
Rhizotrone mit jeweils 70 g Bodensubstrat wurde der durch einen hohen Schluffanteil
charakterisierte und skelettreiche Standortboden in luftgetrocknetem Zustand mehrmals
gesiebt (Maschenweite 2 mm) und anschließend mit einem Drittel seines Gewichtes mit
getrocknetem Sand vermischt. Verschiedene bodenkundliche Angaben zum Substrat können
den Tabellen 31 und 32 im Anhang entnommen werden. In den entsprechenden Varianten
wurde der Boden in den Rhizotronen dann mit jeweils 3 Gramm Weißfäulepilz-Stroh-Substrat
beimpft. Die Kultivierung der Pflanzen in den Rhizotronen erfolgte in einer Gewächshauskabine
wie unter Punkt (2.1.2.2) beschrieben.
20

Material und Methoden
Das experimentelle Design beinhaltete folgendes Variantenspektrum:
Variante A: Kultivierung von mykorrhizierten Kiefern auf belastetem Boden unter Zugabe
von Weißfäulepilz-Stroh-Substrat
Variante B: Kultivierung von mykorrhizierten Kiefern auf belastetem Boden, auf die Zugabe
von Weißfäulepilz-Stroh-Substrat wurde verzichtet
Variante C: ohne Pflanzen, für diesen Ansatz wurde der kontaminierte Boden lediglich mit
Weißfäulepilz-Stroh-Substrat vermischt
Variante K: in diesem Kontrollansatz wurde das Bodensubstrat lediglich mechanisch
bearbeitet (Homogenisieren durch Sieben), mykorrhizierte Kiefern und Weißfäulepilze fehlten
in dieser Variante
Abb. 5: Rhizotron der Versuchsvariante A mit mykorrhizierter Kiefer und entwickeltem Weißfäulepilzmyzel.
Kiefernsämling (Pinus sylvestris)
Petrischale seitlich mit Öffnung
Weißfäulepilz (Pleurotus ostreatus)
auf Weizenstroh
TNT-belasteter Boden
Der Versuchszeitraum erstreckte sich insgesamt über 24 Wochen. Nach 8, 12, 20 und 24
Wochen wurden 8 Parallelansätze jeder Versuchsvariante beprobt. Die Beprobung beinhaltete
in diesem Experiment die Entnahme einer Bodenmischprobe (nach Lufttrocknung 5 g) für die
Nitroaromatenextraktion aus jedem Rhizotron sowie die Entnahme einer 10 g Bodenprobe aus
21

Material und Methoden
jeweils drei der 8 Schalen jeder Variante für die pH-Wert Bestimmung des Bodens. Die
Nitroaromatenextraktion aus den Proben für die HPLC-Analytik wurde wie in Punkt (2.3.2.1)
beschrieben durchgeführt. Die Boden pH-Wert Bestimmung erfolgte nach Punkt (2.3.7).
Außerdem wurde von den Pflanzen das Frischgewicht und der Mykorrhizierungsgrad am
Versuchsbeginn und nach der Entnahme aus den Rhizotronen ermittelt.
Tabelle 2: Probennahmeschema zur Bestimmung der Nitroaromatenkonzentrationen im
Boden
Versuchsdauer
Variante n/t 0 Start 8 Wochen 12 Wochen 20 Wochen 24 Wochen
A 32 32 BdMp
(n = 32)
B 32 32 BdMp
(n = 32)
C 32 32 BdMp
(n = 32)
K 32 32 BdMp
(n = 32)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
n/t 0 = Anzahl der Rhizotrone je Variante zum Zeitpunkt t 0 ; BdMp = Bodenmischprobe; n = Anzahl der
beprobten Rhizotrone, anschließend verworfen (ausgenommen Startbeprobung)
2.2.2 Kultivierung von Pappeln auf TNT-belastetem Boden (Pappelexperiment)
Die gewonnenen Erkenntnisse aus dem vorangegangenen Kiefernexperiment fanden bei der
Überlegung zum Versuchsdesign für das Pappelexperiment Berücksichtigung. Zum einen
sollte nun untersucht werden, welchen Effekt Pflanzen mit einem besonders starken
Wurzelwachstum auf die Nitroaromatentransformation im Boden haben, weshalb auf die
starkwüchsige Populus tremula (Zitterpappel) zurückgegriffen wurde (Punkt 2.1.2.2). Zum
anderen wurde unter Berücksichtigung der zu erwartenden effizienteren Bodendurchwurzelung
und aufgrund vorhandener chemischer bzw. physikalischer Eigendynamikprozesse
bei der TNT-Transformation im Boden die Versuchsdauer auf insgesamt drei Monate halbiert.
Außerdem wurde, basierend auf den Ergebnissen des vorangegangenen Kiefernexperimentes,
diesmal auch auf einen Standortboden mit einer wesentlich höheren Ausgangsbelastung
zurückgegriffen. Die Anzahl der Experimentalvarianten wurde ergänzt und um eine weitere
auf fünf erhöht (Variante D).
Neben der Nitroaromatenentwicklung im Boden galt ein weiterer Untersuchungsschwerpunkt
in diesem Experiment der Frage, in welchem Umfang ein Transfer von Nitroaromaten aus
dem Boden in die Pflanze stattfindet. Zu diesem Zweck wurden die Pflanzen nach
22

Material und Methoden
Versuchsende geerntet und die Nitroaromaten aus den Geweben extrahiert (Methode
abgewandelt nach Görge et al. 1994).
Die Herstellung und Bestückung der Rhizotrone erfolgte wie bereits in Punkt (2.2.1)
beschrieben. Die für das Pappelexperiment eingesetzten Versuchsvarianten sind nachstehend
aufgeführt.
Variante A: Kultivierung von mykorrhizierten Pappeln auf belastetem Boden unter Zugabe
von Weißfäulepilz-Stroh-Substrat
Variante B: Kultivierung von mykorrhizierten Pappeln auf belastetem Boden, auf die Zugabe
von Weißfäulepilz-Stroh-Substrat wurde verzichtet
Variante C: ohne Pflanzen, für diesen Ansatz wurde der kontaminierte Boden lediglich mit
Weißfäulepilz-Stroh-Substrat vermischt
Variante D: wie Variante A, allerdings waren die Rhizotrone mit nicht-mykorrhizierten
Pappeln bestückt
Variante K: in diesem Kontrollansatz wurde das Bodensubstrat wie in den übrigen Varianten
lediglich mechanisch bearbeitet (Homogenisieren durch Sieben), mykorrhizierte Pappeln und
Weißfäulepilze fehlten in dieser Variante
23

Material und Methoden
Abb. 6: Rhizotron der Variante A
mit mykorrhizierter Pappel und
entwickeltem Weißfäulepilzmycel.
Zitterpappel (Populus tremula)
Petrischale seitlich mit Öffnung
Weißfäulepilz (Pleurotus ostreatus)
auf Weizenstroh
TNT-belasteter Boden
Der Versuch wurde nach 12 Wochen beendet. Beprobung und Ernte erfolgten nach 2, 4, 8 und
12 Wochen. Die Entnahme der Bodenproben für die Nitroaromatenbestimmung und die pH-
Wert-Messung ist in den Punkten 2.3.2.1 und 2.3.7 beschrieben. Zur Erfassung der
Nitroaromatenmengen in den Pflanzengeweben erfolgte eine Auftrennung in Wurzel- und
Sprossanteile (Stamm/Blatt). Für die sich anschließende Extraktion wurden die Proben aus
jeweils vier Rhizotronen zu einer Mischprobe zusammengefasst und wie in Punkt 2.3.2.2
beschrieben extrahiert.
24

Material und Methoden
Tabelle 3: Probennahmeschema zur Bestimmung der Nitroaromatenkonzentrationen im
Boden
Versuchsdauer
Variante n/t 0 Start 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen
A 32 32 BdMp
(n = 32)
B 32 32 BdMp
(n = 32)
C 32 32 BdMp
(n = 32)
D 32 32 BdMp
(n = 32)
K 32 32 BdMp
(n = 32)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
8 BdMp
(n = 8)
n/t 0 = Anzahl der Rhizotrone je Variante zum Zeitpunkt t 0 ; BdMp = Bodenmischprobe; n = Anzahl der
beprobten Rhizotrone, anschließend verworfen (ausgenommen Startbeprobung)
2.2.3 Aufnahme des Radiotracers 14 C-TNT in Kiefernsämlinge
Die im vorangegangenen Experiment (Punkt 2.2.2) aus den Pappelgeweben extrahierten und
gaschromatographisch detektierten Nitroaromatenmengen belegen lediglich den Status quo
und gestatten in nur begrenztem Umfang eine Aussage darüber, in welcher Größenordnung
Nitroaromaten tatsächlich in den Organismus der Pflanze aufgenommen wurden. So lassen
sich bereits von den Pflanzen metabolisierte Nitroaromaten nicht mehr bilanzieren. Außerdem
muss insbesondere bei den Wurzelproben in Erwägung gezogen werden, dass möglicherweise
beträchtliche Mengen der chromatographisch detektierten Nitroaromatenverbindungen von
den Pflanzen prinzipiell nicht aufgenommen wurden, sondern den Pappelwurzeln äußerlich
nur anhafteten oder im Apoplasten der Pflanzen akkumulierten und somit miterfasst wurden.
Im Rahmen dieser Überlegungen wurde im nun folgenden Experiment Pflanzen 14 C-TNT in
definierten Mengen über verschiedene Zeiträume angeboten und die Aufnahme und
Verteilung des
14 C-Isotops in der Pflanze durch Mikroautoradiographie und
Szintillationszählung quantitativ bestimmt. Verwendet wurden in diesem Experiment
aufgrund der unkomplizierten Handhabung Pinus sylvestris Sämlinge. Als Mykorrhizapilz
diente Pisolithus tinctorius.
25

Material und Methoden
Den Pflanzen wurde das 14 C-TNT mit einer radiochemischen Reinheit > 98% in einer Ingestad
Nährlösung in zwei verschiedenen Konzentrationen 3, 7 und 14 Tage angeboten:
0,85 x 10 4 Bq in 2 ml Düngelösung je Schale, (0,00075 mg TNT ml -1 oder 0,75 mg TNT l -1 )
17 x 10 4 Bq in 2 ml Düngelösung je Schale, (0,015 mg TNT ml -1 oder 15mg TNT l -1 ).
Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die verschiedenen Applikationszeiten des Radiotracers:
Tabelle 4: Übersicht über die Anzahl der untersuchten Kiefern nach entsprechender
Applikation; myk (-) (nicht- mykorrhiziert), myk (+) (mykorrhiziert)
Applikation niedriges 14 C Angebot hohes 14 C Angebot
myk (-) myk (+) myk (-) myk (+)
3 Tage 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen
7 Tage 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen
14 Tage 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen 3 Pflanzen
Als Rhizotrone dienten für die Pflanzen wiederum Petrischalen ( 9 cm Durchmesser),
allerdings wurde diesmal auf eine Füllung mit Perlite verzichtet. Die Kohlepapierscheiben
lagen den Schalenböden plan auf und wurden im weiteren Versuchsverlauf mit
Leitungswasser stets feucht gehalten. Die Auflage von Glasobjektträgern gewährleistete bei
Bedarf den direkten Kontakt der Wurzeln mit dem Kohlepapier. Nach der Ernte wurden die
Pflanzenproben entsprechend ihrer weiteren Bestimmung entweder mit schmelzenden
Stickstoff kryofixiert und anschließend in flüssigem Stickstoff aufbewahrt (für die
Mikroautoradiographie, siehe Punkt 2.3.5) oder im Ofen bei 70° C getrocknet (für die
Szintillationszählung, siehe Punkt 2.3.4). Durch die Kryofixierung konnten die
Transportvorgänge in den Pflanzen schlagartig unterbrochen werden. Somit blieb das
Verteilungsmuster des aufgenommenen 14 C-TNT in den Pflanzen zum Erntezeitpunkt für die
Mikroautoradiographie erhalten.
26

Material und Methoden
2.2.4 Phytotoxizitätstest mit Kiefern
Die toxische Wirkung von TNT auf höhere Pflanzen ist bisher noch wenig untersucht.
Toxizitätsdaten liegen größtenteils für krautige Pflanzen und Algen vor, wobei sich diese
Daten nicht ohne weiteres auf Gehölzpflanzen übertragen lassen. Voraussetzung für den
Erfolg eines Phytoremediationsverfahrens ist die Toleranz der eingesetzten Pflanzen
gegenüber bodenrelevanten Schadstoffgehalten. Entsprechendes gilt auch für Mykorrhizapilze,
wenn die Pflanzen mykorrhiziert sind. Mit einem Toxizitätstest sollte der Einfluss des
TNTs auf mykorrhizierte Gehölzpflanzen untersucht werden. Die Kultivierung der kleinen
mykorrhizierten Kiefernsämlinge erfolgte bei verschiedenen TNT-Konzentrationen im
Bodensubstrat.
2.2.4.1 Vorbereitung der Pflanzen
Als Testpflanzen dienten 4-5 Monate alte Kiefern (Pinus sylvestris). Die Anzucht erfolgte
unter semisterilen Bedingungen wie in Punkt 2.1.2.1 beschrieben. Mykorrhiziert wurden die
Pflanzen, wie in Punkt 2.1.2.3 erläutert.
2.2.4.2 Vorbereitung des Bodensubstrates
Luftgetrockneter LUFA-Boden vom Typ 2.2 wurde durch sorgfältiges Sieben (Maschenweite
2 mm) homogenisiert und anschließend gezielt mit TNT angereichert. Dazu wurde kristallines
TNT (Reinheitsgrad > 99%) zuvor in Aceton gelöst und zusammen mit dem Lösungsmittel
mit Quarzsand vermengt. Das Aceton verdampfte bei ständigem Umrühren unter dem Abzug
rasch, wobei sich das zurückgebliebene und getrocknete TNT-Quarzsand-Gemisch
anschließend bequem mit dem vorbereiteten LUFA-Boden vermischen ließ. Es wurden
Substrate mit Ausgangskonzentrationen von 3, 300 und 3000 mg TNT/kg Boden hergestellt.
2.2.4.3 Homogenitätskontrolle
Im Rahmen einer Homogenitätskontrolle wurde überprüft, ob das zudotierte TNT in den
Testböden in gleichmäßiger Verteilung vorlag. Von jeder Bodenvariante wurden fünf
Mischproben (5 g) auf ihren TNT-Gehalt untersucht. Die Nitroaromatenextraktion erfolgte
wie in Punkt 2.3.2.1 beschrieben. Zur Nitroaromatenanalytik siehe Punkt 2.3.3.1.
27

Material und Methoden
2.2.4.4 Versuchsdesign und Probennahme
Für die Durchführung des Phytotoxizitätstest kamen als Rhizotrone modifizierte Petrischalen
(Durchmesser 9 cm) zur Anwendung. Diese Pflanzenkammern erhielten im Rand eine kleine
Öffnung für die Sprossachse und wurden mit 70 g kontaminiertem Boden gefüllt. Die kleinen
mykorrhizierten Kiefern wurden zur Bestimmung des Frischgewichtes mit einer
Analysenwaage (Sartorius) gewogen. Die Ermittlung des Mykorrhizierungsgrades der
Feinwurzeln erfolgte mit der Stereolupe. Anschließend wurden die Setzlinge in den
angefeuchteten Boden gepflanzt. Um Sickerverluste von TNT durch austretendes Wasser zu
vermeiden, wurden die Schalen zusätzlich mit einem Streifen Parafilm abgedichtet. Die
Exposition der Pflanzen erfolgte in Böden mit TNT-Konzentrationen von 3, 300 und 3000
mg/kg Boden (lufttrocken) sowie in einem unbelasteten Kontrollboden für maximal 12
Wochen. Nach einer Dauer von 4, 8 und 12 Wochen wurden jeweils fünf Parallelansätze von
jeder Bodenvariante geerntet, siehe dazu auch Tabelle 5. Nach Ermittlung von Frischgewicht
und Mykorrhizierungsgrad der Pflanzen sind die Nadeln auf Nekrosen und Verfärbungen
untersucht worden, außerdem wurde der allgemeine Entwicklungszustand und das
Erscheinungsbild der Wurzeln kontrolliert.
Da aufgrund chemischer Einflüsse und mikrobieller Abbautätigkeit mit einem stetigen
Rückgang der TNT-Belastung im Boden während der Versuchszeit zu rechnen war, musste
parallel zum Pflanzenmonitoring die Entwicklung der Schadstoffkonzentration im
Bodensubstrat im zeitlichen Verlauf bestimmt werden. Deshalb wurde zur Ermittlung des
TNT-Gehaltes aus jeder Petrischale nach 2, 4, 8 und 12 Wochen eine Bodenmischprobe von 5
g (lufttrocken) entnommen und wie in Punkt 2.3.2.1 beschrieben extrahiert und analysiert. Als
zusätzliche Begleituntersuchung wurde außerdem die TNT-Konzentration in der Bodenlösung
bestimmt und die hierfür erforderliche Probenentnahme mit der Probenentnahme zur
Bodenuntersuchung verbunden (Tabelle 5). Die Bodenlösung wurde aus 2,5 Gramm feuchtem
bis nassem Boden 10 Minuten bei 14000 rpm abzentrifugiert (Centrifuge 5415 C, Fa.
Eppendorf) und anschließend filtriert ( Micropure Filter, 22µm, Fa. Amicon). Aufgrund der
geringen Probenvolumina von etwa 200-300 µl gewonnener Bodenlösung aus jeder
Bodenprobe wurden die filtrierten Proben vor der HPLC Analytik in 175 µl Mikroeinsätze aus
Glas für 2 ml Headspacevials überführt.
28

Material und Methoden
Tabelle 5: Schema zur Beprobung der einzelnen Versuchsvarianten. Nach dem Ernten einer
Pflanze wurde der entsprechende Versuchsansatz nicht weiter beprobt.
Versuchsdauer
Variante n/t 0 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen
0 15
5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet
15 Bodenproben 15 Bodenproben 10 Bodenproben 5 Bodenproben
3 15 15 Proben Bdlsg. 15 Proben Bdlsg. 10 Proben Bdlsg. 5 Proben Bdlsg.
5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet
15 Bodenproben 15 Bodenproben 10 Bodenproben 5 Bodenproben
300 15 15 Proben Bdlsg. 15 Proben Bdlsg. 10 Proben Bdlsg. 5 Proben Bdlsg.
5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet
15 Bodenproben 15 Bodenproben 10 Bodenproben 5 Bodenproben
3000 15 15 Proben Bdlsg. 15 Proben Bdlsg. 10 Proben Bdlsg. 5 Proben Bdlsg.
5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet 5 Pflanzen geerntet
n/t 0 =Anzahl der Versuchsansätze je Variante zum Zeitpunkt t 0 (Versuchsbeginn);
2.3 Methoden
2.3.1 Qualitativer Nachweis ligninolytischer Enzyme auf Agar-Festmedien
Die Fähigkeit zur Produktion ligninolytischer, extrazellulärer Enzyme bei Weißfäule- und
Mykorrhizapilzen kann schnell und einfach nachgewiesen werden. Dazu wurden
entsprechende Agar-Festmedien mit verschiedenen Substanzen versetzt, die den Enzymen als
Substrat dienen sollten. Anschließend wurden die Agarplatten mit Pilzkulturen beimpft. Die
enzymatische Umsetzung dieser Substrate verursacht spezifische Farbreaktionen im
Festmedium, die sich als Diffusionszonen im unmittelbaren Bereich der Pilzmyzelien
erkennen lassen. Die Bestimmung der Enzyme erfolgte rein qualitativ. Nach Inokulation der
Agarmedien mit den Pilzen wurden die Kulturplatten mehrere Tage bei 27° C im
Wärmeschrank inkubiert und anfangs nach 1 und 3 Stunden und dann einmal täglich auf
Verfärbungen untersucht. Folgende Pilzarten wurden getestet:
Pleurotus ostreatus (Jacquin ex Fries), Stamm Nr.1833
Trametes versicolor (Linnè ex Fries), Stamm Nr.1977
Phanerochaete chrysosporium (Burdsall & Eslyn), Stamm Nr.1556
Heterobasidion annosum (Fries ex Fries), Stamm Nr.2728
Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch; Kultur von I. Kottke, Universität Tübingen
29

Material und Methoden
2.3.1.1 Nachweis der Mangan-Peroxidase-Aktivität
MnP-Agar Assay (nach Heinzkill 1995): Für den qualitativen Nachweis der Mangan-
Peroxidase (MnP) wurden mehrere Pilzinokulate (Agarplättchen, Durchmesser 4 mm) auf das
Festmedium A (Tabellen 27 und 28 Anhang) mit 0,1 mM MnSO 4 gelegt und bei 27°C
inkubiert. Der Nachweis von Mangan-Peroxidase-Aktivität erfolgte durch das Vorkommen
orangebrauner Verfärbungen (Oxidation von Mn 2+ zu Mn 3+ ) um die Myzelstücke.
2.3.1.2 Nachweis der Lignin-Peroxidase-Aktivität
3-NA-Agar-Assay (nach Heinzkill 1995): Für den qualitativen Nachweis der Lignin-
Peroxidase (LiP) wurden mehrere Pilzinokulate (Agarplättchen, Durchmesser 4 mm) auf das
Festmedium A mit einem Anteil von 0,01 % w/v 3-Nitroanilin (3-Na) gelegt und bei 27° C
inkubiert. Die Zugabe des gelben Substrates 3-Na (gelöst in 50 %igem Ethanol) erfolgte nach
dem Autoklavieren. Der Nachweis von LiP-Aktivität ergab sich durch das Vorkommen
brauner Diffusionszonen (Oxidation von 3-NA) um die Myzelstücke.
Das Screening nach Laccasen bei den entsprechenden Pilzstämmen erfolgte durch Herrn Dr.
Jens Dittmann im Rahmen seiner Promotionsarbeit (Dittmann 1999).
2.3.2 Extraktionsverfahren
2.3.2.1 Nitroaromatenextraktion aus den Bodenmischproben
Für die Extraktion der Nitroaromaten aus den Bodenproben wurde das Bodensubstrat in den
geöffneten Rhizotronen etwa 1 Woche im Dunkeln bei 27° C an der Luft getrocknet, nachdem
zuvor sorgfältig die Pflanzen und das Stroh aus dem Boden entfernt wurden. Anschließend
erfolgte die Entnahme einer 5 g Bodenmischprobe (lufttrocken) aus den Petrischalen. In
verschlossenen 20 ml Rollrandflaschen aus Glas wurden die Bodenproben in 10 ml Methanol
für 5 Stunden im Ultraschallbad (Sonorex Super RK 106, 35 Khz, Fa. Bandelin) bei 20° C
extrahiert. Um eine zu starke Erwärmung der Proben im Ultraschall-Dauerbetrieb zu
vermeiden, wurde das Wasser über einen geschlossenen Kreislauf in einem Kühlaggregat (Fa.
Haake) auf Raumtemperatur gehalten. Der Überstand aus den Probenfläschchen wurde nach
Filtration durch Membranfilter (Polypropylen, 0,22 µm Porendurchmesser, Fa. Macherey &
Nagel) in 2 ml Braunglas Autosamplergefäße aufgenommen und bis zur HPLC-Analytik bei
-18° C im Kühlschrank aufbewahrt.
30

Material und Methoden
2.3.2.2 Nitroaromatenextraktion aus Pflanzengeweben
Eine effiziente Methode zur Nitroaromatenextraktion aus unterschiedlichen Pflanzengeweben
stellt das in einigen Schritten modifizierte Extraktionsverfahren nach Görge et al. (1994b) dar.
Nach sehr sorgfältiger Reinigung der Wurzeln von anhaftenden Bodenpartikeln mit Wasser
wurden die Pflanzen grob zerkleinert und in speziellen Gazé-Netzen gefriergetrocknet
(modifizierte Gefriertrocknungsanlage Gamma 1a, Fa. Christ). Die Mahlung des entwässerten
Materials zu Feinpulver erfolgte mit einer Kugelmühle (Pulverisette 6 und Mahlbecher aus
Sinterkorund von Fa. Fritsch, Idar Oberstein) für 2 x 3 min. bei 600 U/min. Die sich
anschließenden Extraktionsschritte sind zur besseren Übersicht in einzelnen Punkten
dargestellt:
DCM-Aufschluss
Jeweils 100 mg gemahlenes Pflanzenmaterial wurden in verschraubbare Zentrifugengläser aus
Glas eingewogen (Schraubverschlüsse mit Teflondichtung) und nach Zugabe von 4 ml DCM
bei 20°C für 60 min im Ultraschallbad extrahiert. Anschließend wurden die Proben 10 min bei
2000 g zentrifugiert (Minifuge RF, Fa. Heraeus) und die DCM-Fraktion dann vorsichtig mit
einer Spritze abgesaugt. Dieser Extrakt soll fortan als DCM-Aufschluss bezeichnet werden.
Hydrolyse mit Schwefelsäure
Das in den Zentrifugengläsern verbleibende Pflanzenmaterial wurde mit 2 ml 25 %iger
Schwefelsäure versetzt und für 90 min bei 80°C im Wasserbad durch Säurehydrolyse weiter
aufgeschlossen. Dann erfolgte eine erneute Extraktion für 30 min. im Ultraschallbad bei 20°C
nach Zugabe von 2 ml DCM. Dieser Extraktionsschritt mit DCM wurde zweimal
durchgeführt, wobei die jeweiligen DCM-Extrakte nach Zentrifugation aus den Gläsern
abgesaugt und vereint wurden.
Alkalisierung mit NaOH
Unter vorsichtiger Zugabe (tropfenweise) von 8 M NaOH wurde das Pflanzenmaterial mit der
Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 11-12 alkalisiert (Kontrolle mit Indikatorpapier, Fa.
Merck). Nochmals erfolgte eine 30minütige Extraktion im Ultraschallbad in 2 ml DCM. Die
Lösungsmittelfraktion konnte nach dem Zentrifugieren vorsichtig abgesaugt und mit dem
Extrakt aus der Säurehydrolyse vereint werden. Dieser vereinte Extrakt wird nachfolgend als
Hydrolyse-Aufschluss bezeichnet.
31

Material und Methoden
2.3.3 Nitroaromaten-Analytik
2.3.3.1 HPLC-Analytik
Die Auftrennung der Extrakte aus den Bodenproben für den Nitroaromatennachweis erfolgte
mit der High Performance Liquid Chromatographie (HPLC). Die Integration der Peaks wurde
mit der Software (GAT-Chrom, Fa. GAT) durchgeführt. Mittels Regressionsgeraden der
Eichreihen ließen sich über die Peakflächen die Nitroaromatenkonzentrationen in den Proben
errechnen. Die Bodenproben wurden auf insgesamt 15 Nitroaromaten getestet. Die
Konzentrationen der Standardlösungen lagen zwischen 1 und 100 mg/l.
Pumpe: Merck-Hitachi L-6200, 3-Kanal Gradientenpumpe
Autosampler: Perkin-Elmer ISS-100, variable volume injection system
Detektor: LDC Analytical SM 4000 programmable wavelength detector,
Perkin-Elmer LC 480 Dioden Array Detektor
Integrator: GATchrom PC-based LC/GC Chromatography Data System
Säule: Macherey & Nagel ET 250/4 Nucleosil 120-5, C18, 5 µm, 250x4 mm
Vorsäule: Merck LiChroCart 4-4 mm, RP-18, Teilchengröße 5µm
Mobile Phase: 47% Methanol/ 53% Wasser, Flussrate 1,0 ml/min isokratisch
Detektion: 230 nm Wellenlänge, 0,1AUFS
Injektion: 20 µl Probenschleife
Thermostat: 35° C Säulentemperatur
Verwendete Standardsubstanzen:
1. 2,6-Diamino-4-nitrotoluol 9. 4-Amino-2,6-dinitrotoluol
2. 2,4-Diamino-6-nitrotoluol 10. 2-Amino-4,6-dinitrotoluol
3. 6-Amino-2-nitrotoluol 11. 2,6-Dinitrotoluol
4. 4-Amino-2-nitrotoluol 12. 2,4-Dinitrotoluol
5. 2-Amino-4-nitrotoluol 13. 2-Nitrotoluol
6. 1,2-Dinitrobenzol 14. 4-Nitrotoluol
7. 1,3-Dinitrobenzol 15. 3-Nitrotoluol
8. 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT)
32

Material und Methoden
Abb. 7: HPLC-Chromatogramm des verwendeten Nitroaromatenstandards mit 15 Testsubstanzen.
2.3.3.2 GC/MS-Analytik
Die quantitative Erfassung der Nitroaromaten in den Pflanzenproben erfolgte über
Thermodesorptions-Gas-Chromatographie mit Massenspektrometer-Detektor. Ausgewertet
wurde mit der Software HP-Chemstation. Die Konzentrationen der verwendeten
Nitroaromatenstandards bewegten sich zwischen 5 und 50 mg/l.
GC
HP-6890 Serie
Injektor Kaltaufgabesystem Gersten KAS-4
Säule 30 m x 250 µm x 0,25µm Filmdicke, RTX 200, Fa. Resteck, Dünnfilmkap.
Vorsäule 3 m x 530 µm, Fa. Trap
Trägergas Helium, Flussrate: 35 cm/s, Druck:0,7 bar
MS
HP-5972
Scanmodus 35-400 amu
Transfertemp. 260°C
33

Material und Methoden
Thermodesorption
Die Proben wurden im Glasröhrchen (Länge 15 cm, Durchmesser innen 4 mm) direkt vor dem
Injektor im kontinuierlichem Trägergasstrom erhitzt (5°C - 230°C, für 8 - 10 min.). Hierdurch
ließen sich die flüchtigen Nitroaromaten aus den Proben heraustreiben und mit dem Gasstrom
in den Injektor transportieren. Im stark heruntergekühlten Injektor (-100°C) kondensierten sie,
so dass darin schließlich alle Nitroaromaten vollständig konzentriert werden konnten. Durch
schnelles und starkes Erhitzen des Injektors (12°C/s bis auf 260°C) wurden die Nitroaromaten
im gasförmigen Zustand auf die Säule transportiert.
Verwendete Standardsubstanzen:
1. 2,6-Diamino-4-Nitrotoluol 9. 4-Amino-2,6-Dinitrotoluol
2. 2,4-Diamino-6-Nitrotoluol 10. 2-Amino-4,6-Dinitrotoluol
3. 6-Amino-2-Nitrotoluol 11. 2,6-Dinitrotoluol
4. 4-Amino-2-Nitrotoluol 12. 2,4-Dinitrotoluol
5. 2-Amino-4-Nitrotoluol 13. 2-Nitrotoluol
6. 1,2-Dinitrobenzol 14. 4-Nitrotoluol
7. 1,3-Dinitrobenzol 15. 3-Nitrotoluol
8. 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT)
34

Material und Methoden
Abb. 8: GC-Chromatogramm des verwendeten Nitroaromatenstandards mit 15 Testsubstanzen
(50 mg/l). Die Beschriftung über dem Chromatogramm beinhaltet u. a. Angaben zur
Säule und zur Flussrate des Trägergases. Peak-Folge von links nach rechts: 2-NT, 3-NT, 4-
NT, 2,4-DNT, 6A-2NT, 1,3-DNB u. 2A-4NT (Peaks überlagert), 4A-2NT, 2,6-DNT u. 1,2-
DNB (Peaks überlagert), 2,4,6-TNT, 2,4-DANT, 4-ADNT, 2,6-DANT, 2-ADNT. Signal bei
32,82 min. entspricht keinem Nitroaromaten.
2.3.4 Quantifizierung der Radioaktivität durch Szintillationszählung
2.3.4.1 Vorbereitung der Pflanzenproben
Für die Szintillationszählung wurden, getrennt nach Pflanzenorganen, Aliquots von Wurzeln,
Stamm und Nadeln, in getrocknete und gewogene Szintillationsröhrchen gegeben und
anschließend das Trockengewicht der eingegebenen Proben bestimmt. Das Pflanzenmaterial
wurde vorher im Ofen bei 70° C getrocknet, im Mörser zerkleinert und bis zur weiteren
Verwendung im Exsikkator aufbewahrt. Die Auflösung der eingewogenen Pflanzenproben
erfolgte unter Zugabe von 500 µl Tissue-Solubilizer (Fa. Zinsser) je Probe. Nach Aufnahme in
3 ml Szintillationscocktail (Liquid Scintillation Cocktail, Fa. Wallac) konnten die Countraten
in den Proben ermittelt werden.
35

Material und Methoden
2.3.4.2 Aufnahme der Nährlösung
Die in den Rhizotronen verbleibende Düngelösung wurde nach erfolgter Ernte der Kiefern
vorsichtig mit einer Eppendorfpipette abgenommen und in Szintillationsröhrchen überführt. In
diese wurden nach Einengung der Proben durch vollständiges Trocknen im Ofen bei 70° C
jeweils 3 ml Szintillationscocktail dazugegeben und anschließend die Countraten ermittelt.
2.3.4.3 Auswaschung des Kohlepapiers
Die nach der Ernte verbliebenen Kohlepapierscheiben wurden im Ofen getrocknet. Danach
wurden von den Scheiben je fünf Papierstücke (5mg pro Stück) von unterschiedlichen Stellen
mit einer Schere entfernt und zusammen mit 3ml Szintillationscocktail in vorgewogene und
trockene Szintillationsröhrchen gegeben. Über einen Zeitraum von 14 Tagen wurden die 14 C-
Anteile nun unter zwischenzeitigem kräftigem Schütteln (Vortex) herausgespült und
anschließend gemessen.
2.3.4.4 Ermittlung der Radioaktivität
Nach Messung der Proben mit einem Szintillationszähler (1450 Microbeta, Fa. Wallac)
erfolgte die Ermittlung der Countraten (cpm). Hierbei wurde der Mittelwert aus fünf
Einzelmessungen genommen. Um mögliche Quencheffekte auf die Countrate in der Probe
auszugleichen, wurden je nach Stärke der Radioaktivität in den Proben verschiedene interne
Standards verwendet. Die Berechnung der tatsächlichen Kernzerfälle je Zeiteinheit (dpm)
erfolgte schließlich unter Berücksichtigung der Countraten (cpm-Werte) und der Wirksamkeit
der Zählung in Anlehnung an Dyer (1974) und Fox (1976).
2.3.5 Angewandte Methoden für die Mikroautoradiographie
2.3.5.1 Gefriertrocknung der präparierten Wurzeln
Die Infiltration der Wurzeln mit dem Epoxidharz Spurr (nach Spurr 1969) erfordert eine
völlige Entwässerung der Proben aufgrund der Nichtmischbarkeit dieses Kunststoffes mit
Wasser. Bei konventionellen Entwässerungsverfahren wird das Wasser in den Proben vor der
Kunststoffeinbettung schrittweise durch Lösungsmittel wie Ethanol und Aceton ersetzt.
Aufgrund ihrer guten Löslichkeit in solchen Lösungsmitteln würden in mykorrhizierten
Wurzeln befindliche Nitroaromaten während der Entwässerung durch Auswaschung
vermutlich verloren gehen. Auf eine herkömmliche Einbettungsmethode musste deshalb
verzichtet werden.
36

Material und Methoden
Eine schonende Entwässerung durch Kryofixierung und nachfolgende Gefriertrocknung der
Proben verhindert zum einen eine Auswaschung und eine nachträgliche Verlagerung der
Nitroaromaten in den Geweben und ermöglicht zum anderen einen weitestgehenden Erhalt der
Gewebe- und Zellstrukturen. Anfangstemperaturen von etwa -100 C° verhindern bei der
Gefriertrocknung eine Rekristallisation des Wassers. Verwendet wurde ein Gerät der Firma
Leica (Leica EM CFD) mit einer speziellen Zeolithkammer. Das darin befindliche und zuvor
ausgeheizte Granulat erhält und verbessert ein zuvor erzeugtes Vakuum, indem die aus den
Proben freiwerdenden Gase absorbiert werden. Cryofixierung und Gefriertrocknung wurden
wie folgend durchgeführt:
Schockgefrierung der frisch abpräparierten Wurzelproben durch Überführung in
schmelzenden Stickstoff.
Bestückung der Gefriertrockung mit den tiefgefrorenen Proben. Der Probenteller wurde
zuvor mit flüssigem Stickstoff auf -180°C heruntergekühlt. Erzeugung eines Vorvakuums von
16 mbar in der Probenkammer mit einer Rotationspumpe. Durch die Bindeeigenschaften des
Zeolith-Granulates erhöhte sich das Vakuum anschließend auf 5 x 10 -4 mbar.
Gefriertrocknung der Wurzelproben in mehreren aufeinander folgenden Teilschritten.
Reihenfolge und Dauer der einzelnen Teilschritte sind mit den dazugehörigen Temperaturen
in Tabelle 6 dargestellt.
Nach Beendigung der Gefriertrocknung wurde über ein Ventil in der Probenkammer
Normaldruck erzeugt. Die Aufbewahrung der Wurzelproben erfolgte bis zur weiteren
Verarbeitung im Exsikkator über CaCl 2 .
37

Material und Methoden
Tabelle 6: Programm zur Gefriertrocknung von Pflanzenproben
Teilschritt
Dauer
- 100°C 168 Std.
Temperaturerhöhung um 5°C/ Std. 2 Std.
- 90°C 48 Std.
Temperaturerhöhung um 5°C/ Std. 2 Std.
- 80°C 48 Std.
Temperaturerhöhung um 5°C/ Std. 2 Std.
- 60°C 24 Std.
Temperaturerhöhung um 5°C/ Std. 17 Std.
Aufbewahrung bei 27°C bis zur Entnahme
2.3.5.2 Kunststoffinfiltration
Für die Einbettung der gefriergetrockneten Proben in Kunststoff wurde das Epoxidharz Spurr
(Spurr 1969) verwendet. In herkömmlichen Verfahren wird der Kunststoff nach der
chemischen Entwässerung zunächst üblicherweise mit Ethanol oder Aceton verdünnt, um die
Infiltration in die Proben zu erleichtern. Anschließend wird der Lösungsmittelanteil dann
Schritt für Schritt bis zur reinen Kunststoffstufe verringert. Da es mögliche
Auswaschungsverluste von Nitroaromaten aus den Geweben während der Einbettung zu
vermeiden galt, musste in diesem Fall auf eine Verdünnung des Kunststoffes mit
Lösungsmitteln verzichtet werden. Die Kunststoffinfiltration erfolgte deshalb in besonderen
Druckeinbettungsgefäßen (modifizierte Rettberg Eckventile) nach Fritz (1980) direkt in 100%
Epoxidharz. Die Druckgefäße wurden mit einer Rotationspumpe evakuiert und der reine
Kunststoff nach leichtem Öffnen der Ventile direkt in die evakuierte Probenkammer
eingelassen. Folglich konnten die luftleeren Wurzeln leichter infiltriert werden. Nach
10minütiger Herunterkühlung auf gestoßenem Eis und nach luftblasenfreiem Verschluss,
erfolgte eine Lagerung der Ventile im Wärmeschrank bei 29 C°. Der sich nun aufbauende
Druck erleichterte das Eindringen des Kunststoffes in die Proben. Die Einbettung erstreckte
sich insgesamt über fünf Tage bei zweimaligem Kunststoffwechsel täglich. Kühlung auf Eis
und Erwärmung im Wärmeschrank wiederholten sich bei jedem Kunststoffwechsel. Eine
gelungene Infiltration in die Wurzeln ließ sich an einem Absinken der Proben im Kunststoff
erkennen. Am Ende der Druckeinbettung wurden die Proben im reinen Kunststoff in
Flacheinbettungsformen (Fa. Plano) überführt, in diesen entsprechend ausgerichtet und bei 70
38

Material und Methoden
C° im Ofen über Nacht ausgehärtet. Bis zur weiteren Bearbeitung am Ultramikrotom konnten
die Proben nun problemlos aufbewahrt werden.
2.3.5.3 Schneiden der Proben am Ultramikrotom
Die im Kunststoff eingebetteten Wurzelproben wurden mit Teflon beschichteten Single-edge-
Klingen (Fa. Plano) entsprechend zurechtgetrimmt und mit selbst angefertigten Glasmessern
(Messerbrecher von Fa. LKB Bromma, Schweden) trocken am Ultramikrotom (Ultracut E, Fa.
Reichert und Jung) geschnitten. Die Glasmesser erhielten zuvor einen dünnen Teflonüberzug
(Teflonspray, Fa. Reichelt), um Stauchungen der Wurzellängs- und -querschnitte auf der
Messeroberfläche während des Schneidevorgangs zu vermeiden. Anschließend konnten die 1-
1,5 µm dicken Schnitte mit sehr feinen Nadeln vorsichtig von den Messern abgehoben und
auf mit Gelatine beschichteten Glasobjektträgern überführt werden.
2.3.5.4 Mikroautoradiographie
Mit jeweils 100 µl Röntgenfilmemulsion ( Ilford, L4, in Gelform, im Verhältnis 1:2 mit bidest
verdünnt, w/v, 15 min bei 40° C im Wasserbad gerührt) erhielten die Objektträger im
Dunkelkammerlicht (Ilford, Filter 902) einen gleichmäßig dünnen Überzug. Anschließend
wurden die beschichteten Objektträger 24 Stunden in einer lichtdicht verschließbaren Holzbox
neben einer kleinen Schale mit CaCl 2 getrocknet und hinterher bis zur Entwicklung in
verschließbaren Kunststoffboxen im Dunkeln bei 4° C im Kühlschrank aufbewahrt. Die
Entwicklung des Röntgenfilms erfolgte nach verschiedenen Expositionszeiten zwischen 2
Tagen und 20 Wochen mit dem Feinkornentwickler D 19 A/S (Sanderson 1981). Nach
Fixierung des Röntgenfilms (Express-Fixiersalz, Fa. Tetanal) und sorgfältiger Spülung der
Objektträger mit entmineralisiertem Wasser konnten die ungefärbten Wurzelschnitte
(Mikroautoradiographien) nun an einem Universalmikroskop für Durchlicht (Fa. Zeiss)
ausgewertet werden. Die fotografische Dokumentation der Mikroautoradiographien wurde an
einem Interferenzmikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast (Fa. Olympus)
durchgeführt.
2.3.6 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Die Präparation der Proben für die Rasterelektronenmikroskopie wurde folgenderweise
durchgeführt: frische und feuchte Bodenaggregate mit den anhaftenden Weißfäulepilzhyphen
wurden mit einer Federstahlpinzette direkt aus den Rhizotronen entnommen und 12-15
Stunden über Nacht bei 4°C in 2% Glutaraldehyd in 0,05 M Na-Cacodylatpuffer pH-Wert 7,0
vorfixiert. Nach etwa 90minütigem Auswaschen der Proben in 0,05M Cacodylatpuffer (Puffer
39

Material und Methoden
alle zehn Minuten ausgetauscht) konnten die Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe
entwässert werden.
15% Ethanol 15 min.
30% Ethanol 15 min.
50% Ethanol 15 min.
70% Ethanol 15 min.
90% Ethanol 30 min.
100% Ethanol 2x15 min. (gewechselt)
Um die Pilzhyphen in ihrer Struktur möglichst gut zu erhalten, wurde nach dem Entwässern
der Proben eine Kritisch-Punkt-Trocknung angewendet (Gerät CPD 010, Balzers Union,
Liechtenstein). Hierbei wurde das Entwässerungsmedium Ethanol gegen Kohlendioxid als
Übergangsmedium oder Kritisch-Punkt-Medium ausgetauscht. Nach der Trocknung wurden
die Proben mit beidseitig selbstklebenden Leit-Tabs (Plano, Marburg) auf Aluminium-
Probenteller befestigt, mit Gold bedampft (Gerät SCD 040, Balzers Union, Liechtenstein) und
im Rasterelektronenmikroskop ISI 100B (Leitz, Wetzlar) betrachtet.
2.3.7 Bestimmung des pH-Wertes von Bodenproben
Die Bestimmung der Boden pH-Werte erfolgte nach Scheffer und Schachtschabel (1984). Je
Probe wurden 10 g luftgetrockneter Boden mit 25 ml 0,01 M CaCl 2 vermengt und 24 Stunden
geschüttelt. Anschließend wurde der pH-Wert im Überstand mit einer pH-Elektrode gemessen
(WTW pH 525).
2.3.8 Fotografische Dokumentation
Beobachten und Fotografieren erfolgte am Universalmikroskop für Durchlicht und am
Stereomikroskop DV4 (Stereolupe), Aufsetzkameras: MC 63 und 45 60 70 - 3, Belichtungssteuerung:
Gerät M und.45 93 40. Alle Geräte von Zeiss, Oberkochen.
Für fotografische Aufnahmen wurden Kleinbildfilme von Ilford Pan F50 18DIN/50ASA,
schwarz/weiß und Kodak Ektachrome 160T 23DIN/160ASA, Kunstlicht Farbdiafilme
verwendet. Herstellung von schwarz/weiß Vergrößerungen auf Fotopapier von Ilford,
Multigrade IV und von Farbvergrößerungen im Digital-Printverfahren. Für die weitere
Bearbeitung mit der Computer-Software Adobe Photoshop 5.0 wurden die Aufnahmen mit
einem Agfa Snap Scan 600 Flachbettscanner eingescannt.
40

Material und Methoden
2.3.9 Ergebnisauswertung und Statistik
Die Berechnung der Mittelwerte, Mediane, Standardabweichungen, Maxima und Minima
erfolgte mit Microsoft Excel für Windows 97 NT Version 7.0 oder Excel für Windows 2000
Professional, Version 2002. Insbesondere die ermittelten Messdaten zur Erfassung der
Nitroaromatenbelastung im Boden wiesen keine Normalverteilung auf. Aus diesem Grund
wurde als Signifikanztest der nichtparametrische U-Test nach Mann & Whitney mit dem
Statistikprogramm Unistat Version 5.1 durchgeführt. Der H-Test nach Kruskal und Wallis
fand als Ausweitung des U-Testes Anwendung. Als Signifikanzgrenze wurde die
Irrtumswahrscheinlichkeit p (α) ≤ 0,05 unter zweiseitiger Testanwendung gewählt.
Die Graphischen Darstellungen wurden mit Excel für Windows 97 NT oder Windows 2000
Professional (Versionen 7.0 und 2002) erstellt.
41

Ergebnisse
3. Ergebnisse
Die Darstellung der Ergebnisse ist wie folgt gegliedert: im Kiefernexperiment konzentrierten
sich die Untersuchungen im Wesentlichen auf die Entwicklung der Nitroaromatengehalte im
Boden (Kapitel 3.2). Im anschließend durchgeführten Pappelexperiment (Kapitel 3.3)
beinhalteten die Arbeiten zusätzlich Untersuchungen zum Aufnahmeverhalten von
Nitroaromaten aus dem Boden in die Pflanzen. Aufnahmeversuche mit angebotenem
ringmarkiertem 14 C-TNT sollten in Verbindung mit mikroautoradiographischen Untersuchungen
genauere Kenntnisse über das Akkumulations- und Translokationsverhalten von
Nitroaromaten in Pflanzen erbringen (Kapitel 3.4). Der phytotoxische Einfluss von TNT auf
Pflanzen wurde mit Hilfe eines Kiefern-Toxizitätstests untersucht, wobei mykorrhizierte
Kiefern in Böden mit unterschiedlichen Schadstoffgehalten kultiviert wurden (Kapitel 3.5).
3.1 Qualitativer Nachweis ligninolytischer Enzyme
Mit verschiedenen Enzym-Plattentests konnte die Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer
ligninolytischer Enzyme bei Pilzen untersucht und nachgewiesen werden. Hierbei zielten die
ausgewählten Tests insbesondere auf die Unterscheidung zwischen der Mangan- und Lignin-
Peroxidase ab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Der Laccase-Nachweis (siehe
Sternchen *) wurde von Jens Dittmann im Rahmen seiner Promotion durchgeführt (Dittmann
1999).
Tabelle 7: Nachweis ligninolytischer Enzyme auf Agar-Festmedien
Pilzkultur
Mangan-
Peroxidase
Lignin-
Peroxidase
Laccase*
P. ostreatus + + +
T. versicolor ++ ++ +
P.
chrysosporium
+ – –
H. annosum – – +
P. tinctorius – – nicht getestet
– = negative Reaktion, + = positive Reaktion; ++ = starke Reaktion
Insbesondere T. versicolor und P. ostreatus zeichneten sich durch eine gute
Enzymausstattung aus. Beide Pilzarten waren zur Synthese extrazellulärer Mangan- und
Lignin-Peroxidasen befähigt. Mangan-Peroxidase-Aktivität ließ sich bei P. chrysosporium
42

Ergebnisse
nachweisen. H. annosum besaß weder Mangan- noch Lignin-Peroxidase-Aktivität. Negativ
war die Reaktion für diese beiden Enzyme auch bei dem Mykorrhizapilz P. tinctorius.
3.2 TNT-Abbau-Experimente mit Kiefern
Dieses Experiment zielte in erster Linie darauf ab, Kenntnisse darüber zu erlangen, in welcher
Größenordnung die Biodegradation von TNT und verschiedenen TNT-Metaboliten im Boden
durch Bepflanzung mit mykorrhizierten Kiefern gefördert wird. Die Versuchsanleitung und
Versuchsdurchführung ist aus Punkt 2.2.1 zu entnehmen. Der vom ehemaligen
Sprengstoffwerk „Tanne“ entnommene Standortboden enthielt zahlreiche TNT-Kristalle und
Aggregate unterschiedlicher Größe. Diese kleinen Splitter verursachten zum Teil eine sehr
inhomogene Verteilung des TNT. Durch sorgfältiges Vermischen und Sieben des Bodens
konnte die Inhomogenität zwar gemindert, jedoch nicht vollständig behoben werden. Von der
Inhomogenität im Boden war allerdings nur das TNT selbst betroffen. Die ADNTs als
unmittelbare Reduktionsprodukte des TNT zeigten einheitlichere Belastungswerte.
Demzufolge war das vereinzelte Auftreten von stark abweichenden Extremwerten bezüglich
der ermittelten Schadstoffkonzentrationen im Boden, hervorgerufen durch das Erfassen
solcher Splitter bei der Beprobung, auf das TNT begrenzt. Entsprechende Werte mit extremer
Abweichung konnten bei der weiteren statistischen Auswertung der Messergebnisse nicht
berücksichtigt werden, da sonst der tatsächliche Abreicherungsvorgang im Boden nicht
korrekt wiedergegeben worden wäre. Im Anhang sind die nicht in die Auswertung
eingegangenen Werte in den Tabellen 33 und 34 fettgedruckt aufgeführt. Als Kontaminanten
wurden TNT und dessen unmittelbaren Reduktionsprodukte 2-ADNT und 4-ADNT gefunden.
Weitere Nitroaromatenverbindungen konnten mit Hilfe der eingesetzten Extraktionsmethoden
nicht detektiert werden. Die Ausstattung der einzelnen Versuchsvarianten mit den
entsprechenden Organismen ist in Punkt 2.2.1 beschrieben. Die beobachtete
Transformationsdynamik bezüglich des TNT und der beiden ADNTs ist in verschiedenen
Abschnitten dargestellt. In einem weiteren Kapitel soll kurz auf die Biomasseentwicklung der
Pflanzen und auf den Mykorrhizierungsgrad ihrer Wurzeln eingegangen werden.
3.2.1 Entwicklung der TNT-Belastung im Boden
In Abbildung 9 sind die Ergebnisse der Bodenanalysen dargestellt. Mit Ausnahme von
Variante K war das TNT bis zur ersten Probennahme bereits größtenteils eliminiert. Auch in
der Kontrollvariante K fiel der Rückgang deutlich aus, war allerdings zeitlich verzögert. Bis
zur letzten Probennahme pendelte sich das Belastungsniveau der analysierten Bodenproben in
allen Varianten auf einem niedrigen Level ein. Der ermittelte zwischenzeitliche Anstieg in
den Varianten A und C ist vermutlich eine Folge der inhomogenen Verteilung des TNT
43

Ergebnisse
(TNT-Kristalle und -Aggregate). Auch die anfangs noch recht hohen Standardabweichungen
können auf eine ungleichmäßige Verteilung zurückgeführt werden.
200
TNT in mg/kg Boden
180
160
140
120
100
80
60
Variante A
Variante B
Variante C
Variante K
40
20
0
0 2 3 5 6
Versuchsdauer in Monaten
Abb. 9: Nachweisbare TNT-Konzentrationen im Bodensubstrat der Versuchsvarianten A, B,
C und K im Zeitverlauf; abgebildet sind die Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen
(Startbeprobung n = 32, sonst n = 8). Ausstattung: Variante A mit myk. Kiefern
und mit Weißfäulepilzkultur; Variante B mit myk. Kiefern ohne Weißfäulepilzkultur;
Variante C mit Weißfäulepilzkultur ohne myk. Kiefern; Kontrollvariante K weder mit myk.
Kiefern noch mit Weißfäulepilzkultur.
Bei einem Vergleich der Varianten lassen sich folgende Tendenzen feststellen:
– Variante A mit einer Kombination aus mykorrhizierten Pflanzen und Weißfäulepilzen
erwies sich bei der Reduzierung von TNT am effektivsten. Signifikant waren die
Unterschiede nach 6 Monaten Versuchsdauer gegenüber den Varianten K und B, nicht
signifikant gegenüber C.
– Variante B zeigte nach 6 Monaten weder einen signifikant höheren Schadstoffgehalt zu
Variante C noch einen signifikant niedrigeren Schadstoffgehalt zu Kontrollvariante K. Ein
durch die Mykorrhiza hervorgerufener entscheidender Einfluss auf die TNT-Transformation
44

Ergebnisse
konnte somit in dieser Teilvariante, die lediglich mit mykorrhizierten Kiefern ausgestattet
war, nicht beobachtet werden.
– In Variante C reduzierte sich der Schadstoff signifikant gegenüber der Variante K. Obwohl
der Unterschied zwischen den Varianten nur gering ist, konnte durch die Beimpfung mit dem
Weißfäulepilz in diesem Experiment ein positiver Effekt erzielt werden.
– Wie bereits erwähnt wurde, nahm auch in der Kontrollvariante K die TNT-Belastung in den
ersten Monaten stark ab. Allerdings war der Rückgang gegenüber den anderen Varianten
verlangsamt. Die Schadstoffbelastung blieb in der zweiten Versuchshälfte auf einem wenn
auch deutlich reduziertem Niveau konstant.
Tabelle 8: Abnahme der TNT-Bodenbelastung in den verschiedenen Versuchsvarianten.
Aufgrund der deutlichen Messschwankungen ist zusätzlich zum arithmetischen Mittel auch
der Median aufgeführt.
Variante A Variante B Variante C Variante K
t n Mw Sd Med n Mw Sd Med n Mw Sd Med n Mw Sd Med
0 31 99,0 80,7 73,8 31 86,5 83,2 64,5 31 82,8 47,1 77,1 31 96,7 82,6 78,6
2 7 8,9 5,3 6,0 6 21,7 2,01 21,5 7 6,8 5,9 5,4 8 42,2 28,8 31,3
3 6 19,0 12,8 14,6 8 18,7 9,3 15,0 8 13,1 14,2 6,7 8 31,5 17,6 23,1
5 5 5,9 2,6 5,1 6 12,7 3,56 12,1 7 5,8 2,3 5,7 8 12,6 5,3 10,6
6 8 3,4 1,6 2,7 7 12,0 8,3 9,8 8 6,6 6,0 3,4 7 19,1 21,1 11,9
t = Versuchsdauer in Monaten; n= Anzahl der berücksichtigten Proben; Mw = arithmetisches Mittel; Sd = Standardabweichung
(±); Med = Median; Werte für Mw, Sd und Med in mg TNT/kg Boden (TS)
45

Ergebnisse
3.2.2. Entwicklung der ADNT-Belastung im Boden
Ein bedeutender Teil des TNT wurde zu 2- und 4-ADNT reduziert. Aufgrund der initialen
TNT-Transformation konnte deshalb ein deutlicher Abreicherungseffekt für die ADNTs nicht
beobachtet werden (Abbildung 10). In einem Teil der Varianten erfolgte sogar eine
Anreicherung dieser Kontaminanten. Insgesamt betrachtet verläuft die Entwicklung der
ADNT-Gehalte in den einzelnen Versuchsvarianten allerdings unterschiedlich. Eine starke
Streuung der Messergebnisse war aufgrund des Fehlens von Extremwerten nicht gegeben.
Hohe Standardabweichungen, wie im Falle des TNT sind daher nicht aufgetreten.
35
ADNT in mg/kg Boden
30
25
20
15
10
Variante A
Variante B
Variante C
Variante K
5
0
0 2 3 5 6
Versuchsdauer in Monaten
Abb. 10: Nachweisbare ADNT-Konzentration im Bodensubstrat der Versuchsvarianten A, B,
C und K im Zeitverlauf (4-ADNT und 2-ADNT wurden zusammengefasst); abgebildet sind
die Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen (Startbeprobung n = 32, sonst
n = 8). Ausstattung: Variante A mit myk. Kiefern und mit Weißfäulepilzkultur; Variante B
mit myk. Kiefern ohne Weißfäulepilzkultur; Variante C mit Weißfäulepilzkultur ohne myk.
Kiefern; Kontrollvariante K weder mit myk. Kiefern noch mit Weißfäulepilzkultur.
46

Ergebnisse
Die Entwicklungen in den Varianten lassen sich folgendermaßen beschreiben:
– Variante A verzeichnete als einzige Experimentalvariante eine deutliche Abnahme bei der
ADNT-Belastung und zeigte nach Beendigung des Experiments signifikant niedrigere
Konzentrationen im ADNT-Gehalt gegenüber den übrigen drei Ansätzen.
– Eine durch die TNT-Reduktion bedingte Anreicherung der ADNT-Kontaminanten war in
Variante B zu beobachten. Insgesamt betrachtet war im Vergleich mit der Kontrollvariante K,
welche ebenfalls ADNT anreicherte, kein eindeutiger Unterschied festzustellen.
– Variante C zeichnete sich weder durch eine deutliche Zunahme noch durch eine auffällige
Abnahme der ADNTs aus. Die Belastungen bewegten sich in ihrer Größenordnung zu
Versuchsbeginn und nach Versuchsende auf einem vergleichbaren Niveau. Trotzdem waren
die Belastungen nach 6 Monaten gegenüber den Varianten B und K signifikant niedriger. In
Anbetracht der Tatsache, dass durch die TNT-Transformation ein Zugang von ADNTs
gegeben war und sich unter diesem Gesichtspunkt das Belastungsniveau dennoch kaum
veränderte, kann den Weißfäulepilzen bei der ADNT-Eliminierung ein positiver Einfluss
zugesprochen werden.
– Wie bereits erwähnt wurde, war auch in Variante K eine erhebliche Zunahme der ADNTs in
Folge der initialen TNT-Reduktion festzustellen. Das Belastungsniveau lag zuletzt mit einer
Steigerung um 50% deutlich über der Ausgangsbelastung.
Tabelle 9: ADNT-Konzentrationen in den analysierten Bodenmischproben. Die detektierten
Mengen von 2-ADNT und 4-ADNT wurden summarisch zusammengefasst.
Variante A Variante B Variante C Variante K
t n Mw Sd Med n Mw Sd Med n Mw Sd Med n Mw Sd Med
0 32 17,2 2,5 17,4 32 17,5 2,5 16,9 32 16,5 1,8 16,4 32 17,4 2,8 17,5
2 8 17,8 2,1 17,8 7 24,5 3,3 26,3 8 16,6 2,9 16,1 8 22,1 2,6 22,2
3 7 17,7 2,4 19,0 8 19,5 2,2 19,3 8 18,9 3,0 19,8 8 22,8 2,7 23,7
5 7 18,0 3,2 19,0 7 20,2 1,0 20,2 8 19,9 4,6 20,3 8 22,9 2,8 23,5
6 8 11,4 2,5 10,7 7 23,7 4,0 22,0 8 15,8 2,5 17,2 8 25,5 4,64 26,2
t = Versuchsdauer in Monaten; n= Anzahl der berücksichtigten Proben; Mw = arithmetisches Mittel; Sd = Standardabweichung
(±); Med = Median; Werte für Mw, Sd und Med in mg ADNT/kg Boden (TS)
47

Ergebnisse
3.2.3 Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Kiefern
Insgesamt erreichten die Pflanzen bis zum Versuchsende nach 6 Monaten nur geringe
Zuwächse an Biomasse (Tabelle 10). Die Mykorrhizierung der Kurzwurzeln ging in Variante
A deutlich zurück. Während hier ältere mykorrhizierte Kurzwurzeln durch normale
Seneszenzvorgänge verloren gingen, wurden nachwachsende junge Kurzwurzeln so gut wie
nicht mykorrhiziert. In Variante B konnten zahlreiche Neuinfektionen an den jungen Wurzeln
beobachtet werden. Der Mykorrhizierungsgrad nahm etwas zu.
Tabelle 10: Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Pflanzen in den bepflanzten
Experimentalvarianten
Variante A
Variante B
t n BM MYK n BM MYK
0 32 0,345 35 32 0,381 35
2 8 0,356 10 8 0,408 30
3 7 0,428 10 8 0,410 45
5 7 0,471 15 8 0,442 40
6 8 0,641 10 7 0,594 45
t = Versuchsdauer in Monaten; n = Anzahl der untersuchten Pflanzen;
BM=Frischgewicht der Pflanzen (Wurzel + Spross) in g (arithmetisches
Mittel); MYK = Anteil der mykorrhizierten Kurzwurzeln in %
3.2.4 Zusammenfassung
Variante A mit einer Kombination aus mykorrhizierten Kiefern und Weißfäulepilzen zeigte
von allen Varianten die beste Abbauleistung, dies gilt vor allem für die ADNTs. Eine
verbesserte Abbauleistung wurde auch in Variante C, die lediglich mit Weißfäulepilzen
ausgestattet war, beobachtet. Für Variante B ließ sich in diesem Experiment kein eindeutig
positiver Effekt feststellen. Allerdings ist hierbei zu berücksichtigen, dass die Pflanzen
bezüglich ihres Wachstums während der Versuchsphase nur wenig an Biomasse zulegten und
den Boden nur schwach durchwurzelten. Auf Phytoremediation basierende Abbauleistungen
in der Rhizosphäre konnten somit in den durch Mischproben ermittelten Ergebnissen nur in
sehr begrenztem Umfang in Erscheinung treten. Auffällig war der starke Rückgang der TNT-
Belastung in der Kontrollvariante K.
48

Ergebnisse
3.3 TNT-Abbauexperimente mit Pappeln als Phytoremediatoren
Aus dem vorangegangenen Kiefernexperiment wurden wichtige Erkenntnisse gewonnen, die
bei den Planungen für die Durchführung des sich nun anschließenden Pappelexperimentes
berücksichtigt wurden. Zum einen wurde aufgrund zu erwartender Abbauraten in der
vorgesehenen Kontrollvariante (Punkt 3.2.1) auf einen deutlich stärker belasteten Standortboden
zurückgegriffen, um das Experiment mit einer höheren Ausgangsbelastung starten
zu können. Zum anderen wurden die Versuchszeit und die Zeitintervalle zwischen den
jeweiligen Beprobungen verkürzt, um der voraussichtlich zügigen Abbaukinetik der
Kontaminanten gerecht zu werden. Unter Berücksichtigung der im Kiefernexperiment
beobachteten Langsamwüchsigkeit der Pflanzen und einer damit verbundenen geringen
Durchwurzelung des Substrates in den Rhizotronen wurde nun auf die schnellwüchsige
Zitterpappel (Populus tremula) zurückgegriffen. Besonders Pappeln zeichnen sich durch ein
starkes Wurzelwachstum aus. Verbunden mit einer intensiven Durchwurzelung des
kontaminierten Bodens sollte ein möglicherweise auftretender und auf die Pflanzen
zurückzuführender Phytoremediationseffekt (v. a. Rhizosphärendegradation) mit diesem
Experiment besser fassbar werden. Ergänzend wurde die Anzahl der Versuchsvarianten um
eine weitere auf fünf erhöht. Die unterschiedliche Bestückung der Rhizotrone ist in Punkt
2.2.2 beschrieben.
Zusätzlich zur Rückstandsanalytik des Bodensubstrates, wurde untersucht, ob und in welcher
Größenordnung eine Aufnahme und Akkumulation von TNT und Metaboliten in die
Versuchspflanzen stattgefunden hat.
Versuchsanleitung und Versuchsdurchführung sind im Methodenteil Punkt 2.2.2 zu entnehmen.
3.3.1 Bodenanalytik
In den Bodenproben wurden regelmäßig TNT und dazu die unmittelbaren
Reduktionsprodukte 2-ADNT und 4-ADNT detektiert. In sehr geringen Konzentrationen
ließen sich in einem Teil der untersuchten Proben außerdem 2,4- und 2,6-DNT über die
Rückstandsanalytik nach-weisen. Weitere Nitroaromaten konnten nicht gefunden werden.
49

Ergebnisse
Abb. 11: HPLC-Chromatogramm eines Bodenextraktes nach Methanol-Ultraschall-Extraktion
einer 5g Bodenprobe (luftgetrocknet) der Versuchsvariante B. Das detektierte
Nitroaromatenspektrum umfasst nach 30 min Laufzeit, abgesehen vom TNT und den beiden
ADNTs, auch das 2,6-DNT.
3.3.1.1 Entwicklung der TNT-Belastung im Boden
Insgesamt war die Entwicklung der TNT-Gehalte in den für die Experimente verwendeten
und damit auch behandelten Böden von einer deutlichen Schadstoffabnahme geprägt, was
besonders für die bepflanzten Varianten zutrifft. In diesen Varianten war der überwiegende
Teil des TNT bereits bis zur vierten Versuchswoche transformiert (Abbildung 12). Gegenüber
den übrigen Varianten verlangsamt und weniger ausgeprägt, war der Rückgang dennoch auch
in der Kontrollvariante K zu beobachten. In dieser Variante wurde der TNT-Abbau nach vier
Wochen gebremst und stagnierte schließlich. Das Niveau der Schadstoffkonzentration
pendelte sich auf knapp die Hälfte der Ausgangsbelastung ein. Das Auftreten von
Extremwerten infolge einer inhomogenen Schadstoffverteilung im Bodensubstrat war in
seinem Umfang im Vergleich zum vorangegangenen Kiefernexperiment deutlich
abgeschwächt.
50

Ergebnisse
700
TNT in mg/kg Boden
600
500
400
300
200
Variante A
Variante B
Variante C
Variante D
Variante K
100
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
Abb. 12: Nachweisbare TNT-Konzentration im Bodensubstrat der Versuchsvarianten A, B,
C, D und K im Zeitverlauf; abgebildet sind die Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen
(Startbeprobung n = 32, sonst n = 8). Ausstattung: Variante A mit myk.
Pappeln und mit Weißfäulepilzkultur; Variante B mit myk. Pappeln ohne Weißfäulepilzkultur;
Variante C mit Weißfäulepilzkultur ohne myk. Pappeln; Variante D mit nicht-myk.
Pappeln und mit Weißfäulepilzkultur, Kontrollvariante K weder mit myk. Pappeln noch mit
Weißfäulepilzkultur.
Die Transformationsdynamik des TNT-Abbaus in den einzelnen Experimentalvarianten lässt
sich folgendermaßen beschreiben:
– In Variante A fiel die TNT-Abreicherung von allen Varianten am deutlichsten aus.
Signifikante Unterschiede im Belastungsgrad waren nach 12 Wochen allerdings nur
gegenüber den Varianten C und K feststellbar. Nicht signifikant waren die Unterschiede zu
den übrigen Pappelvarianten B und D.
– Die mit mykorrhizierten Pappeln bestückteVariante B zeigte ebenfalls signifikant höhere
Abbauraten zu C und K. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die Abbauleistung gegenüber
der Experimentalvariante A nicht signifikant niedriger war, obwohl in B Weißfäulepilze
fehlten.
51

Ergebnisse
– Die Weißfäulepilzvariante C unterscheidet sich signifikant von K. Abbauleistungen, wie sie
in den Pappelvarianten erzielt wurden, konnten mit zunehmender Versuchsdauer allerdings
nicht erreicht werden.
– In Experimentalvariante D waren die Pappeln nicht mykorrhiziert. Demnach konnten bei
den Transformationsvorgängen Weißfäulepilze, jedoch keine Mykorrhizapilze mitwirken.
Trotzdem wurden in dieser Pappelvariante Abbauraten ermittelt, die den Abbauleistungen in
den Kombinationsvarianten aus Pappeln mit Mykorrhizapilzen vergleichbar sind. Signifikant
niedriger waren die Belastungen nach 12 Wochen gegenüber C und K.
– Die Analysen der Bodenproben aus den Rhizotronen der Kontrollvariante K ergaben
ebenfalls auffällige Schadstoffabreicherungen. Allerdings stagnierte die TNT-Degradation
bereits nach vier Wochen und das Belastungsniveau hielt sich im weiteren Versuchsverlauf
bei knapp der Hälfte der Ausgangsbelastung. Bezüglich des Abreicherungseffektes blieb K
jedoch deutlich hinter den übrigen Versuchsvarianten zurück.
Tabelle 11: Ermittelte TNT-Konzentrationen in den analysierten Bodenmischproben.
Varianten
t A B C D K
n 32 32 32 32 32
0 Mw 463,1 428,7 446,7 454,9 427,9
Sd 83,4 110,6 180,7 116,3 60,8
Med 443,8 401,4 418,1 408,4 415,1
n 8 8 8 8 8
2 Mw 149,4 198,4 189,8 140,0 327,3
Sd 123,4 52,2 59,4 51,2 141,2
Med 100,82 199,5 176,6 133,6 258,5
n 8 8 8 8 8
4 Mw 117,6 87,6 132,2 136,8 204,8
Sd 95,1 37,2 107,4 72,7 120,0
Med 85,1 79,6 94,1 110,8 149,9
n 7 8 8 8 8
8 Mw 47,2 30,7 71,5 56,5 149,4
Sd 16,0 9,4 21,4 30,4 119,6
Med 37,2 32,4 68,5 44,2 124,2
n 8 6 8 8 8
12 Mw 24,2 45,2 89,9 33,3 183,0
Sd 13,3 21,0 46,2 15,6 161,9
Med 20,6 41,2 75,6 27,2 100,9
t = Versuchsdauer in Wochen; n= Anzahl der berücksichtigten
Proben; Mw = arithmetisches Mittel; Sd = Standardabweichung
(±); Med = Median; Werte für Mw, Sd und Med in mg TNT/kg
Boden (TS)
52

Ergebnisse
3.3.1.2 Entwicklung der ADNT-Belastung im Boden
Die Analysen der Bodenmischproben zeigten für alle Varianten nach Versuchsende einen
Anstieg der ADNT-Gehalte gegenüber den Ausgangskonzentrationen (Abbildung 13).
Allerdings fiel die Ausprägung des Anreicherungseffektes in den verschiedenen Versuchsvarianten
nicht einheitlich aus. In einem Teil der Varianten nahmen die ADNTs insgesamt
nur geringfügig zu. Die Zunahme der ADNT-Konzentration liegt ursächlich in der Reduktion
des TNT begründet. Die Belastungsspitzen konnten mit Ausnahme von Variante K für die
übrigen Varianten nach 4 Wochen detektiert werden. Dieses Verhaltensmuster korreliert mit
dem zügigen TNT-Abbau zu Versuchsbeginn in diesen Varianten.
250,00
ADNT in mg/kg Boden
200,00
150,00
100,00
Variante A
Variante B
Variante C
Variante D
Variante K
50,00
0,00
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
Abb. 13: Nachweisbare ADNT-Konzentration im Bodensubstrat der Versuchsvarianten A, B,
C, D und K im Zeitverlauf (4-ADNT und 2-ADNT wurden zusammengefasst); abgebildet
sind die Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen (Startbeprobung n = 32,
sonst n = 8). Ausstattung: Variante A mit myk. Pappeln und mit Weißfäulepilzkultur;
Variante B mit myk. Pappeln ohne Weißfäulepilzkultur; Variante C mit Weißfäulepilzkultur
ohne myk. Pappeln; Variante D mit nicht-myk. Pappeln und mit Weißfäulepilzkultur,
Kontrollvariante K weder mit myk. Pappeln noch mit Weißfäulepilzkultur.
53

Ergebnisse
Für die einzelnen Varianten konnten folgende Beobachtungen gemacht werden:
– In Variante A hat die ADNT-Konzentration nach dem Erreichen der Belastungsspitze bis
zur Beendigung des Versuchs stetig abgenommen und erreichte nach 12 Wochen von allen
Varianten das niedrigste Belastungsniveau. Signifikant niedriger war der ADNT-Gehalt zu
diesem Zeitpunkt gegenüber den Varianten C, D und K. Nicht signifikant war der Unterschied
gegenüber Variante B.
– In Variante B zeigte die Belastung in ihrer Entwicklung ein ähnliches Verhaltensmuster wie
in Variante A. Nach Erreichen der Belastungsspitze war ein deutlicher Rückgang der ADNT-
Konzentration zu verzeichnen. Das Belastungsniveau war gegenüber A in der zweiten
Versuchshälfte nicht signifikant höher. Signifikant reduziert war in der Variante B nach
Ablauf des Versuches die ADNT-Belastung gegenüber den Varianten C, D und K.
– Die Weißfäulepilzvariante C grenzte sich insbesondere in der zweiten Versuchshälfte
aufgrund eines signifikant niedrigeren Schadstoffgehaltes von der Kontrollvariante K ab.
Abbauleistungen, wie sie in den Pappelvarianten A und B erzielt wurden, konnten bei
zunehmender Versuchsdauer in C allerdings nicht erreicht werden.
– In der Pappelvariante D waren die Pflanzen nicht mykorrhiziert. Bei einem Vergleich mit
den beiden übrigen Pappelvarianten A und B, in denen Mykorrhizapilze zugegen waren,
zeigte sich in D ein deutlich geringerer Effekt bei der Eliminierung der ADNTs, so dass der
Schadstoffgehalt nach 12 Wochen signifikant höher war. Ein signifikant niedrigerer ADNT-
Gehalt konnte letztendlich nur gegenüber der Kontrollvariante K festgestellt werden.
– In der Kontrollvariante K wurden die maximalen ADNT-Konzentrationen am Ende des
Experimentes nach zwölf Wochen detektiert. Das Auftreten einer Belastungsspitze nach 4
Wochen mit einem sich anschließendem Schadstoffrückgang konnte nicht beobachtet werden,
so dass der ADNT-Gehalt in dieser Variante zum Schluss die höchsten Werte erreichte.
54

Ergebnisse
Tabelle 12: Ermittelte ADNT-Konzentrationen in den analysierten Bodenmischproben. Die
Gehalte von 2-ADNT und 4-ADNT sind zusammengefasst aufgeführt.
Varianten
t A B C D K
n 32 32 32 32 32
0 Mw 83,8 97,6 109,5 109,3 91,8
Sd 6,7 14,9 12,6 8,4 8,5
Med 81,3 93,26 106,0 108,2 90,5
n 8 8 8 8 8
2 Mw 105,3 114,1 145,8 146,6 125,5
Sd 4,9 12,7 5,1 7,7 11,5
Med 103,8 110,3 145,6 146,1 128,2
n 8 8 8 8 8
4 Mw 133,9 168,8 183,6 167,1 175,3
Sd 9,5 9,8 4,4 7,9 4,6
Med 130,3 168,2 183,3 167,1 174,4
n 7 8 8 8 8
8 Mw 117,2 131,2 135,2 151,4 169,6
Sd 11,5 15,0 11,9 12,6 12,6
Med 113,4 124,4 134,0 152,1 168,6
n 8 7 8 8 8
12 Mw 103,8 114,4 161,5 151,7 193,9
Sd 13,0 8,9 14,6 20,3 40,6
Med 100,7 116,3 158,4 146,9 205,5
t = Versuchsdauer in Wochen; n= Anzahl der berücksichtigten
Proben; Mw = arithmetisches Mittel; Sd = Standardabweichung
(±); Med = Median; Werte für Mw, Sd und Med in mg TNT/kg
Boden (TS)
3.3.1.3 Dinitrotoluole
Die beiden Dinitrotoluole 2,4-DNT und 2,6-DNT treten mitunter als Begleitkontaminanten
TNT-belasteter Böden auf. Sie können in geringer Rate aus Trinitrotoluol (TNT) durch
Abspaltung einer Nitrogruppe entstehen. Beide DNTs konnten in geringen Mengen aus den
Bodenproben extrahiert und analysiert werden. Als Kontaminanten des initialen Belastungsspektrums
im Boden erreichten sie lediglich Konzentrationen < 5 mg/kg Boden. Im
weiteren Versuchsverlauf ließ sich zum Teil eine geringe Zunahme um wenige mg/kg Boden
feststellen. Allgemein blieb die Belastung unter 8 mg/kg Boden. Variantenspezifische
Unterschiede waren nicht zu erkennen.
55

Ergebnisse
3.3.2 Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Pappeln
Die Pappeln zeichneten sich während der Kultivierung in den Rhizotronen durch ein gutes
Wachstum aus und erreichten gute Biomassezuwächse (Tabelle 13). Die Gewichtszunahme
ließ sich insbesondere auf ein starkes Wurzelwachstum zurückführen. Bei den nichtmykorrhizierten
Pappeln (Variante D) war der Zuwachs etwas schwächer ausgeprägt. Der
Mykorrhizierungsgrad der Kurzwurzeln war über den Versuchszeitraum Schwankungen
ausgesetzt. Am Ende war der Grad der Mykorrhizierung allerdings nicht höher als zu Beginn
des Versuchs.
Tabelle 13: Biomasseentwicklung und Mykorrhizierungsgrad der Pflanzen in den
Experimentalvarianten.
Variante A Variante B Variante D
t n BM MYK n BM MYK n BM MYK
0 32 7,01 45 32 5,89 30 32 6,44 —
2 8 7,21 45 8 6,07 40 8 6,62 —
4 8 9,55 25 8 8,81 40 8 8,81 —
8 8 10,93 50 8 9,67 25 8 9,75 —
12 8 11,05 50 8 9,62 30 8 9,22 —
t = Versuchsdauer in Monaten; n= Anzahl der untersuchten Pflanzen; BM=Frischgewicht der Pflanzen
(Wurzel + Spross) in g (arithmetisches Mittel); MYK = Anteil der mykorrhizierten Kurzwurzeln in %
3.3.3 Zusammenfassung
Beim TNT wurde in den bepflanzten Varianten A, B und D der deutlichste Rückgang
verzeichnet. Die ähnlich guten Abbauraten in diesen Varianten lassen den Schluss zu, dass
eine zusätzliche Beimpfung des Substrates mit Weißfäulepilzen für die Transformation des
TNT keine große Bedeutung hatte. Auch bei der ADNT-Degradation ließ sich durch das
zusätzliche Beimpfen des Substrates mit Weißfäulepilzen kein besonderer Abreicherungseffekt
erzielen. Die ADNT-Gehalte in den bepflanzten Experimentalvarianten A (mit
Weißfäulepilz) und B (ohne Weißfäulepilz) zeigten nach Versuchsende keinen signifikanten
Unterschied zueinander und waren die niedrigsten von allen Varianten. In der mit nichtmykorrhizierten
Pappeln bestückten Variante D konnte ein entsprechend niedriges Niveau im
Belastungsgrad bei den ADNTs letztendlich nicht erreicht werden. In Anbetracht der
Ergebnisse muss den mykorrhizierten Pappeln insbesondere beim ADNT-Abbau somit eine
besondere Rolle zugesprochen werden.
Hervorzuheben ist außerdem die Tatsache, dass auch in diesem Experiment in der
Kontrollvariante K ein starker Rückgang der TNT-Belastung zu beobachten war.
56

Ergebnisse
Bezüglich ihrer Biomasseentwicklung zeigten die Pappeln ein deutliches Wachstum. Dieser
Umstand spiegelte sich vor allem in einer guten Durchwurzelung des Substrates wieder.
3.3.4 Nachweis des Nitroaromatentransfers aus dem Boden in die Versuchspflanzen
Durch die Schadstoffanalysen der Bodenproben konnte in den bepflanzten Rhizotronen eine
besonders effiziente Nitroaromatenabreicherung nachgewiesen werden. Deshalb sollte nun
untersucht werden, ob dieser Effekt auf einen verstärkten Abbau im Wurzelraum
(Rhizosphäreneffekte) oder möglicherweise auch auf eine Aufnahme der Schadstoffe aus dem
Boden in die Pflanzen zurückzuführen ist.
Wie bereits aus Abschnitt 2.3.2.2 hervorgeht, wurden die Pflanzenproben mit Dichlormethan
(DCM) extrahiert. Außerdem beinhaltete die Extraktion eine Säurehydrolyse mit
anschließender Alkalisierung, damit auch die fest in die pflanzliche Matrix eingebundenen
Metabolite herausgelöst werden konnten. Abbildung 14 zeigt den Chromatogrammausschnitt
eines Wurzelextraktes nach Säurehydrolyse. Die analytische Erfassung der Nitroaromaten
erfolgte über eine thermische Desorption gekoppelt mit nachfolgender GC/MS. Im Anhang
sind die Nitroaromaten-Peaks einer Probe herausgefiltert dargestellt (Abbildung 44).
Außerdem ist dort ein Massenspektrum für TNT aufgeführt (Abbildung 45).
57

Ergebnisse
Abb. 14: Ausschnitt aus dem GC-Chromatogramm einer Wurzelprobe nach 60 min. Ultraschallextraktion
in DCM. Die Doppelsternchen markieren die Lage der Nitroaromaten-Peaks,
v. l. n. r.: TNT, 2-ADNT und 4-ADNT. Zahlreiche weitere Peaks stehen für herausgelöste
Pflanzenbestandteile, z. B. Palmitinsäure, Phenolverbindungen und Phtalate.
58

Ergebnisse
3.3.4.1 Quantitativer Nachweis von Nitroaromaten mittels GC/MS
In den Tabellen 14, 15 und 16 sind die aus den Pflanzen der jeweiligen Versuchsvarianten
extrahierten Nitroaromatenmengen aufgeführt. Sowohl in den Wurzeln als auch im Spross der
untersuchten Pflanzen wurden das TNT und dessen Reduktionsprodukte 4-ADNT und 2-
ADNT detektiert. In den meisten Fällen lag die Konzentration von 2-ADNT höher, als die
von 4-ADNT. Weitere Metaboliten wurden nicht nachgewiesen. Betrachtet man die Mengen
der extrahierbaren Nitroaromaten insgesamt, fallen z. T. erhebliche
Konzentrationsunterschiede von Probe zu Probe auf. Auch in den Parallelproben waren
teilweise deutliche Unterschiede im Belastungsgrad festzustellen. Die nachweisbare
Nitroaromatenkonzentration wies außerdem eine Organspezifität auf. Die Wurzeln der
Pflanzen waren höher belastet als die Sprosse. Als Hauptkontaminanten wurden in den
Wurzeln die ADNTs detektiert (Maximalwert 93,16 µg/g TS). Das TNT konnte in den
Wurzelproben nur in erheblich niedrigeren Konzentrationen (Maximalwert 21,66 µg/g TS)
oder gar nicht nachgewiesen werden. Im insgesamt wenig belasteten Spross fanden sich in
zahlreichen Proben weder TNT noch ADNTs. In den belasteten Proben war hier der
Schadstoffanteil zugunsten der ADNTs weniger ausgeprägt (Maximalwert ADNTs 50,04
µg/g TS, Maximalwert TNT 26,52 µg/g TS). Eine Tendenz zur Akkumulation mit
fortlaufender Versuchsdauer ließ sich aufgrund der z. T. erheblichen Messwertschwankungen
nicht nachweisen. Ein Mykorrhizaeffekt trat nicht auf.
Tabelle 14: Variante A; ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen in Pflanzenorganen.
t Wurzel Spross (Stamm/Blatt)
TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT
2 0,00 50,50 14,60 35,90 0,00 0,00 0,00 0,00
— — — — 0,00 0,00 0,00 0,00
4 0,00 62,92 12,64 50,28 0,00 0,00 0,00 0,00
— — — — 0,00 0,00 0,00 0,00
8 0,00 30,86 5,00 25,86 0,00 0,00 0,00 0,00
— — — — 0,00 0,00 0,00 0,00
12 0,00 28,34 0,00 28,34 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 49,10 15,32 33,78 0,00 0,00 0,00 0,00
Aufgeführt sind die Nitroaromatengehalte aller Einzelproben in µg/g Pflanzentrockenmasse;
t=Versuchsdauer in Wochen; ADNT als Summe von 4-ADNT und 2-ADNT
59

Ergebnisse
Tabelle 15: Variante B; ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen in Pflanzenorganen
t Wurzel Spross (Stamm/Blatt)
TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT
2 3,76 18,96 8,92 10,04 0,00 12,84 5,20 7,64
0,00 11,84 5,00 6,84 26,52 23,98 11,66 12,32
4 1,92 29,39 17,48 11,91 21,00 0,00 0,00 0,00
21,66 93,16 28,38 64,78 17,28 0,00 0,00 0,00
8 17,24 62,68 20,29 41,76 11,84 0,00 0,00 0,00
4,18 50,12 13,00 37,12 7,16 9,28 5,56 3,72
12 0,00 25,00 4,16 20,84 2,16 50,04 7,38 42,66
0,00 30,64 5,00 25,64 0,00 0,00 0,00 0,00
Aufgeführt sind die Nitroaromatengehalte aller Einzelproben in µg/g Pflanzentrockenmasse;
t=Versuchsdauer in Wochen; ADNT als Summe von 4-ADNT und 2-ADNT
Tabelle 16: Variante D; ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen in Pflanzenorganen
t Wurzel Spross (Stamm/Blatt)
TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT TNT ADNT 4-ADNT 2-ADNT
2 0,00 6,12 0,00 6,12 0,00 0,00 0,00 0,00
2,56 18,84 5,24 13,60 0,00 0,00 0,00 0,00
4 0,00 0,00 0,00 0,00 3,60 0,00 0,00 0,00
2,64 0,00 0,00 0,00 0,00 36,12 8,76 27,36
8 0,00 42,62 4,16 38,46 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 62,64 12,36 50,28 0,00 20,70 9,18 11,52
12 5,92 19,76 3,60 16,16 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 21,54 0,00 21,54 0,00 0,00 0,00 0,00
Aufgeführt sind die Nitroaromatengehalte aller Einzelproben in µg/g Pflanzentrockenmasse;
t=Versuchsdauer in Wochen; ADNT als Summe von 4-ADNT und 2-ADNT
Die nachgewiesenen TNT-Gehalte waren in den Pflanzen der B-Variante deutlich höher als in
den Pflanzen der anderen beiden Pappelvarianten A und D. Ob dieser Unterschied ein Zufall
ist oder in einer Varianzspezifität begründet liegt, bleibt zunächst ungeklärt. Bei Betrachtung
dieses Sachverhaltes ist hervorzuheben, dass die Variante B nicht mit Weißfäulepilzen
ausgestattet wurde.
Interessant ist die Tatsache, dass der überwiegende Teil der analytisch erfassten
Nitroaromaten erst durch eine Säurehydrolyse in 25%iger Schwefelsäure und anschließender
Alkalisierung mit 8 M Natronlauge aus den Pflanzenproben extrahiert werden konnte. In
Tabelle 17 sind exemplarisch die gewonnenen Nitroaromatenmengen aus den Wurzelproben
der B-Variante aufgeführt. Die Darstellung beinhaltet die Werte für den reinen DCM-Extrakt
(Extraktion 1) und für den DCM-Extrakt nach erfolgter Säurehydrolyse mit Alkalisierung
60

Ergebnisse
(Extraktion 2). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass der überwiegende Teil des TNT und der
ADNTs bereits in festgelegter Form als ‚Bound Residues’ in den Pflanzen vorlag und eine
gewöhnliche DCM-Extraktion (Extraktion 1) zur Herauslösung der Kontaminanten nicht
ausreichte.
Tabelle. 17: Ermittelte Nitroaromatenmengen aus den Wurzelproben der B-Variante. Die
Werte aus der reinen DCM-Extraktion (Extraktion 1) und der DCM-Extraktion nach
Säurehydrolyse (Extraktion 2) sind anteilig dargestellt.
TNT 4-ADNT 2-ADNT
t E 1 E 2 E 1 E 2 E 1 E 2
2 0,00 3,76 0,00 8,92 0,00 10,04
0,00 0,00 0,00 5,00 0,00 6,84
4 1,92 0,00 7,52 9,96 9,84 2,07
0,00 21,66 4,20 24,18 5,68 59,10
8 7,40 9,84 9,64 11,28 12,24 29,52
1,72 2,46 7,72 5,28 14,44 22,68
12 0,00 0,00 4,16 0,00 10,04 10,80
0,00 0,00 5,00 0,00 12,20 13,44
E1 = Extraktion 1; E2 = Extraktion 2; t = Versuchsdauer in Wochen;
Angaben in µg/g Pflanzentrockenmasse
3.3.4.2 Wiederfindungsraten für TNT in Pflanzenproben
Eine Quantifizierung der Aufnahmeraten für das TNT ist schwierig. Zum einen verhindert die
initiale TNT-Abreicherung im Boden eine kontinuierliche Nachlieferung in die Pflanzen.
Zum anderen ist zu erwarten, dass aufgenommene Nitroaromaten in den Pflanzen
metabolisiert und die dabei entstehenden Abbauprodukte größtenteils fest in die pflanzliche
Matrix eingebaut oder auch veratmet werden. Möglicherweise ist dann ein Teil der
eingebundenen Abbauprodukte auch durch Säurehydrolyse und Alkalisierung nicht mehr zu
extrahieren. Außerdem ist bei einer Interpretation der detektierten Nitroaromatenmengen zu
be-rücksichtigen, dass die Trockenmassen pflanzlicher Substanz nach der Gefriertrocknung
im Vergleich zu Frischmaterial etwa nur noch 10% der ursprünglichen Menge ausmachen.
Somit ergeben bereits geringe Mengen an aufgenommenen Nitroaromaten relativ hohe
Belastungswerte. Trotzdem soll eine kurze Überschlagsrechnung verdeutlichen, im welchem
Verhältnis die mittels GC-MS in den Pflanzen detektierten Nitroaromatenmengen zu den
Bodengehalten stehen.
61

Ergebnisse
angenommener Nitroaromatengehalt (TNT und ADNTs)
je 1000 g Trockenboden, bezogen auf die Ausgangskonzentration
angenommener Nitroaromatengehalt (TNT und ADNTs)
je 70 g Trockenboden (entspricht dem Bodenvolumen eines
Rhizotrons)
angenommenes Frischgewicht von 10 g je Pflanze, dass
entspricht etwa 1 g Trockenmasse
angenommener Nitroaromatengehalt je 1 g Pflanzentrockenmasse
(ungefährer detektierter Wert)
Anteil detektierter Nitroaromaten je Pflanze bezogen auf
den initialen Schadstoffgehalt in 70 g Trockenboden
550 mg
38,5 mg
50 µg
0,1 - 0,2 %
3.3.4.3 Zusammenfassung
In den Wurzel- und Sprossproben der Pappeln konnten die Nitroaromaten TNT, 4-ADNT und
2-ADNT detektiert werden. Als Hauptkontaminanten erwiesen sich die beiden ADNTs. Die
nachweisbare Nitroaromatenkonzentration war organspezifisch. Die Wurzeln der Pflanzen
waren höher belastet als der Spross.
3.4 Aufnahme und Verteilung von 14 C-TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten in Pinus
sylvestris Sämlingen
In Experiment 2.2.2 konnten verschiedene Nitroaromaten in den Wurzeln und im Spross der
Pflanzen gaschromatographisch nachgewiesen werden. Allerdings gaben die erzielten
Ergebnisse keine genaue Auskunft darüber, in welchem Umfang die detektierten
Schadstoffmengen von den Pflanzen tatsächlich aufgenommen wurden oder möglicherweise
den Wurzeln nur äußerlich anhafteten. Um die Aufnahme und Verteilung von TNT und
dessen Metaboliten in die Pflanzen quantitativ erfassen zu können, wurde nichtmykorrhizierten
und mykorrhizierten Pinus sylvestris Sämlingen
14 C-TNT in zwei
Konzentrationen angeboten. Die sich anschließende Untersuchung zur Aufnahme der
Radiotracer erfolgte mikroautoradiographisch und durch Szintillationszählung. Die
experimentellen Schritte können im einzelnen den Angaben in Kapitel 2.2.3 entnommen
werden.
62

Ergebnisse
3.4.1 Mikroautoradiographische Untersuchungen von nicht-mykorrhizierten und
mykorrhizierten Kiefernwurzeln
Für die mikroautoradiographischen Untersuchungen wurden sowohl nicht-mykorrhizierte als
auch mit Pisolithus tinctorius mykorrhizierte Wurzeln von Pinus sylvestris Sämlingen
verwendet. Nach einem Angebot von 17 x 10 4 Bq in 2 ml Düngelösung (10,2 x 10 6 dpm) je
Pflanze, erfolgte die Ernte der Wurzeln nach 3, 7 und 14 Tagen Applikation. Die
Radioaktivität wurde durch Auflage einer speziellen Röntgenfilmemulsion auf die
Semidünnschnitte nachgewiesen (Punkt 2.3.5.4). Bezüglich ihrer Körnung wurden Proben mit
Expositionszeiten zwischen 2 Tagen und 20 Wochen nach Fixierung des Röntgenfilms
lichtmikroskopisch untersucht. Aufgrund der schwachen Ausbildung von Kornstrukturen sind
im folgenden Abbildungsteil ausschließlich beschichtete Präparate nach 20wöchiger
Exposition dargestellt.
Grundsätzlich ließ sich nach relativ hoher 14 C-TNT-Applikation in den Wurzeln insgesamt
nur wenig 14 C nachweisen. Größtenteils wurde eine Schwärzung des Films durch den
Wurzeln äußerlich anhaftendes 14 C hervorgerufen . Eine Tendenz zur Akkumulation von
Radioaktivität mit fortdauernder Applikation konnte in den Proben nicht beobachtet werden.
Auffällige Unterschiede zwischen mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten Wurzeln
bezüglich der Aufnahmemenge und der Verteilung der aufgenommenen Radioaktivität in den
Pflanzen-zellen wurden nicht festgestellt.
In Abbildung 15 ist eine nicht-mykorrhizierte Seitenwurzel nach 14tägiger Applikation im
Längsschnitt (die dazugehörige Trägerwurzel im Querschnitt) als Übersicht dargestellt.
Erkennbare Schwärzungen des Films befanden sich lediglich im Randbereich der Wurzeln
(siehe Pfeile). Die großen Silberkornflecken im Bereich der Trägerwurzel wurden
wahrscheinlich von kontaminierten Kohlepapierresten verursacht, die den Wurzeln
anhafteten. In zahlreichen Schnitten konnten entsprechend großflächige Schwärzungen
beobachtet werden. Innerhalb der Wurzeln waren die Markierungen durch eine geringe
Silberkorndichte gekennzeichnet. Abbildung 16 zeigt einen Detailausschnitt mit Rhizodermisund
Rindenzellen der Seitenwurzel. Während sich die Silberkörner im Bereich der
Rhizodermisaußenseite konzentrierten, blieb die Anzahl der Körner über der Rhizodermis und
den Zellen der primären Rinde wesentlich niedriger. Die höhere Silberkorndichte an der
Wurzeloberfläche könnte ein Indiz für einen erschwerten (gehemmten) Eintransport in die
Wurzel sein oder auf eine verstärkte Adsorption hinweisen. Die aufgenommene
Radioaktivität erfuhr eine relativ gleichmäßige Verteilung in Rhizodermis und primärer Rinde
und gelangte schließlich bis in die Zellen des Zentralzylinders. So konnten zahlreiche
Silberkörner in den Tracheiden des Xylems nachgewiesen werden (Abbildung 17). Allgemein
war die Silberkorndichte in den tracheidalen Elementen etwas höher als in den anliegenden
Zellen, was insbesondere für die ring- und schraubenartig verdickten Wandbereiche der
Leitelemente zutraf. Radioaktivität im Xylem ließ sich bereits nach 3 Tagen Applikation
63

Ergebnisse
mikro-autoradiographisch nachweisen (nicht abgebildet). Eine auffällige Akkumulation mit
fortschreitender Angebotsdauer war in den Tracheiden aufgrund der niedrigen Aufnahmerate
insgesamt innerhalb der 14tägigen Applikation allerdings nicht erkennbar, wobei
berücksichtigt werden muss, dass anteilig Radioaktivität mit dem Xylemstrom bereits
abtransportiert wurde. Eine nennenswerte Verlagerung des aufgenommenen 14 C in die
apikalen Regionen der Wurzeln fand nicht statt. Über den Zellen der Wurzelspitze wurden
kaum Silberkörner gefunden (Abbildung 18).
Radioaktivität konnte auch im Trägerwurzelsystem der Kiefern nachgewiesen werden
(Abbildung 19). Silberkörner fanden sich hier vor allem über den tracheidalen Leitelementen
des Zentralzylinders. Der Aufnahmepfad des in den Trägerwurzeln vorgefundenen 14 C verlief
vermutlich überwiegend über die Leitelemente der Seitenwurzeln, die eine direkte
Verbindung mit den Tracheiden der Trägerwurzeln herstellen. Über den Zellen der primären
Rinde ließen sich kaum Silberkörner nachweisen.
Wie bereits erwähnt wurde, konnten zwischen nicht-mykorrhizierten und mykorrhizierten
Wurzeln kaum Unterschiede bezüglich der Aufnahmemenge und der Verteilung der
aufgenommenen Radioaktivität in den Wurzeln festgestellt werden. Abbildung 20 zeigt eine
mykorrhizierte Seitenwurzel im medianen Längsschnitt mit dazugehöriger Trägerwurzel.
Letztere ist quer geschnitten. Der Hyphenmantel umgibt die Seitenwurzel vollständig. Im
apikalen Bereich der Wurzel noch locker und verhältnismäßig dünn, nimmt der Mantel in
proximaler Richtung an Stärke und Kompaktheit zu. Das Hartigsche Netz ist nur sporadisch
ausgebildet und bleibt auf wenige Bereiche der Rinde begrenzt. Abgesehen von durch
anhaftende Kohlepapierfasern verursachte Schwärzungen, die an zahlreichen mykorrhizierten
Wurzeln beobachtet wurden, waren Markierungen im Hyphenmantel allgemein wenig zu
finden. Silberkörner traten nur ganz vereinzelt auf (Abbildung 21). Die Markierung über den
Zellen der primären Rinde, des Zentralzylinders und des Apikalmeristems ist in ihrer
Intensität der Markierung vergleichbar, wie sie bereits für entsprechende Regionen nichtmykorrhizierter
Wurzeln nachgewiesen wurde. In den Rindenzellen war die Verteilung der
Aktivität relativ gleichmäßig (Abbildung22). Im Zentralzylinder traten Silberkörner
insbesondere über den Tracheiden und in diesen vor allem im Bereich der Wände in
Erscheinung (Abbildungen 23 und 24). Auch in mykorrhizierten Kiefern ließ sich
Radioaktivität in den tracheidalen Leitbahnen der Trägerwurzeln nachweisen (Abbildung 24).
Der apikale Wurzelabschnitt blieb von einem 14 C-Eintransport weitgehend ausgenommen.
Radioaktivität war hier kaum zu finden (Abbildung 25).
64

Ergebnisse
Tw
Abb. 19
Abb.15: Mikroautoradiographie einer
längsgeschnittenen nicht-mykorrhizierten
Seitenwurzel (Sw) mit quergeschnittener
Trägerwurzel (Tw) von Pinus
sylvestris; angeboten wurden 17 x 10 4
Bq 14 C-TNT für einen Zeitraum von 14
Tagen; mit Silberkornflecken im Randbereich
außerhalb der Wurzel; erhöhte
Silberkorndichte im äußeren Randbereich
der Rhizodermis (siehe Pfeile);
Detailausschnitte sind markiert; Apikalmeristem
(Am), Rinde (Ri), Zentralzylinder
(Zz), Maßstab 100 µm.
Rh
Abb.:17
Zz
Abb.:16
Ri
Abb.:18
Am
Sw
Rh
Abb.16: Detail aus Abbildung 15; Verteilung
der Radioaktivität (Silberkörner) in
Rhizodermis (Rh), primärer Rinde (Ri)
und im Randbereich der Seitenwurzel
(Pfeile), Maßstab 25 µm.
Ri
65

Ergebnisse
Ri
Rh
Tr
Zz
Am
Abb.17: Detail aus Abbildung 15;
Verteilung der Radioaktivität (Silberkörner)
im Zentralzylinder (Zz)
der Seitenwurzel, Tracheide (Tr);
Maßstab 15 µm.
Abb.18: Detail aus Abbildung 15;
Verteilung der Radioaktivität (Silberkörner)
im apikalen Wurzelabschnitt;
Apikalmeristem (Am),
Rhizodermis (Rh), Rinde (Ri);
Maßstab 25 µm.
Tr
Abb.19: Detail aus
Abbildung 15; Ausschnitt
aus dem Zentralzylinder
der quer
angeschnittenen Trägerwurzel;
Verteilung
der Radioaktivität (Silberkörner);
Tracheiden
(Tr) mit sich
ausdifferenzierenden
Zellwänden (Pfeile);
Maßstab 15 µm.
66

Ergebnisse
Tw
Abb.: 24
Abb. 20: Mikroautoradiographie
einer mykorrhizierten Seitenwurzel
(Sw) mit Trägerwurzel (Tw) als
Übersicht (Pinus sylvestris/Pisolithus
tinctorius Mykorrhiza); angeboten
wurden 17 x 10 4 Bq 14 C-TNT
für einen Zeitraum von 14 Tagen;
Detailausschnitte sind markiert;
Hyphenmantel (Hm), Hartigsches
Netz (Hn), Apikalmeristem (Am),
Rinde (Ri), Zentralzylinder (Zz);
Maßstab 100 µm.
Zz
Abb.: 23
Ri
Hn
Hn
Ri
Hm
Sw
Abb.: 22
Abb. 21: Ausschnitt aus einer quer
angeschnittenen mykorrhizierten Kiefernwurzel
(Pinus sylvestris/Pisolithus
tinctorius); angeboten wurden 17 x 10 4
Bq 14 C-TNT für einen Zeitraum von 14
Tagen; Silberkörner (Pfeile) nur ganz
vereinzelt im Bereich des Hyphenmantels
(Hm), Hartigsches Netz (Hn),
Rinde (Ri); Maßstab 20 µm.
Am
Abb.: 25
67

Ergebnisse
Ri
Tr
Hm
Abb. 22: Detail aus Abbildung 22;
Verteilung der Radioaktivität (Silberkörner)
in der primären Rinde
(Ri), Hyphenmantel (Hm); Maßstab
25 µm.
Abb. 23: Detail aus Abbildung 22;
Silberkörner über den Tracheiden
(Tr) der Seitenwurzel, Ring- und
Schrauberverdickungen in den
Tracheidenwänden (Pfeile); Maßstab
15 µm.
Tr
Am
Abb.24: Detail aus Abbildung 33;
Ausschnitt aus dem Zentralzylinder der
quer angeschnittenen Trägerwurzel;
Verteilung der Radioaktivität in den
Tracheiden (Tr); Maßstab 20 µm.
Hm
Abb. 25: Detail aus Abbildung 33;
apikaler Wurzelabschnitt; Apikalmeristem
(Am), Hyphenmantel
(Hm); Maßstab 25 µm.
68

Ergebnisse
3.4.2 Bestimmung der Radioaktivität in den einzelnen Pflanzenorganen durch
Szintillationszählung
Die Quantifizierung der aufgenommenen Aktivität mittels Szintillationszählung erfolgte für
Wurzeln, Spross und Nadeln getrennt. Untersucht wurden sowohl nicht-mykorrhizierte als
auch mit Pisolithus tinctorius mykorrhizierte Pinus sylvestris Sämlinge.
Angeboten wurde das 14 C-TNT in zwei Konzentrationen:
0,85 x 10 4 Bq in 2 ml Düngelösung (0,501 x 10 6 dpm)
17 x 10 4 Bq in 2 ml Düngelösung (10,2 x 10 6 dpm)
Die ermittelten Aktivitäten zeigten für die verschiedenen Organe der Pflanzen, besonders für
die Wurzelproben, zum Teil hohe Schwankungsbreiten in ihren Werten. Die Ursache für das
Auftreten solcher Streuungen liegt vermutlich darin begründet, dass für die Auswertung nur
Aliquots von den jeweiligen Pflanzenteilen entnommen wurden, wobei die Organe der
Pflanzen allgemein durch Bereiche unterschiedlicher Aufnahme- und Transportaktivitäten
charakterisiert sind. Bei den Wurzeln dürften zu den zum Teil erheblichen Schwankungen
außerdem sehr feine anhaftende kontaminierte Kohlepapierfasern beigetragen haben.
Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Radioaktivität sind daher in den Diagrammen die
Mediane mit den dazugehörigen Maximal- und Minimalwerten aufgeführt. Ein Mykorrhizaeffekt
trat beim Anreicherungsverhalten nicht auf. Grundsätzlich ließen sich zwischen
nicht-mykorrhizierten und mykorrhizierten Pflanzen keine auffälligen Unterschiede bezüglich
der aufgenommenen radioaktiv markierten Substanzen nachweisen.
69

Ergebnisse
dpm/mg Trockensubstanz
10000
1000
100
10
Nadeln
Stamm
Wurzeln
1
3 7 14
14 C-TNT Angebot in Tagen
Abb. 26: 14 C-Verteilung in verschiedenen Bereichen nicht-mykorrhizierter Kiefern nach Angebot
von 0,85 x 10 4 Bq 14 C-TNT (0,501 x 10 6 dpm); die Dotierung erfolgte in einer Ingestad
Nährlösung mit einer Konzentration von 0,75 mg 14 C-TNT/l; abgebildet sind Median,
Maximal- und Minimalwert (n = 3).
dpm/mg Trockensubstanz
10000
1000
100
10
Nadeln
Stamm
nicht-mykorrhizierte Wurzeln
mykorrhizierte Wurzeln
1
3 7 14
14 C-TNT Angebot in Tagen
Abb. 27: 14 C-Verteilung in verschiedenen Bereichen mykorrhizierter Kiefern nach Angebot
von 0,85 x 10 4 Bq 14 C-TNT (0,501 x 10 6 dpm); die Dotierung erfolgte in einer Ingestad Nährlösung
mit einer Konzentration von 0,75 mg 14 C-TNT/l; abgebildet sind Median, Maximalund
Minimalwert (n = 3).
70

Ergebnisse
dpm/mg Trockensubstanz
1000000
100000
10000
1000
100
Nadeln
Stamm
Wurzeln
10
1
3 7 14
14 C-TNT Angebot in Tagen
Abb. 28: 14 C Verteilung in verschiedenen Bereichen nicht-mykorrhizierter Kiefern nach Angebot
von 17 x 10 4 Bq 14 C-TNT (10,2 x 10 6 dpm); die Dotierung erfolgte in einer Ingestad
Nährlösung mit einer Konzentration von 15 mg 14 C-TNT/l; abgebildet sind Median, Maximal-
und Minimalwert (n = 3).
dpm/mg Trockensubstanz
1000000
100000
10000
1000
100
Nadeln
Stamm
nicht-mykorrhizierte Wurzeln
mykorrhizierte Wurzeln
10
1
3 7 14
14 C-TNT Angebot in Tagen
Abb. 29: 14 C Verteilung in verschiedenen Bereichen mykorrhizierter Kiefern nach Angebot
von 17 x 10 4 Bq 14 C-TNT (10,2 x 10 6 dpm); die Dotierung erfolgte in einer Ingestad Nährlösung
mit einer Konzentration von 15 mg 14 C-TNT/l; abgebildet sind Median, Maximal- und
Minimalwert (n = 3).
71

Ergebnisse
In den Aliquots der Wurzelproben ließen sich stets die größeren Mengen an 14 C nachweisen.
Unter Berücksichtigung der mikroautoradiographischen Untersuchungsergebnisse muss
allerdings angenommen werden, dass der wesentlich größere Teil der ermittelten
Radioaktivität auf Kontaminationen zurückzuführen ist, die den Wurzeln zum Zeitpunkt der
Probennahme tatsächlich von außen anhafteten. Nur der geringere Teil dürfte demnach von
den Pflanzen aufgenommen worden sein. Eine Tendenz zur Akkumulation der Aktivität in
den Wurzeln mit fortschreitender Versuchsdauer bzw. zunehmender Angebotsdauer ließ sich
nicht feststellen. Allerdings wäre bei insgesamt niedrigen 14 C-Aufnahmeraten in die Wurzeln
eine Überlagerung zeitlich bedingter Anreicherungen durch anteilig größere Anhaftungen an
den Wurzeloberflächen möglich. Diesbezüglich konnte eine Zunahme der Silberkörner in den
Mikroautoradiographien mit fortschreitender Angebotsdauer jedoch nicht beobachtet werden.
In den Stämmchen blieb die nachweisbare Radioaktivität im gesamten Versuchsverlauf auf
einem sehr niedrigen Niveau konstant. Weder die Angebotsdauer noch eine Erhöhung des
extern applizierten 14 C bewirkten hier eine Zunahme der Aktivität. Eine Verlagerung des von
den Wurzeln aufgenommenen 14 C in den Stamm der Pflanze war also kaum von Bedeutung.
Dies ist insoweit bemerkenswert, da selbst die von den Xylemleitbahnen der Wurzeln
aufgenommenen 14 C-Anteile kaum in die oberirdischen Teile der Pflanzen transportiert
wurden.
Die Nadelfraktion war im Vergleich zu den Wurzel- und Sprossanteilen am geringsten
belastet. Ein nennenswerter Eintransport von markierten Substanzen in die Nadeln konnte im
Allgemeinen in nur ganz niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden. Mit fortlaufender
Versuchsdurchführung nimmt die Radioaktivität hier ab. Dieser Befund könnte auf eine
Veratmung radioaktiver Verbindungen hindeuten.
3.4.3 Bilanzierung
3.4.3.1 Wiederfindung nach Dotierung einer hohen 14 C-TNT-Konzentration
Abgesehen von wenigen Ausnahmen lag die ermittelte Countrate für die Wurzelfraktion
(nicht-mykorrhizierte und mykorrhizierte Wurzeln) zwischen 10 x10 3 und 100 x 10 3 dpm je
mg Trockensubstanz. Die nachweisbare Aktivität für die Stamm- und Nadelfraktion ist
aufgrund der niedrigen Werte bezüglich der Berechnung der aufgenommenen Gesamtaktivität
in der Pflanze kaum von Bedeutung. Wird für eine Bilanzierung eine Aktivität von 30 x 10 3
dpm je mg Wurzelfraktion (TS) angenommen, beträgt die Aktivität für das
Gesamtwurzelwerk einer Pflanze bei einer Wurzeltrockenmasse von 15 mg (ermittelter
Durchschnittswert) insgesamt 450 x 10 3 dpm bzw. 7,5 x 10 3 Bq. Bei einer Dotierung von 10,2
x 10 6 dpm bzw. 17 x 10 4 Bq wurden demzufolge 4,4 % des angebotenen 14 C in der Pflanze
mittels Szintillationszählung wiedergefunden. Unter Berücksichtigung der mikroautoradiographischen
Untersuchungen muss allerdings bedacht werden, dass erhebliche Mengen 14 C
72

Ergebnisse
den geernteten Wurzeln äußerlich anhafteten und nicht von der Pflanze aufgenommen
wurden. Demzufolge dürfte die Wiederfindungsrate für tatsächlich aufgenommenes 14 C
erheblich niedriger sein und unter 1 % liegen.
3.4.3.2 Wiederfindung nach Dotierung einer niedrigen 14 C-TNT-Konzentration
Nennenswerte Mengen Radioaktivität konnten lediglich in der Wurzelfraktion (nichtmykorrhizierte
und mykorrhizierte Wurzeln) detektiert werden. Die Countrate je mg
Wurzeltrockenmasse lag zwischen 0,1 x 10 3 und 1 x 10 3 dpm. Für das Gesamtwurzelwerk
einer Pflanze mit einer durchschnittlichen Wurzeltrockenmasse von 15 mg (ermittelter Wert)
und einer angenommenen Aktivität von 0,6 x 10 3 dpm je mg Trockensubstanz lässt sich somit
eine Gesamtaktivität von 9x10 3 dpm bzw. 0,15 x 10 3 Bq errechnen. Dotiert wurden 0,501 x
10 6 dpm bzw. 0,85 x 10 4 Bq. Demnach konnten 1,8 % des angebotenen 14 C in den
Wurzelproben wieder gefunden werden. Nach Abzug der Radioaktivität, die den Wurzeln von
außen anhaftete, dürfte die tatsächliche Wiederfindungsrate für aufgenommenes 14 C weit
unter 1 % liegen.
3.4.3.3 Verbleibende Radioaktivität in Kohlepapier und Düngelösung
Nach erfolgter Ernte der Pflanzen wurden die Kohlepapierscheiben und die nicht
aufgenommenen Reste der Düngelösung aus den Rhizotronen entfernt und auf ihre
Radioaktivität untersucht. Hierbei ließen sich zusammengenommen im Mittel etwa 75% der
ursprünglich eingesetzten Radioaktivität wieder finden. Unter Berücksichtigung der von den
Pflanzen aufgenommenen 14 C-Anteile (inklusive Anhaftungen an den Wurzeloberflächen)
lässt sich eine Bilanzlücke von etwa 20% feststellen, die vermutlich größtenteils durch
Anhaftungen an Wänden und Böden der Petrischalen erklärt werden kann.
3.4.4 Zusammenfassung
Allgemein ließ sich nach 14tägiger Applikation nur wenig Radioaktivität in den Pflanzen
nachweisen. Die lokale 14 C-Verteilung war organspezifisch und konzentrierte sich auf die
Wurzeln. Insbesondere die Tracheiden waren hier deutlich markiert. Oberirdische Organe
waren nur gering belastet. Eine Akkumulation in den Geweben mit zunehmender
Angebotsdauer wurde nicht beobachtet. In den Kiefernnadeln als Endpunkt des Transportes
wurden möglicherweise radioaktive Substanzen anteilig veratmet, da dort die ermittelte 14 C-
Menge mit der Zeit abnahm. Ein Mykorrhizaeffekt trat nicht auf.
73

Ergebnisse
3.5 Toxizitätstest mit mykorrhizierten Kiefern in TNT-haltigem Bodensubstrat
Die erfolgreiche Durchführung eines Phytoremediationsverfahren setzt Kenntnisse über den
Einfluss der toxischen Bodenkontaminanten voraus, denen die Pflanzen ausgesetzt werden.
Schädliche Wirkungen sind in der Regel mit einer Verminderung der Vitalität verbunden und
setzen die Effizienz der Pflanzen bei der Sanierung herab. Oft sind Toleranzspielräume
gegenüber Schadstoffgehalten im Boden gegeben. Allerdings müssen Resistenzverhalten und
Regenerationsfähigkeit ermittelt werden um herauszufinden, bis zu welchen Kontaminationsgraden
Phytoremediation möglich ist. Unter diesem Aspekt wurden in einem Toxizitätstest
mykorrhizierte Kiefernsämlinge auf einem TNT-belasteten Standardboden kultiviert und die
Pflanzen auf ihre Vitalität und Entwicklung geprüft. Die genaue Versuchsbeschreibung ist im
Methodenteil in Kapitel 2.2.4 zu finden. Als Maß für die Toxizität wurde in erster Linie der
Effekt von Nitroaromaten auf die Biomasseentwicklung berücksichtigt. Weitere Größen zur
Bewertung der Phytotoxizität waren die Entwicklung des Mykorrhizierungsgrades der
Pflanzen sowie das Auftreten morphologischer Veränderungen an Nadeln und Wurzeln.
Die inhomogene Verteilung von TNT in Standortböden würde Rückschlüsse auf den
Zusammenhang zwischen Belastungsgrad des Bodens und Vitalität der Pflanzen kaum
zulassen. Aus diesem Grund wurde ein Standardboden gleichmäßig in drei unterschiedlichen
Belastungskategorien mit TNT angereichert.
niedrig belastet
mäßig belastet
hoch belastet
3 mg TNT/ kg Trockenboden
300 mg TNT/ kg Trockenboden
3000 mg TNT/ kg Trockenboden
3.5.1 Wiederfindung der TNT-Kontamination
Etwa 24 Stunden nach der Dotierung des Bodens mit dem TNT wurden vor der Bepflanzung
der Rhizotrone Bodenproben zur Überprüfung der Kontamination entnommen. Abgesehen
von der Erfassung der Wiederfindungsraten, sollte zusätzlich kontrolliert werden, ob eine
gleichmäßige Verteilung der TNT-Kontamination im Boden vorlag. In Tabelle 18 sind die
ermittelten Messwerte für die jeweiligen Dotierungsklassen dargestellt. Auffällig sind die
deutlichen Verluste an TNT in den Dotierungsklassen 300 mg /kg und 3000 mg/kg Boden.
Durch Extraktion konnten hier lediglich 73% der Ausgangsmengen wieder gefunden werden.
ADNTs ließen sich nicht nachweisen und gehörten zum Zeitpunkt der Bepflanzung der
Rhizotrone somit noch nicht zum Schadstoffspektrum des Bodens. Die geringen Standard-
74

Ergebnisse
abweichungen innerhalb der einzelnen Dotierungsklassen belegen eine gleichmäßige
Schadstoffverteilung im Boden.
Tabelle 18: Wiederfindungsraten für TNT nach Dotierung unmittelbar vor Bepflanzung des
Standardbodens
Dotierungsklasse
Wiederfindung TNT
in mg/kg TB (nach 24 h)
Wiederfindung in %
(nach 24 h)
3 mg TNT/kg TB 3,41 (± 0,12) 113,33
300 mg TNT/kg TB 219,63 (± 8,61) 73,20
3000 mg TNT/kg TB 2198,47 (± 127,75) 73,29
Mw = Mittelwert aus n = 5 Proben; Standardabweichung in Klammern angegeben; TB = Trockenboden
3.5.2 Ermittlung der Nitroaromatengehalte im Boden und in der Bodenlösung
In den Experimentalvarianten unterlag das TNT im Boden einer erheblichen Abbaudynamik.
Die dabei entstandenen Metaboliten wurden größtenteils entweder weiter transformiert oder
in verschiedener Weise an Bodenbestandteile gebunden. Um den Abreicherungsverlauf des
TNT bzw. den tatsächlichen Schadstoffgehalt im Boden über den gesamten Versuchsverlauf
zeitlich nachvollziehen zu können, war eine regelmäßige Beprobung der Rhizotrone deshalb
unabdingbar. Von entscheidender Bedeutung für die Bioverfügbarkeit war allerdings nicht
das im Boden partikulär vorliegende TNT, sondern der im Bodenwasser gelöste
Schadstoffanteil, weshalb parallel zur Bestimmung der Gehalte im Trockenboden auch die
Nitroaromaten-konzentrationen in der Bodenlösung während der gesamten Versuchsdauer
gemessen wurden.
Die Entwicklung der Nitroaromatengehalte im Boden und in der Bodenlösung stellte sich
folgendermaßen dar:
Dotierung von 3 mg TNT/kg Boden
Etwa 24 Stunden nach Dotierung und anschließender Homogenisierung des Bodens wurden
Proben für die Nitroaromatenextraktion entnommen und auf ihren Schadstoffgehalt analysiert.
Die Wiederfindung lag mit 3mg TNT/kg Boden bei 100% (Abbildung 30). Weitere
Nitroaromaten wurden zu diesem Zeitpunkt nicht gefunden. Bereits nach zwei Wochen war
der Schadstoffgehalt deutlich zurückgegangen und pendelte sich im weiteren Versuchsverlauf
75

Ergebnisse
auf Werte zwischen 0,2 und 0,6 mg/kg Trockenboden ein. Das TNT war hierbei als
Kontaminant nur noch von untergeordneter Bedeutung. Es überwogen nun die erstmalig
nachgewiesenen ADNTs. Aufgrund der niedrigen Dotierung des Bodens blieb die erstmalig
nach vierzehn Tagen ermittelte Nitroaromatenkonzentration in der Bodenlösung unter 0,01
mg/l, wobei sich die ADNTs wiederum als Hauptkontaminanten erwiesen. Nach 12 Wochen
konnten im Bodenwasser keine gelösten Nitroaromaten mehr detektiert werden.
Nitroaromaten in mg/kg Boden
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
2A-DNT
4A-DNT
TNT
2-ADNT gelöst
4-ADNT gelöst
TNT gelöst
Nitroaromaten gelöst (gesamt)
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
Nitroaromaten in mg/l Bodenlösung
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 30: Nitroaromatengehalte im Bodensubstrat und in der Bodenlösung bei einer
Dotierung von 3 mg TNT/kg Standardboden im Zeitverlauf; dargestellt sind die Mittelwerte;
die Anzahl der ausgewerteten Proben und die jeweiligen Standardabweichungen sind in den
Tabellen 5 und 19 aufgeführt.
76

Ergebnisse
Dotierung von 300 mg TNT/kg Boden
Bei der Homogenitätskontrolle wurden lediglich 70% der Originalbelastung wieder gefunden.
Die tatsächliche Startbelastung lag für die Pflanzen somit bei etwa 220 mg TNT/kg
Trockenboden (Abbildung 31). Die Eliminierung des Schadstoffes ging im weiteren
Versuchsverlauf zügig vonstatten. Nach zwei Wochen wurden nur noch knapp 20% (50
mg/kg) der dotierten Menge TNT im Boden detektiert. Die weitere Beprobung erbrachte nur
noch geringe Mengen der ursprünglichen Kontamination. Die Belastung mit 2-ADNT und 4-
ADNT blieb relativ konstant und lag zwischen der zweiten und zwölften Woche für beide
Kontaminanten zusammen bei etwa 30 mg/kg. Analog zur Schadstoffabnahme im Boden
entwickelte sich der Nitroaromatengehalt der Bodenlösung. Fanden sich in den ersten
Wochen noch etwa 10 mg TNT/ml Bodenlösung, so war dieser Kontaminant nach acht
Wochen praktisch nicht mehr nachweisbar. Auch für die ADNTs ging der Wert insgesamt
nicht über 6 mg/l hinaus.
Nitroaromaten in mg/kg Boden
300
250
200
150
100
50
2A-DNT
4A-DNT
TNT
2-ADNT gelöst
4-ADNT gelöst
TNT gelöst
Nitroaromaten gelöst (gesamt)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
Nitroaromaten in mg/l Bodenlösung
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 31: Nitroaromatengehalte im Bodensubstrat und in der Bodenlösung bei einer
Dotierung von 300 mg TNT/kg Standardboden im Zeitverlauf; dargestellt sind die
Mittelwerte; die Anzahl der ausgewerteten Proben und die jeweiligen Standardabweichungen
sind in den Tabellen 5 und 19 aufgeführt.
77

Ergebnisse
Dotierung von 3000 mg TNT/kg Boden
Auch in diesem hoch belasteten Ansatz ließen sich von den ursprünglich dotierten 3000 mg
TNT/kg Trockenboden bei der Homogenitätskontrolle nur noch ca. 70% wieder finden
(Abbildung 32). Allerdings blieb das TNT aufgrund der hohen Ausgangsdotierung über den
gesamten Versuchsverlauf der dominierende Schadstoff in sehr hoher Konzentration. Nach
zwölf Wochen konnten noch 1600 mg/kg TNT im Boden nachgewiesen werden. ADNTs
wurden wiederum erst nach zwei Wochen gefunden. Zusammen erreichten die beiden
Kontaminanten während des Experiments Konzentrationen zwischen 50-60 mg/kg. Die TNT-
Konzentration in der Bodenlösung blieb während des gesamten Versuchsverlaufs
entsprechend der starken Belastung im Boden sehr hoch und fiel nicht unter 70 mg/l. Die
Werte für die ADNT-Konzentrationen insgesamt schwankten zwischen 10 und 17 mg/l
Bodenlösung.
Nitroaromaten in mg/kg Boden
2500
2000
1500
1000
500
TNT 4A-DNT
2A-DNT
Nitroaromaten gelöst (gesamt)
TNT gelöst
4-ADNT gelöst
2-ADNT gelöst
160
140
120
100
80
60
40
20
Nitroaromaten in mg/l Bodenlösung
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 32: Nitroaromatengehalte im Bodensubstrat und in der Bodenlösung bei einer
Dotierung von 3000 mg TNT/kg Standardboden im Zeitverlauf; dargestellt sind die
Mittelwerte; die An-zahl der ausgewerteten Proben und die jeweiligen Standardabweichungen
sind in den Tabellen 5 und 19 aufgeführt.
78

Ergebnisse
Tab. 19: Parallel ermittelte Nitroaromatengehalte im Bodensubstrat und in den Bodenlösungen
der jeweiligen Dotierungsstufen
Dt. Nitroaromatenkonz. im Bodensubstrat Nitroaromatenkonz. in der Bodenlsg
t TNT 4-ADNT 2-ADNT TNT 4-ADNT 2-ADNT
0 3,41 (± 0,12) − − − − −
3 2 0,05 (± 0,01) 0,35 (± 0,05) 0,21 (± 0,04) 0,00 (± 0,00) 0,02 (± 0,00) 0,01 (± 0,00)
4 0,172 (± 0,09) 0,27 (± 0,04) 0,17 (± 0,03) 0,02 (± 0,02) 0,03 (± 0,02) 0,02 (± 0,01)
mg 8 0,07 (± 0,02) 0,13 (± 0,06) 0,04 (± 0,02) 0,00 (± 0,00) 0,01 (± 0,00) 0,03 (± 0,03)
12 0,06 (± 0,03) 0,13 (± 0,07) 0,10 (± 0,05) 0,00 (± 0,00) 0,00 (± 0,00) 0,00 (± 0,00)
0 219,60 (± 8,61) − − − − −
300 2 51,40 (± 9,34) 16,43 (± 0,73) 12,44 (± 0,60) 10,63 (± 3,28) 3,28 (± 0,18) 2,39 (± 0,14)
4 12,49 (± 4,21) 18,26 (± 0,63) 15,40 (± 0,50) 1,85 (± 0,83) 3,14 (± 0,20) 2,73 (± 0,17)
mg 8 1,10 (± 0,33) 12,83 (± 1,09) 14,68 (± 1,39) 0,08 (± 0,12) 1,54 (± 0,54) 1,38 (± 0,47)
12 4,07 (± 6,44) 13,22 (± 1,19) 13,64 (± 0,86) 0,00 (± 0,00) 1,92 (± 0,24) 2,00 (± 0,28)
0 2198,4 (± 127,7) − − − − −
3000 2 2048,6 (± 163,5) 20,78 (± 4,05) 14,76 (± 2,38) 77,54 (± 10,3) 8,16 (± 14,40) 3,31 (± 0,61)
4 1904,4 (± 128,9) 29,29 (± 2,44) 21,18 (± 2,35) 70,08 (± 6,48) 5,47 (± 0,33) 4,71 (± 0,28)
mg 8 1702,8 (± 132,3) 29,22 (± 1,60) 26,43 (± 1,87) 66,86 (± 23,1) 6,67 (± 2,24) 5,96 (± 2,00)
12 1610,9 (± 193,8) 24,06 (± 1,69) 26,28 (± 1,72) 58,19 (± 3,08) 8,51 (± 0,74) 7,71 (± 0,44)
Angegeben sind die Mittelwerte in mg/kg Trockenboden und in mg/l Bodenlösung; Standardabweichungen in
Klammern (±); t = Probennahme nach Wochen, t 0 = Startbeprobung; Dt. = Dotierungsstufe mg TNT/kg (TB)
3.5.3 Ermittlung des Pflanzenwachstums in den Dotierungskategorien
Im vorangegangenen Abschnitt wurde deutlich, welcher Abbau- und
Transformationsdynamik Nitroaromaten im Boden und in der Bodenlösung unterliegen
können. Unter Berücksichtigung der bioverfügbaren Schadstoffkonzentrationen, womit die in
der Bodenlösung befindlichen Nitroaromaten gemeint sind, sollte nun die Sensibilität
mykorrhizierter Pinus sylvestris Sämlinge gegenüber TNT und dessen Metaboliten untersucht
werden. Die Entwicklung der pflanzlichen Biomasse, der Mykorrhizierungsgrad, das
Sprosswachstum sowie morphologische Abweichungen an Nadeln und Wurzeln im Vergleich
zu den Kontroll-pflanzen dienten als Parameter für die Phytotoxizität dieses Schadstoffes.
79

Ergebnisse
3.5.3.1 Gesamtüberblick
Einen Gesamtüberblick über die Entwicklung der Frischgewichte der Pflanzen in den
einzelnen Versuchsvarianten mit entsprechender Dotierung der Böden geben die Abbildungen
33-35. Die wichtigsten Ergebnisse für die einzelnen Versuchsansätze lassen sich wie folgt
beschreiben:
Eine Dotierung von 3 mg TNT/kg Trockenboden hatte keinen negativen Einfluss auf die
Entwicklung des Frischgewichtes der Pflanzen. Ganz im Gegenteil könnte eine solch niedrige
TNT-Gabe das Wachstum der Pflanzen gefördert haben, da in dieser Variante letztendlich die
höchsten Zuwächse beobachtet wurden. Denkbar wäre eine Erhöhung der N-Bioverfügbarkeit
durch Transformation der TNT-Moleküle, so dass ein Düngeeffekt auftrat. Allerdings war der
Unterschied im Pflanzenwachstum gegenüber den Kontrollen nicht signifikant.
2,5
0 mg TNT/kg
Frischgewicht in Gramm
2
1,5
1
3mg TNT/kg
300 mg TNT/kg
3000 mg TNT/kg
0,5
0
0 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
Abb. 33: Frischgewichte der mykorrhizierten Kiefern im Zeitverlauf; Kultivierung in Standardboden
unterschiedlicher Dotierungsstufen.
80

Ergebnisse
Abb. 34: Spross- und Wurzelwachstum nach 12 Wochen Versuchsdauer;
Dotierungsstufen von l. n. r, in mg TNT/kg Standardboden: 3000, 300, 3 und
unbelastete Kontrollvariante.
Eine Dotierung von 300 mg TNT hemmte das Pflanzenwachstum. Reduziert waren sowohl
Spross- als auch Wurzelwachstum. Mit zunehmender Versuchsdauer erholten sich die
Pflanzen und legten an Biomasse zu. Die verlangsamte Gewichtszunahme machte sich
allerdings erst nach acht Wochen in einem signifikanten Unterschied gegenüber der
Kontrollvariante und der Variante mit 3 mg TNT/kg Boden bemerkbar. Eine hohe TNT-
Belastung (Dotierung 3000 mg/kg Trockenboden) hemmte das Wachstum der Pflanzen
vollständig. Ein Biomassezuwachs konnte somit nicht beobachtet werden. Signifikant waren
die Unterschiede gegenüber der Kontrolle nach 4 Wochen und gegenüber den übrigen
Varianten nach 8 Wochen.
81

Ergebnisse
1,4
Frischgewicht in Gramm
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0 mg/kg TNT Sproß
0 mg/kg TNT Wurzel
3 mg/kg TNT Sproß
3 mg/kg TNT Wurzel
300 mg/kg TNT Sproß
300 mg/kg TNT Wurzel
3000 mg/kg TNT Sproß
3000 mg/kg TNT
Wurzel
0,2
0
4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
Abb. 35: Frischgewichte der mykorrhizierten Kiefern im Zeitverlauf, getrennt in Wurzel- und
Sprossfraktion; Kultivierung in Standardboden unterschiedlicher Dotierungsstufen.
3.5.3.2 Pflanzenwachstum in Bezug zur Nitroaromatenkonzentration in der Bodenlösung
Phytotoxische Wirkungen von TNT und ADNTs auf krautige Pflanzen wurden bereits
mehrfach nachgewiesen (Peterson et al. 1998, Palazzo & Legget, 1986). Auch die zu den
Gehölzen zählende Kiefer (Pinus sylvestris) reagierte empfindlich auf diese Kontaminanten
(s. o.). Aufgrund der enormen Abbaudynamik in Boden und Bodenlösung war der
Kontaminationsgrad für die nachgewiesenen Nitroaromaten TNT, 4-ADNT und 2-ADNT
fließend. Eine Beurteilung, inwieweit welcher Schadstoff im Einzelnen als Verursacher der
beobachteten Schäden in Frage kommt war deshalb schwierig. Die im Boden und in der
Bodenlösung nachgewiesenen Nitroaromaten wurden aus diesem Grunde bei der sich
anschließenden Beschreibung zusammengefasst. Für den unbelasteten Kontrollansatz ist die
Biomasseproduktion der Pflanzen den Abbildungen 33 und 35 zu entnehmen. Ansonsten
stellen sich die Ergebnisse für die übrigen Varianten wie folgt dar:
82

Ergebnisse
Dotierung von 3 mg TNT/kg Boden
Aufgrund der niedrigen Dotierung von 3mg TNT/kg Trockenboden blieb die Nitroaromatenbelastung
in der Bodenlösung mit Werten unter 1mg/l im Versuchszeitraum
insgesamt sehr niedrig (Abbildung 36). Nach zwölf Wochen konnten keine Belastungen mehr
nachgewiesen werden. Die Schadstoffkonzentrationen reichten nicht aus, um die
Biomasseproduktion der Pflanzen in diesem Ansatz zu beeinträchtigen, wie ein Vergleich mit
den Kontrollpflanzen zeigte (Abbildung 33). Das Wachstum der Sämlinge war gegenüber den
Kontrollpflanzen weder reduziert noch zeitlich verzögert. Auffällige Veränderungen oder
Schäden an Nadeln, Wurzeln und Hyphenmänteln traten nicht auf. Die Herausbildung und
Etablierung neuer Mykorrhizen an den jungen Kurzwurzeln wurde nicht beeinträchtigt
(Tabelle 20).
Nitroaromatenkonz. in mg/l Bodenlösung
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
2-ADNT
4-ADNT
TNT
Pflanzengewicht
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
Pflanzengewicht in Gramm (TS)
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 36: Entwicklung der Frischgewichte mykorrhizierter Kiefern in Abhängigkeit zu den
nachweisbaren Nitroaromatengehalten in der Bodenlösung bei einer Dotierung von 3 mg
TNT/kg Standardboden. Der Nitroaromatengehalt in der Bodenlösung wurde erstmalig nach 2
Wochen Versuchsdauer ermittelt. Die Entwicklung der Frischgewichte der Kontrollpflanzen
ist den Abbildungen 33 u.35 zu entnehmen.
83

Ergebnisse
Dotierung von 300 mg TNT/kg Boden
Eine Nitroaromatenkonzentration um 16 mg/l Bodenlösung wirkte sich noch hemmend auf
die Biomasseentwicklung der Pflanzen aus, wobei die zeitgleiche Belastung der
entsprechenden Kontaminanten im Boden bei etwa 80 mg/kg lag. Der Beginn des Wachstums
war zeitlich verzögert und die Gewichtszunahme verlangsamt (Abbildung 37).
Morphologische Schädigungen traten allerdings wenig in Erscheinung. Nur vereinzelt kam es
zu Braunfärbungen an den Nadelspitzen. Wurzeln und Hyphenmäntel des Mykobionten
zeigten keine auffälligen Veränderungen, die auf Schädigungen zurückzuführen waren. Neue
Kurzwurzeln differenzierten sich anfangs jedoch nicht aus, weshalb aufgrund fehlender
Neuetablierungen zu Beginn keine Steigerung der Mykorrhizierungrate zu beobachten war.
Erst bei einem Rückgang der Nitroaromatenkonzentration unter 10 mg/l Bodenlösung (4.
Woche), das entsprach einer Bodensubstratkonzentration von etwa 50 mg/kg Nitroaromaten,
erholten sich die Kiefern sichtbar. Die Pflanzen reagierten nun mit einer verstärkten
Biomasseproduktion. Es differenzierten sich zahlreiche neue Nadeln und Wurzeln aus.
Einhergehend mit der Ausbildung neuer Kurzwurzeln war parallel eine zunehmende
Mykorrhizierung der jungen Wurzeln durch den Mykobionten zu beobachten. Dieser Trend
verstärkte sich im weiteren Versuchsverlauf.
Die Ergebnisse zeigten, dass mäßige Kontaminationsgrade mit Nitroaromaten phytotoxisch
wirken. Belastungswerte zwischen 10 und 15 mg/l Bodenlösung (50 bis 100 mg/kg
Bodensubstrat) verminderten das Wachstum der Pflanzen und verursachten leichte Schäden
an den Nadeln, hatten jedoch keine letale Wirkung. Möglicherweise können auch höhere
Schadstoffgehalte toleriert werden. Die Pflanzen behielten ihr Regenerationsvermögen und
zeigten sich mit abnehmender Nitroaromatenbelastung schnell erholt. Schwierig ist die
Bewertung eines möglichen phytotoxischen Effektes auf den Pilzsymbionten. So könnte die
herabgesetzte Mykorrhizierungsrate in einer verminderten Seitenwurzelbildung und nicht in
einer Schwächung des Mykorrhizapilzes begründet liegen.
84

Ergebnisse
Nitroaromatenkonz. in mg/l Bodenlösung
40
35
30
25
20
15
10
5
2-ADNT
4-ADNT
TNT
Pflanzengewicht
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
Pflanzengewicht in Gramm (TS)
0
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 37: Entwicklung der Frischgewichte mykorrhizierter Kiefern in Abhängigkeit zu den
nachweisbaren Nitroaromatengehalten in der Bodenlösung bei einer Dotierung von 300 mg
TNT/kg Standardboden. Der Nitroaromatengehalt in der Bodenlösung wurde erstmalig nach 2
Wochen Versuchsdauer ermittelt. Die Entwicklung der Frischgewichte der Kontrollpflanzen
ist den Abbildungen 33 u. 35 zu entnehmen.
Dotierung von 3000 mg TNT/kg Boden
Als Folge der anhaltend hohen Nitroaromatenbelastung in der Bodenlösung, auch nach zwölf
Wochen lag die Konzentration noch über 70 mg/l, war eine Zunahme der Biomasse bei den
Pflanzen nicht festzustellen (Abbildung 38). Die Kiefern wurden in ihrem Wachstum völlig
gehemmt. Die Ausdifferenzierung neuer Nadeln und Wurzeln konnte an keiner der Pflanzen
während des Experiments beobachtet werden. Ausgehend von den Spitzen, vertrockneten
zahlreiche Nadeln bis zum Versuchsende vollständig. Die Bildung neuer Wurzeln blieb aus.
Bereits vorhandene Wurzeln färbten sich schwarz (Abbildung 39). Leichte Gewichtsverluste,
die sich in der zweiten Versuchshälfte einstellten, lassen sich durch vertrocknete Nadeln und
durch Auflösungserscheinungen an den inzwischen abgestorbenen Wurzeln erklären.
Bestehende Mykorrhizen verloren ihre Vitalität. Die Hyphenmäntel verfärbten sich grau bis
schwarz. Der Pilzsymbiont starb zeitgleich mit den Wurzeln ab.
85

Ergebnisse
Nitroaromatenkonz. in mg/l Bodenlösung
120
110
100
90
80
70
60
50
40
2-ADNT
4-ADNT
TNT
Pflanzengewicht
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
Pflanzengewicht in Gramm (TS)
30
0 2 4 8 12
Versuchsdauer in Wochen
0
Abb. 38: Entwicklung der Frischgewichte mykorrhizierter Kiefern in Abhängigkeit zu den
nachweisbaren Nitroaromatengehalten in der Bodenlösung bei einer Dotierung von 3000 mg
TNT/kg Standardboden. Der Nitroaromatengehalt in der Bodenlösung wurde erstmalig nach 2
Wochen Versuchsdauer ermittelt. Die Entwicklung der Frischgewichte der Kontrollpflanzen
ist den Abbildungen 33 u. 35 zu entnehmen.
Abb. 39: Wurzelwerk einer mykorrhizierten
Zitterpappel (Populus tremula),
12 Wochen kultiviert in hochbelastetem
Standardboden (3000 mg TNT/kg); mit
Detailvergrößerung. Die Wurzeln waren
braun/ schwarz verfärbt. Die Neubildung
von Kurz- oder Trägerwurzeln blieb aus.
86

Ergebnisse
Tabelle 20: Ermittelte Mykorrhizierung der Kiefernfeinwurzeln; keine
Mykorrhizaneubildung bei hohem Belastungsniveau, bereits vorhandene Mykorrhizen starben
mit zunehmender Versuchsdauer ab.
Mykorrhizierungsgrad in den einzelnen Dotierungsstufen
t Kontrolle 3 mg TNT/kg TB 300 mg TNT/kg TB 3000 mg TNT/kg TB
Start
n = 15
4
n = 5
8
n = 5
12
n = 5
31 % 34 % 25 % 25 %
70 % 70 % 25 % 25%
70 % 64 % 29 %
56 % 66 % 51 %
25%
keine neuen Kurzw.
25%
keine neuen Kurzw.
Mittelwert aus n Proben; t = Zeitpunkt der Untersuchung nach Versuchswochen; TB = Trockenboden
3.5.4 Zusammenfassung
Bei einer Nitroaromatenkonzentration von etwa 50 mg/kg Boden wurde das Wachstum der
mykorrhizierten Kiefern gehemmt. Außerdem setzten erste beobachtbare morphologische
Schädigungen an den Pflanzen ein. Hohe Nitroaromatenkonzentrationen über 1600 mg /kg
Boden reduzierten das Wachstum vollständig und verursachten erhebliche Schäden an
Nadeln, Wurzeln und Hyphenmänteln der Mykorrhiza. Bei niedriger TNT-Gabe von 3 mg/kg
Boden wurde möglicherweise ein Düngeeffekt erzielt.
87

Diskussion
4. Diskussion
Die nun folgende Diskussion ist in vier wesentliche Abschnitte untergliedert. Neben den
Wechselwirkungen und Bindungen von Nitroaromaten mit Bestandteilen der Bodenmatrix
sollen in einem zweiten Abschnitt unter Berücksichtigung der eingesetzten
Experimentvarianten mikrobielle Aspekte und die Funktion mykorrhizierter Pflanzen beim
Nitroaromatenabbau näher beleuchtet werden. In einem weiteren Kapitel wird über das
Aufnahme-, Akkumulations- und Abbauverhalten von Nitroaromaten in Pflanzen diskutiert.
Im vierten Abschnitt wird das Toleranzverhalten mykorrhizierter Kiefern gegenüber
Nitroaromaten bewertet.
Im Anschluss an die Diskussion sollen die im Rahmen dieser Arbeit erzielten
Laborergebnisse mit den Ergebnissen eines maßstabsgerecht erprobten in situ-
Phytoremediationsverfahren zur Sanierung TNT-kontaminierter Böden am Standort ‘Werk
Tanne’ verglichen und das Phytoremediationspotenzial mykorrhizierter Gehölze beim Abbau
von TNT und dessen Metaboliten diskutiert werden.
4.1 Wechselwirkungen zwischen Nitroaromaten und Bodenmatrix
Aromatische Verbindungen wie das TNT und dessen Transformationsprodukte können auf
unterschiedliche Weise mit den Bestandteilen des Bodens in Wechselwirkung treten. Dabei
kann es zu reversiblen oder irreversiblen Bindungen mit der Bodenmatrix kommen. Als
Hauptadsorbentien des Bodens gelten die Tonmineralien, die organische Bodenfraktion sowie
die Ton- Humuskomplexe. Bei den Bindungsmechanismen unterscheidet man zwischen
Physisorption, (Van der Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen und Ionenbindungen)
und Chemiesorption (kovalente Bindungen). Allgemein wird die Art der Bindungsweise von
der chemischen Struktur der Verbindungen, der Beschaffenheit der Bodenstrukturen, von den
Umweltbedingungen und gegebenenfalls von den Inkubationsbedingungen bestimmt (Lenke
2001).
4.1.1 Adsorption an Tonmineralien
Tonmineralien bestehen aus Aggregaten kleinster anorganischer Partikel, den mit einer
negativen Oberflächenladung versehenen Tonplättchen. Die Tonplättchen werden durch einen
Belag von Kationen, z. B. Ca 2+ , zusammengehalten und bilden dadurch Feinporen. Aufgrund
ihrer negativen Oberflächenladung fungieren die Tonplättchen als Kationenaustauscher.
Adsorbierte Kationen können durch gleichsinnig geladene Ionen aus der Bodenlösung
ausgetauscht werden. Generell verlaufen die Austauschvorgänge schnell und sind in der
Regel reversibel (Gisi et al. 1990). Organische Kationen mit aromatischen Ringsystemen
werden besonders stark gebunden (Martinetz & Rippen 1996). Die Adsorption verschiedener
88

Diskussion
Nitroaromaten erfolgt größtenteils an der Oberfläche der Tonmineralien. Dabei nimmt die
Affinität und das Adsorptionsvermögen verschiedener Tonmineralien gegenüber
Nitroaromaten in der Reihenfolge Kaolinit < Illit < Montmorillinit zu (Haderlein et al. 1996).
Der Sorptionsprozess verläuft sehr schnell innerhalb weniger Minuten. Allerdings sind die
Substanzen einem weiteren biologischen Abbau nicht dauerhaft entzogen, da die Bindung
überwiegend von kurzer Dauer und reversibel bleibt. Bei einer länger andauernden Bindung
können die Kationen allerdings in die Tonoberfläche hinein diffundieren, was eine sehr starke
und nahezu irreversible Adsorption zur Folge hat (Martinetz & Rippen 1996). Vor allem für
das TNT und dessen unmittelbaren Transformationsprodukte 4-ADNT und 2-ADNT konnte
eine vollständig reversible Bindung an Montmorillonit nachgewiesen werden, während die
Sorption von 2,4-DANT, welches aufgrund seiner basischen Aminogruppen und seiner
höheren Polarität stärker an die negative Oberfläche der Tonmineralien adsorbiert, nur zum
Teil reversibel blieb (Daun et al. 1998). Von weitaus geringerer Bedeutung ist vermutlich die
Einlagerung von Nitroaromaten in die Feinporen der Tonmineralien, da die Oberflächen
primär schneller als Kontaktzone erreichbar sind und dort eine Adsorption dann in der Regel
schnell vonstatten geht (Haderlein et al. 1996).
4.1.2 Wechselwirkung mit Huminstoffen
Die organischen Huminstoffe spielen bei den Wechselwirkungen zwischen Nitroaromaten
und Bodenmatrix vermutlich eine weitaus bedeutendere Rolle als die anorganischen
Tonmineralien. Chemisch sind Huminstoffe schwierig zu charakterisieren. Sie sind ein
Gemisch hochmolekularer Substanzen mit vielfältigen Strukturen und sind überwiegend aus
aromatischen Bestandteilen (als Grundgerüst von Lignin) zusammengesetzt. Ein Abbau ist
schwierig und erfolgt sehr langsam. Unterteilt werden die Huminstoffe in Humin,
Fulvinsäuren und Huminsäuren. Als Bindungsstellen für aromatische Amine werden u. a.
Chinone und Carbonylstrukturen diskutiert (Thorn et al. 1996). Allgemein sind die
Wechselwirkungen zwischen Niroaromaten und den organischen Bodenbestandteilen bisher
wenig untersucht. Einerseits wäre theoretisch eine reversible Sorption von TNT und seinen
Metaboliten an die Huminstoffmatrix denkbar. Andererseits findet ein mikrobieller Einbau
der Kontaminanten in die Huminstoffe statt (Martinetz & Rippen 1996). Die letztere
Möglichkeit sollte als dominierend angesehen werden, wobei die Schadstoffe mit
zunehmender Reduktion der Nitrogruppen durch Chemisorption irreversibel binden. Elovitz
et al. (1999) stellten fest, dass unter aeroben Verhältnissen 2,4-DANT irreversibel in
Sedimenten gebunden wurde, während dieses für TNT und 4-ADNT nicht zutraf.
89

Diskussion
4.1.3 Reduktive TNT-Transformation in den Experimenten und Wechselwirkungen mit
Bodenbestandteilen
In allen Experimenten war allgemein ein deutlicher Rückgang der originalen TNT-Belastung
festzustellen. Die Menge des durch methanolische Extraktion aus dem Bodensubstrat
desorbierbaren TNT variierte dabei je nach Versuchsvariante (siehe Abschnitte 3.2 und 3.3).
Über die Transformationswege des TNT im Bodensubstrat und das Bindungsverhalten des
TNT und möglicher Metabolite mit Bodenbestandteilen können nur Vermutungen angestellt
werden. Falls es anteilig zu Wechselwirkungen zwischen TNT und der Bodensubstanz kam,
kann in diesem Fall in der Regel von einer reversiblen Sorption des Schadstoffes an die
Bodenmatrix ausgegangen werden. Prinzipiell bleibt auch die reversibel gebundene Fraktion
einer Umsetzung nicht dauerhaft entzogen. Der weitaus bedeutendere Teil des TNT dürfte
einem schnell einsetzenden und umfassenden Reduktionsprozess zum ADNT ausgesetzt
gewesen sein. Kurzzeitversuche mit Boden als Bakterieninokulum zeigten, dass unter aeroben
und anaeroben Bedingungen die Transformation von TNT zu 2- ADNT und 4-ADNT
innerhalb von 24 Stunden abläuft (Pennington & Pattrick 1990). In den hier durchgeführten
Experimenten akkumulierten die ADNT-Gehalte in einigen Versuchsvarianten, und hier
insbesondere in den Kontrollvarianten, zum Teil erheblich. Im Pappelexperiment hat sich die
extrahierbare ADNT-Menge in der Kontrollvariante K letztendlich verdoppelt. Bezogen auf
die umgesetzte TNT-Menge ließen sich nach Versuchsende immerhin noch 42 % als ADNT
wieder finden. Die relativ hohe ADNT-Wiederfindungsrate in der Kontrollvariante zeigte,
dass abgesehen vom TNT auch das ADNT entweder weniger zur Sorption neigte oder, falls
doch, in größeren Mengen nicht fest an die Bodenmatrix gebunden wurde. Ähnliche
Beobachtungen machten bereits Elovitz et al. (1999). Waren die Versuchsvarianten mit
Bäumchen bestückt, ließ sich trotz einer hohen Abnahme der TNT-Konzentration lediglich
ein verhältnismäßig geringer Anstieg der ADNT-Konzentration ermitteln. So wurden in
Variante A nach Versuchsende nur noch 5 % des umgesetzten TNT als ADNT nachgewiesen.
In Anbetracht der relativ geringen bzw. reversiblen Sorptionsneigung von ADNT zur
Bodenmatrix ist demzufolge von einem umfassenden Fortgang der Transformation
auszugehen. Sei es anteilig durch Reduktion einer weiteren Nitrogruppe zu DANT oder über
andere mikrobiell vermittelte Reaktionswege, z. B. durch Oxidationsprozesse zu
verschiedensten anderen nicht identifizierten Verbindungen. Obwohl sich die
Reduktionssequenz bis zum DANT nicht nachweisen ließ, DANT wurde in keiner
Versuchsvariante gefunden, kann davon ausgegangen werden, dass in den Bodenproben
sämtlicher Varianten relevante Mengen DANT gebildet wurden, anschließend schnell und
irreversibel an Bodenbestandteile adsorbierten und sich deshalb nicht extrahieren ließen. Die
Reduktion bis zum DANT unter aeroben Bedingungen ist bereits belegt (Schackmann und
Müller 1991). Das in mäßig belasteten Böden ungebundenes DANT während der
Abbaukinetik unter aeroben Verhältnissen nicht akkumuliert und unter der Nachweisgrenze
90

Diskussion
bleibt, ist nicht ungewöhnlich. Selbst in hochkontaminierten TNT-Böden bleibt die DANT-
Konzentration allgemein niedrig und kurzzeitig nachweisbar. So fanden Achtnich et al.
(2000), wenn auch in einem alternierend anaeroben/ aeroben Prozess, bei einer
Ausgangskonzentration von nahezu 5000 mg TNT kg -1 Boden (TS) maximal zwischen 50 und
60 mg DANT kg -1 Boden, wobei diese Konzentrationen lediglich wenige Tage nach
Inkubationsbeginn gemessen werden konnten und danach sehr schnell abnahmen.
Für eine weitere Reduktion vom DANT zum TAT sind anaerobe Verhältnisse und ein
Redoxpotenzial (E H ) von < -200 mV erforderlich (Lenke et al. 1994 in Martinetz & Rippen
1996). Im aeroben Milieu der jeweiligen Versuchsvarianten dürfte die reduktive Transformation
deshalb auf der Stufe des DANT ihr Ende gefunden haben. TAT wurde in keinem
Fall nachgewiesen.
Neben TNT und ADNT wurden aus den Bodenproben des Pappelexperimentes zusätzlich
geringe Mengen DNT extrahiert und analytisch erfasst. Aufgrund fehlender funktioneller
Gruppen ist generell von einer geringen Bindungsneigung dieser Verbindungen mit
Bodenbestandteilen auszugehen. So beobachteten Pörschmann und Stottmeister (1993) keine
Bindung von 2,6-DNT an in Grundwasser gelöste Huminstoffe. Die aerobe Mineralisierung
des 2,4-DNT durch Bakterien ist inzwischen gut untersucht (Martinetz & Rippen 1996). Die
Ringspaltung wird durch Oxigenasereaktionen unter Bildung verschiedener aromatischer
Zwischenprodukte katalysiert. Auch für 2,6-DNT ließ sich mittlerweile ein oxidativer Abbau
über Dioxygenase-vermittelte Initialreaktionen nachweisen (Nishino et al. 2000b).
4.1.4 Einfluss von Bodenfaktoren auf die Bindungskinetik
Kenntnisse über den Einfluss verschiedener Milieufaktoren im Boden auf die
Bindungskinetik der Nitroaromaten mit Bodenbestandteilen sind bisher stark limitiert. Neben
dem Redox-potenzial sind insbesondere der pH-Wert und der Gehalt organischer
Bodensubstanzen von entscheidender Bedeutung für Bindungsreaktionen. Der optimale pH-
Wert-Bereich für die biologische Aktivität zahlreicher Mikroorganismen liegt zwischen 4 und
7. Entsprechende Bereiche gelten z. B. für die bei vielen Pilzen vorkommenden und beim
mikro-organismenvermittelten Einbau von Xenobiotika wichtigen Enzyme wie Peroxidasen
und Laccasen. In einem für optimale Aktivität geeigneten Bereich befanden sich auch die in
den TNT-Abbau-Experimenten verwendeten Bodensubstrate (siehe Abbildungen 41 und 42
im Anhang). Abgesehen von geringen Schwankungen lag der pH-Wert des Bodens im
Pappelexperiment bei 4,2 und im Kiefernexperiment bei 5,5.
Auch für die physiko-chemischen und in der Regel reversiblen Sorptionsprozesse zwischen
Nitroaromaten und Bodenbestandteilen spielt der pH-Wert eine maßgebliche Rolle. Mit
sinkendem pH-Wert in der Bodenlösung erhöht sich der Anteil protonierter Amine. Folglich
kommt es zu einer zunehmenden Bindung reduzierter Verbindungen an die Bodenmatrix. In
Tabelle 21 sind die pK a -Werte für verschiedene Nitroaromaten dargestellt. Der pK a -Wert gibt
91

Diskussion
als Maß für die Ionisation infolge Protonierung des Amins denjenigen pH-Wert an, bei dem
sich 50 % der in einer Lösung vorhandenen Moleküle in einem ionisierten Zustand befinden.
Tabelle 21: pK a -Werte verschiedener TNT-Metaboliten (aus Martinetz & Rippen 1996;
berechnet nach Harris und Hayes 1990)
4-ADNT 1,21
2,4-DANT 3,47
TAT 5,79
4-A-2-NT 3,67
2,4-DAT 5,52
4-A-2-HA-6-NT 3,28
2,4-DAHAT 5,47
Werden beim TNT die Nitrogruppen zunehmend durch Aminogruppen ersetzt, steigt auch das
Maß der Ionisierung infolge Protonierung der Aminogruppen unter umweltrelevanten
Bedingungen. So hat 2,4-DANT einen pK a -Wert von 3,47, für 2,6-DANT ist er mit 3,37 nur
geringfügig niedriger. Von den in den Experimentvarianten anfallenden TNT-Metaboliten
dürften sich die DANTs daher durch deutlich höhere Bindungseigenschaften ausgezeichnet
haben als vergleichsweise die ADNTs, was sich auch in ihrer Nachweisbarkeit ausdrückte.
Für 2,6-DANT liegen Untersuchungen über das Bindungsverhalten bei verschiedenen pH-
Werten vor. In Abhängigkeit von der Huminsäurekonzentration in einer Testlösung wurde bei
einem pH-Wert von 4,6 eine um bis zu 25 % höhere Bindung an Huminsäure beobachtet, als
bei pH 6,8 (Li et al. 1997).
Unter dem Aspekt, dass zum einen der mikrobiell vermittelte Einbau reduzierter
Nitroaromaten bevorzugt bei niedrigen pH-Werten abläuft (niedriger pH-Wert erhöht ja auch
Anteil protonierter Amine) und zum anderen die Sorption reduzierter Verbindungen aufgrund
zunehmender Protonierung der Aminogruppen bei abnehmenden pH-Wert zunimmt, ist zu
berücksichtigen, dass im unmittelbaren Rhizosphärenbereich von mykorrhizierten
Pflanzenwurzeln der pH-Wert um mehrere Einheiten niedriger sein kann als im umgebenden
Boden. Dass entsprechende Beobachtungen mit deutlichen pH-Wert-Differenzen zwischen
bepflanzten und unbepflanzten Varianten in den Experimenten allerdings nicht gemacht
werden konnten, dürfte darin begründet liegen, dass die Bodenprobenahme für die pH-Wert-
Bestimmung in den bepflanzten Ansätzen als Bodenmischprobe aus dem gesamten Bereich
der Rhizotrone erfolgte, und nicht nur aus dem Rhizosphärenbereich wenige mm um die
Wurzeln herum. Eventuelle pH-Wert-Unterschiede zwischen Rhizosphärenboden und
umgebenem Boden könnten somit möglicherweise verwischt worden sein. Über den Einfluss
92

Diskussion
mykorrhizierter Pflanzen bei der Transformation von Nitroaromaten wird an späterer Stelle
ausführlich diskutiert.
Eine wichtige Rolle bei der TNT-Transformation im Boden spielt auch der C-Gehalt. Zur
Reduktion der Nitrogruppen werden aus dem Abbau von Kohlenstoffquellen stammende
Reduktionsäquivalente benötigt (kometabolische Reaktion). Da Pflanzen über ihre Wurzeln
erhebliche Mengen verschiedener niedermolekularer Substanzen durch Exsudation an ihre
Umgebung abgeben, dürfte insbesondere in den bepflanzten Experimentalvarianten von einer
Erhöhung des bioverfügbaren C-Pools auszugehen sein, was schließlich eine verstärkte
mikrobielle metabolische Aktivität zur Folge hatte. Außerdem wurden mit den Pflanzen
allgemein vermehrt komplexere Kohlenstoffverbindungen mit den abgestorbenen Wurzeln in
den Boden eingebracht (vor allem durch die starkwüchsigen Pappeln), die für anfallende
Transformationsprodukte als geeignete Reaktionspartner zur Festlegung fungieren können.
Möglicherweise wurde der C-Gehalt im Bodensubstrat auch durch das Einbringen des
Weizenstrohs beeinflusst und erhöht. Allerdings ist eine Beurteilung darüber, inwieweit
Strohanteile zwischenzeitlich biochemisch zersetzt und somit für Bindungsprozesse verfügbar
wurden, nicht möglich. Ein durch Strohzugabe hervorgerufener Abreicherungseffekt bei der
Nitroaromatenkonzentration ließ sich nicht beobachten. Letztendlich kann über die
Entwicklung der C-Konzentrationen in den Böden der jeweiligen Versuchsvarianten nur
spekuliert werden, da sich die Untersuchungen zur Gehaltsbestimmung auf die
Ausgangssubstrate beschränken. Die Messergebnisse können aus Tabelle 31 im Anhang
entnommen werden.
4.1.5 Hydroxylaminodinitrotoluole (HADNT) als Intermediate der TNT-Reduktion
Ein Nachweis der sehr hydrophilen HADNT-Isomere in den Bodenproben konnte mit der im
Rahmen dieser Arbeit zur Anwendung gekommenen HPLC-Methode nicht geführt werden.
Auf den Einsatz zusätzlicher Nachweismethoden zur Quantifizierung der HADNTs wurde
verzichtet, weil diese Transformationsprodukte in Gegenwart von Bodenbestandteilen
gewöhnlich einer zügigen Umwandlung unterliegen. Dafür spricht zum einen die deutliche
Zunahme der ADNTs. In einigen Experimentalvarianten konnte ein Anstieg um nahezu 100%
nachgewiesen werden. Zum anderen besteht die Möglichkeit zur schnellen Kondensation mit
Nitroso-Derivaten zu Azoxyverbindungen (s. u.). In den Experimenten ist deshalb lediglich
von sehr geringen Mengen längerfristig akkumulierender HADNTs im Boden auszugehen.
Entsprechende Beobachtungen machten Achtnich et al. (2000) in einem Kompostierungsversuch
im Labormaßstab bei schneller Transformation des in großer Menge dotierten TNT
(4500 mg kg -1 TS). Eine im Verhältnis zur dotierten TNT-Menge sehr geringe Konzentration
von 0,33 mg kg -1 (TS) isomerer HADNTs ließ sich lediglich bis zum zweiten Tag nach
Versuchsbeginn nachweisen.
93

Diskussion
Für eine Bewertung des ökotoxikologischen Potentials der Hydroxylaminoverbindungen
liegen bisher nur wenige Daten vor. Intermediate wie 2-Hydroxylamino-4,6-Dinitrotoluol
(2HA46DNT) inhibierten das Wachstum der Grünalge Selenastrum capricornutum bei einer
Konzentration von 1,4 mg l -1 um etwa 50 %, wobei die Wachstumshemmung deutlich
niedriger ausfiel als bei vergleichbarer TNT-Konzentration (Tadros et al. 2000). Für eine
abschließende Beurteilung des Toxizitätsprofils von HADNTs sind noch weitere Studien
notwendig. Da allerdings von einer geringen Neigung zur Akkumulation im Boden auszugehen
ist, dürfte das toxische Wirkungspotenzial auf Pflanzen und andere Organismen eher
eine untergeordnete Rolle spielen.
4.1.6 Entstehung von Azoxyverbindungen bei TNT-Abbauprozessen
Unter aeroben Bedingungen, kaum jedoch unter anaeroben Bedingungen, kann es im Verlauf
der Reduktion der Nitrogruppe zu einer abiotischen Kondensationsreaktion von Nitroso- und
Hydroxylaminoaromaten zu Azoxyverbindungen kommen (Abbildung 40). Mikroorganismen
spielen dabei lediglich eine Rolle als Lieferanten der Kopplungssubstrate, entweder beim
bakteriellen Abbau durch Kompostierung oder bei der Transformation des TNT durch Pilze
(Garg et al. 1991, Isbister et al. 1984, Michels u. Gottschalk 1994; in Martinetz & Rippen
1996).
CH 3
O2N
N=O
O2N
CH3
H3C
NO2
O 2 N
NO2
+
CH 3
H
N OH
N=N
+ H2O
O
O2N
NO2
4,4',6,6'-Tetranitro-2,2'-azoxytoluol
NO 2
Abb. 40: Entstehung von 2,2’-Azoxy aus TNT-Metaboliten (aus Martinetz & Rippen 1996,
nach Layton et al. 1987)
94

Diskussion
Azoxyverbindungen gelten als hochresistent. Ihre toxikologische Relevanz ist bisher
ungeklärt. In welcher Größenordnung diese Verbindungen entstehen und dann
möglicherweise Wechselwirkungen mit der Huminstofffraktion im Boden eingehen und dabei
fest gebunden werden oder im Boden akkumulieren, ist bisher ebenfalls wenig untersucht.
Sollte es tatsächlich zu einer Akkumulation kommen, könnte dies bei Sanierungsvorhaben so
ein Problem darstellen. In welchem Umfang Azoxyverbindungen durch Kondensation in den
hier durchgeführten Experimenten im Bodensubstrat anfielen, wurde im Rahmen dieser
Arbeit nicht näher untersucht. Eine Akkumulation kann grundsätzlich nicht ausgeschlossen
werden. Achtnich et al. (2000) fanden in einem generell aeroben Prozess bei einer
Ausgangsdotierung von 4500 mg TNT kg -1 Boden (TS) 1-2 Tage nach Inkubationsbeginn
lediglich Maximalwerte von 7-13 mg kg -1 (TS). Im Laufe der weiteren Behandlung lag die
Konzentration nach 9 Behandlungstagen schließlich unter der Nachweisgrenze, wobei nicht
ausgeschlossen wurde, dass durch mikrobielle Sauerstoffzehrung anaerobe Mikrobereiche
entstanden sein könnten und die Azoxy-Bildung somit unterbunden wurde. In anderen
Versuchen wurden bei ähnlich hoch TNT-belasteten Böden dagegen wesentlich höhere
Azoxy-Konzentrationen nach-gewiesen (Achtnich et al. 1999).
4.2 Dekontamination sprengstoffbelasteter Böden im Kiefern- und Pappelexperiment;
ein Variantenvergleich
Die Eignung verschiedener Kraut- und Gehölzpflanzen beim Abbau von Nitroaromaten im
Boden wurde bereits mehrmals erfolgreich getestet und in der Literatur beschrieben (Cataldo
et al. 1989, Görge et al. 1994a und 1995, Scheidemann 1998, Schönmuth und Pestemer 2000).
Der Aspekt der Mykorrhiza fand in den hierbei erwähnten Experimenten allerdings wenig
Beachtung. Böhler et al. (2000) erprobten im kleintechnischen Maßstab in Gefäßversuchen
eine Kombination von verschiedenen krautigen Pflanzen (Medicago sativa, Carex
buchananii, Miscanthus sinensis) mit dem sowohl saprophytisch als auch Mykorrhiza-bildend
lebenden Basidiomyzeten Stropharia rugosoannulata. Die Inokulation des Bodens mit dem
Pilz erfolgte durch Einbringung von Stroh, welches als Wuchssubstrat diente. Der Mykorrhizaeffekt
beim TNT-Abbau wurde nicht näher beleuchtet. Ein weiteres Freilandexperiment
speziell mit mykorrhizierten Gehölzen zur Phytoremediation TNT-belasteter Flächen wurde
in den vergangenen Jahren auf dem Gelände einer ehemaligen Sprengstoffproduktionsstätte
im Harz (‘Werk Tanne’/Clausthal-Zellerfeld) durchgeführt (Warrelmann et al. 2000, Koehler
et al. 2001 a und 2001 b). Die während der Erprobung dieses in situ-Phytoremediationsverfahrens
gewonnenen Erkenntnisse werden noch an späterer Stelle mit den Ergebnissen aus
den Laborexperimenten der vorliegenden Arbeit verglichen und diskutiert. Weitere
Experimente, die bei der Sanierung TNT-belasteter Böden in ihrem Schwerpunkt
insbesondere auf den Einsatz mykorrhizierter Pflanzen basieren, sind bisher nicht bekannt.
95

Diskussion
Weißfäulepilze in ihrer Funktion als ligninolytische Organismen sind in der Lage, TNT
enzymatisch zu reduzieren und mittels Peroxidasen eine Ringspaltung des Aromaten
herbeizuführen (Stahl und Aust 1993a, Spiker et al. 1992). Verbunden mit einem
enzymatischen Angriff auf TNT im Boden durch Weißfäulepilze ist allerdings die
Einbringung organischer Zuschlagstoffe in den Boden, welche als Kultursubstrate für den Pilz
dienen. Dabei haben über das Substrat eingebrachte Weißfäulepilze in der Regel
Schwierigkeiten, sich im Boden zu etablieren (Böhler et al. 2000; eigene Beobachtungen), da
sie nicht zu den eigentlichen Bodenorganismen zählen, sondern überwiegend in der
Holzfraktion von Bäumen und in der Streuschicht verbreitet sind. Im Gegensatz zu
Weißfäulepilzen ist bei einer Beimpfung des Bodens mit Mykorrhizapilzen eine
Substratzugabe in Form von Zuschlagstoffen nicht erforderlich, da eine kontinuierliche
Versorgung mit Kohlenstoffverbindungen über Photoassimilate durch die Pflanzen erfolgt.
Des Weiteren fungieren zahlreiche Mykorrhizapilze als Saprophyten (z. B. Paxillus und
Stropharia) und können sich Kohlenstoffquellen aus dem Material der Streuschicht
erschließen. Der Besitz reduktiver Enzymsyteme und verschiedener ringspaltender
Peroxidasen konnte inzwischen für zahlreiche Mykorrhizapilze festgestellt werden (Scheibner
et al. 1997, Gramss et al. 1998, Meharg et al. 1997a). Als Bodenorganismen ist es
Mykorrhizapilzen zudem möglich, sich im Boden gut zu etablieren und diesen mit ihrem
feinen und weit verzweigten Hyphensystem weiträumig zu durchwachsen und als
Nahrungsquelle zu erschließen. Basierend auf diesen Tatsachen sollten mit Hilfe der
Variantenauswahl in den beiden Experimenten mit mykorrhizierten Kiefern und Pappeln zur
Untersuchung der TNT-Abreicherung im Boden zwei wesentliche Fragen näher beleuchtet
werden.
• Führt eine Kombination aus Beimpfung mit Weißfäulepilzen und Bepflanzung mit
mykorrhizierten Gehölzen generell zu einer Dekontamination TNT-belasteter Böden
(Variante A)?
• Sind in den Boden eingebrachte Mykorrhizapilze aufgrund ihrer Eigenschaften dazu in der
Lage, Weißfäulepilze in ihrer Funktion beim TNT-Abbau zu ergänzen oder sogar zu ersetzen
(Varianten A und B)?
Darüber hinaus wurde die Anzahl der Versuchsvarianten im Pappelexperiment um eine
weitere ergänzt und das Spektrum der Varianten um eine Kombination aus Weißfäulepilzen
und nicht-mykorrhizierten Pflanzen erweitert (Variante D). Dabei sollte die Einflussgröße der
Pflanzen auf die TNT-Abreicherung im Boden ermittelt werden.
96

Diskussion
• Inwieweit lässt sich ein Einfluss der nicht-mykorrhizierten Pflanzen auf die TNT-
Abreicherung im Boden erkennen (Variante D) bei einem Vergleich mit mykorrhizierten
Pflanzen (Variante A)?
In der vorliegenden Arbeit zeigte sich in den Varianten des Kiefernexperimentes ein anderes
Abbauverhalten der Bodenkontaminationen als in den gleichartig angesetzten Varianten des
Pappelexperimentes. Ein geringer Biomassezuwachs der Kiefern, einhergehend mit einer
schwachen Durchwurzelung des Substrates in den Rhizotronen insgesamt, resultierte in einer
Ausprägung der Rhizosphäreneffekte auf niedrigem Niveau. Ein lediglich kleiner
Einflussbereich der Wurzeln mit einer gerade dort zu erwartenden erhöhten mikrobiellen
Biomasse mit hoher metabolischer Aktivität aufgrund einer großen Bioverfügbarkeit dort
freigesetzter organischer Nährstoffe durch die Wurzeln ließ pflanzeninduzierte
Transformationsvorgänge kaum in Erscheinung treten. Auffällige Abreicherungseffekte,
insbesondere bei den ADNTs, ließen sich überwiegend in den mit Weißfäulepilzen beimpften
Varianten beobachten und sind demnach vermutlich hauptsächlich auf Abbauleistungen der
Weißfäulepilze zurückzuführen. Allerdings müssen auch die Mykorrhizapilze eine positive
Wirkung auf die Abreichungsprozesse gehabt haben, da in der Variante A die Belastungen am
stärksten zurückgingen. Im Pappelexperiment stellte sich die Situation grundlegend anders
dar. Hier hatte die Bestückung der Rhizotrone mit den starkwüchsigen mykorrhizierten
Gehölzen erhebliche Effekte auf die Entwicklung der Nitroaromatenbelastung im Substrat.
Die mykorrhizierten Pappeln erwiesen sich bei der Dekontamination nicht nur als sinnvolle
Ergänzung zu den Weißfäulepilzen, viel mehr scheinen die Untersuchungen zu belegen, dass
die Funktion der Weißfäulepilze durch eine Assoziation Mykorrhizapilz/Pflanze übernommen
werden konnte. Eine zusätzliche Beimpfung der bepflanzten Varianten mit Weißfäulepilzen
erbrachte keine wesentlich verbesserte Abbauleistung (vergleiche Varianten A und B). Als
erstaunlich effizient erwiesen sich außerdem nicht-mykorrhizierte Pappeln beim TNT-Abbau.
Das Fehlen der Mykorrhizapilze wirkte sich nicht nachteilig auf die TNT-Degradation aus.
Eine entsprechend positive Tendenz konnte beim Abbau der ADNTs allerdings nicht
beobachtet werden (Variante D). Verglichen mit den Kiefern hatten die starkwüchsigen
Pappeln nicht nur wesentlich mehr Biomasse zu Versuchsbeginn aufzuweisen, sondern legten
auch während des Experimentes erheblich mehr an Biomasse zu (vergleiche Tabellen 10 und
13). Ein besserer Durchwurzelungsgrad im Substrat der Rhizotrone ließ dementsprechend ein
deutlich stärkeres Auftreten von Rhizosphäreneffekten erwarten. Mehr Lebendbiomasse bzw.
Wurzelbiomasse der Pflanzen hatte vermutlich eine höhere Exsudatfreisetzung in die
Rhizosphäre zur Folge und ein größeres Angebot freiverfügbarer organischer Nährstoffe für
die Mikroflora ermöglichte dann eine Steigerung der Rhizosphärendegradation aufgrund einer
erhöhten metabolischen Aktivität. In Verbindung mit dem guten Durchwurzelungsgrad der
Pappeln kann außerdem von einer besseren Verteilung der Mykorrhizapilzhyphen im Substrat
97

Diskussion
ausgegangen werden, die mit den Wurzeln der Wirtspflanze assoziiert waren. Ein
effizienteres Durchwachsen der Bodenbereiche wird den Abreicherungsprozess somit
ebenfalls positiv beeinflusst haben. Im Hinblick auf die unterschiedliche Ausstattung der
einzelnen Versuchsvarianten sollen die erzielten Ergebnisse im Folgenden genauer betrachtet
werden.
4.2.1 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden der Kontrollvariante
(Variante K)
Sowohl im Kiefern- als auch im Pappelexperiment zeigten die Bodenanalysen der
Kontrollansätze eine erhebliche Transformation des TNT, obwohl dem Boden zubeimpfte
Mykorrhiza- und Weißfäulepilze sowie Pflanzen fehlten. Eine möglicherweise durch
mechanische Bearbeitung des Bodens herbeigerufene Initiierung des TNT-Abbaus wurde
schon mehrmals beobachtet (Koehler et al. 2001a, Kraß 1998, Thomas et al. 2001). Im
Allgemeinen zeigt TNT eine jahrzehntelange Persistenz in ungestörten Standortböden. Diese
Eigenschaft kann vermutlich auf eine Selbsteinkapselung der unterschiedlich großen TNT-
Partikel und Kristalle zurückgeführt werden (Seifert und Schecker 1993), so dass die
Bioverfügbarkeit dieser Verbindung herabgesetzt wird. Bodenstörungen in der Startphase der
Experimente könnten somit als Anschub für Abbauvorgänge in Frage kommen. Eine
mechanische Bearbeitung des Bodens (Substrat wurde gesiebt) zerkleinerte das in partikulärer
Form vorliegende TNT, wodurch zwischenzeitlich die Einkapselung aufgehoben wurde und
mehr TNT in Lösung gehen konnte. Einhergehend mit der Bearbeitung des Bodens könnte
eine damit verbundene Belüftung eine pulsartige Aktivierung der Bodenmikroflora bewirkt
und die TNT-Transformation initiiert haben (Koehler et al. 2001b). Mit der Zeit kann
allerdings der Wiedereinkapselungsprozess an den Kristallen einsetzen (Seifert und Schecker
1993). In diesem Zusammenhang lässt sich die nach einigen Wochen beobachtete Stagnation
des TNT-Abbaus, welche insbesondere im Kontrollansatz des Pappelexperimentes beobachtet
wurde, erklären.
Die lange anhaltende Persistenz von TNT und Metaboliten in Standortböden ist außerdem
darauf zurückzuführen, dass die Schadstoffe mit der Zeit in für Bakterien nicht erreichbare
Mikroporen des Bodengefüges diffundieren. In gealterter Erde sind sie damit für die
Bakterien kaum bioverfügbar (Martinetz und Rippen 1996). Auch in diesem Fall wäre eine
Initiierung der Biotransformation durch Freisetzung der Kontaminanten nach Störung des
Bodengefüges während der mechanischen Einwirkung vorstellbar.
Als abiotische Mechanismen bei der Transformation von TNT können möglicherweise auch
Photolyseprozesse mitgewirkt haben, wobei die Bedeutung dieses Abbauweges in den
abgedunkelten Rhizotronen allerdings eher gering gewesen sein dürfte. Durch Lichtenergie
erfolgt eine Umwandlung des TNTs in verschiedene aromatische Verbindungen. Diese
photoinstabilen Zwischenprodukte sind zum Teil in der Lage, Dimere zu bilden (Layton et al.
98

Diskussion
1987, in Martinetz und Rippen 1996). Des Weiteren können sie einer mikrobiellen
Transformation unterliegen. Nach Zepp et al. (1985) können Photolyseprozesse durch die
Anwesenheit von Huminstoffen erheblich beschleunigt werden, da sie als Photosensibilatoren
und Bindungspartner für Metabolite wirken.
4.2.2 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden der Weißfäulepilzvariante
(Variante C)
Weißfäulepilze sind im Boden normalerweise nicht konkurrenzfähig, weil die dort
vorherrschenden Bedingungen für sie ungünstig sind (Hüttermann et al. 1988). Als Besiedler
der Holzanteile von Pflanzen und der Streuschicht sind sie im Boden dem Wettkampf mit den
dort lebenden Mikroorganismen nicht gewachsen. Ihre Möglichkeiten, den Bodenbereich in
den Rhizotronen mit ihren Hyphen von den Zuschlagstoffen ausgehend intensiv zu besiedeln,
blieben deshalb begrenzt. Ein dichtes Pilzmyzel des zugeimpften Weißfäulepilzes ließ sich in
der Regel nur in Bodenbereichen mit direktem Kontakt zu den überwachsenen Strohanteilen
beobachten. Lediglich Rhizomorphen durchzogen vereinzelt das Substrat. Die Möglichkeit
zur Ausbildung eines feinen, engmaschigen und weit verzweigten Hyphengeflechtes, um
damit möglichst effizient und ganzräumig die Bodenbereiche durchwachsen zu können, blieb
daher den Mykorrhizapilzen in den anderen Varianten vorbehalten. Zwischen der
Besiedlungsdichte transformierender Pilze im Boden einerseits und der Transformationsrate
andererseits besteht jedoch ein enger Zusammenhang. So konnte für den Weißfäulepilz
Phanerochaete chrysosporium eine direkte Korrelation der TNT-Reduktion mit der
Myzelmasse nachgewiesen werden (Stahl und Aust 1993a und b). Demzufolge kann davon
ausgegangen werden, dass eine eingeschränkte Besiedlung des Bodensubstrates mit dem
zubeimpften Weißfäulepilz und das Fehlen von Mykorrhizapilzen in Versuchsvariante C
aufgrund einer reduzierten Pilzbiomasse und Pilzaktivität im Boden insgesamt zu einer
Verlangsamung des Degradationsprozesses im Variantenvergleich geführt hat. Diese
Entwicklung im Abreicherungsprozess zeichnete sich insbesondere im Pappelexperiment ab.
In der lediglich mit dem Weißfäulepilz beimpften Variante C blieben die Abbauleistungen
beim TNT und bei den ADNTs signifikant niedriger als in den Varianten A und B, welche
zusätzlich mit starkwüchsigen, mykorrhizierten Pappeln bestückt waren und in Verbindung
mit einer intensiven Durchwurzelung deutliche Abreichungseffekte (auch durch eine damit
geförderte Mikroflora) sichtbar werden ließen.
Obwohl der verwendete Weißfäulepilz Pleurotus ostreatus in Folge seiner eingeschränkten
Etablierungsmöglichkeiten im Boden in seiner Leistungsfähigkeit dem Abbaupotenzial
mykorrhizierter Pappeln nachstand, konnte immerhin noch ein verbesserter
Abreicherungsverlauf gegenüber den weder mit Pilzen beimpften noch mit Pflanzen
bestückten Kontrollvarianten (Variante K) beobachtet werden. Beim Abbau nitroaromatischer
Verbindungen durch Weißfäulepilze sind sehr unspezifische, auf viele Aromaten reduktiv und
99

Diskussion
oxidativ einwirkende Enzyme wirksam. Bereits Anfang der 80er Jahre wurden hauptsächlich
mit dem Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium für zahlreiche Xenobiotika gute
Abbauergebnisse in Flüssigkultur erzielt (Bumpus et al. 1985). Majcherczyk et al. (1993)
gelang der Abbau verschiedener Xenobiotika, u. a. TNT, durch Weißfäulepilze später auch
unter Bodenbedingungen. Neben niederkondensierten Aromaten können verschiedene
Weißfäulepilze außerdem hochkondensierte Verbindungen wie das Benz[a]pyren angreifen
(Hüttermann et al 1988). Allerdings erfordert eine erfolgreiche Biodegradation solcher
schwerstabbaubarer Bodenkontaminanten die unmittelbare Nähe des belasteten Bodens zum
bewachsenen Substrat damit die Schadstoffe für den Metabolismus des Weißfäulepilzes
erschlossen werden können. Durch das Einbringen eines aktiven Pilz-/Stroh-Gemisches in
den Boden konnte diese Voraussetzung nur unzureichend erfüllt werden, wie die eigenen
Experimente zeigten, da der Pilz mit seinen Hyphen nur wenig in den Boden vordrang.
Gerade in Hinblick auf die Verwendung von Pilzen in in-situ-Sanierungsverfahren ist deshalb
die Fähigkeit zur Ausbildung sehr feiner und weiträumiger Hyphengeflechte im Boden von
vorrangiger Bedeutung, um eine umfassende Biodegradation, sei es durch den Pilz selbst oder
durch eine Förderung der autochthonen Bakterienflora wie auch der Pflanzen zu erreichen.
Diesbezüglich bieten sich bestimmte Mykorrhizapilz-Pflanzen-Assoziationen zur Dekontamination
TNT-belasteter Böden an, da sie in der Lage sind den Bodenbereich äußerst effizient
zu durchwachsen, so dass eine Nitroaromatentransformation nicht lokal begrenzt bleibt.
4.2.3 Abreicherung der Nitroaromatenkonzentration im Boden der Versuchsvarianten
mit mykorrhizierten Pflanzen (Varianten A und B)
Im Mittelpunkt der experimentellen Fragestellungen stand die Überlegung, ob Weißfäulepilze
in ihrer Funktion als TNT-Abbauer durch den Einsatz mykorrhizierter Gehölze sinnvoll
ergänzt oder möglicherweise sogar ersetzt werden können. Es zeigte sich, dass unter
Verwendung mykorrhizierter Gehölze (Variante B) vergleichbar gute Abbauleistungen erzielt
wurden wie unter Verwendung einer Kombination aus mykorrhizierten Gehölzen und
Weißfäulepilzen (Variante A). Die eingebrachten Weißfäulepilzkulturen bewirkten keine
signifikante Verbesserung der Abbauleistung, wenn die Varianten mit mykorrhizierten
Gehölzen bestückt waren. Die Voraussetzung für einen durchgreifenden Einfluss der
Mykorrhiza auf den Abreicherungseffekt war eine intensive Durchwurzelung des Substrates,
da eine höhere Wurzeldichte ein höheres externes Myzelium in der wurzelfreien Zone zur
Folge hat. Ausgehend von den ummantelten Feinwurzeln konnten die Hyphen mit ihrem
Wuchs das Substrat feinmaschig und weiträumig erschließen und somit die Mikroflora des
Bodens nachhaltig stimulieren bzw. den mikrobiellen Abbau fördern. Gleichzeitig beinhaltete
eine dichte Besiedlung des Substrates mit dem Mykorrhizapilz eine bessere Verteilung
transformierender Enzyme, die von den Pilzhyphen selbst ausgeschieden werden. Auch die
Pflanzen dürften einen erheblichen Einfluss auf die Abnahme der Nitroaromaten gehabt
100

Diskussion
haben. Zum einen sind Pflanzen in der Lage die metabolische Aktivität der
Rhizosphärenorganismen durch Exsudation organischer Substanzen anzukurbeln, was eine
gesteigerte Schadstoffdegradation nach sich zieht. Zum anderen können auch von den
Wurzeln Enzyme abgegeben werden, so dass die Transformation beschleunigt wird. Über die
Bedeutung der Aufnahme und Translokation von TNT und Abbauprodukten in die Pflanzen
beim Abreicherungsprozess im Boden wird noch an späterer Stelle diskutiert.
4.2.3.1 Verwendete Organismen und ihre Fähigkeit zur Nitroaromatentransformation
Es wurde bereits erwähnt, dass neben den holzzersetzenden Weißfäulepilzen auch zahlreiche
Arten streuabbauender Mykorrhizapilze aufgrund ihrer enzymatischen Ausstattung die
Fähigkeit zur Biotransformation von Nitroaromaten haben (Scheibner et al. 1997, Meharg et
al. 1997a, Gramss et al. 1998). In der vorliegenden Arbeit wurde im Kiefernexperiment der
Mykorrhizapilz Pisolithus tinctorius als Symbiont für die Kiefernsämlinge verwendet.
Pisolithus tinctorius ist als Mykobiont für Kiefern hervorragend geeignet und bildet
gemeinsam mit der Wirtspflanze in kurzer Zeit etablierte Mykorrhizen aus. Ein qualitativer
Nachweis oxidativer Enzyme mittels Platten-Enzymtests gelang für diese Pilzspezies
allerdings nicht. Die durchgeführten Nachweisreaktionen blieben negativ (siehe Tabelle 7).
Die im Pappelexperiment verwendeten Pflanzen zeichneten sich an ihren Wurzeln durch
Mehrfachinfektionen mit mindestens zwei unterschiedlichen Hebeloma-Arten aus (siehe
Abschnitt 2.1.2.4). Die Isolierung steriler Kulturen einzelner dieser Pilze auf Agar-
Nährmedien von den mykorrhizierten Pappelwurzelfragmenten gelang trotz mehrerer
Versuche nicht. Sämtliche produzierten Pilzmischisolate auf den Agarplatten waren außerdem
mit Kolonien verschiedener Bakterien kontaminiert. Isolierungsversuche aus
Pilzfruchtkörpern konnten nicht vorgenommen werden, da solche nicht vorlagen. Aufgrund
nicht bestehender Zuordnungsmöglichkeiten eventuell auftretender positiver Nachweisreaktionen
für den einzelnen Organismus wurde auf Plattenenzymtests mit den Mykobionten
der Pappeln verzichtet. Gramss et al. (1998) gelang der Nachweis für den Besitz
verschiedener oxidativer Enzyme für Hebeloma crustuliniforme (Bull.) Quél. und weiterer
Spezies dieser Gattung in Reinkultur. Auch für eine Reihe anderer
Ektomykorrhizapilzgattungen gelang dieser Nachweis. Zahlreiche Pilze, u. a. Stropharia und
Paxillus ließen Aktivität von Phenoloxidasen, Laccasen, Tyrosinasen und Peroxidasen
beobachten (Scheibner et al. 1997, Gramss et al. 1998). Die Fähigkeit aromatische
Verbindungen mit Hilfe oxidativer Enzyme anzugreifen, scheint unter den Mykorrhizapilzen
also eine weit verbreitete Eigenschaft zu sein. Diesbezüglich ist die Annahme berechtigt, dass
auch die hier zum Einsatz gekommenen Pilzstämme der Gattung Hebeloma durchaus dazu in
der Lage waren, aromatische Verbindungen wie das TNT und dessen Metaboliten oxidativ
anzugreifen. Oxidative Enzyme gelangen nicht nur durch Weißfäule- und Mykorrhizapilze in
101

Diskussion
den Boden. Auch Pflanzen produzieren zahlreiche Peroxidasen, welche über die
Wurzeloberfläche in den Rhizos-phärenboden freigesetzt werden (Adler et al. 1994).
Bevor über oxidative Angriffe durch extrazelluläre Enzyme letztendlich eine Ringspaltung
erfolgen kann und damit der weitere Mineralisierungsprozess eröffnet wird, muss das TNT
zuvor in einer Initialreaktion enzymatisch reduziert werden. Reduktaseaktivitäten sind
ubiquitär bei Organismen (Bakterien, Pilze, Pflanzen) vorhanden. Viele Untersuchungen
belegen inzwischen die enzymkatalysierte Reduktion von Nitroaromaten durch zahlreiche
Prokaryonten und Eukaryonten. So konnte inzwischen auch für verschiedene Weißfäule- und
Ektomykorrhizapilze, u. a. für Pisolithus tinctorius, eine entsprechende Fähigkeit
nachgewiesen werden (Stahl und Aust 1993b, Meharg et al. 1997a und 2000). Von
pflanzlichen Reduktasen, welche in Verbindung mit Laccasen zum Aufbrechen des
Aromatenringes führen sollen, berichteten Schnoor et al. (1995). Die partielle
Nitrogruppenreduktion des TNT mittels Reduktasen läuft unspezifisch ab und stellt nicht die
eigentliche Funktion dieser Enzyme dar, da natürliche aromatische Nitroverbindungen nur
selten vorkommen. Zu erwähnen sind hier vor allem die Antibiotika Chloramphenicol und
Pyrrolnytrin, sowie die in Pflanzen synthetisierte und dem Fraßschutz dienende
Aristolochiasäure (Pailer 1960, Rastrick 1949). In Anbetracht der Tatsache, dass die bei der
TNT-Transformation wirksamen Enzyme nicht durch TNT oder dessen Metaboliten induziert
werden und ein weites Substratspektrum aufweisen, ist von einer allgemein weit verbreiteten
Fähigkeit zur reduktiven Nitroaromatentransformation unter den Organismen auszugehen.
Daher ist zu vermuten, dass auch die hier zur Anwendung gekommenen Pilz- und
Pflanzenspezies entsprechende reduktive Fähigkeiten besaßen.
4.2.3.2 Mykorrhizapilze und ihr Einfluss auf die mikrobielle Lebensgemeinschaft im
Boden
Einerseits können Mykorrhizapilze einen direkten Einfluss auf die autochthone Lebensgemeinschaft
der Mikroorganismen ausüben und so ihre metabolische Aktivität im Boden
verändern. Andererseits ist eine Modifizierung der mikrobiellen Abbauvorgänge auch indirekt
über die Einflussnahme auf Pflanzen möglich, so dass letztendlich die Pflanzen als Reaktion
auf den Mykobionten die Bedingungen in der Rhizosphäre ändern und auf diesem Wege die
mikrobiologische Aktivität beeinflussen. Beispielsweise wird durch die Mykorrhizierung der
Anteil an Photoassimilaten und Kohlenhydraten in den Wurzeln und damit schließlich auch
im Rhizosphärenbereich deutlich erhöht. Dies belegen verschiedene Studien. So fanden sich
am selben Individuum von Eucalyptus pilularis/Pisolithus tinctorius Mykorrhizen im
Vergleich zu nicht-mykorrhizierten Wurzeln etwa 18 Mal mehr 14 C-markierte Photoassimilate
(Cairney et al. 1989 in Smith und Read 1997). Da sich der TNT-Abbau im Boden prinzipiell
als schwierig darstellt, gilt es als unwahrscheinlich, dass dieser lediglich durch einige wenige
Bakterienspezies erfolgt. Vielmehr kann von der Beteiligung ganzer Bakterienkonsortien an
102

Diskussion
der kometabolischen Nitroaromatendegradation ausgegangen werden (Breitung et al. 1995).
Gerade solche Bakterienkonsortien können durch die Besiedlung des Bodens mit
Mykorrhizapilzhyphen sowohl qualitativ als auch quantitativ entscheidend verändert werden.
In letzter Konsequenz erfährt aus diesem Grunde auch die mikrobielle Aktivität eine
Veränderung. Mit einem Größendurchmesser zwischen 2-15 µm ist es Hyphen von
Mykorrhizapilzen möglich auch in sehr kleine Bodenporen einzuwachsen, welche für die im
Durchmesser größeren Wurzeln und Wurzelhaare unerreichbar bleiben (O’Keefe und Sylvia
1992). Prinzipiell ist daher auch in diesen Kleinsträumen eine Einflussnahme auf die
mikrobielle Aktivität durch die vermehrte Freisetzung von Stoffen aus den Hyphen in den
Boden möglich, die dann dort von den Bakterien als Wachstumssubstrat genutzt werden
können (Joner et al. 2000 und 2001). So geben lebende Pilzhyphen verwertbare Proteine wie
Glomalin und extrazelluläre Enzyme in die Umgebung ab. Des Weiteren können Pilzhyphen
größere Mengen an P und N in ihren in der Regel kurzlebigen Zellen akkumulieren (Johansen
et al. 1993, Zhao et al. 1997), welche nach dem Absterben verfügbar werden. Dies gilt auch
für die Biomasse der abgestorbenen Pilzmyzelien selbst. Üben Mykorrhizapilze auf die
mikrobielle Stoffwechselaktivität im rhizosphärenfernen Bereich einen direkten Einfluss aus,
erfolgt die Einflussnahme auf die Aktivität der Mikroflora im Rhizosphärenbereich auch
indirekt über die Wirtspflanzen. Hierbei äußert sich der Mykorrhizaeffekt in einer qualitativ
als auch quantitativ veränderten Exsudation der mykorrhizierten Wurzeln. So ließ sich bei
Wurzeln mykorrhizierter krautiger Pflanzen eine deutlich höhere Exsudation von Zuckern,
Aminosäuren und noch anderen organischen Säuren nachweisen als bei Wurzeln nichtmykorrhizierter
Pflanzen (Schwab et al. 1983). Ähnliches wäre auch für mykorrhizierte
Gehölze vorstellbar. Eine erheblich modifizierte Wurzelexsudation kann entscheidend zu
einer Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft in ihrer Zusammensetzung und somit auch
in ihrer Aktivität im Rhizosphärenbereich führen. In diesem Zusammenhang verweisen Joner
et al. (2001) auf positive Effekte während der mikrobiellen PAK-Degradation. Es ist daher zu
vermuten, dass auch bei der Nitroaromatendegradation in den Experimentalvarianten
möglicherweise positive Einflüsse zum Tragen kamen, die auf einer modifizierten
Wurzelexsudation basieren.
Vermutlich verursachen Infektionen mit Mykorrhizapilzen nicht nur eine Stimulierung der
mikrobiellen Nitroaromatentransformation, sei es direkt oder indirekt über die Pflanzen.
Vielmehr können Pflanzen nach erfolgreicher Mykorrhizierung auch selbst ihre
Abbauleistung effizient verbessern, indem sie nach der Infektion mit dem Pilzpartner zu einer
vermehrten Expression extrazellulärer reduktiv und oxidativ wirksamer Enzyme angeregt
werden. Criquet et al. (2000) beobachteten eine Erhöhung der Peroxidaseaktivität bei
mykorrhizierten Luzernen, McArthur und Knowles (1992) fanden eine erhöhte extrazelluläre
Oxidoreduktaseaktivität bei mykorrhizierten Kartoffelwurzeln. Die Infektion mit einem
Mykorrhizapilz induziert in der Wirtspflanze allgemein verschiedene Abwehrreaktionen
(Gianinazzi-Pearson et al. 1996). In diesem Zusammenhang könnte auch das verstärkte
103

Diskussion
Einsetzen der Peroxidaseaktivität in Pflanzen nach erfolgreicher Mykorrhizierung eine
Abwehrreaktion auf die Pilzinfektion darstellen (Salzer et al. 1999), was letztendlich als
positiven Nebeneffekt eine verbesserte enzymatische Nitroaromatendegradation im
Rhizosphärenbereich zur Folge hat.
4.2.4 Nitroaromatenabreicherung in Versuchsvariante D mit Weißfäulepilzen und mit
nicht-mykorrhizierten Pflanzen
Das Versuchsdesign für das Kiefernexperiment beinhaltete vier Versuchsvarianten, im
anschließend durchgeführten Pappelexperiment wurde die Anzahl der Experimentalvarianten
um Variante D ergänzt und somit auf insgesamt fünf erhöht. Bei Experimentalvariante D
handelte es sich um eine Kombination von nicht-mykorrhizierten Pflanzen mit dem
zubeimpften Weißfäulepilz Pleurotus ostreatus. Vordergründig sollte unter Hinzunahme
dieser Variante näher untersucht werden, welchen Beitrag Pflanzen selbst am
Abreicherungsvorgang zu leisten im Stande sind, ohne Einfluss eines Pilzsymbionten. Es
zeigte sich, dass bei der Abreicherung der TNT-Konzentration mit nicht-mykorrhizierten
Pappeln vergleichbar gute Ergebnisse erzielt wurden wie unter Verwendung mykorrhizierter
Pappeln (siehe Abbildung 12). So war nach Ablauf des Versuchs kein signifikanter
Unterschied des TNT-Gehaltes in den Bodenproben der Varianten A, B und D festzustellen.
Signifikant höher blieb die TNT-Konzentration in Variante C, welche unbepflanzt war und
lediglich mit dem Weißfäulepilz Pleurotus ostreatus beimpft wurde. Grundsätzlich anders
war die Situation bei den ADNTs. Die 2-ADNT- und 4-ADNT-Konzentrationen blieben in
Variante D auf einem signifikant höheren Niveau als in den zwei mit mykorrhizierten Pappeln
bestückten Varianten A und B (Abbildung 13). Im Vergleich zu Variante C (nur
Weißfäulepilz) ließ die ADNT-Konzentration in Variante D keinen signifikanten
Abreicherungseffekt erkennen. Die Ergebnisse in den einzelnen Varianten zeigten, dass nichtmykorrhizierte
Pflanzen bei der initialen TNT-Reduktion zum ADNT im Boden einen
effektiven Beitrag leisten konnten. Im fortschreitenden Transformationsverlauf konnte dieser
Trend bei der Eliminierung der ADNTs dagegen nicht mehr beobachtet werden. Hier ließen
die Mykorrhizapilze ein größeres Einflusspotenzial auf die Abreicherungsprozesse erkennen.
Es stellt sich die Frage, in welcher Weise Pflanzen die Abreicherungsvorgänge im
Rhizosphärenboden zu beeinflussen vermögen. Als wesentlicher Faktor ist hier die Abgabe
von Exsudaten aus den Wurzeln in ihre unmittelbare Umgebung zu nennen. In Folge der
Wurzelexsudation und auch der Wurzeldeposition wird der organische C-Gehalt des Bodens
in Wurzelnähe erheblich erhöht (Shimp et al. 1993). So kann über 40% des photosynthetisch
fixierten C durch Exsudation von Zucker, Aminosäuren u. a. wieder in die Rhizosphäre
abgegeben werden. Für Zea mays wurde ein Anteil täglich produzierter wasserlöslicher
Exsudate von 0,4-0,6 mg C je Gramm Wurzeltrockenmasse ermittelt (Yoshitomi und Shann
2001). Cheng et al. (1996) ermittelten einen täglichen Kohlenstoffeintrag von über 1500 µg je
104

Diskussion
Gramm Boden (TS) in die Rhizosphäre. Entsprechend dem verbesserten Angebot
freiverfügbarer Nährstoffe zieht eine hohe Mikrobiomasse mit dazugehöriger erhöhter
metabolischer Aktivität eine deutlich verstärkte Biotransformation organischer Schadstoffe
nach sich, wovon somit auch TNT und Metaboliten betroffen wären. Da TNT-Metabolite die
Neigung haben, an die organische Matrix des Bodens als “bound residues” zu binden, werden
durch den verstärkten Eintrag organischer Substanz aus den Wurzeln außerdem Adsorptionsund
Bindemöglichkeiten verbessert, was wiederum Einfluss auf die Konzentration freier
Nitroaromaten im Boden hat.
Aus den Pflanzenwurzeln können zudem zahlreiche reduktive und oxidative Enzyme in den
Boden gelangen (Adler et al. 1994). Hierbei haben sie eine gewichtige Funktion beim
Streuabbau und bei der Humusbildung. Solche in die Rhizosphäre freigesetzten und in der
Regel substratunspezifischen Enzyme könnten somit eine weitere Ursache für die TNT-
Abreicherung in den Rhizotronen der D-Variante sein. Dass diese Möglichkeit mit hoher
Wahrscheinlichkeit bestand hat, belegen inzwischen vereinzelte Hinweise aus der Literatur.
So erwähnten Schnoor et al. (1995) eine nicht genauer beschriebene pflanzliche
Nitroreduktase, die im Zusammenspiel mit einer Laccase letztendlich sogar zum Aufbrechen
des Aromatenringes führen kann. Sens (1998) gelang der Nachweis von ADNTs in
Pflanzenwurzeln einer sterilen mit 14 C-TNT dotierten Hydrokultur. Ein weiterer Beleg dafür,
dass Pflanzen die Fähigkeit besitzen, TNT zu reduzieren.
Eine weitere mögliche Ursache für die Abreicherung des extrahierbaren TNT im Boden
könnte auch die Adsorption von Nitroaromaten an die Wurzeloberfläche bzw. ihre Aufnahme
in die Pappelwurzeln sein. Diesbezüglich bleibt allerdings festzustellen, dass solche
Adsorptions- und Aufnahmeprozesse im 14 C-Fütterungsversuch mit Kiefern insgesamt nur
eine untergeordnete Rolle bei der Abreicherung spielten, wie im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführte Untersuchungen zeigten (siehe Abschnitt 3.4). Von einem Transfer in die
Pflanze oder einer Bindung an die Wurzeloberfläche waren hier nur geringe Mengen
Nitroaromaten betroffen. Jedoch vermögen allgemein schnellwüchsige Pappeln dem Boden
möglicherweise in wesentlich deutlicherem Ausmaß bioverfügbares TNT bzw. dessen
Metaboliten zu entziehen und in ihren Geweben aufzunehmen. Über die Aufnahme und
Festlegung von Nitroaromaten in Pflanzen wird ausführlich im folgenden Kapitel diskutiert.
105

Diskussion
4.3 Nitroaromaten in Pflanzengeweben
4.3.1 Aufnahme von Nitroaromaten aus dem Boden
Grundsätzlich können nur in der Bodenlösung gelöste Nitroaromaten von den Pflanzen
aufgenommen werden. Liegt das TNT ursprünglich in kristalliner Form im Boden vor, wird
es aufgrund seiner persistenten Eigenschaften nur langsam im Bodenwasser gelöst. Die
Wasserlöslichkeit von TNT beträgt bei 25° C 140 mg/l (Martinetz & Rippen 1996). Für den
Lösungsvorgang mitentscheidend ist dabei auch die Größe der TNT-Partikel. Von kleineren
Partikeln geht im Verhältnis mehr TNT in Lösung als von großen Partikeln. Je kleiner der
Durchmesser der Teilchen, desto größer ist im Verhältnis zur Partikelgröße die Oberfläche
und somit auch die zur Bodenlösung exponierten Fläche (Voudrias & Assaf 1996).
Dissoziieren mehr TNT-Moleküle, erhöht sich dementsprechend auch der Anteil dissoziierter
Transformationsprodukte. Solche Metaboliten, genannt seien hier insbesondere 2-ADNT und
4-ADNT, können für die Pflanzen dann ebenfalls besser verfügbar sein.
Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen über das Transferverhalten
von Nitroaromaten in Pflanzen wurden abgesehen vom TNT außerdem 2-ADNT und 4-
ADNT im Schadstoffspektrum der Pflanzenproben nachgewiesen. Weitere Verbindungen
wurden nicht gefunden. Auch in der Literatur wurden bisher ähnliche Befunde beschrieben.
Unabhängig vom Kultivierungssystem wurden neben dem TNT die beiden ADNTs als
dominierende Kontaminanten in Pflanzen identifiziert (Görge et al. 1994 und 1995,
Thompson et al. 1998, Scheidemann et al. 1998, Schönmuth und Pestemer 2000, Schneider et
al. 1996, Palazzo & Leggett 1986, Hughes et al. 1997, Harvey et al. 1990). DANTs als
unmittelbare Reduktionsprodukte der ADNTs ließen sich in Pflanzengeweben bisher nur in
zwei Fällen in sehr geringen Mengen nachweisen (Thompson et al. 1998, Sens 1998). In
einigen Fällen konnten 2,6-DNT und 2,4-DNT gefunden werden (Görge 1995, Scheidemann
1998, Thompson et al. 1998). Allen Untersuchungen gemeinsam ist die deutliche Dominanz
der ADNTs gegenüber dem TNT im Nitroaromatenspektrum der Pflanzen. Eine weitere
Gemeinsamkeit liegt in der Tatsache begründet, dass die nachweisbare Nitroaromatenkonzentration
stets eine hohe Organspezifität aufwies. Die Wurzeln der untersuchten Pflanzen
waren mit deutlichem Abstand anteilig am höchsten belastet. Die Sprosse waren auffällig
niedriger, z. T. gar nicht belastet. In den Kiefernnadeln wurde für den Gehalt der 14 C-
Radioaktivität mit zunehmender Versuchsdauer eine rückläufige Tendenz beobachtet.
Möglicherweise könnte dieses Ergebnis als ein Indiz dafür angesehen werden, dass 14 C-TNT-
Metaboliten in den Nadeln zum Teil veratmet und als 14 CO 2 in die Atmosphäre freigesetzt
wurde. Zu berücksichtigen ist hierbei allerdings das insgesamt sehr niedrige Belastungsniveau
in den Blattorganen der Kiefern über den gesamten Versuchsverlauf. In den Nadeln wurde bei
hoher Dotierung anteilig unter 0,1% und in den Stämmchen maximal 0,5% der
106

Diskussion
Gesamtaufnahmemenge nachgewiesen. Thompson et al. (1998) konnten nach 14 C-TNT-
Applikation bei Hybridpappeln keine respiratorische 14 CO 2 -Freisetzung detektieren.
In Abschnitt 3.4 sind Verteilung und Wiederfindung der eingesetzten Radioaktivität nach 14-
tägiger Fütterung in den jeweiligen Fraktionen aus dem 14 C-Dotierungsversuch aufgeführt.
Nur der geringste Teil des ursprünglich applizierten 14 C konnte mittels Szintillationszählung
später in den mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten Wurzelfraktionen der Kiefern
detektiert werden. Der weitaus größte Teil des 14 C befand sich im getränkten Kohlepapier, im
nicht von den Pflanzen aufgenommenen Gießwasser oder als Anhaftungen an den Wänden
der Petrischalen. Mikroautoradiographisch konnte zudem gezeigt werden, dass große Anteile
der mittels Szintillationszählung in den Wurzeln detektierten 14 C-TNT und 14 C-Metaboliten
nicht tatsächlich von den Zellen aufgenommen waren, sondern den Wurzeln äußerlich nur
anhafteten. Demzufolge lag der Anteil von den Wurzeln inkorporierter 14 C-Mengen noch
wesentlich niedriger, als mittels Szintillationszählung ermittelt wurde. Für die untersuchten
Kiefern dürfte die tatsächliche Aufnahmerate nach 14-tägiger Applikation unter 1% gelegen
haben, wobei es keine Rolle spielte, ob die Wurzeln mykorrhiziert oder nicht-mykorrhiziert
waren. Aufnahmeexperimente mit 14 C-TNT liegen auch von anderen Pflanzenspezies vor.
Schönmuth und Pestemer (2000) fanden nach 60tägiger Applikation in Topfkulturen mit
Altlastenboden in Fichten (Picea abies) immerhin 39% der eingesetzten Radioaktivität
wieder. In Sandboden betrug die Wiederfindungsrate für Fichten sogar 77%. Auch Weiden
(Salix-Hybride EW-20) erreichten in Sandkultur mit 72% ähnlich hohe Aufnahmeraten.
Thompson et al. (1998) erreichten mit Pappelhybriden in Flüssigkultur nach 20tägiger
Inkubation 14 C-TNT Aufnahmeraten von über 80%, in Bodenkultur war die Aufnahmerate
mit 25% dagegen wesentlich niedriger. In Anbetracht dieser Ergebnisse sind mehrere
Rückschlüsse erlaubt. Zum einen haben verschiedene Pflanzenspezies vermutlich ein
unterschiedliches Aufnahmevermögen für TNT und Metaboliten. Schnellwüchsige Pappelund
Weiden-Hybride mit einem besonders starken Wurzelwachstum vermögen dem Boden
wesentlich mehr bioverfügbares TNT zu entziehen und aufzunehmen als weniger
schnellwüchsige Arten, wie z. B. Kiefern mit einem mäßigen Wurzelwachstum. Zum anderen
ist die Aufnahme in Pflanzen stark von der Bioverfügbarkeit im Boden abhängig. Im
Vergleich zu künstlich hergestellten Quarzsandsubstraten oder Flüssigkulturen waren die
Aufnahmeraten aus den ton- und humushaltigen Standortböden deutlich niedriger. In ihrer
Ursache dürfte die herabgesetzte Pflanzenverfügbarkeit in den verschiedenen
Wechselwirkungen zwischen TNT und seinen Metaboliten mit den Bestandteilen der
Bodenmatrix begründet liegen. Kritisch angemerkt werden muss allerdings, dass weder bei
Schönmuth und Pestemer (2000) noch bei Thompson et al. (1998) die Wurzeln genauer
daraufhin untersucht wurden, in welchen Anteilen die gemessene Radioaktivität tatsächlich in
den Wurzeln oder nur äußerlich anhaftend lokalisiert war. Demzufolge könnten die
tatsächlichen Aufnahmeraten wesentlich niedriger liegen als angenommen wurde. Im
Hinblick auf Phytoremediationsverfahren gilt es deshalb in Zukunft noch genauer zu
107

Diskussion
untersuchen, in welcher Größenordnung Pflanzen zur Aufnahme von TNT und dessen
Metaboliten aus dem Boden befähigt sind, wobei Wachstumsaktivität und
Transpirationsfähigkeit noch stärker berücksichtigt werden müssen. Wichtig ist außerdem die
Frage, ob aufgenommene Nitroaromaten in Pflanzengeweben akkumulieren oder zügig
metabolisiert bzw. in die Pflanzenmatrix eingebaut werden. Nach Schönmuth und Pestemer
(2000) ließ sich etwa 80% der aufgenommenen TNT-Radioaktivität selbst mit Essigsäure
nicht extrahieren. Entsprechende Beobachtungen machten Thompson et al. (1998) mit
Hybrid-Pappeln. In eigenen Versuchen ließen sich große Teile der analytisch erfassten
Nitroaromaten erst nach Säurehydrolyse mit anschließender Alkalisierung aus den
Pflanzengeweben der Pappeln extrahieren (siehe Tabelle 17), wobei auch hier von nicht
extrahierten Resten auszugehen ist. Vergleichbare Erfahrungen wurden auch von Görge et al.
(1994 und 1995), Sens (1998) und Scheidemann (1998) beschrieben. Insgesamt sprechen
diese Ergebnisse für umfassende Metabolisierungs- und Festlegungsvorgänge in Pflanzen.
Untermauert wird dies durch die Feststellung, dass bei 14 C-TNT-Versuchen große Teile des in
den Pflanzen gefundenen 14 C in Form nicht-identifizierter polarer Bestandteile, bzw. als
gebundene Rückstände, den so genannten “bound residues”, vorzufinden waren (Sens 1998,
Thompson et al. 1998). Des Weiteren sind die Transformationsvorgänge in den Pflanzen
artspezifisch. So waren bei Phaseolus vulgaris und bei Triticum aestivum die Anzahl der
polaren Metaboliten und ihr Anteil an der ermittelten Gesamtradioaktivität verschieden (Sens
1998). Artspezifisch sind möglicherweise auch Akkumulation und Festlegung in den
unterschiedlichen Organen. Während in den Kiefernnadeln kaum erhöhte Radioaktivität
nachgewiesen wurde (siehe Abbildungen 26-29), fanden Thompson et al., (1998) bereits nach
wenigen Tagen in den Blättern von Hybrid-Pappeln teilweise über 10% der applizierten
Radioaktivität wieder und konnten somit einen Transfer von 14 C-TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten
in die Blätter nachweisen. In Fichtennadeln wurden nach 60 Tagen Applikation zwischen 2
und 5% der Radioaktivität wieder gefunden (Schönmuth und Pestemer 2000). In den hier
gaschromatographisch untersuchten Pappelproben (Populus tremula) ließen sich teilweise
TNT und die beiden ADNTs im oberirdischen Sprossteil finden. Da Blatt- und Stammanteile
nicht getrennt sondern als Mischproben analysiert wurden, konnte eine weiterführende
organspezifische Aufgliederung nicht durchgeführt und ein gesicherter Nachweis von
Nitroaromaten in den Pappelblättern nicht mit letzter Sicherheit beschrieben werden.
Bei der Erprobung von Pflanzen bezüglich ihrer Rolle in der Nitroaromatentransformation
wurde der Aspekt der Mykorrhiza bisher kaum berücksichtigt. Angaben über das Aufnahmeund
Akkumulationsverhalten von Nitroaromaten in den Pilzpartner der Mykorrhiza sind in
der Literatur nicht zu finden. Für andere aromatische Xenobiotika ist das Aufnahmeverhalten
in Mykorrhizapilze inzwischen besser untersucht. So gelang Dittmann (1999) röntgenmikroanalytisch
3-Chlorbenzoesäure intrazellulär im Hyphenmantel von Suillus bovinus/Pinus
sylvestris Mykorrhizen nachzuweisen. Hier kam es insbesondere zu einer Akkumulation in
den Vakuolen der Hyphen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten mikroauto-
108

Diskussion
radiographischen Untersuchungen an mykorrhizierten Kiefernwurzeln lassen Aussagen über
Aufnahme und Verteilung von 14 C-TNT und 14 C-TNT-Metaboliten auf zellulärer Ebene im
Hyphenmantel nicht zu. Allerdings konnte eine erhöhte Radioaktivität aufgrund
akkumulierender Silberkörner im Bereich der Hyphenmäntel insgesamt nicht beobachtet
werden. Grundsätzlich hatte die Mykorrhizierung keinen deutlichen Effekt auf den
Nitroaromatengehalt in den Wurzeln. So ließen sich weder mittels Szintillationszählung in
den mykorrhizierten Kiefernwurzeln noch durch gaschromatographische Untersuchungen in
den mykorrhizierten Pappelwurzeln erhöhte Werte gegenüber nicht-mykorrhizierten Wurzeln
detektieren, wobei im letzteren Fall bereits festgelegte Bestandteile von der GC-MS-Analytik
nicht erfasst wurden und somit von der Bilanzierung ausgenommen waren. Insgesamt
betrachtet gilt es, den anteiligen Mykorrhizaeffekt bezüglich der Nitroaromatenaufnahme in
die Pflanze noch genauer zu untersuchen, insbesondere unter dem Aspekt der artspezifischen
Wurzelwüchsigkeit. Möglicherweise müssen auch seitens des Pilzsymbionten hervorgerufene
artspezifische Mykorrhizaeffekte mehr Berücksichtigung finden.
4.3.2 Kiefern als Versuchspflanzen bei der Applikation mit 14 C-TNT
Die mittels Gaschromatographie detektierten Nitroaromatenkonzentrationen in den
Pappelproben (siehe Pappelexperiment 3.3.4) erlauben letztendlich keine genaue
Quantifizierung des tatsächlichen Schadstofftransfers in die Pflanzen, da analytisch nur ein
Teil der vielen möglichen Transformationsprodukte erfasst bzw. identifiziert werden konnte.
Außerdem sind von der GC-MS-Analyse bereits in den Pflanzenkörper fest inkorporierte
Rückstände in Teilen ausgenommen. Deshalb wurde im Anschluss an das Pappelexperiment
in einem gesonderten Versuch mit Kiefern eine Applikation mit einer definierten Menge 14 C-
TNT durchgeführt, um Aufnahmeraten und den
14 C-Gehalt in den Pflanzenproben
abschließend genauer bilanzieren zu können. Da die Ergebnisse bisher durchgeführter
Versuche zur TNT-Aufnahme in die Pflanze Hinweise auf ein artspezifisches Transfer-,
Akkumulations- und Transformationsverhalten geben, wäre es im Hinblick auf die
Verwendung einer einheitlichen Pflanzenlinie in den jeweiligen Versuchen zu wünschen
gewesen, auch im
14 C-Experiment für eine bessere Vergleichbarkeit auf Pappeln
zurückzugreifen. Aus mehreren praktischen Gründen konnte dieses Vorhaben nicht
verwirklicht werden. Im 14 C-Experiment wurde auf die Inokulation und Infektion der
Pflanzen mit nur einem definierten Mykorrhizapilz abgezielt. Deshalb war es unabdingbar,
die Versuchspflanzen aus zuvor oberflächensterilisiertem Saatgut anzuziehen, damit
Fremdinfektionen mit anderen Pilzen weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Da
Pappelsamen nur für kurze Zeit nach der Reife keimungsfähig bleiben ist eine Anzucht von
Pflanzen aus Samen allgemein sehr schwierig. Auf die Anzucht von Pappeln aus Saatgut
wurde daher verzichtet. Zudem ließen sich in eigens durchgeführten Vorversuchen junge
Pappelpflänzchen nach gezielter Beimpfung mit unterschiedlichen Mykorrhizapilzen bei
109

Diskussion
niedriger Erfolgsquote kaum erfolgreich infizieren, was möglicherweise allgemein für Arten
mit einem starken Wurzelwachstum zutrifft. Letztendlich wurde deshalb bei der
Durchführung der Radiotracer-Untersuchung auf die in der Arbeitsgruppe etablierte Pinus
sylvestris/ Pisolithus tinctorius Mykorrhiza zurückgegriffen. Beide Organismen dieser
Symbiose ließen sich problemlos in den bewährten Rhizotronsystemen halten und
garantierten hohe Mykorrhizierungsraten.
4.3.3 Nitroaromatenaufnahme in die Wurzeln
Prinzipiell kann die Aufnahme organischer Stoffe aus der Bodenlösung in die Pflanzen passiv
durch Diffusion oder Massenfluss erfolgen (Marschner 1995, Trapp 1995). Entsprechendes
dürfte auch für Pilze gelten. Allerdings wird die Aufnahme stark von den lipophilen
Eigenschaften des Moleküls bestimmt. Als Maß für die Lipophilie eines Stoffes kann der
Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (K OW ) herangezogen werden. Dieser Verteilungskoeffizient
definiert das Verteilungsverhältnis einer Substanz zwischen der Octanol- bzw. der
Wasserphase, wobei das Octanol als Modell-Lösungsmittel zur Simulierung des Lipidanteils
biologischer Membranen dient. Aufgenommen werden lipophile Substanzen mit einem log
K OW zwischen 0,5 und 3,0 (Briggs et al. 1982 in Schnoor et al. 1995). In der Regel adsorbiert
das Schadstoff-Molekül zuerst an der Wurzeloberfläche, um dann über die Biomembran in
die Wurzelzelle passiv einzudringen (Shone & Wood 1972). Sehr lipophile Substanzen mit
einem log K OW > 3,0 sind dagegen kaum bioverfügbar, da sie zu stark sorbiert sind. Zum
einen erschwert die starke Bindung an die Wurzeloberfläche eine Aufnahme durch die
Zellmembran erheblich, zum anderen adsorbieren sie stark an die organische Bodenmatrix.
Letzteres ist nicht verwunderlich, da die organische Bodensubstanz (Humus) im Wesentlichen
aus pflanzlichen Materialien entsteht und die Sorptionseigenschaften von Boden und Wurzeln
für sehr lipophile organische Stoffe deshalb als ähnlich anzusehen sind. Sehr polare,
hydrophile Stoffe mit einem log K OW < 0,5 sorbieren nicht genügend an Wurzeln. Außerdem
wird die Aufnahme durch den Widerstand der Zellmembran gehemmt (Briggs et al. 1982 in
Schnoor et al. 1995, Trapp 2000). Der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient beträgt für
TNT log K OW 1,65 (Palazzo & Legget 1983), für 2-ADNT log K OW 1,59 und für 4-ADNT log
K OW 1,31 (Görge 1994 in Martinetz & Rippen 1996). Aufgrund ihrer lipophilen
Eigenschaften und mit den entsprechenden Koeffizienten ist es diesen Nitroaromaten also
möglich, Biomembranen zu durchdringen. In Anbetracht des nachgewiesenen
Schadstoffspektrums der Wurzeln mit einer auffälligen Dominanz von 2-ADNT und 4-ADNT
gegenüber dem TNT wäre einerseits eine Aufnahme des transformierten TNT nach
mikrobieller Reduktion im wurzelnahen Raum als ADNT durchaus vorstellbar, zumal sich
auch in anderen Untersuchungen die ADNTs stets als dominante Schadstoffgruppe in den
Wurzeln nachweisen ließen (u. a. Görge et al. 1995, mit verschiedenen krautigen Pflanzen;
Schönmuth und Pestemer 2000, mit Salix spec. und Picea abies; Thompson et al. 1998, mit
110

Diskussion
Populus spec.). Andererseits besteht auch die Möglichkeit einer raschen Transformation des
aufgenommenen TNT zu ADNT innerhalb der Pflanzen, wonach die Dominanz der ADNTs
letztendlich auf eine Metabolisierungsleistung der Pflanzen zurückzuführen wäre. Dass das
TNT in die Wurzeln transferiert wird, zeigten u. a. auch die Schadstoffspektren dieser Arbeit
und zahlreiche weitere in der Literatur beschriebene Untersuchungen, und dass TNT von
Pflanzen reduziert werden kann, belegen Experimente mit Triticum aestivum unter sterilen
Bedingungen (Sens et al. 1999). So ließen sich ADNTs in den Wurzeln aus Pflanzen
nachweisen, denen unter sterilen Bedingungen in Hydrokultur 14 C-TNT appliziert wurde.
Bezogen auf die hier durchgeführten Versuche kann letztendlich nicht beantwortet werden, in
welchem Umfang das TNT direkt oder nach Transformation im Boden als ADNT in die
Pflanzen gelangt ist. Zu berücksichtigen bleibt die Tatsache, dass vermutlich beide
Möglichkeiten bestehen. Berücksichtigt werden muss außerdem die Tatsache, dass neben
TNT und den ADNTs vermutlich noch weitere im Boden gebildete unpolare und lipophile
TNT-Metaboliten mit einem logK OW zwischen 0,5 und 3,0 aufgrund ihrer
Membrangängigkeit ebenfalls diffusiv ihren Weg aus der Bodenlösung in die Wurzeln
fanden. Für geladene Metaboliten mit einem zu niedrigen Octanol–Wasser–
Verteilungskoeffizienten ist eine Diffusion durch Membranen dagegen kaum möglich.
4.3.4 Apoplastischer Transport
Wie bereits in der Einleitung beschrieben wurde, bildet der Pilzsymbiont einer Mykorrhiza
ein mehr oder weniger dichtes Hyphengeflecht, den so genannten Hyphenmantel, um die
ektotroph mykorrhizierten Feinwurzeln der Wirtspflanze aus. Ein direkter Kontakt der
Wurzelzellen mit dem umgebenden Bodenmilieu wird durch diesen Hyphenmantel
unterbunden. Verursacht durch eine interzelluläre Matrix diskutieren verschiedene Autoren
außerdem eine apoplastische Blockade und somit eine Impermeabilität des Hyphenmantels
aufgrund einer interzellularen Matrix (Ashford et al. 1988 und 1989, Bücking 1995, Smith
und Read 1997). Demzufolge wäre die mykorrhizierte Pflanze in ihrer Nährstoffaufnahme
vollständig vom pilzlichen Symbiosepartner abhängig. Dass diese Annahme nicht
uneingeschränkt gilt, zeigten Versuche mit verschiedenen Pinus sylvestris-Mykorrhizen, bei
denen eine apoplastische Permeabilität des Hyphenmantels für mehrere Tracer nachgewiesen
werden konnte (Behrmann 1995, Behrmann und Heyser 1992). Es ist deshalb davon
auszugehen, dass die Wasseraufnahme und damit verbunden auch die Nährstoffaufnahme in
die Wurzel nicht gänzlich vom Pilzsymbionten kontrolliert wird. Eine apoplastische
Permeabilität des Hyphenmantels konnte auch an Picea abies/Hebeloma crustuliniforme
Ektomykorrhizen nachgewiesen werden (Scheidegger und Brunner 1995). Insofern dürfte
deshalb grundsätzlich die Möglichkeit eines apoplastischen Transportes von TNT/TNT-
Metaboliten durch den Hyphenmantel für die in dieser Arbeit untersuchten Ektomykorrhizen
nicht auszuschließen sein. Behrmann (1995) konnte eine unterschiedliche apoplastische
111

Diskussion
Permeabilität des Hyphenmantels entlang der Wurzelachse feststellen. Im jüngeren
Wurzelbereich zeigte sich der Hyphenmantel durchlässiger als im basalen Abschnitt, so dass
die Stoffe hier bevorzugt in das Hartigsche Netz gelangten, was vermutlich auf den
kompakteren Aufbau des Hyphenmantels an der Wurzelbasis zurückzuführen war. Im
Interface, das als Kontaktzone gemeinsam von den Zellwänden beider Symbionten gebildet
wird, treten die Stoffe auch in die Rhizodermis- und Rindenzellwände der Wirtspflanze über.
Apoplastisch können Stoffe wie TNT und seine Metabolite nun bis zur Endodermis gelangen.
Bei nicht mykorrhizierten Wurzeln beginnt der apoplastische Weg der im Bodenwasser
gelösten niedermolekularen Stoffe in den Zellwänden der Rhizodermis. Auch hier erfolgt das
Eindringen in den leicht zugänglichen „Freien Raum“ (Apparent Free Space, AFS) passiv und
nicht selektiv durch Diffusion. Sind Metabolite wie ADNTs und DANTs im sauren Milieu
des Apoplasten positiv geladen, kann eine Bindung an Zellwandbestandteile erfolgen. Für
solche Substanzen muss der AFS dann in den „Wasserfreiraum“ (Water Free Space, WSF)
und den „Donnan-Freiraum“ (Donnan Free Space, DFS) unterteilt werden. Im DFS wäre
insbesondere eine Bindung durch die Carboxylgruppen der Polygalacturonsäure des
Protopektins möglich (Marschner 1995), während der WFS für Ladungsträger frei
permeierbar bleibt. Die mikroautoradiographischen Untersuchungen zeigten, dass ein
ausschließlich apoplastischer Transport von TNT und dessen Metaboliten bis zur Endodermis
beim Aufnahmeprozess in die Wurzel vermutlich kaum eine Bedeutung hat. Nur sehr
vereinzelt ließ sich Radioaktivität, verursacht durch mobile oder festgelegte TNT/TNT-
Metaboliten mikroautoradiographisch im Bereich der Zellwände der Rindenzellen
detektieren. Wahrscheinlicher ist eine Aufnahme durch die Plasmamembran ins Zellinnere
nach kurzer apoplastischer Diffusion bereits im Bereich der Rhizodermis. Diese Annahme
wird durch das gehäufte Auftreten von Radioaktivität im Inneren der Rhizodermiszellen
erhärtet. Trotzdem kann die Möglichkeit für eine apoplastische Diffusion bis zur Endodermis
prinzipiell nicht ausgeschlossen werden. Nach gängiger Lehrmeinung wird der apoplastische
Transport von Substanzen über die primäre Rinde in den Zentralzylinder der Wurzel durch
den Casparyschen Streifen in den Radialwänden der Endodermis effektiv unterbunden.
Demzufolge müssten die Teilchen spätestens an der Endodermis das Plasmalemma
überwinden, um letztendlich symplastisch durch die Plasmodesmen in den Zentralzylinder
gelangen zu können. Allerdings ist eine grundsätzliche Sperrwirkung möglicherweise nicht
gegeben. Untersuchungen von Behrmann (1995) zeigten eine gewisse Durchlässigkeit
Casparyscher Streifen primär ausdifferenzierter Endodermen verschiedener
Kiefernmykorrhizen für mehrere Fluoreszenzfarbstoffe und das Schwermetall Lanthan.
Außerdem bleibt festzustellen, dass auch in jungen Bereichen der Wurzel nahe der
Wurzelspitze, dort, wo in den Radialwänden der Endodermis der Casparysche Streifen noch
fehlt oder auch über das Apikalmeristem ein apoplastischer Transport molekularer Teilchen in
den Zentralzylinder grundsätzlich möglich ist (Steudtle et al. 1987, Peterson et al. 1986,
Behrmann 1995). Jedoch ließ sich mikroautoradiographisch im apikalen und subapikalen
112

Diskussion
Bereich mykorrhizierter als auch nicht-mykorrhizierter Wurzeln kaum nennenswerte
Radioaktivität weder in den Zellwänden noch innerhalb der Zellen nachweisen. Ein
Aufnahmeweg für TNT/TNT-Metaboliten über die Wurzelspitze in den Zentralzylinder spielt
deshalb vermutlich kaum eine Rolle.
Dass TNT/TNT-Metaboliten in die Xylem-Leitungsbahnen von Pflanzen transportiert
werden, belegen neben den eigenen Untersuchungen auch Experimente mit 14 C-TNT von
Sens (1998). Dass der Weg dorthin zumindest bei den hier untersuchten Kiefern
hauptsächlich symplastisch über das Cytoplasma und durch die Plasmodesmen erfolgt, kann
aufgrund der nachgewiesenen Radioaktivität im Zellinnern angenommen werden.
4.3.5 Symplastischer Transport
TNT sowie 2-ADNT und 4-ADNT sind aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften gut
membrangängig. Selektive Aufnahmeprozesse von TNT und dessen Metaboliten in die Pilzbzw.
Pflanzenzellen sind unwahrscheinlich. Die Aufnahme dieser Substanzen in die Zellen
erfolgt passiv durch Diffusion aufgrund einer Gleichgewichtseinstellung zwischen der
Bodenlösung und den mykorrhizierten bzw. nicht-mykorrhizierten Wurzeln. In den
Pilzhyphen mykorrhizierter Wurzeln ist prinzipiell ein passiver Transport mit der
cytoplasmatischen Strömung bis zur Interface denkbar. Die Löslichkeit von TNT in Wasser
ist mit etwa 130 mg/l relativ gut. Möglichkeiten zur Wechselwirkung mit Wasser bietet das
Molekül über die freien Elektronenpaare der Sauerstoffatome in den Nitrogruppen, die als
Wasserstoff-Brücken-Akzeptoren fungieren. TNT besitzt keinen pKa-Wert, da die
funktionellen Gruppen nicht protoniert oder deprotoniert werden. Eine Ionisierung durch
Protonierung mit sinkendem pH-Wert wie im Fall aromatischer Amine tritt also nicht ein. Das
TNT-Molekül behält sowohl beim Eintritt ins neutrale Cytoplasma (pH-Wert 6,8-7,4; nach
Smith & Raven 1979), als auch im sauren Milieu des Apoplasten beim Übertritt in die
gemeinsame Austauschzone, der pH-Wert des Apoplasten steriler und mykorrhizierter
Wurzeln variiert zwischen 3 und 4 (Nenninger 1995 und 1999), seine membrangängigen
Eigenschaften und kann ungehindert ins Zellinnere der Wurzelzellen diffundieren. Wiederum
mit der cytoplasmatischen Strömung wäre in der Wurzel ein symplastischer Transport über
die Plasmodesmen durch die Endodermis in den Zentralzylinder denkbar. Aufgrund seiner
lipophilen Eigenschaften ist letztendlich ein Durchtritt des Moleküls durch die
Plasmamembran der Xylemparenchymzellen und somit in den Apoplasten der Xylem-
Tracheiden möglich. Auch die ADNTs büßen beim Eintritt ins Cytoplasma des Zellinneren
nichts von ihrem lipophilen Charakter und ihrer Membrangängigkeit ein und können relativ
gut bis zu den Wasserleitelementen des Xylems diffundieren. Bei 2-ADNT und 4-ADNT
üben jeweils die beiden Nitrogruppen einen starken Elektronenzug auf das restliche Molekül
aus. Das freie Elektronenpaar am Stickstoffatom der Aminogruppe steht deshalb für eine
Protonierung kaum zur Verfügung (Kraß 1998). 4-ADNT besitzt einen entsprechend
113

Diskussion
niedrigen pK a -Wert von 1,21 (für 2-ADNT liegt kein pKa-Wert vor), d. h. erst bei einem sehr
niedrigen pH-Wert von 1,21 sind 50% der 4-ADNT-Moleküle protoniert. Ist der pH-Wert um
drei Einheiten auf 4,21 erhöht, beträgt der Anteil protonierter Moleküle lediglich noch 0,1%.
Von wesentlicher Bedeutung für den symplastischen Transport von Zelle zu Zelle ist die
Durchlässigkeit der Plasmodesmen für Substanzen. Durch Mikroinjektion fluoreszenzmarkierter
Moleküle ließ sich die Durchgängigkeit für Stoffe bis etwa 1 kDa
Molekulargewicht nachweisen (Robards und Lucas 1990, Lucas 1997). Hiernach ist nicht nur
eine intrazelluläre Diffusion von Zuckern, verschiedenen Signalstoffen und Ionen möglich,
sondern auch der Durchtritt von TNT und dessen Metaboliten. Bisher blieb die molekulare
Architektur dieser symplastischen Verbindungen wenig untersucht, wobei inzwischen
feststeht, dass Plasmodesmen mit unterschiedlicher und bisweilen komplizierter Struktur
vorkommen (Blackman und Overall 2001). Mittlerweile belegen neuere Untersuchungen die
Möglichkeit zum Durchtritt weitaus größerer Moleküle, u. a. für Proteine mit
Größenordnungen über 50 kDa, wobei die Öffnungen hierzu erweitert werden können
(Crawford und Zambryski 2000).
4.3.6 Metabolismus der aufgenommenen Nitroaromaten
4.3.6.1 Orte der Metabolisierung
Außer TNT, 2- und 4-ADNT konnten in wenigen Fällen geringe Mengen 2,4- und 2,6-DNT
bisher aus Pflanzen extrahiert und identifiziert werden (Görge et al. 1994 und 1995,
Thompson et al. 1998, Scheidemann et al. 1998, Schönmuth und Pestemer 2000, Schneider et
al. 1996 u.a.). Thompson et al. (1998) gelang es, 2,4-DANT in jungen Hybrid-Pappeln
nachzuweisen. Des Weiteren ließen sich noch zahlreiche überwiegend polare nicht
identifizierte aus dem TNT-Metabolismus hervorgegangene Verbindungen in Pflanzen
finden. Aus Phaseolus vulgaris wurden insgesamt 10 unpolare, 17 polare und 3 sehr polare,
aus Triticum aestivum 3 unpolare und 13 polare Metaboliten gewonnen und
dünnschichtchromatographisch aufgetrennt (Sens 1998). Auch in Geweben von
Hybridpappeln wurden mehrere nicht identifizierte polare TNT-Metaboliten gefunden
(Thompson et al. 1998).
Die Aufnahme von Xenobiotika in Zellen von Pflanzen und Pilzen setzt lipophile
Eigenschaften dieser Stoffe voraus. Bei Pflanzen erfolgt die zelluläre Detoxifizierung
aufgenommener Schadsubstanzen entweder durch chemische Transformation oder durch
Kompartimentierung (Coleman et al. 1997). Für Pilze sind vergleichbare Prozesse
anzunehmen. So wird die Vakuole von Pilzen beispielsweise als Kompartiment zur
Ablagerung von Schwermetallen verwendet. Die Detoxifizierung wird durch eine Bindung
der Schwermetalle über SH-Gruppen der Cystein-Bausteine an Phytochelatine oder
Metallothionine erreicht (Richter 1998). Die aus der Transformation hervorgehenden
114

Diskussion
Folgemetaboliten haben in der Regel ein geringeres toxisches Potential für den Organismus,
außerdem sind sie häufig polarer und damit hydrophiler als die Ausgangssubstanzen. In
Phaseolus und Triticum sowie in Hybrid-Pappeln ließen sich zahlreiche polare Metaboliten
nachweisen (Sens 1998 und Thompson et al. 1998). In Tomatenpflanzen konnte für 4-
Nitrophenol die Bildung eines 4-Nitrophenyl-ß-D-Glucopyranosid und damit eine Erhöhung
der Polarität der entstandenen Verbindung beobachtet werden (Wallnöfer et al. 1996). Mit
zunehmender Polarität wird eine weitere Ausbreitung aufgrund einer herabgesetzten
Durchlässigkeit für Membranen erschwert und somit eine gewisse “Festlegung“ durch
Kompartimentierung erreicht. Diese Möglichkeit der Detoxifikation aufgenommener
Nitroaromaten kann auch für die hier untersuchten mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten
Kiefern angenommen werden. Insbesondere in den Rindenzellen konnte mikroautoradiographisch
eine Verteilung der Radioaktivität über das gesamte Zelllumen, folglich
auch eine Verteilung in den Vakuolen nachgewiesen werden. Allerdings sei an dieser Stelle
noch mal darauf hingewiesen, dass die in den Pflanzen detektierten Mengen an TNT/TNT-
Metaboliten stets auf niedrigem Niveau blieben. Auch in den gaschromatographisch
untersuchten Pappelproben wurden, abgesehen von den ADNTs, relevante Mengen weiterer
polarer Verbindungen nicht gefunden.
Allgemein wird die Biotransformation von aufgenommenen Xenobiotika in Phase-I- und
Phase-II-Reaktionen unterteilt (Coleman et al. 1997, Zhang et al. 1996). Eine entsprechende
Einteilung ist auch auf Metabolisierungsvorgänge von Nitroaromaten übertragbar. Die Phase-
I-Reaktionen sind überwiegend durch enzymatisch katalysierte Reduktions- und
Oxidationsvorgänge an den Nitroaromaten geprägt. Entstehende Metaboliten können dann in
Phase-II-Reaktionen über Konjugationen an Gluthathion, Glukose und andere Zucker,
Aminosäuren und weiteren Verbindungen verknüpft werden.
Phase-I-Mechanismen
Zahlreiche Enzyme katalysieren die Reduktion von Nitroaromaten in prokaryotischen als
auch in eukaryotischen Zellen. In Frage kommen hierfür insbesondere Cytochrom c-
Oxidoreduktasen und Cytochrom P-450-Oxidoreduktasen (Cerniglia und Somerville 1995). In
Arabidopsis thaliana konnte die Reduktion von TNT durch eine NADPH-abhängige
Thioredoxin-Reduktase nachgewiesen werden (Miskiniene et al. 1998). Insgesamt bleibt
festzustellen, dass die eigentliche Funktion dieser Enzyme nicht die Reduktion von
Nitroaromaten ist, da natürlich vorkommende Nitroverbindungen in sehr geringer Zahl
auftreten. Als wesentlich dominante Kontaminanten treten in Pflanzen in der Regel 2-ADNT
und 4-ADNT auf. DANT als reduktives Folgeprodukt des ADNT konnte bisher nur in sehr
wenigen Ausnahmefällen in Hybrid-Pappeln bzw. in Phaseolus gefunden werden (Thompson
et al. 1998, Sens et al. 1999). Die reduktive Transformation bis zum DANT dürfte demnach in
Pflanzen eine untergeordnete Rolle spielen. Eine vollständige Reduktion des TNTs bis zur
115

Diskussion
Stufe des Triaminotoluols kann unterdessen ausgeschlossen werden, da eine vollständige
Reduktion aller drei Nitrogruppen nur im strikt anaeroben Milieu erfolgt und entsprechende
Bedingungen in Pflanzen nicht vorliegen.
Bedeutsamer und verbreiteter im Transformationsverlauf von Nitroaromaten sind
möglicherweise durch Mono- und Dioxygenasen katalysierte Metabolisierungsschritte.
Oxidative Angriffe als Transformationsreaktionen an Aminonitrotoluolen sind durchaus
vorstellbar. Für den weiteren oxidativen Angriff kommen zudem diverse extrazellulär
transformierte und anschließend in die Zellen aufgenommene TNT-Metaboliten in Frage.
Membrangebundene Monooxygenasen katalysieren den Einbau nur eines O-Atoms in das
Kohlenstoffgerüst und kommen zahlreich in Pflanzenzellen vor. Als Beispiel sei hier die
Cytochrom P 450 Monooxygenase genannt. Mit Cytochrom P 450 als O 2 -Bindungsstelle
katalysiert dieses Enzym die Oxidation von Phenylpropanen, welche als Ligninvorstufen in
die Ligninsynthese eingehen. Eine unter zahlreichen Bakterien nachgewiesene
Monooxygenasereaktion ist die durch oxidativen Angriff hervorgerufene Nitritabspaltung
beim 4-Nitrophenol (Kadiyala und Spain 1998), wobei das dabei entstehende
Trihydroxyphenol letztendlich einer Ringspaltung unterliegt und weiter metabolisiert wird.
Auch über Hydrochinon als Zwischenprodukt konnte eine mikrobielle Metabolisierung des 4-
Nitrophenols (Gattung Arthrobacter) beobachtet werden (Hanne et al. 1993). Auch
Dioxygenasen sind in Pflanzen zahlreich verbreitet. Sie katalysieren eine
Doppelhydroxylierung des Aromaten. Die häufig vorkommende Lipooxygenase katalysiert
die Dioxygenierung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren Linol- und Linolensäure. Die
Hydroperoxylinolensäure wird durch die Hydroperoxid-Ligase gespalten (Heldt 1996). Für
verschiedene Nitroaromaten, wie 1,3-Dinitrobenzol, 2,4-Dinitrotoluol, 2,6-Dinitrotoluol u.a.,
konnte inzwischen die mikrobielle Transformation durch Dioxygenasen nachgewiesen
werden (Nishino et al. 2000a und 2000b, Spanggord et al. 1991). Dinitrotoluole wurden in
Phaseolus vulgaris (Görge et al. 1994, Scheidemann 1998 und Sens 1998) sowie in Medicago
sativa und Phleum spec. (Scheidemann 1998) nachgewiesen.
Phase-II-Mechanismen
Durch Phase I-Reaktionen entstandene TNT-Metaboliten können vermutlich über Phase-II-
Reaktionen weiter metabolisiert und über Konjugationen gebunden werden. Die Konjugate
liegen entweder gebunden oder mobil in der Pflanze vor. Eine feste Bindung von TNT und
dessen Metabolite ist unter anderem mit der Ligninfraktion sehr wahrscheinlich. Mobile
Konjugate können vorerst kompartimentiert werden und erfahren somit eine gewisse
zwischenzeitliche Festlegung. Aus dem Ergebnisteil dieser Arbeit geht hervor, dass ein großer
Teil der ADNTs erst nach Säurehydrolyse mit anschließender Alkalisierung aus dem
pflanzlichen Material extrahiert werden konnte, was auf eine Konjugation mit pflanzlichen
Bestandteilen schließen lässt. Dass sowohl 2-ADNT als auch 4-ADNT durch
116

Diskussion
Konjugationsprozesse in Pflanzen detoxifiziert werden, zeigten Untersuchungen von Bhadra
et al. (1999) mit sterilen Pflanzenwurzeln von Catharanthus roseus. NMR-spektroskopisch
gelang der Nachweis von Konjugationsbindungen der beiden unmittelbaren TNT-Metaboliten
an einen unbekannten C6-Körper im intrazellären Milieu. Da die sterilen Pflanzenkulturen
ausschließlich mit TNT dotiert wurden, mussten die Pflanzen außerdem über reduzierende
Systeme verfügen. Es ist bekannt, dass auch zahlreiche Pestizide, Herbizide, Fungizide und
andere Xenobiotika über Konjugationen in der Pflanze detoxifiziert werden. Verschiedene
Autoren beschreiben die vakuoläre und die vesikuläre Deposition von Konjugationsintermediaten
als einen Zwischenschritt vor ihrer endgültigen Festlegung als so genannte
“bound residues”. Verknüpft mit zukünftigen Zellwandpolymeren, wie Glukosiden, werden
die vakuolären Konjugate letztendlich ins Cytosol und ins apoplastische Milieu transportiert
und dort in der Zellwand festgelegt (Sandermann 1994, Schmidt et al. 1997, Laurent und
Scalla 1999). Ein weiteres Beispiel für die Detoxifizierung aufgenommener Xenobiotika
durch Konjugatbildung und Kompartimentierung stellt die Synthese von Gluthathionkonjugaten
und der Transport dieser Verbindungen in die Vakuolen dar (Edwards et al. 2000,
Coleman et al. 1997). Über diese Reaktion werden übrigens auch von der Pflanze selbst
gebildete Verbindungen unschädlich gemacht. Die Konjugation wird durch Glutathion-S-
Transferasen katalysiert. Dabei wird die sehr reaktive SH-Gruppe des Gluthations über
Thioether an Carbonylgruppen und anderen funktionellen Gruppen der aufgenommenen
Schadstoffe gebunden. Durch einen im Tonoplasten lokalisierten spezifischen Glutathion-
Translokator werden die Glutathionkonjugate unter ATP-Verbrauch gegen einen
Konzentrationsgradienten in die Vakuole transportiert und dort deponiert oder weiter
metabolisiert.
4.3.6.2 Einbau von 14 C-TNT und Metaboliten in die Zellwände
Unabhängig von den Zelltypen der Pflanze ist vor allem die Sekundärwandbildung durch eine
erhebliche Cellulosesynthese geprägt. In Geweben mit Stütz- und Festigungsfunktion ist
ferner die Lignifizierung (Verholzung) der Sekundärwand von wesentlicher Bedeutung.
Zusammen mit Suberin und Kutin, die zusätzlich in verschiedene Zellwände eingelagert
werden, kommt dem Lignin außerdem eine gewisse Bedeutung bei der Imprägnierung von
Zellwänden und bei dem Schutz vor Pflanzenpathogenen zu. Lignin entsteht durch
radikalische Polymerisation der drei Monolignole Sinapyl-, Coniferyl- und p-Cumarylalkohol
(Phenylpropane mit einem Aromaten als Grundkörper) zu Makromolekülen. Der
Mechanismus ist in wesentlichen Teilen noch unklar. Die Synthese erfolgt außerhalb der
Zellen (Heldt 1996). Bei der Verkettung der einzelnen Monolignole sind Peroxidasen
beteiligt. Auch Suberin ist ein Polymerisat, das neben Fettsäuren, Fettalkoholen und anderen
Bestandteilen aus Phenylpropanen zusammengesetzt wird. Bei der Verknüpfung der
Phenylpropane beim Wandaufbau ist eine kovalente Einbindung verschiedener TNT-
117

Diskussion
Metabolite in das Gerüst der entstehenden Makromoleküle durchaus zu vermuten. Auch
andere Formen der Festlegung oder Einlagerungen im Wandbereich sind denkbar. Auffällige
Konzentrationen an
14 C-TNT/Metaboliten konnten mikroautoradiographisch an den
Rhizodermisaußenwänden nicht-mykorrhizierter Wurzeln sowie im Bereich des Xylems in
den Leitbündeln nicht-mykorrhizierter als auch mykorrhizierter Wurzeln nachgewiesen
werden. Zahlreiche Seitenwurzeln der Kiefern waren durch Spitzenwachstum gekennzeichnet
und befanden sich noch im Stadium der Ausdifferenzierung. Bemerkenswert war die deutlich
erhöhte Silberkorndichte über den ring- und schraubenförmigen Versteifungen in den
tracheidalen Elementen. Möglicherweise lässt sich diese Häufung als Hinweis auf die
Einbindung von TNT-Metaboliten in die Ligninfraktion deuten. Andererseits könnten die
Silberkornansammlungen anteilig auch ein Präparationsartefakt des Entwässerungsvorganges
darstellen, wobei sich 14 C-TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten als Transportsubstanz des Xylems
bevorzugt in den Aussteifungen der Zellwände sammelten.
4.3.6.3 Einbau von TNT-Metaboliten in die Ligninfraktion
Hinweise für einen kovalenten Einbau von Xenobiotika in die Ligninfraktion ergaben
Versuche mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (Scheel und Sandermann 1981) und mit 14 C-
Phenoxyessigsäure (Laurent und Scalla 1999) in Zellsuspensionskulturen von Glycine max
(Sojabohne) und Triticum aestivum (Weizen). Letztere genannte Autoren konnten außerdem
erhebliche Anteile der applizierten
14 C-Phenoxyessigsäure fest gebunden in der
Hemicellulosefraktion der Zellwände von Glycine max lokalisieren.
Versuche mit ringmarkiertem 14 C-TNT von Cataldo et al. (1989) zeigten, dass die tatsächlich
von den Pflanzen aufgenommene Schadstoffmenge größer war als nach chemischer
Extraktion wieder gefunden werden konnte. Bereits hier ergab sich der Hinweis auf eine feste
Einbindung von TNT-Metaboliten als „bound residues“ in Pflanzen. Deutliche Hinweise für
einen kovalenten Einbau von TNT/TNT-Metaboliten in das Lignin, vergleichbar dem
angenommenen festen Einbau verschiedener Xenobiotka, ergaben umfangreiche
Untersuchungen mit ringmarkiertem 14 C-TNT an Phaseolus vulgaris und Triticum aestivum
(Sens 1998). Gelpermeationschromatographische Untersuchungen (GPC) des Lignins zeigten,
dass der wesentliche Anteil der 14 C-markierten Ligninbestandteile ein Molekulargewicht
>1000 g/mol hatten. Dagegen ließen sich nur geringe Mengen an Radioaktivität im
Molekulargewichtsbereich von TNT und TNT-Transformationsprodukten finden. Der Autor
schließt allerdings nicht aus, dass TNT-Metabolite in “käfigartige Strukturen” eingeschlossen
wurden und sich daher in der GPC nicht herauslösen und somit nicht nachweisen ließen. Wie
bereits erwähnt wurde, könnte die mikroautoradiographisch nachgewiesene Ansammlung von
14 C-Radioaktivität in Xylem des Zentralzylinders ein weiteres Indiz für eine mögliche
Einbindung von TNT-Metaboliten in das Lignin sein. Vor allem im Bereich der ring- und
schraubenartig verholzten Wandverdickungen der Tracheiden konnten vermehrt radioaktive
118

Diskussion
Einlagerungen durch eine erhöhte Silberkorndichte aufgezeigt werden. Gewöhnlich wird für
den Einbau des Lignins in die Zellwand die Beteiligung von Peroxidasen und Laccasen
angenommen (Heldt 1996). Voraussetzung für eine Polymerisation ist der Besitz von
Hydroxylgruppen am aromatischen Ring der Monolignole. Sens (1998) zieht in Erwägung,
dass möglicherweise ebenso hydroxylgruppentragende TNT-Metaboliten für einen Einbau in
die Ligninfraktion in Frage kämen. Die Einführung von Hydroxylgruppen in den
aromatischen Ring der Nitroaromaten könnte durch Monooxygenasen mit Cytochrom P 450 als
O 2 -Bindungsstelle synthetisiert werden, ebenso, wie solche Monooxygenasen die Einführung
von Hydroxylgruppen in den Phenylring von Ligninvorstufen synthetisieren. In der Regel
sind alle P 450 -Monooxygenasen an die Membran des Endoplasmatischen Reticulums
gebunden (Heldt 1996). Der Transport hydroxylierter TNT-Metabolite durch die
Zellmembran in den Apoplasten könnte vergleichbar dem Export von Monolignolen aus dem
Zellinnern erfolgen (Sens 1998). Nach Lewis und Yamamoto (1990) gibt es Befunde, dass die
Monolignole als Glucoside die Zellmembran überwinden und im Apoplasten durch
Glucosidasen wieder freigesetzt werden. Diese Annahme ist allerdings noch umstritten (Heldt
1996). Insgesamt bleibt festzustellen, dass über den Mechanismus des Exports bisher noch
wenig bekannt ist. Auch der Mechanismus der Ligninbildung selbst ist bisher nur lückenhaft
untersucht. An der Verknüpfung der Monolignole sind neben Peroxidasen noch Laccasen und
andere Oxidasen beteiligt (Boudet 2000), wobei angenommen wird, dass die Polymerisierung
unter Verbrauch von H 2 O 2 erfolgt. Allerdings konnte im Xylem von Tabak eine Polyphenol-
Oxidase vom Laccasetyp lokalisiert werden, welche Coniferylalkohol ohne H 2 O 2 zu
polymerisieren vermag (Richardson und McDougall 1997).
4.3.6.4 Festlegung an Zellwandbestandteilen der Wurzeloberfläche
Mikroautoradiographisch ließen sich erhöhte Konzentrationen von
14 C-TNT/TNT-
Metaboliten vor allem an der Oberfläche nicht-mykorrhizierter Wurzeln detektieren.
Möglicherweise handelt es sich bei der Sorption um kovalente Verbindungen mit
verschiedenen Zellwandbestandteilen wie Suberinen und Tanninen. Die Vermutung, dass die
Bindungen in fester Form vorliegen, wird durch die Tatsache erhärtet, dass sich selbst nach
mehrmaligem Kunststoffwechsel während der Einbettung die radioaktiven Bestandteile nicht
von der Wurzeloberfläche ablösten. Ähnliche Beobachtungen machte Sens (1998) mit
radioaktiv markierten Nitroaromaten, die fest an die Wurzeln von Phaseolus vulgaris und
Triticum aestivum sorbierten und sich selbst nach mehrmaligem Spülen mit Methanol nicht
loslösen ließen. Vor allem die Tannine oder Gerbstoffe sind in Pflanzen weit verbreitet und
oft sehr fest mit Proteinen verbunden. Über den genauen Syntheseweg ist nur anteiliges
bekannt. Vermutlich sind radikalische Prozesse beteiligt (Heldt 1996). Die gebräuchliche
Bezeichnung Polyphenole deutet auf den Ursprung dieser heterogenen Stoffgruppe hin.
Neben phenolischen Hydroxylgruppen besitzen diese Monomere weitere Funktionelle
119

Diskussion
Gruppen (–OH, –NH, –NH 2 ). Sie sind in der Lage zu hochmolekularen Verbindungen zu
kondensieren. Solche Kondensationsreaktionen können durch Stress für die Pflanze stimuliert
werden und sind als eine Abwehrreaktion gegen Mikroorganismen oder toxische Stoffe zu
verstehen. Durch die Bindung an Tanninen können von Mikroorganismen freigesetzte,
sezernierende Enzyme für die Pflanzen unschädlich gemacht werden. Ein vergleichbarer
Schutzmechanismus wäre auch für toxisch wirkende Nitroaromaten vorstellbar, nachdem die
Pflanze zuvor durch den Kontakt in eine Stresssituation gebracht wurde. Hinweise auf eine
umfangreiche Tanninproduktion in der Rhizodermis und in den äußeren Rindenzellen liegen
in einer dunkelbraunen Verfärbung der Kiefernwurzeln in den Experimenten begründet.
Entsprechende Verfärbungen ließen sich insbesondere nach hohen TNT-Applikationen
beobachten ( 14 C-Versuch und Kiefern-Toxizitätstest). Anteilig könnte die Bildung einer
Tanninschicht auf der Wurzeloberfläche auch auf tanninhaltige, kollabierte Kalyptrazellen
zurückzuführen sein, die noch in Resten den Wurzeln anhafteten.
4.3.7 Extraktion von Nitroaromaten aus Pflanzengeweben
Alle bisher in der Literatur beschriebenen Extraktionsmethoden zur Isolierung von
Nitroaromaten aus Pflanzengeweben basieren letztendlich auf einem sauren Extraktionsschritt
mit einer nachfolgenden Alkalisierung des sauren Hydrolysats. Durch die Verwendung
unpolarer Lösungsmittel (Dichlormethan, Diethylether u. a.) ließen sich bisher die relativ
"unpolaren" Kontaminanten TNT, 2-ADNT, 4-ADNT sowie vereinzelt in sehr geringen
Mengen 2,4-DNT und 2,6-DNT extrahieren ( Palazzo & Leggett 1986, Cataldo et al. 1989,
Harvey et al. 1990, Görge et al. 1994 , Schneider et al. 1996). Auch im Rahmen dieser Arbeit
wurde auf ein entsprechendes Verfahren, modifiziert nach Görge et al. (1994a)
zurückgegriffen. Über dünnschichtchromatographische Methoden konnten inzwischen
zahlreiche weitere überwiegend polare nicht identifizierte TNT-Metaboliten in
Pflanzengeweben nachgewiesen werden (Sens 1998).
Etwa 70 % der detektierten Nitroaromaten ließen sich erst nach Säurehydrolyse und
nachfolgender Alkalisierung mit Natronlauge aus den Pflanzen extrahieren, nachdem zuvor
nach einfacher DCM-Extraktion lediglich 30 % der Nitroaromaten gewonnen werden konnten
(siehe Tabelle 17). Vergleichbare Ergebnisse lieferten auch die Versuche von Cataldo et al.
(1989), Görge et al. (1994 ), Scheidemann (1998) u. a. Autoren. Vermutlich liegt der
überwiegende Teil der von den Pflanzen aufgenommenen Nitroaromaten demnach in einer
Form vor, die eine Herauslösung allein durch eine DCM-Extraktion nicht zulässt. Schon
Catoldo et al. (1989) belegten anhand von Experimenten mit radioaktiv markiertem 14 C-TNT
eine Festlegung großer Teile des 14 C als gebundene Rückstände (bound residues) in den
Pflanzen. Bestätigt wurden diese Beobachtungen durch Versuche von Sens et al. (1999).
Gelpermeationschromatographisch ließen sich 14 C-TNT-Metaboliten in der Ligninfraktion
von Phaseolus und Triticum nachweisen. Aufgrund der hohen Molekulargewichte von über
120

Diskussion
1000 g/mol dieser Metaboliten gilt eine kovalente Bindung mit Ligninbestandteilen als
wahrscheinlich. Diese Annahme wird durch eigene mikroautoradiographische
Untersuchungen gestützt, denn vor allem im Bereich der ring- und schraubenartig
lignifizierten Wandverdickungen der Tracheiden konnten vermehrt radioaktive Einlagerungen
durch eine erhöhte Silberkorndichte festgestellt werden. Eine starke Adsorption von 14 C-
TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten an der Wurzeloberfläche der Kiefernwurzeln deutet außerdem auf
eine Bindung an Tanninen, welche in ihrer Grundstruktur, ebenso wie die Lignine, aus
phenolischen Verbindungen synthetisiert werden.
Von den analytisch in den Pflanzen nachgewiesenen Nitroaromaten bildete das TNT
gegenüber den ADNTs einen Anteil von weniger als 10 % der Gesamtmenge. Mit ca. 90 %
Anteil waren 2-ADNT und 4-ADNT die Hauptkontaminanten. Vergleichbare Ergebnisse
zeigten u. a. die Untersuchungen von Görge et al. (1994 und 1995) und Scheidemann (1998).
Die Dominanz der ADNTs im identifizierten Schadstoffspektrum ist möglicherweise auf die
Tatsache zurückzuführen, dass allgemein weniger TNT als vermehrt ADNT in die Wurzeln
aufgenommen wird. Denkbar wäre andererseits eine zügige Metabolisierung des
aufgenommenen TNT innerhalb der Wurzeln, so dass der Anteil des TNT am Nitroaromatengehalt
in der Wurzel insgesamt unbedeutend wird.
Die deutliche Dominanz der ADNTs gegenüber dem TNT unter den extrahierbaren
Nitroaromaten könnte eventuell auch auf eine unterschiedlich starke Bindung an Bestandteile
der Pflanzen zurückzuführen sein. Schon mehrmals wurde die Bindung von TNT und
Metaboliten mit Ligninverbindungen in den Zellwänden diskutiert (s. o.). Vorstellbar wären
u. a. starke π-π-Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen (Charge-Transfer-Wechselwirkungen)
zwischen aromatischen π-Systemen. So könnte das in seiner Struktur planare TNT-Molekül
(abgesehen von der Methylgruppe) aufgrund des hohen Elektronendefizits an seinem
aromatischen π-System (verursacht durch die elektronenziehenden Nitrogruppen) als
Elektronenakzeptor wirken, während Phenylstrukturen in der Ligninfraktion als
Elektronendonor fungieren. Möglicherweise waren die TNT-Moleküle über Charge-Transfer-
Wechselwirkungen so stark am Lignin gebunden, dass sie durch eine Säurehydrolyse mit
anschließender Alkalisierung nur schwer herauszulösen waren. Im Falle der ADNTs führt die
Reduktion der Elektronen ziehenden Nitrogruppen zu Elektronen gebenden Aminogruppen zu
einer Erniedrigung des Elektronendefizits am aromatischen π-System mit der Folge deutlich
schwächer ausgeprägter Charge-Transfer-Wechselwirkungen zwischen den Akzeptor-Donor-
Komplexen, so dass eine Extraktion möglicher wurde.
121

Diskussion
4.4 Toxizitätstest mit mykorrhizierten Kiefern in TNT-haltigem Bodensubstrat
Über die toxikologische Wirkung von Nitroaromaten auf den Menschen ist in der Einleitung
(Abschnitt 1.1.2) bereits ausführlich berichtet worden. Relativ begrenzt ist das Wissen über
die phytotoxische Wirkung dieser Schadstoffe. Bisherige Untersuchungen beschränken sich
hauptsächlich auf Algen (Bringmann und Kühn 1977) und verschiedene krautartige Pflanzen
(Peterson et al. 1996 u. 1998; Gong et al. 1999 u. 2001 und Krishnan et al. 2000). Dabei
zeigte sich eine unterschiedliche Anfälligkeit der Pflanzen gegenüber diesen Schadstoffen.
Kenntnisse über die Empfindlichkeit von Gehölzpflanzen gegenüber TNT und dessen
Metaboliten liegen bisher so gut wie nicht vor. Gerade im Hinblick auf eine erfolgreiche
pflanzenbasierte Sanierung TNT-kontaminierter Böden, ist für den Sanierungserfolg jedoch
von ganz wesentlicher Bedeutung, in welcher Größenordnung TNT und dessen Metaboliten
von den Pflanzen toleriert werden können. Das Phytoremediationspotenzial ist also ganz
wesentlich vom Resistenz- bzw. Toleranzvermögen der Pflanzen gegenüber diesen
Kontaminanten im Boden abhängig. Verlieren Pflanzen aufgrund von toxischen Einflüssen
der Bodenkontaminanten an Vitalität, würde somit sicherlich der Phytoremediationseffekt
beeinträchtigt werden. Wie Gehölze mit Nitroaromatenkonzentrationen verschiedener
Größenordnung umzugehen vermögen, sollte daher an mykorrhizierten Kiefern untersucht
werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden mit Pisolithus tinctorius mykorrhizierte
Kiefernsämlinge (Pinus sylvestris) über einen längeren Zeitraum unterschiedlichen TNT-
Bodenkonzentrationen ausgesetzt, um festzustellen, inwieweit die Pflanzen auf
toxikologische Einflüsse der Kontaminanten reagieren. Das toxische Potential von TNT und
dessen Wirkung auf die Kiefern wurde in erster Linie über den Biomassezuwachs als Maß für
die Vitalität ermittelt. Weitere Parameter waren eventuell auftretende morphologische
Schäden an Nadeln und Wurzeln und die Entwicklung des Mykorrhizierungsgrades der
Wurzeln. Biomasseentwicklung und morphologische Abnormitäten an Pflanzenorganen als
wichtige Parameter zur Bestimmung der Phytotoxizität von Nitroaromaten wurden bereits
mehrmals verwendet (Peterson et al. 1998, Gong et al. 1999, Krishnan et al. 2000). Da von
der Annahme auszugehen war, dass das TNT im mechanisch bearbeiteten Bodensubstrat einer
erheblichen Abbaudynamik unterliegt (siehe Schadstoffentwicklung im Kiefern- und
Pappelexperiment) und der Kontaminationsgrad während der Experimentierphase somit nicht
konstant bleiben, sondern stetig abnehmen würde, musste außerdem die Belastung in Boden
und Bodenlösung über den gesamten Versuchszeitraum ermittelt werden. So war es möglich,
die Schadstoffentwicklung im Boden in zeitlicher Abhängigkeit nachzuvollziehen und in
diesem Zusammenhang einen Einfluss auf die Vitalität der Pflanzen herzustellen. Für die
Bioverfügbarkeit ist allerdings in erster Linie der Nitroaromatengehalt in der wässrigen Phase
122

Diskussion
entscheidend, deshalb wurde parallel der Schadstoffgehalt in der Bodenlösung bestimmt. Als
Kontaminanten konnten neben dem dotierten TNT auch 4-ADNT und 2-ADNT als
unmittelbare Reduktionsprodukte des TNT im Bodensubstrat und in der Bodenlösung
detektiert werden. Weitere Nitroaromaten ließen sich nicht finden. Die DANTs als reduktive
Folgeprodukte der ADNTs binden unter aeroben Bedingungen irreversibel an
Bodenbestandteile (Elovitz und Weber 1999). Vermutlich konnten die DANTs deshalb nicht
nachgewiesen werden. Phytotoxische Eigenschaften für TNT, 4-ADNT und 2-ADNT sind
bereits von Palazzo und Legget (1986) belegt worden. So reduzierten in Flüssigkultur alle
drei Nitroaromaten das Wachstum von Cyperus esculentus L. signifikant. Allerdings wird die
Toxizität der unmittelbaren TNT-Metabolite allgemein geringer eingestuft als für das TNT
selbst (Martinetz und Rippen 1996). Dies konnte u. a. im Leuchtbakterien- Hemmtest
festgestellt werden, wobei allgemein die Biolumineszenz als Maß für die Vitalität
angenommen wird. In Tabelle 22 sind die jeweiligen Schadstoffkonzentrationen ausgewählter
Nitroaromaten aufgeführt, welche die Biolumineszenz um 20% reduzieren (EC 20 ).
Tabelle 22: Wichtige Nitroaromaten und ihre Giftigkeit gegen Leuchtbakterien (Angaben aus
Martinetz & Rippen 1996, nach Schäfer 1992)
Verbindung
EC 20 (in mg/l)
2,4,6-TNT 1
4-Amino-2,6-dinitrotoluol
115
2-Amino-4,6-dinitrotoluol
38
2,4-Dinitrotoluol 22
2,6-Dinitrotoluol 1,6
2,3-Dinitrotoluol 4,8
3,4-Dinitrotoluol 3,6
2-Amino-4-nitrotoluol 20
2-Nitrotoluol 2,1
3-Nitrotoluol 4,0
4-Nitrotoluol 12
123

Diskussion
Da eine Abschätzung des toxischen Wirkungspotenzials jedes einzelnen Kontaminanten
aufgrund der gegebenen Mischbelastung im Bodensubstrat und in der Bodenlösung nicht
möglich ist, sollen die drei nachgewiesenen Schadstoffe im Folgenden als Nitroaromaten
zusammengefasst diskutiert werden. Die wesentlichen Erkenntnisse, die sich aus dem
Kiefern-Toxizitätstest ableiten lassen, sind als Übersicht noch mal in Tabelle 23
zusammengefasst
Tabelle 23: beobachtete Schadstoffkonzentrationen und Schadsymptome
Dotierungstufe
(TNT-Zugabe)
niedrig:
(3 mg/kg)
mittel:
(300 mg/kg)
Gesamtnitroaromatenkonzentrationen
1)
< 1 ml/l
(< 3 mg/kg)
10 mg/l
(50 mg/kg)
Symptome an den
mykorrhizierten Pflanzen
keine reduzierte Biomasseentwicklung,
keine Seneszenzmerkmale an
Wurzeln, Nadeln und Pilzhyphen 2) ,
Mykorrhizierung nicht beeinträchtigt,
möglicherweise Düngeeffekt
aufgrund niedriger TNT-Zugabe
Grenzbereich, mit abnehmender
Konzentration fortschreitende Erholung
der Pflanzen
15 mg/l reduzierte Biomasseentwicklung,
(50 – 100 mg/kg) kaum morphologische Seneszenzmerkmale
an Wurzeln, Nadeln und
Pilzhyphen 2) , Beeinträchtigung der
Mykorrhizaneubildung, Pflanzen behalten
ihr Regenerationsvermögen
hoch:
(3000 mg/kg)
70 – 90 mg/l
(1600 – 2000 mg/kg)
kein Zuwachs an Biomasse, erhebliche
morphologische Seneszenzmerkmale
an Nadeln, Wurzeln und
Pilzhyphen 2) , keine Mykorrhizaneubildung
1)
In der Bodenlösung ermittelte Konzentrationen von TNT, 4-ADNT und 2-ADNT zusammengefasst
dargestellt, Werte in Klammern beziehen sich auf die Bodenkonzentrationen;
2) Pilzhyphen des inokulierten Symbionten
Das Dotierungsangebot beinhaltete eine niedrige (3 mg TNT/ kg), eine mittlere (300 mg
TNT/kg) und eine hohe (3000 mg TNT/kg) Konzentration. Die als Reaktionen auf die
vorherrschenden Schadstoffkonzentrationen beobachteten Effekte an den Pflanzen traten
zeitlich verzögert in Erscheinung. Die Schadstoffgehalte von Bodensubstrat und Bodenlösung
blieben, wie die Messungen zeigten, in ihrer Höhe nicht konstant, sondern waren einer
ständigen Abbau- bzw. Transformationsdynamik ausgesetzt.
124

Diskussion
Während Pflanzen bei hohen Nitroaromatenkonzentrationen allgemein mit einer reduzierten
Biomasseproduktion reagieren oder ihr Wachstum ganz einstellen, können gering dotierte
Mengen durchaus stimulierend auf das Wachstum wirken und letztendlich sogar zu einer
gesteigerten Biomasseproduktion führen. Solche stimulierenden Effekte, verursacht durch
geringe TNT-Zugaben, wurden bereits für die Dikotyledonen Lepidium sativum L. und
Brassica rapa Metzg. sowie für die Monokotyledonen Avena sativa L. und Triticum aestivum
L. beobachtet (Gong et al. 1999). Auch die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Kiefern
zeigten bei einer Dotierung von 3 mg TNT kg -1 eine entsprechende Tendenz. So lag die
Biomasseproduktion der Pflanzen nach 12 Wochen um etwa 15 % höher als bei den Kiefern
des unbelasteten Kontrollbodens (Abbildung 33). Zwar war der Unterschied nicht signifikant,
trotzdem ist zu vermuten, dass mit der Dotierung des TNT und dem damit verbundenen
zusätzlichen Stickstoffeintrag in den Boden ein gewisser Düngeeffekt bei den Pflanzen
ausgelöst wurde und das TNT bzw. Metabolite als Stickstoffquelle dienten.
Wie bereits erwähnt wurde, stellt die Ermittlung des EC-Wertes eine allgemein verbreitete
Methode zur Bestimmung des toxischen Wirkungspotenzials von Schadstoffen gegenüber
Organismen dar. Anwendung findet diese Methode vor allem im Leuchtbakterien- Hemmtest.
Beträgt die Inkubationszeit, wie in solchen Tests allgemein üblich, nur Stunden oder maximal
ein bis zwei Tage, kann der zwischenzeitliche Transformationsvorgang als beeinflussende
Größe in der Regel vernachlässigt werden. Problematischer stellt sich die Lage für
Wachstumshemmtests mit Pflanzen dar. Solche Untersuchungen erstrecken sich zeitlich über
mehrere Wochen oder sogar Monate. Durch die zwischenzeitlich ablaufenden
Transformationsvorgänge kann der Schadstoffabbau während der Versuchsdurchführung
erhebliche Ausmaße annehmen. Dies belegen die eigenen Studien. Die mykorrhizierten
Kiefern waren in den Rhizotronen keiner konstanten, sondern einer ständig in Abnahme
begriffenen Belastung ausgesetzt. An den Pflanzen auftretende toxische Wirkungen konnten
in diesem Fall dann nicht auf die dotierten Ausgangswerte bezogen werden, wie das sonst bei
der EC-Wert-Bestimmung üblich ist. Ein auftretender Effekt konnte nur mit einem etwas
weiter gefassten Kontaminationsbereich in Beziehung gebracht werden, zumal durch
Schadstoffeinwirkung auftretende Effekte wie Wachstumshemmung und morphologische
Schäden an den Pflanzen zeitlich verzögert in Erscheinung traten. Bezüglich des
Toxizitätstest mit den mykorrhizierten Kiefern lassen sich deshalb folgende Aussagen
machen: Belastungen zwischen 50 und 200 mg Nitroaromaten kg -1 Boden, das entspricht etwa
einem Kontaminationsbereich zwischen 10 und 30 mg l -1 , hemmten einerseits die Biomasseproduktion
der Pflanzen nahezu vollständig, bewirkten aber andererseits so gut wie
keine Schadeffekte an Nadeln, Wurzeln und Hyphenmänteln bezüglich ihrer morphologischen
Ausgestaltung. Schäden ließen sich nur sehr vereinzelt durch das Auftreten brauner
Nadelspitzen feststellen. Die Kiefern als auch der Pilzsymbiont waren zum einen in der Lage,
125

Diskussion
Nitroaromatengehalte dieser Größenordnung mehrere Wochen mit Wachstumseinbußen
relativ unbeschadet auszuhalten, zum anderen reagierten Pflanze und Pilz mit abnehmender
Schadstoffkonzentration rasch mit einer deutlichen Erhöhung der Biomasseproduktion bzw.
mit einer vermehrten Mykorrhizainfektion an den Kurzwurzeln. Das erstaunliche
Regenerationspotenzial der mykorrhizierten Kiefern zeigte sich insbesondere bei
Nitroaromatengesamtkonzentrationen unter 50 mg kg -1 Boden, das entspricht etwa 10 mg l -1
Bodenlösung. Die Fähigkeit, ungünstige Bedingungen zu überdauern, beobachteten auch
Trapp und Karlson (2000) in ihren Studien mit Salix spec. in Laborversuchen in Verbindung
mit mineralischen Kohlenwasserstoffen und Cyanid. Die Pflanzen konnten bis zu 5g Dieselöl,
fast 1 g Superbenzin oder 0,5 g Gesamtzyanid je kg Boden mit Wachstumseinbußen
aushalten. Verbesserte Überlebenschancen gegenüber hohen TNT-Belastungen hatten
transgene Tabakpflanzen der Art Nicotiana tabacum CV Xanthi im Vergleich zum
entsprechenden Wildtyp (Hannink et al. 2001). Durch den Besitz eines modifizierten
Bakteriengens (Enterobacter cloacae NCIMB 10101) zur Kodierung von Nitroreduktase
(nFsI) ließ sich das Toleranzvermögen erheblich steigern. Während das Schadstoffspektrum
an aufgenommenen Nitroaromaten beim Wildtyp abgesehen von den ADNTs auch noch das
TNT beinhaltete, wurden beim transgenen Typ lediglich ADNTs gefunden. Der Schluss liegt
nahe, dass im letzteren Typ durch zügige reduktive Transformation des aufgenommenen TNT
zum weniger toxischen ADNT die Schadwirkung insgesamt herabgesetzt und das
Toleranzpotenzial somit letztendlich erhöht wird. Trotz solcher Erfolge müssen allerdings die
Chancen und Risiken der Gentechnik beim Einsatz transgener Pflanzen in zukünftigen in-situ-
Phytoremediationsverfahren gründlich überdacht und kritisch diskutiert werden.
In hohem Maße toxisch für die mykorrhizierten Kiefern waren Bodenbelastungswerte
zwischen 1600 und 2000 mg Nitroaromaten kg -1 Boden, das entsprach Konzentrationen
zwischen 70 und 90 mg Nitroaromaten l -1 Bodenlösung, denen die Pflanzen in der hohen
Belastungskategorie ausgesetzt wurden. Die hohen Schadstoffkonzentrationen verursachten
nicht nur erhebliche morphologische Schäden an den Nadeln und Wurzeln, sie führten zum
Teil auch mitsamt dem Mykobionten gänzlich zum Absterben der Pflanzen. Neue Nadeln und
Wurzeln wurden nicht ausgebildet. Bereits ausdifferenzierte Mykorrhizen zeigten bald
Auflösungserscheinungen. Die Pilzhyphen pigmentierten zunehmend und gaben dem
Hyphenmantel bald eine dunkelbraune Färbung. Dunkel verfärbte Hyphen in alternden oder
seneszenten Mykorrhizen sind bereits mehrfach von Autoren beschrieben worden (Downes et
al. 1992, Behrmann 1995). Ein Biomassezuwachs konnte bei den Pflanzen nicht verzeichnet
werden. Kontaminationsgrade dieser Größenordnung lagen demnach jenseits jeglicher
Toleranzgrenzen für die Kiefern, wie das Auftreten der starken phytotoxischen Symptome
zeigte. Die Fähigkeit, eine Schadstoffbelastung unter Beibehaltung eines bestimmten
Regenerationspotenzials für einen gewissen Zeitraum zunächst mit einer Wachstumseinbuße
auszuhalten - bei mittleren Belastungen unter 300 mg kg -1 Boden waren die Kiefern dazu in
126

Diskussion
der Lage - ging bei einem Nitroaromatengehalt über 1600 mg kg -1 Boden verloren. Auch die
Literatur liefert Hinweise dafür, dass hohe Nitroaromatenkonzentrationen von Pflanzen nur
selten vertragen werden. So ist der Stechapfel Datura innoxia Mill. dazu in der Lage, etwa
1000 mg TNT kg -1 Boden zu tolerieren (Müller et al. 1993 in Peterson et al. 1996). Der im
Vergleich zu anderen Pflanzen als relativ TNT-tolerant geltende Saat-Hafer Avena sativa L.
vermochte noch bei Konzentrationen zwischen 800 und 1600 mg TNT kg -1 Boden zu
wachsen, wobei das Spross- und Wurzelwachstum bereits in erheblichem Maße verzögert und
deutlich weniger ausgeprägt war (Gong et al., 1999). Die verkümmerten Wurzeln blieben
kürzer und besaßen weniger Wurzelhaare. Die meisten bisher untersuchten Pflanzen, vor
allem Gräser und dikotyle krautartige Pflanzen, reagieren schon bei wesentlich niedrigeren
TNT-Konzentrationen sehr empfindlich (Peterson et al. 1996 und 1998, Krishnan et al. 2000,
Gong et al 1999 u. 2001). Obwohl sich die Empfindlichkeit gegenüber Nitroaromaten für die
verschiedenen Pflanzenarten unterschiedlich darstellt, dürften Toleranzwerte für
Expositionsgrade, die ein gewisses Erholungspotential erlauben, somit allgemein deutlich
unter 1000 mg TNT oder Nitroaromaten kg -1 Boden liegen. Bei hohen Belastungen werden
jedoch nicht nur Pflanzen in ihrem Wachstum stark beeinträchtigt. Auch die mikrobielle
Abbautätigkeit kann bei hohen TNT-Konzentrationen stark vermindert werden oder gänzlich
zum erliegen kommen (Bradley und Chapelle 1995) mit wiederum weitreichenden
Konsequenzen für die Pflanzen. Stagniert der Abbau oder ist er stark verlangsamt, bietet sich
den Pflanzen nicht die Möglichkeit, ungünstige Bedingungen mit Wachstumseinbußen
auszuhalten, wie dies im Ansatz der mittleren Belastungskategorie beobachtet werden konnte.
Resümierend bleibt festzustellen, dass sich für Phytoremediationsverfahren daher Flächen mit
niedrigen und mittleren Belastungsgraden anbieten, deren Schadstoffgehalte von Pflanzen
toleriert werden können, während in Bereichen hoher Belastungskategorien dem
Sanierungspotenzial durch Pflanzen aufgrund des zunehmend toxischen Einflusses der
Nitroaromaten Grenzen gesetzt sind.
127

Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Phytoremediationspotenzial mykorrhizierter Gehölze für
TNT und Begleitkontaminanten bei der biologischen Bodensanierung zu untersuchen. Hierzu wurden
bei der Ausführung der Experimente drei wesentliche Schwerpunkte gebildet:
1) Untersuchungen zur Abreicherung der Nitroaromatenkonzentrationen im Boden.
Mit der Durchführung dieser Versuche wurde überprüft, ob und inwieweit durch den Einsatz
mykorrhizierter Kiefern und Pappeln (Pinus sylvestris/Pisolithus tinctorius, Populus
tremula/Hebeloma spec.) unter Einbeziehung des Weißfäulepilzes Pleurotus ostreatus in
besonderen Rhizotronsystemen der Abbau von TNT und Metaboliten gefördert werden kann. Als
kontaminiertes Substrat diente ein nachträglich mit Sand vermischter TNT-belasteter Standortboden
vom ehemaligen Sprengstoffwerk ‘Tanne’ bei Clausthal-Zellerfeld. Die Ausgangskonzentrationen für
TNT in den Bodensubstraten lagen bei 80-100 mg/kg (Experiment mit Kiefern) bzw. 400-450
mg/kg (Experiment mit Pappeln). Die Detektion der Nitroaromatenkonzentrationen in den
Bodenproben erfolgte mit der HPLC.
2) Untersuchungen zur Aufnahme und Verteilung von Nitroaromaten im Organismus Pflanze.
Mittels GC/MS-Analytik wurden verschiedene Nitroaromaten in den Geweben nicht-mykorrhizierter
und mykorrhizierter Pappeln erfasst. Allerdings gestattet eine gaschro-matographische Detektion in
nur begrenztem Umfang Aussagen darüber, in welcher Größenordnung Nitroaromaten tatsächlich
von den Pflanzen aufgenommen werden. Bereits in den Geweben metabolisierte oder festgelegte
TNT-/TNT-Metaboliten-Anteile lassen sich nicht mehr bilanzieren. Im Rahmen dieser Überlegungen
wurde in einem gesonderten Experiment nicht-mykorrhizierten und mykorrhizierten Kiefern 14 C-TNT
in definierten Mengen angeboten und die Aufnahme und Verteilung des 14 C-Radiotracers in den
Pflanzen durch mikroautoradiographische Verfahren und Szintillationszählung quantitativ bestimmt.
3) Untersuchungen zur Nitroaromatentoleranz bei Gehölzen
Voraussetzung für den Erfolg eines Phytoremediationsverfahrens ist die Toleranz der eingesetzten
Pflanzen gegenüber bodenrelevanten Schadstoffgehalten. Entsprechendes gilt auch für
128

Zusammenfassung
Mykorrhizapilze, wenn die Pflanzen mykorrhiziert sind. Daher wurde mit einem Toxizitätstest der
Einfluss des TNTs auf mykorrhizierte Kiefern untersucht (Pinus sylvestris/Pisolithus tinctorius).
Die Kultivierung der 4-5 Monate alten Pflanzen erfolgte bei verschiedenen TNT-
Ausgangskonzentrationen (3, 300 und 3000 mg TNT/kg Boden) in einem dotierten LUFA-
Standardboden (Typ 2.2). Das toxische Potenzial von TNT und dessen Wirkung auf die Kiefern
wurde in erster Linie über den Biomassezuwachs als Maß für die Vitalität ermittelt. Weitere
Parameter waren auftretende morphologische Schäden an Nadeln und Wurzeln und die Entwicklung
des Mykorrhizierungsgrades der Wurzeln.
Die wichtigsten Ergebnisse der kurz dargestellten Experimente lassen sich wie folgt beurteilen:
zu 1) Als erstaunlich effizient beim Nitroaromatenabbau (TNT und ADNTs) im Boden erwiesen sich
insbesondere mykorrhizierte als auch nicht-mykorrhizierte Pappeln, wobei sich die guten
Abbauleistungen nicht-mykorrhizierter Pappeln auf die TNT-Transformation konzentrieren. Die
Untersuchungen scheinen zu belegen, dass die Funktion der Weißfäule-pilze bei der
Nitroaromatendegradation durch eine Assoziation Mykorrhizapilz/Pflanze übernommen werden
kann. Voraussetzung hierfür ist allerdings ein guter Durchwur-zelungsgrad des Bodens, so dass eine
umfassende Rhizosphärendegradation ermöglicht wird. Die eingesetzten Pappeln erfüllten diese
Voraussetzung. Sie zeichneten sich durch ein starkes Wurzelwachstum aus. In den
Abreicherungsexperimenten mit Kiefern zeigte sich ein anderes Abbauverhalten der
Bodenkontaminationen. Ein geringer Biomassezuwachs der Kiefern, einhergehend mit einer
schwachen Durchwurzelung des Substrates insgesamt, resultierte in einer Ausprägung der
Rhizosphäreneffekte auf niedrigem Niveau und ließ pflanzeninduzierte Transformationsvorgänge
daher kaum in Erscheinung treten.
zu 2) Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen zum Transferverhalten von Nitroaromaten aus
dem Boden in die Pflanzen ließen sich TNT, 2-ADNT und 4-ADNT dem aufgenommenen
Schadstoffspektrum zuordnen. Die nachweisbare Nitroaromaten-konzentration in den Pflanzen zeigte
stets eine hohe Organspezifität. Die Wurzeln waren mit deutlichem Abstand anteilig am höchsten
belastet. Aufnahmeexperimente mit 14 C-TNT ergaben bei Kiefern für tatsächlich inkorporierte 14 C-
TNT/ 14 C-TNT-Metaboliten lediglich eine Wiederfindung unter 1% nach 14 Tagen Applikation. Eine
Akkumulation in den Geweben mit zunehmender Angebotsdauer wurde nicht beobachtet. Durch
mikro-autoradiographische Verfahren ließ sich eine teilweise Bindung von 14 C-TNT/ 14 C-TNT-
Metaboliten an der Oberfläche der Seitenwurzeln feststellen. Aufgenommene 14 C-Anteile fanden sich
129

Zusammenfassung
bevorzugt in den Tracheiden des Xylems der Seiten- und Trägerwurzeln und dort häufig im Bereich
der ring- und schraubenartig verstärkten Zellwandbereiche. Erhebliche Teile aufgenommener
Nitroaromaten konnten erst nach Säurehydrolyse mit nachfolgender Alkalisierung aus den Geweben
der Pflanzen (Populus tremula) extrahiert werden. Insgesamt sprechen die Ergebnisse für
umfassende Metabolisierungs- und Festlegungsvorgänge in den Pflanzen bezüglich der
aufgenommenen Schadstoffe. Ein Mykorrhizaeffekt hinsichtlich des Aufnahmeverhaltens trat nicht
auf.
zu 3) Die zu Beginn dotierten TNT-Mengen waren während der Experimentierphase einer
erheblichen Abbaudynamik unterlegen, so dass der Kontaminationsgrad im Substrat stetig abnahm.
Parallel zum Vitalitätszustand der Pflanzen wurde daher die Nitroaromaten-konzentration im Boden
und in der Bodenlösung über den gesamten Versuchszeitraum ermittelt. Das nachgewiesene
Schadstoffspektrum beinhaltete abgesehen vom TNT auch 2-ADNT und 4-ADNT. Beide
Metaboliten stellen Transformationsprodukte des TNT dar. Bei der Abschätzung des toxischen
Wirkungspotenzials wurden die nachgewiesenen Konta-minanten aufgrund der gegebenen
Mischbelastung als Nitroaromaten zusammengefasst diskutiert. Eine Dotierung von 3 mg TNT/kg
Boden wirkte sich nicht beeinträchtigend auf die Vitalität der Mykorrhiza aus. Die gesteigerte
Biomasseproduktion gegenüber den Pflanzen aus den unbelasteten Kontrollen legt einen gewissen
Düngeeffekt verbunden mit einem zusätzlichen Stickstoffeintrag in den Boden nahe. Als
Toleranzgrenze für Beeinträchtigungen der Vitalität sollten Nitroaromatenbelastungswerte um 50
mg/kg angesehen werden. Bei dieser Konzentration traten Wachstumsminderungen gegenüber den
Kontrollen ein, allerdings behielten die Pflanzen ihr Regenerationsvermögen und reagierten bei
abnehmender Schadstoffkonzentration mit steigender Biomasseproduktion. Unter Berücksichtigung
einer zügigen Abbaukinetik der Schadstoffe sollten die untersuchten Pflanzen aufgrund ihres
Erholungspotenzials daher in der Lage sein, Expositionsgrade im mäßigen Belastungsbereich mit
Werten deutlich über 50 mg TNT/kg Boden auszuhalten. Belastungswerte zwischen 1600-2000 mg
Nitroaromaten/kg Boden waren in hohem Maße toxisch für die mykorrhizierten Kiefern und
brachten zahlreiche Pflanzen mitsamt des Mykobionten zum absterben.
130

6. Phytoremediation am Standort ’Werk Tanne’; Durchführung und
Beurteilung unter Berücksichtigung der Laborergebnisse
Zwischen 1998 und 2000 wurden auf dem ehemaligen Sprengstoffwerk ‘Tanne’ in Clausthal-
Zellerfeld verschiedene biologische Verfahren zur Sanierung TNT-belasteter Böden durchgeführt.
Die maßstabsgerechte Erprobung beruhte hierbei im Wesentlichen auf herkömmlichen ex-situ
Verfahren, die eine Auskofferung des kontaminierten Bodens und eine Aufschüttung als Mieten
voraussetzten (Walter et al. 1998, Winterberg et al. 1998 und Spreinat et al 1998). Darüber hinaus
führte das Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie (UFT) in Kooperation mit der
Firma ‘Umweltschutz Nord’ aus Ganderkesee parallel ein in-situ Phytoremediationsverfahren zur
Dekontamination großflächiger und oberflächennaher Bodenbelastungen an gleicher Stelle durch. Die
Idee des Verfahrens zielte auf einen mikrobiellen Abbau von Sprengstoffverbindungen in der
pflanzlichen Rhizosphäre unter Verwendung von Weißfäulepilzen und mykorrhizierten Gehölzen ab.
Im Hinblick auf weitreichende methodische Übereinstimmungen des in-situ Verfahrenskonzeptes am
Standort ‘Tanne’ mit den Modellansätzen mehrerer Labor-experimente der vorliegenden Arbeit
(Kiefern- und Pappelexperiment) sollen die gewonnenen Erkenntnisse sowohl aus dem
Freilandversuch als auch aus den Laborversuchen zueinander in Beziehung gesetzt werden (siehe
Tabelle 24). Im Mittelpunkt des Interesses steht insbesondere die Frage nach einer Übertragbarkeit
der positiven Laborergebnisse auf das hier dargestellteVerfahrensprinzip im Feld.
6.1 Kurze Beschreibung des Standortes ‘Werk Tanne’
Das ehemalige Sprengstoffwerk ‘Tanne’ in Clausthal-Zellerfeld zählte zu den bedeutendsten
Produktionsstätten für TNT im ehemaligen Deutschen Reich während des zweiten Weltkrieges.
Zwischen den Jahren 1939 und 1944 wurden dort 105.358 Tonnen dieses Sprengstoffes produziert
und verarbeitet (Braedt et al. 1999). Fabrikation und Verarbeitung auf dem etwa 120 Hektar großen
Werksgelände verursachten Bodenkontaminationen mit TNT sowie mit Zwischen- und
Nebenprodukten aus dem Herstellungsprozess. Verschiedene Abbauprodukte des TNT,
hauptsächlich Aminodinitrotoluole, zählen ebenso zu den verbreiteten Kontaminanten im Boden.
Nach Abholzung des Geländes Ende der vierziger Jahre erfolgte kurz darauf eine nahezu
flächendeckende Aufforstung mit Fichten (Warrelmann et al. 2000), so dass der Standort
gegenwärtig durch einen etwa 50jährigen Fichtenbestand (Picea abies) gekennzeichnet ist. Das
Versuchsareal schloss sich in seiner Lage dem ehemaligen Tonsilerdelager des Werkes an. Die
Tonsilerde wurde zur Rückgewinnung von TNT aus Fehlproduktionen und Produktionsverlusten
verwendet. Großflächige Verteilung der Belastung in ausreichender räumlicher Ausdehnung,
einheitliche Geländebeschaffenheit und gute Erreichbarkeit waren ausschlaggebende Faktoren für die
131

Wahl der Fläche. Innerhalb der Probefläche zeigte sich die Belastungssituation im Boden teilweise
sehr heterogen.
6.2 Verfahrenskonzept:
Die weitreichenden methodischen Übereinstimmungen des in-situ Verfahrenskonzeptes am Standort
‘Tanne’ mit den Modellansätzen verschiedener Experimente im Labormaßstab wurden bereits
erwähnt (siehe auch Einleitung Abschnitt 1.3). Konzeptvorstellungen des in-situ
Phytoremediationsverfahrens sollen an dieser Stelle deshalb nur in den wesentlichen Grundzügen
erläutert werden. Den Kernpunkt des Feldversuches bildet der mikrobielle Abbau von
Sprengstoffverbindungen im Wurzelraum mykorrhizierter Gehölze (Rhizosphären-degradation).
Mykorrhizapilze mit ligninolytischen Fähigkeiten als Streuzersetzer in Symbiose mit Pflanzen,
Weißfäulepilze und dazu Bakterien, die in Assoziation mit den genannten Pilzen und Pflanzen leben,
erwirken als Organismengemeinschaft über einen Mehrstufenprozess letztendlich eine Ringspaltung
der Nitroaromaten. Nach reduktivem Initialangriff an den Nitrogruppen kommt insbesondere den
Mykorrhizapilzen in zweierlei Hinsicht eine Schlüsselrolle zu. Zum einen sollen sie durch den Besitz
verschiedener extrazellulärer und oxidativer Enzyme die Mineralisierung der Schadstoffe initiieren,
zum anderen partizipieren die Wirtspflanzen von stickstoffhaltigen Folgeprodukten, die durch die
metabolische Weiterverwertung der Ringspaltungsprodukte durch den Mykorrhizapilz seitens des
Mykobionten bereitgestellt werden. Bei der Durchführung des Verfahrens war außerdem von
Interesse, ob die Funktion der ligninolytischen Weißfäulepilze möglicherweise von den verwendeten
Mykorrhizapilzen übernommen werden kann, da nur letztere eigentliche Bodenbewohner sind und
zudem kontinuierlich von den Pflanzen mit Kohlen-stoffverbindungen versorgt werden. Im Gegensatz
zu den Weißfäulepilzen sind die Mykorrhizapilze somit nicht von Substratzugaben abhängig.
6.3 Einrichtung der Versuchsflächen:
Auf dem Versuchsareal stehende Bäume wurden gefällt und die im Erdreich verbleibenden
Wurzelteller in einem Schutzwall auf dem Gelände integriert. Auflockerung und eine horizontale
Vermischung der oberen 30 cm Boden mit einer Bodenfräse brachten eine teilweise Aufhebung der
erheblichen Belastungsheterogenitäten mit sich. Trotz mechanischer Verteilung des TNTs ließen sich
Unterschiede im Kontaminationsgrad auf den Versuchs-varianten allerdings nicht vollständig
aufheben. Hierauf wird an späterer Stelle noch einzugehen sein.
132

Auf dem Areal (Nitroaromatenbelastung bis 1000 mg TNT/kg Boden TS) wurden nach
mechanischer Bearbeitung vier Versuchsparzellen mit einer Ausdehnung von jeweils 4,5 x 6,5 m
eingerichtet:
Variante U: unbelastet, bepflanzt mit ektotroph mykorrhizierten Fichten (Picea abies) und
mykorrhizierten Pappeln (Populus tremula) sowie mit Holunder (Sambucus nigra, möglicherweise
mit VA-Mykorrhiza) im 0,5-Meter-Raster (Mengenverhältnis 6:1:1), als ektotrophe Mykorrhizapilze
wurden Pisolithus tinctorius und Paxillus involutus Kulturen verwendet, Fläche bis etwa 20-30
cm Bodentiefe beimpft mit Weißfäulepilz-Pappelholz- Weizenstroh-Schreddersubstrat (Pleurotus
ostreatus und Trametes, versicolor), Abdeckung aus Kiefernrindenmulch.
Variante B: belastet, sonst wie Fläche U.
Variante P: wie Fläche B, allerdings nicht mit Weißfäulepilz-Schredder-Substrat beimpft.
Variante M: wie Fläche P, allerdings ohne Bepflanzung, lediglich mechanische Bearbeitung der
Bodenoberfläche.
In einem angrenzendem Fichtenforst (belastet, mit etwa 50jährigen Picea abies bestanden) wurden
parallel ebenfalls Bodenproben entnommen und auf ihren Nitroaromatengehalt überprüft; Variante K
ohne jeden Eingriff.
6.4 Grenzen des Versuchsansatzes
Für die Durchführung des in-situ Phytoremediationsverfahrens wurde als Versuchsfläche auf dem
ehemaligen Werksgelände ein Areal ausgewählt, das in seiner Ausdehnung an das ehemalige
Tonsilerdelager anschloss (siehe oben). Gründe für die Wahl des Standortes waren neben einer
relativ einheitlichen morphologischen Beschaffenheit und günstigen Lage bzw. guten Erreichbarkeit
die deutliche Belastung der Fläche. Resultierend aus umfangreichen Voruntersuchungen erwies es
sich im Nachhinein als schwierig, replizierbare Flächen mit einer geeigneten Belastung in einem
Bereich von 100-1000 mg TNT/kg Boden (TS) mit ausreichender räumlicher Ausdehnung zu finden.
Wie es für Altlastenstandorte typisch ist, trat die Verteilung der Kontamination im Boden sehr
inhomogen in Erscheinung. Auch nach Bearbeitung der schließlich ausgewählten Fläche durch den
Einsatz der Bodenfräse ließen sich die vorhandenen Inhomogenitäten nur teilweise aufheben.
133

Diesbezüglich konnte nicht vermieden werden, dass die Versuchsvarianten durch erhebliche
Unterschiede in ihren Ausgangskontaminationen charakterisiert waren. Diesem Sachverhalt muss
beim Vergleich der Versuchsvarianten Rechnung getragen werden. Des Weiteren war aufgrund der
Anwendung umfangreicher Monitoring- und Testsysteme die wissenschaftliche Versuchsplanung nur
mit Abstrichen zu bewältigen. Hier wäre insbesondere eine Verkürzung der Zeitintervalle zwischen
den Beprobungen wünschenswert gewesen.
6.5 Beurteilung des Phytoremediationsverfahrens im Hinblick seines Sanierungserfolges
unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus den Laborversuchen
Das Begleitmonitoring zur Erfolgskontrolle des Verfahrens beinhaltete umfangreiche chemische
(Nitroaromatenrückstandsanalytik in Boden und Pflanzen), bodenkundliche und bodenbiologische
(Biotest-Batterie, Bodentiere, Streuabbau) Untersuchungen. Vordergründig von Interesse im
vorliegenden Abschnitt sind die Erhebungen zur Entwicklung der Nitroaromatengehalte in Böden und
Pflanzengeweben unter variantenspezifischem Aspekt (Tabelle 24). Weitere Angaben zur
Flächeneinrichtung und zu methodischen Ausführungen sowie eine detaillierte, umfassende
Ergebnisdokumentation bezüglich des Gesamtmonitorings sind den Publikationen Warrelmann et al.
(2000) bzw. Koehler et al. (2001a) zu entnehmen.
134

Tabelle 24: Gegenüberstellung wichtiger Ergebnisse aus Freilanderhebungen am Standort ’Werk
Tanne’ und aus Laborexperimenten der vorliegenden Arbeit
Laboruntersuchungen
Freilanduntersuchungen
Deutliche Initiierung des TNT-Abbaus Deutliche Initiierung des TNT-Abbaus
nach mechanischer Bearbeitung des nach mechanischer Bearbeitung des
Bodens (Homogenisierung durch Sie-ben, Bodens (Homogenisierung durch Ein-satz
2 mm Maschenweite) 1 einer Bodenfräse)
Eine Bepflanzung der Varianten mit
mykorrhizierten Gehölzen steigert effi-zient
den Nitroaromatenabbau; unter der
Voraussetzung einer guten Durchwurzelung
der Rhizotrone
Wenn die Versuchsvarianten mit
mykorrhizierten Gehölzen bestückt waren,
bewirkte eine zusätzliche Be-impfung mit
Weißfäulepilzen keine Verbesserung der
Abbauleistung
Nur ein geringer Teil der im Boden
bioverfügbaren Nitroaromaten wurde von
den Pflanzen tatsächlich aufgenommen.
Neben TNT wurden 2-ADNT und 4-
ADNT im Schad-stoffspektrum der
Pflanzen detektiert, wobei die ADNTs
dominierten. Die nachweisbare
Nitroaromatenkonzentra-tion war stets
durch eine deutliche Organspezifität
gekennzeichnet. Die Wurzeln waren mit
Abstand am höchsten belastet.
Eine effizientere Dekontamination der
Flächen durch Bepflanzung mit mykorrhizierten
Gehölzen ließ sich nicht eindeutig
nachweisen
Den zubeimpften Weißfäulepilzen konnte
für den Abreicherungsprozess der
Schadstoffe keine Bedeutung zugeordnet
werden
Auch im Feldversuch nahmen die Pflanzen
nur einen geringen Teil der verfügbaren
Schadstoffe aus dem Boden auf. Das
Aufnahmeverhalten war artspezifisch.
Nitroaromaten wur-den hauptsächlich in
den Geweben der Fichten gefunden, kaum
in den Pappeln und gar nicht im Holunder.
Das Schadstoffspektrum umfasst TNT
sowie 2-ADNT und 4-ADNT mit leichter
Dominanz zugunsten der ADNTs. Eine
organspezifische Akku-mulation war nicht
festzustellen.
Grundsätzlich scheint das am Standort ‘Werk Tanne’ erprobte in-situ Verfahren zur
Phytoremediation TNT-belasteter Böden geeignet. Als Voraussetzung für eine umfassende Entgiftung
ist allerdings die Bioverfügbarkeit und Zugänglichkeit der Kontaminanten in gelöster oder
feinpartikulärer Form Bedingung. Obwohl sich im maßstabsgerechten Feldversuch auf den mit
mykorrhizierten Gehölzen bestandenen Experimentalflächen (Flächen B und P) kein eindeutig
positiver Effekt bei der Schadstoffabreicherung im Vergleich zu der unbepflanzten Fläche nachweisen
ließ, ist die Annahme einer sich auf die Nitroaromatentransformation günstig auswirkende
Einflussnahme durch die eingebrachten Mykorrhizapartner berechtigt. Das Transformations- und
Remediationspotenzial von Mykorrhizapilzen und deren Wirtspflanzen konnte in eigenen
Laborexperimenten aufgezeigt werden (siehe Abschnitt) und wurde auch in der Literatur mehrfach
135

eschrieben (Kreslavski et al. 1999, Scheidemann 1999). Relevante Gründe für einen fehlenden
Nachweis im Feld dürften in mehrfacher Weise vorliegen und sollen nun kurz erläutert werden.
Nachteilig für eine sichere Beurteilung des Mykorrhizaeffektes ist in jedem Fall die sehr heterogen
verteilte Ausgangskontamination im Boden nach der Flächeneinrichtung. So verhielt sich die
Belastung zum Zeitpunkt t 0 auf den belasteten und bearbeiteten Flächen P>B>M im Verhältnis
10:4:2. Erreichte die Nitroaromatenbelastung auf Fläche P im Mittel anfangs etwa 110 mg/kg Boden
(TS), konnten für die lediglich mechanisch bearbeitete Kontrollfläche M zu Versuchsbeginn nur 25
mg/kg Boden (TS) detektiert werden. Damit war die verhältnismäßig gering belastete Fläche M für
einen Variantenvergleich letztendlich ungeeignet. Durch den mechanischen Eingriff initiierter
pulsartiger starker TNT-Abbau, wie er auch in den Laborexperimenten beobachtet werden konnte
(siehe Abschnitt Variante K Pappelversuch und Kiefernversuch) bewirkte bis zur ersten
Messkampagne nach 6 Monaten einen nahezu vollständigen Abbau der Belastung auf M. Auch die
Flächen B und P waren diesbezüglich bis zur ersten Messung von einer weitreichenden
Dekontamination betroffen. Vergleichende Aussagen zurAbbaukinetik während der schnellen
Abreicherung sind aufgrund fehlender weiterer Messungen innerhalb des ersten Halbjahres daher
kaum zulässig. Genauere Hinweise für eine allgemein schnell einsetzende Abbaukinetik nach
Bodenbearbeitung ergaben die Laborversuche mit drastischen Rückgängen der TNT-Belastung
innerhalb weniger Wochen nach Versuchsbeginn (siehe Abschnitte 3.2 und 3.3). Nachteilig für die
Beurteilung von Mykorrhizaeffekten wirkte sich auch der insgesamt kurze Versuchszeitraum über
lediglich zwei Vegetationsperioden aus. Für in ihrer Durchführung längerfristig ausgelegte
Phytoremediationsverfahren war dieser Zeitraum im Nachhinein zu knapp bemessen. Eine
flächendeckende Durchwurzelung des Bodens auf den bepflanzten Varianten B und P ließ sich nach
eingehender Kontrolle selbst nach Beendigung des Feldexperiments nicht bestätigen. Somit dürfte
sich die Ausbildung einer Rhizosphäre mit einer assoziierten metabolisch hoch aktiven Mikroflora
lokal begrenzt auf das unmittelbare Umfeld der gesetzten Bäumchen mit ihren Wurzeln konzentriert
haben, während Bereiche außerhalb des Wurzelraums weniger von den Einflüssen der Pflanzen
partizipierten. In diesem Zusammenhang würden sich insbesondere die mit den Pflanzen verbundenen
Mykorrhizapilze mit ihren sich weit verzweigenden Hyphensystemen mittelfristig für einen Abbau der
Restkontaminationen anbieten, wie sie vor allem für Fläche P detektiert wurden.
Keine große Bedeutung bei der Nitroaromatendekontamination konnte den zubeimpften
Weißfäulepilzen im Freilandversuch zugeordnet werden. Bereits die Ergebnisse der
Laborexperimente ließen erkennen, dass die Weißfäulepilze in ihrer Funktion mit Erfolg durch
Mykorrhizapilze und deren Wirtspflanzen ersetzt werden können (siehe Variante A und B). Es stellt
sich somit die Frage nach dem Verzicht von Weißfäulepilzen in entsprechenden zukünftigen
Phytoremediationsverfahren, zumal deren Verwendung mit aufwendiger und langwieriger Anzucht auf
Zuschlagstoffen verbunden ist, welche anschließend in den Boden eingebracht werden müssen.
136

Unter dem Aspekt eines eventuell bestehenden Risikopotenzials für die Umwelt durch Verlagerung
relevanter Mengen Nitroaromaten aus dem Boden über die Wurzeln in oberirdische Sprossteile
wurde über den gesamten Versuchszeitraum ein umfangreiches Schadstoffmonitoring an den Pflanzen
durchgeführt. Hierbei ließ sich insgesamt ein nur sehr niedriger Schadstofftransfer in die gepflanzten
Gehölze nachweisen, wobei zu berücksichtigen ist, dass vermutlich nur ein Teil der inzwischen weiter
metabolisierten Nitroaromaten detektiert werden konnte, da sich die Nachweisanalytik auf GC/MS-
Untersuchungen konzentrierte. Eigene Laborexperimente mit 14 C-TNT und verschiedene Ergebnisse
aus der Literatur (Sens 1998, Schönmuth und Pestemer 2000) deuten auf eine zügige und
umfassende Metabolisierung aufgenommener Schadstoffe mit nachfolgendem Einbau der gebildeten
Verbindungen in die pflanzliche Matrix hin, so dass auch bei einer Aufnahme größerer Mengen
Nitroaromaten aufgrund einer rückhaltenden Festlegung vermutlich kaum von einer Gefährdung der
Umwelt durch einen Schadstoffaustrag über die Pflanzenbiomasse auszugehen ist. Untersuchte
Freiland- und Laborpflanzen zeigten ein übereinstimmendes Belastungsspektrum mit den
Nitroaromaten TNT, 2- ADNT und 4-ADNT. Weitere Nitroaromaten wurden nicht gefunden. Der
Feldversuch ließ artspezifische Unterschiede im Aufnahmeverhalten deutlich werden. Ein Indiz dafür,
dass niedrige Aufnahmeraten nicht generell auf alle Pflanzen übertragbar sind (Schönmuth und
Pestemer 2000). Kontaminationen fanden sich fast ausschließlich in den Fichten. Im Gewebe der
Holunderpflanzen konnten keine Schadstoffe detektiert werden. Zusammenfassend betrachtet muss
über fortführende Remobilisierungsexperimente das Reversibilitäts- und Festlegungsverhalten von
Nitroaromaten in Pflanzen weiter untersucht werden, um eine Gefährdung der Umwelt bei der
Anwendung von Phytoremediationsverfahren mit letzter Sicherheit ausschließen zu können.
6.6 Sanierung TNT-belasteter Flächen durch Phytoremediation;
Anwendungsbereiche und Machbarkeit
Für eine sichere und abschließende Beurteilung über den Erfolg des durchgeführten
Phytoremediationsverfahrens war der knapp zweijährige Versuchszeitraum insgesamt zu kurz. Somit
besteht der Bedarf zusätzlicher Freilandexperimente auf entsprechenden Problemstandorten, zumal
weitere vergleichbare Testverfahren bisher nicht durchgeführt wurden. Unter Berücksichtigung der
eigenen und aus der Literatur bekannten positiven Laborergebnisse soll dennoch modellhaft skizziert
werden, bei welchen Bedingungen Phytoremediation auf TNT-Altlasten einen grundlegenden
Sanierungserfolg verspricht.
137

6.6.1 Zeitrahmen und Art des Verfahrens
Grundsätzlich sollten zur Anwendung kommende Verfahren bis zum Erreichen des
Sanierungserfolges auf einen Zeitraum über mehrere Jahre ausgelegt sein, da die mykorrhizierten
Pflanzen mit ihren Wurzeln und Mykorrhizapilze mit ihren Hyphensystemen mehrere
Vegetationsperioden benötigen, um den Boden flächendeckend und feinmaschig zu erschließen. Ein
guter Durchwurzelungsgrad ist Voraussetzung für eine durchgreifende Schadstofftransformation. Als
dominierende Technik beim Nitroaromatenabbau ist die Rhizodegradation anzusehen, wobei
entstehende Transformationsprodukte in der Huminstoffmatrix dauerhaft festgelegt oder von
Rhizosphärenorganismen (einschließlich Mykorrhizapilze) weiter abgebaut werden. Auch der
Phytodegradation muss Beachtung geschenkt werden. Diesbezüglich müssen Aufnahmeverhalten,
Translokation und Metaboli-sierungsvorgänge mit anschließender Festlegung der Abbauprodukte im
Pflanzenkörper noch genauer untersucht werden. Im Hinblick auf die Toxizität von Nitroaromaten
und deren schädlichen Wirkung auf Organismen sind insbesondere Flächen mit einem schwachen bis
mittleren Kontaminationsgrad für Phytoremediationsverfahren geeignet, wobei die Höhe der
Kontamination 400-500 mg TNT/ kg Boden (TS) nicht überschreiten sollte. Im Blickpunkt stehen
hierbei die großflächigen heterogen belasteten und zum Teil bewaldeten Areale, die mit
herkömmlichen ex-situ Verfahren nicht gereinigt werden können.
6.6.2 Auswahl der Organismen
Eine weitere Bedingung für den Sanierungserfolg eines Verfahrens ist die richtige Auswahl von
Pflanzen- und Mykorrhizapilzspezies. Abgesehen von einer guten Wüchsigkeit der eingesetzten
Pflanzen spielt insbesondere eine gute Anpassung an die jeweiligen Standortgegebenheiten der zum
Einsatz kommenden Arten eine wichtige Rolle. So sind möglicherweise natürlich am Standort
verbreitete Pflanzen bei der Flächeneinrichtung vorzuziehen. Als Mykobionten bieten sich Isolate von
belasteten Flächen an, wobei eventuell optimierte Detoxifizierungsmechanismen nicht nur die
Abbauleistung, sondern auch das Toleranzvermögen gegenüber der Toxizität der Nitroaromaten
erhöhen. Als Gehölzpflanzen sind außerdem Arten mit einem weiten Wirtsspektrum für verschiedene
Mykorrhizapilze vorzuziehen. Eine hohe Artendiversität an Ektomykorrhizapilzen im Boden dürfte für
eine rege Enzymaktivität im Boden nur förderlich sein. Bisher sind erst wenige Ektomykor-rhizapilze
auf ihre Fähigkeit zur Biodegradation untersucht. Unter Berücksichtigung der Artenvielfalt und auch
der Variationen innerhalb einer Spezies ergibt sich möglicherweise ein enormes
Degradationspotenzial (Meharg & Cairney 2000). Von 42 getesteten ECM-Arten besaßen 33 Arten
die Fähigkeit, eine oder mehrere Klassen von Schadstoffen zu degradieren.
Durch die Verwendung tief wurzelnder Gehölze könnte zudem die Schadstoffdegradation in tieferen
Bodenschichten gesteigert werden. Vor allem Bakterien könnten von den Bedingungen in der
138

Rhizosphäre profitieren, verrottende Wurzeln als Substrat nutzen und vermehrt Schadstoffe
cometabolisch umsetzen. Entstehende Wurzelgänge wiederum erleichtern den Gasaustausch mit der
Erdoberfläche. Positiv wirkt sich möglicherweise auch aus, dass Pflanzen über die Wasseraufnahme
ihrer Wurzeln eine Verdriftung der Nitroaromaten mit dem versickernden Bodenwasser in tiefere
grundwasserführende Bodenschichten verringern. Außerdem verbessern sie die
Wasserhaltekapazität des Bodens und vermindern auch auf diesem Wege die Verlagerung von
Nitroaromaten in das Grundwasser.
Umstritten ist bisher die Verwendung genetisch modifizierter Pflanzen in der Phytoremediation, wobei
sich Befürworter der Gentechnik hiervon einen verbesserten Abbau der Schadstoffe versprechen.
Der Nachweis vielversprechender Erfolge im Freiland blieb bisher allerdings aus. Im Hinblick auf
mögliche Risiken der Gentechnik sollte bedacht werden, ob sich genetische Modifikationen in der
Phytoremediation nicht als unnötig erweisen. Nur ein sehr kleiner Teil aller vorkommenden
Gefäßpflanzen (400000 Arten bekannt) wurde bisher hinsichtlich des Abbaupotenzials für organische
Schadstoffe untersucht. Erwartet wird, dass im Laufe der Zeit zahlreiche weitere für die
Phytoremediation geeignete Pflanzen gefunden werden (Trapp & Karlson 2000).
139

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159

Anhang
Anhang
Tabelle 25: Zusammensetzung des MMN-Agars nach Marx (1969); Kulturmedium für
Mykorrhizapilze.
Komponenten in mg/l in mM/l
Glucose 10,0 x 10 3
Malz-Extrakt 5,0 x 10 3
Agar Agar 20,0 x 10 3
CaCl 2 50,0 0,451
NaCl 25,0 0,266
KH 2 PO 4 500,0 3,674
(NH 4 ) 2 HPO 4 250,0 1,893
MgSO 4 x 7H 2 O 150,0 0,609
Fe-EDTA 28,3
Thiamin-HCl 1,0
Tabelle 26: Zusammensetzung des Malz-Pepton-Agars zur Kultivierung der Weißfäulepilze,
Rezept nach DSM (DSM 19).
Komponenten
in g/l
Malz-Extrakt 10
Pepton 3
Agar Agar 20
159

Anhang
Tabelle 27: Zusammensetzung des Agar-Festmediums A zum qualitativen Nachweis von
Mangan- und Ligninperoxidase-Aktivität (Zusammensetzung der Spurenelementelösung siehe
Tabelle 28) bei verschiedenen Weißfäule- und Mykorrhizapilzen.
Komponenten
in mg/l (sonst ml/l)
Agar Agar 20,0 x 10 3
Glukose 1,0 x 10 3
KH 2 PO 4 200,0
MgSO 4 x 7 H 2 O 50,0
CaCl 2 x 2 H 2 O 13,0
NH 4 H 2 PO 4 240,0
0,1 M Na-acetat pH 5,0 100,0 ml
Spurenelemente-Lsg.
7,0 ml
Thiamin-HCL 1,0
pH 5,5
Tabelle 28: Zusammensetzung der Spurenelementelösung für das Agar-Festmedium A (siehe
Tabelle 27).
Zusammensetzung der Spurenelementelösung
in mg/l
MgSO 4 x 7 H 2 O 3,0 x 10 3
MnSO 4 x H 2 O 500,0
NaCl 1,0 x 10 3
FeSO 4 x 7 H 2 O 100,0
CaSO 4 x 2 H 2 O 100,0
ZnSO 4 x 7 H 2 O 100,0
CaCl 2 x 2 H 2 O 82,0
Al 2 (SO 4 ) 3 x 18 H 2 O 10,0
H 3 BO 3 10,0
Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O 10,0
CuSO 4 x 5 H 2 O 50,0
H 2 O bidest
ad 1 l
160

Anhang
Tabelle 29: Düngerlösung für Pinus sylvestris modifiziert nach Ingestad (1960)
Komponenten in mg/l in mM/l
KH 2 PO 4 88,0 0,646
NH 4 NO 3 143,0 1,785
KCl 46,0 0,624
CaCl 2 x 6H 2 O 219,0 1,000
MgSO 4 x 7H 2 O 154,0 0,630
FeCl 3 x 6H 2 O, Fe-EDTA 5,0 0,017
MnCl 2 x 4H 2 O 0,6 0,003
H 3 BO 3 1,0 0,015
ZnCl 2 x 2H 2 O, Fe-EDTA 0,04 0,003
CuCl 2 x 2H 2 O 0,05 0,003
Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0,007 0,0003
Tabelle 30: Zusammensetzung des Volldüngers für die Pappeln (nach Packungsbeilage); die
Angaben beziehen sich auf eine konzentrierte Düngerlösung; 1-2 ml Düngerlösung wurden
mit 1 Liter Gießwasser verdünnt.
Komponenten
in g/l
N (12% Stickstoff, davon
sind 1% Nitratstickstoff
144,0
und 11% Carbamidstickstoff)
P 2 O 5 (4% Phosphat) 48,0
K 2 O (6% Kali) 72,0
MgO (0,24%) 2,0
In sehr geringen Mengen die Elemente Bor, Eisen,
Kupfer, Mangan, Molybdän und Zink
161

Anhang
Tabelle 31: ermittelte bodenkundliche Angaben zu den in den Experimenten verwendeten
Substraten; 1) Daten wurden dankenswerterweise von Herrn Tobias Frische zur Verfügung
gestellt; 2) u. 3) Daten wurden dankenswerterweise vom Niedersächsischem Landesamt für
Bodenforschung, BTI Bremen (Bodentechnologisches Institut) zur Verfügung gestellt.
Boden
LUFA 2.2 1)
Kieferntoxizitätstest
Substrat 2)
Kiefernexperiment
Substrat 3)
Pappelexperiment
% TM
C total
Gew.%
TM
N total
Gew.%
TM
C/N
NH 4 -N
mg/kg
TM
NO 3 -N
mg/kg
TM
KAK eff.
µmol c /g
TM
88,5 2,4 0,23 10,5 4,4 10,9 87,5
97,1 1,75 0,13 15 1,4 0,7 —
96,3 3,87 0,25 15 10,5 0,9 —
Tabelle 32: Körnungsanteil in % des humusfreien trockenen Bodens (105°); Substrat A
(Kiefernexperiment); Substrat B (Pappelexperiment); Die Daten wurden dankenswerterweise
vom Niedersächsischem Landesamt für Bodenforschung, BTI Bremen (Bodentechnologisches
Institut) zur Verfügung gestellt.
Substrat
Glühverlust
Körnungsklassen in mm und ihr prozentualer Anteil am Substrat
2,0 ─
0,6
0,6 ─
0,2
0,2 ─
0,1
0,1 ─
0,06
0,06 ─
0,02
0,02 ─
0,002
< 0,002
A 5,4% 16,6% 28,3% 10,5% 1,8% 13,0% 20,1% 9,8%
B 7,9% 8,9% 32,5% 8,3% 2,7% 11,4% 21,2% 15,0%
162

Anhang
8
7,5
7
Variante A
Variante B
Variante C
Variante K
6,5
pH-Wert
6
5,5
5
4,5
4
0 2 3 5 6
Versuchsdauer in Monaten
Abb. 41: Übersicht über die Boden-pH-Wert-Entwicklung in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Kiefernexperiments im Zeitverlauf (Punkt 2.2.1). Dargestellt sind die Mittelwerte von drei Proben.
Erläuterungen zu den Varianten sind in Punkt 2.2.1 zu finden.
6
5,5
5
Variante A
Variante B
Variante C
Variante K
Variante D
pH-Wert
4,5
4
3,5
3
0 2 4 6 8 10 12 14
Versuchsdauer in Wochen
Abb. 42: Übersicht über die Boden-pH-Wert-Entwicklung in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Pappelexperiments im Zeitverlauf (Punkt 2.2.2). Dargestellt sind die Mittelwerte von drei Proben.
Erläuterungen zu den Varianten sind in Punkt 2.2.2 zu finden.
163

Anhang
8
7,5
7
0 mg TNT/kg
3 mg TNT/kg
300 mg TNT/kg
3000 mg TNT/kg
6,5
pH-Wert
6
5,5
5
4,5
4
0 4 8 12
Versuchdauer in Wochen
Abb. 43: Übersicht über die Boden-pH-Wert-Entwicklung in den jeweiligen Dotierungsstufen des
Kiefern-Toxizitätstest im Zeitverlauf (Punkt 2.2.4). Dargestellt sind die Mittelwerte von drei Proben.
164

Anhang
Tabelle 33: ermittelte Nitroaromatengehalte (Einzelwerte) der Bodensubstrate in den jeweiligen Versuchsvarianten des Kiefernexperiments zum
Zeitpunkt t 0 (Startbeprobung). Fett gedruckte Werte wurden nicht in die Auswertung einbezogen.
# Variante A Variante B Variante C Variante K
TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT
1 26,19 5,35 5,38 66,41 14,01 13,10 50,62 8,53 8,23 105,20 7,32 6,80
2 203,23 7,99 7,73 48,24 11,14 9,74 542,80 10,47 9,39 86,50 9,82 9,75
3 43,05 9,18 8,56 61,84 9,50 8,88 94,83 8,74 7,88 45,28 5,93 6,04
4 296,16 9,32 8,06 49,12 10,59 9,75 34,34 7,11 6,68 64,44 11,23 10,92
5 83,99 9,86 8,44 157,4 8,50 7,12 44,19 8,00 7,87 43,11 8,35 9,29
6 60,58 9,42 9,05 47,57 8,95 7,90 38,38 7,29 6,72 84,28 7,96 7,66
7 60,78 10,48 9,01 80,78 9,69 8,88 115,55 9,01 9,01 486,09 9,67 8,15
8 64,34 8,74 7,19 76,13 8,17 7,94 121,33 8,21 7,29 163,01 8,65 8,31
9 48,65 9,22 8,58 33,17 7,83 7,08 77,08 9,13 8,54 59,57 8,89 7,97
10 55,48 6,21 5,59 87,01 7,63 8,57 93,59 7,94 7,50 41,21 9,88 8,54
11 408,37 12,17 10,35 74,55 8,93 8,68 54,19 8,88 9,05 121,39 10,07 8,79
12 110,14 8,79 8,65 197,35 10,00 8,49 115,65 10,05 9,29 52,43 10,64 9,91
13 177,52 9,27 7,59 81,32 8,68 7,28 41,88 8,05 8,33 56,04 9,07 8,24
14 903,97 10,09 9,86 42,64 8,81 7,09 57,47 7,78 7,10 57,26 6,97 6,43
15 130,39 8,81 8,52 53,9 9,41 7,96 298,25 8,56 7,65 40,59 7,80 7,19
16 46,14 9,22 7,91 124,53 9,12 7,81 90,28 9,55 8,68 135,30 9,15 8,37
17 61,57 9,54 8,38 101,35 9,48 8,33 79,54 6,38 5,81 201,90 8,76 7,51
18 102,17 11,70 10,41 982,22 8,36 7,71 102,78 8,82 7,86 704,85 9,11 8,77
19 69,39 7,82 6,63 61,27 7,45 7,87 51,47 8,87 8,96 44,09 7,09 6,50
20 49,19 8,80 7,79 62,29 9,32 8,81 110,65 7,97 7,27 129,79 9,27 8,13
21 85,43 7,54 6,25 51,45 11,48 9,33 65,49 8,28 6,93 36,97 6,45 6,16
22 75,1 9,13 7,83 64,48 8,34 7,18 58,72 10,23 9,69 109,02 11,39 10,87
23 76,21 10,84 9,47 34,45 8,34 7,86 62,1 8,26 7,70 78,59 9,05 8,49
24 73,84 9,68 8,91 56,32 7,87 7,21 105,26 9,45 9,08 46,59 10,37 9,34
25 52,36 7,53 7,19 65,58 6,91 6,49 93,10 8,96 8,52 174,30 9,55 8,98
26 46,02 7,30 6,69 53,06 8,55 7,88 71,02 9,07 8,67 78,79 7,49 8,01
27 84,75 9,50 8,90 59,95 8,55 7,19 81,95 9,79 8,75 94,69 11,59 11,18
28 179,96 9,53 9,05 69,72 9,81 8,87 45,50 7,43 6,95 110,82 9,22 9,13
29 138,51 10,70 8,39 70,86 9,50 8,60 98,63 8,39 7,36 89,97 6,93 5,96
30 78,03 8,83 8,05 503,94 11,17 9,94 107,32 9,03 8,42 50,32 8,64 7,89
31 36,97 9,21 8,46 85,50 9,37 8,17 46,17 7,45 6,45 58,56 9,23 8,52
32 44,58 8,77 7,89 58,25 7,83 7,96 58,92 8,57 7,78 52,29 11,32 10,91
Nitroaromatengehalte in mg/kg; # = Probe
159

Anhang
Tabelle 34: ermittelte Nitroaromatengehalte (Einzelwerte) der Bodensubstrate in den jeweiligen Versuchsvarianten des Kiefernexperiments zum
Zeitpunkt t 1 -t 4 . Fett gedruckte Werte wurden nicht in die Auswertung einbezogen.
t # Variante A Variante B Variante C Variante K
TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT
1 4,02 8,77 7,09 23,19 15,19 12,10 3,24 7,65 6,82 17,19 11,89 10,02
2 148,96 10,17 8,20 19,59 14,82 12,07 5,35 9,43 8,10 104,99 12,78 10,05
3 10,06 10,25 8,26 258,06 15,91 12,60 3,28 7,63 6,15 59,97 14,64 12,17
t 4 6,03 9,28 7,95 24,89 14,28 12,00 21,01 8,01 6,70 37,72 13,51 11,13
1 5 21,01 10,70 9,79 20,50 11,04 9,04 5,37 11,29 9,27 18,78 10,56 8,62
6 5,78 7,97 6,79 - - - 3,60 7,10 6,10 16,79 10,45 8,95
7 6,03 8,60 7,59 22,52 11,22 9,13 5,63 11,36 9,78 24,84 12,37 10,14
8 9,25 13,30 7,77 19,43 11,88 9,97 142,92 9,76 7,91 57,14 10,69 8,64
1 42,09 7,64 7,09 10,42 10,24 9,21 6,25 9,85 9,89 25,22 13,98 11,48
2 2,96 7,44 7,06 39,14 12,86 10,63 38,17 10,64 9,90 16,78 13,60 11,23
3 - - - 25,93 10,92 9,34 8,23 9,99 9,95 62,36 12,03 9,33
t 4 648,50 11,43 9,48 16,76 11,31 9,87 2,98 9,19 9,05 21,03 12,98 11,26
2 5 28,57 9,96 9,82 10,31 9,97 8,69 3,08 7,67 7,79 14,53 13,87 11,68
6 13,06 9,51 8,65 13,28 10,06 8,18 2,74 6,58 6,77 20,92 10,06 8,02
7 16,13 8,54 7,56 12,02 10,47 8,69 36,76 10,77 10,08 32,32 10,63 8,73
8 11,03 10,16 9,63 21,39 8,26 7,10 7,05 12,05 11,44 59,22 12,57 10,62
1 5,21 9,85 9,38 9,83 10,67 9,56 5,73 8,58 8,19 11,18 12,27 10,62
2 525,46 13,05 10,98 8,41 9,73 8,99 4,25 10,10 10,83 10,42 10,48 9,22
3 3,95 6,74 6,88 19,42 10,18 8,74 3,08 5,27 5,79 13,65 9,54 8,63
t 4 957,96 10,28 8,79 14,40 10,61 9,61 7,97 9,16 9,58 10,79 13,56 11,46
3 5 11,07 9,73 9,30 256,09 12,12 10,00 2,29 8,12 8,79 8,52 11,24 9,88
6 4,28 8,00 8,29 11,46 10,73 9,55 114,93 12,98 12,35 26,02 12,57 11,43
7 5,13 7,39 7,34 12,80 10,87 9,66 5,93 12,10 12,80 10,17 13,43 12,24
8 - - - - - - 9,05 11,82 11,81 9,99 13,71 12,72
1 2,48 6,69 7,61 - - - 9,02 8,30 8,96 11,37 15,20 12,94
2 6,83 4,87 5,60 5,48 12,41 10,95 3,59 8,47 8,69 12,15 14,04 11,97
3 2,58 5,42 5,54 11,90 11,27 10,77 3,21 7,72 9,44 10,75 12,44 10,99
t 4 2,36 4,37 4,21 6,33 10,74 9,53 1,82 5,21 6,13 12,91 14,30 12,42
4 5 2,01 4,62 5,09 2,66 10,85 9,76 20,69 8,90 9,44 11,88 13,23 11,73
6 5,39 5,71 5,28 9,80 13,24 11,56 9,26 8,39 9,69 4,36 8,12 7,39
7 2,86 8,77 7,95 20,44 17,16 15,70 2,03 6,49 7,29 70,41 14,41 11,91
8 2,81 4,80 5,03 27,60 11,71 10,15 3,11 6,48 6,72 472,80 18,32 14,87
t 1 =2, t 2 = 3, t 3 = 5 und t 4 = 6 Monate Versuchsdauer; Nitroaromatengehalte in mg/kg; # = Probe
159

Anhang
Tabelle 35: ermittelte Nitroaromatengehalte (Einzelwerte) der Bodensubstrate in den jeweiligen Versuchsvarianten des Pappelexperiments zum
Zeitpunkt t 0 (Startbeprobung).
# Variante A Variante B Variante C Variante D Variante K
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT
373,97 37,83 58,35 438,51 32,54 49,62 405,83 35,76 53,40 414,57 40,71 75,95 397,60 36,60 52,35
459,02 32,30 49,09 772,78 33,04 50,18 754,49 36,81 53,99 328,57 33,21 63,51 481,88 36,59 52,46
614,44 37,65 57,51 388,66 31,65 47,40 438,50 33,31 48,21 366,31 35,97 68,66 527,05 38,49 55,47
390,47 34,76 54,49 417,70 36,25 55,95 474,58 36,94 54,21 411,25 34,39 65,04 388,81 33,00 47,07
428,60 33,40 51,55 462,49 34,76 52,55 410,13 33,67 49,87 530,35 33,26 62,89 455,91 36,36 52,03
483,11 32,81 49,46 433,32 33,37 50,75 546,21 34,96 52,15 395,10 36,91 70,46 454,39 33,91 49,25
405,76 30,10 46,69 652,71 38,60 58,25 553,11 38,75 57,43 384,67 37,34 71,60 506,76 36,51 53,53
472,06 32,43 49,49 349,76 32,64 49,45 398,14 32,51 50,49 391,88 37,84 71,51 476,90 36,04 52,53
388,82 30,74 45,86 315,50 29,06 47,76 417,12 37,44 67,71 365,79 35,58 68,38 445,79 37,98 56,92
361,23 31,49 45,69 409,70 32,56 57,24 336,75 41,24 73,97 500,70 39,37 76,04 385,26 35,18 53,24
569,05 32,03 46,70 507,66 31,74 54,82 391,45 41,75 72,79 397,18 37,60 71,75 450,72 33,29 49,73
418,47 30,97 45,88 360,19 31,15 53,09 372,91 43,22 77,51 371,34 34,29 67,11 507,38 37,79 56,69
358,38 29,56 43,95 421,12 36,02 64,86 346,59 39,21 70,01 406,96 35,83 71,51 415,17 37,00 56,15
368,92 32,42 48,03 363,13 36,68 68,53 329,48 38,34 67,14 784,94 38,62 76,82 507,03 36,24 55,17
367,39 31,97 46,86 338,19 35,12 66,74 333,39 38,57 65,85 375,70 36,67 72,34 460,17 37,32 56,28
600,97 51,78 36,62 417,35 37,83 72,01 366,66 42,69 74,04 737,36 37,83 75,65 399,04 42,17 66,44
587,95 32,13 45,88 399,78 42,00 83,66 474,06 43,60 74,19 639,27 40,16 80,78 381,05 33,53 51,44
413,18 32,35 46,75 352,78 41,38 79,66 691,77 44,07 72,44 465,40 41,26 81,83 469,18 38,22 58,28
397,51 31,78 45,83 403,79 42,76 80,32 393,59 42,64 72,51 420,16 38,65 78,82 426,76 36,53 56,90
413,42 36,62 53,54 347,68 39,89 75,00 413,79 46,61 78,22 409,84 39,09 80,46 405,14 40,36 64,47
528,99 36,99 54,62 364,24 37,14 71,96 606,02 36,04 57,40 508,27 39,83 80,67 380,42 39,45 62,45
460,28 35,51 52,17 345,96 41,38 79,91 650,48 39,48 61,43 399,24 41,29 84,39 395,02 31,48 51,04
412,87 36,32 55,25 325,04 37,57 72,94 396,84 34,51 55,81 338,97 36,44 76,94 389,60 32,41 51,68
466,46 32,92 48,24 361,57 38,12 74,25 538,12 37,38 59,93 614,95 39,22 84,18 338,48 32,32 51,50
520,32 37,90 56,69 330,72 40,75 82,47 401,49 39,97 66,55 372,11 36,51 62,97 363,61 34,43 56,47
413,55 36,80 55,73 359,25 31,61 45,93 383,58 39,77 62,64 453,39 37,44 64,59 402,63 34,96 58,20
541,74 37,29 56,22 463,85 38,56 54,79 360,23 40,17 67,67 358,14 38,18 64,79 335,61 32,54 53,93
358,39 32,49 48,61 402,05 36,29 51,76 429,95 42,73 71,96 346,94 37,04 63,80 414,92 35,17 57,48
630,08 31,53 46,80 400,72 35,24 50,27 418,99 44,25 78,62 400,71 36,54 64,09 322,08 30,87 52,24
598,27 32,25 48,01 709,85 38,71 54,46 421,23 44,56 78,47 634,54 38,97 67,31 354,28 31,09 52,62
503,95 36,40 54,74 623,12 38,94 54,74 431,68 42,34 69,29 607,14 39,11 67,29 445,96 37,22 67,01
509,89 30,46 44,90 478,92 37,07 52,83 1384,9 42,02 67,56 423,34 36,63 63,85 606,62 43,35 77,93
Nitroaromatengehalte in mg/kg; # = Probe
159

Anhang
Tabelle 36: ermittelte Nitroaromatengehalte (Einzelwerte) der Bodensubstrate in den jeweiligen Versuchsvarianten des Pappelexperiments zum
Zeitpunkt t -t Fett gedruckte Werte wurden nicht in die Auswertung einbezogen.
1 4.
t # Variante A Variante B Variante C Variante D Variante K
TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT TNT 4ADNT 2ADNT
1 99,46 46,75 54,26 239,71 55,47 66,62 138,46 65,14 78,07 89,55 54,40 81,29 228,47 33,11 82,84
2 61,56 47,91 52,51 239,85 43,02 55,96 176,75 60,22 81,54 131,66 60,29 85,23 253,43 36,54 87,98
3 85,72 47,21 55,68 254,24 44,74 54,30 316,63 60,06 77,02 135,55 59,26 81,89 441,06 35,39 81,99
t 4 89,49 48,16 56,52 252,63 62,35 74,62 170,30 68,27 81,56 99,54 61,82 85,98 263,65 38,72 97,58
1 5 118,41 53,13 58,67 145,19 49,55 58,23 188,67 68,15 86,76 101,82 61,76 84,89 211,70 37,55 94,31
6 437,15 54,81 58,76 159,22 49,08 60,16 225,04 66,58 81,76 181,53 66,83 84,24 184,05 36,54 98,11
7 201,29 47,51 52,66 137,73 50,65 60,77 126,32 67,02 79,60 135,84 60,57 81,19 496,75 39,63 99,59
8 102,18 51,21 56,51 158,78 57,10 70,38 176,36 63,94 80,56 244,13 68,69 94,61 538,91 40,98 62,88
1 100,79 69,04 67,69 109,11 75,45 88,73 362,64 80,76 107,98 275,50 73,55 94,59 299,60 42,36 135,50
2 82,31 66,41 63,87 57,32 67,81 93,82 202,87 66,57 111,58 58,27 71,60 90,60 129,13 40,65 128,23
3 144,62 83,96 73,61 105,68 75,96 86,43 96,85 75,88 101,95 112,56 77,56 108,07 468,15 45,45 130,73
t 4 66,88 66,63 61,50 90,21 68,73 82,91 63,25 81,58 104,32 86,15 67,68 91,27 151,48 44,63 141,04
2 5 67,43 69,21 61,13 164,91 79,81 92,39 95,07 83,71 106,98 109,02 73,18 95,35 168,24 39,58 133,01
6 63,25 64,82 60,98 68,94 75,64 101,73 78,70 80,65 101,48 144,23 73,96 94,13 143,15 40,28 134,16
7 327,78 64,05 64,71 63,91 81,23 101,18 93,05 81,27 103,14 95,24 69,20 89,96 129,95 42,77 131,51
8 87,87 67,07 66,33 40,40 77,38 100,90 64,85 79,32 101,64 213,71 70,15 95,90 148,38 42,45 130,43
1 32,08 61,74 66,77 35,88 50,60 69,34 67,54 57,45 74,53 40,79 70,39 88,10 439,40 37,22 131,15
2 52,41 69,09 69,15 26,84 58,70 80,26 51,07 54,66 70,46 44,09 69,40 84,91 127,80 39,74 135,81
3 61,84 58,52 58,72 46,86 66,04 96,61 49,76 66,58 84,93 48,59 61,75 75,37 80,80 36,01 132,48
t 4 33,67 50,26 50,54 17,49 51,95 68,99 82,21 65,76 85,35 26,10 58,74 80,86 132,27 42,88 135,37
3 5 77,33 54,58 58,41 34,17 55,86 72,09 69,41 63,82 76,72 44,22 59,52 79,40 126,65 38,38 115,88
6 - - - 31,98 49,65 67,32 73,63 58,68 75,52 43,78 63,12 86,73 99,71 39,83 128,84
7 35,71 54,55 54,95 19,70 49,38 69,38 61,16 50,89 62,64 119,32 64,71 90,47 66,96 33,76 116,42
8 37,22 55,60 57,78 32,83 61,64 81,71 117,08 60,57 73,28 85,20 74,91 102,94 121,75 46,94 145,88
1 11,76 43,36 41,91 17,02 60,16 75,30 80,59 81,61 103,32 20,74 64,44 77,07 525,78 53,48 152,08
2 21,76 56,29 55,33 - - - 100,69 70,75 89,48 27,69 55,96 71,00 101,00 41,82 149,89
3 54,50 46,23 50,68 506,57 59,52 64,83 70,69 65,21 80,00 41,86 69,33 78,77 100,33 52,67 123,18
t 4 19,42 61,65 65,18 28,53 47,66 53,46 57,91 59,96 84,58 26,71 65,35 81,32 98,63 49,60 183,89
4 5 26,55 51,06 52,39 77,69 46,38 50,90 43,41 75,62 96,07 15,40 63,61 70,68 150,07 46,48 185,85
6 26,76 49,85 48,16 35,44 42,79 54,15 179,31 69,57 87,07 23,54 70,67 76,55 100,79 46,55 163,07
7 13,92 44,28 47,10 65,58 55,43 60,85 53,90 57,51 91,34 51,84 93,52 96,90 329,96 31,32 66,13
8 19,03 57,34 59,79 46,95 56,58 72,75 133,05 77,72 101,79 58,42 86,18 92,49 57,04 44,80 160,60
t 1 =2, t 2 = 4, t 3 = 8 und t 4 = 12 Wochen Versuchsdauer; Nitroaromatengehalte in mg/kg; # = Probe
159

Anhang
Tabelle 37: Entwicklung der TNT-Bodengehalte in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Kiefernexperiments (Punkt 3.2.1), ermittelte Signifikanzen nach Mann & Whitney (U-Test).
t 0 t 1 t 2 t 3 t 4
A B C K A B C K A B C K A B C K A B C K
A – – – +
t B – – +
0 C – +
K +
A + – + – – +
t B + – – + ─
1 C + – – –
K – + +
A – – – – +
t B – – – ─
2 C + – –
K + +
A ─ – + –
t B + – –
3 C + –
K –
A + – +
t B – –
4 C +
K
Probennahme nach t 0 = Start, t 1 = 2, t 2 = 3, t 3 = 5 und t 4 = 6 Monaten in den Varianten A, B, C und K;
errechnete Signifikanzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p 0,05 (), + (signifikant), – (nicht
signifikant)
159

Anhang
Tabelle 38: Entwicklung der ADNT-Bodengehalte in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Kiefernexperiments (Punkt 3.2.2), ermittelte Signifikanzen nach Mann & Whitney (U-Test).
t 0 t 1 t 2 t 3 t 4
A B C K A B C K A B C K A B C K A B C K
A – – – –
t B + – +
0 C – –
K –
A + – + –
t B + – +
1 C + –
K –
A – – + –
t B – + –
2 C + –
K –
A – – + +
t B – – +
3 C – –
K –
A + + +
t B + –
4 C +
K
Probennahme nach t 0 = Start, t 1 = 2, t 2 = 3, t 3 = 5 und t 4 = 6 Monaten in den Varianten A, B, C und K;
errechnete Signifikanzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p 0,05 (), + (signifikant), – (nicht
signifikant)
160

Anhang
Tabelle 39: Entwicklung der TNT-Bodengehalte in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Pappelexperiments (Punkt 3.3.1.1), ermittelte Signifikanzen nach Mann & Whitney (U-Test).
t 0 t 1 t 2 t 3 t 4
A B C D K A B C D K A B C D K A B C D K A B C D K
A – – – – +
t B – – – +
0 C + – +
D – +
K –
A + – – + – + +
t B – + + + + +
1 C – + – + +
D + – + +
K + + +
A – – + – + +
t B – – + + +
2 C – + – –
D – + +
K + –
A ─ – – + +
t B + + + –
3 C – + –
D + –
K –
A ─ + – +
t B + – +
4 C + +
D +
K
Probennahme nach t 0 = Start, t 1 = 2, t 2 = 4, t 3 = 8 und t 4 = 12 Wochen in den Varianten A, B, C, D und K;
errechnete Signifikanzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p 0,05 (), + ( ist signifikant), – (ist nicht
signifikant)
161

Anhang
Tabelle 40: Entwicklung der ADNT-Bodengehalte in den jeweiligen Versuchsvarianten des
Pappelexperiments (Punkt 3.3.1.2), ermittelte Signifikanzen nach Mann & Whitney (U-Test).
t 0 t 1 t 2 t 3 t 4
A B C D K A B C D K A B C D K A B C D K A B C D K
A – – + – +
t B – + – +
0 C – – +
D – +
K +
A – – – – –
t B + + – +
1 C – + +
D + +
K +
A + + + + +
t B + – – +
2 C + + +
D + +
K –
A – + + + ─
t B – + + –
3 C + + +
D + –
K +
A – + + +
t B + + +
4 C – +
D +
K
Probennahme nach t 0 = Start, t 1 = 2, t 2 = 4, t 3 = 8 und t 4 = 12 Wochen in den Varianten A, B, C, D und K;
errechnete Signifikanzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p 0,05 (), + ( ist signifikant), – (ist nicht
signifikant)
Tabelle 41: Entwicklung der Pflanzenfrischgewichte im Kiefern-Toxizitätstest (Punkt 3.5.3),
ermittelte Signifikanzen nach Mann & Whitney (U-Test).
t
Dotie- 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen
rung 0 3 300 3000 0 3 300 3000 0 3 300 3000
4 0 ─ ─ +
WO 3 ─ ─
CH 300 ─
EN 3000
8 0 ─ + +
WO 3 + +
CH 300 +
EN 3000
12 0 ─ + +
WO 3 + +
CH 300 +
EN 3000
Biomasseentwicklung in Abhängigkeit von der TNT-Konzentration; Dotierung in mg/kg Boden;
Versuchsdauer in Wochen; errechnete Signifikanzen + (signifikant), - (nicht signifikant).
162

Anhang
Tabelle 42: Kiefern-Toxizitätstest (Punkt 3.5.2); ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen
(Einzelwerte) in Bodensubstrat und Bodenlösung nach 2 Wochen Versuchsdauer in den
jeweiligen Dotierungsklassen.
Nitroaromatenkonz. im Boden (TB)
in mg/kg
Nitroaromatenkonz. in der Boden.-Lsg.
in mg/l
Dotierungsklasse
TNT in mg/kg TNT 4-ADNT 2-ADNT TNT 4-ADNT 2-ADNT
3
3
0
0
3
0
0
0
0,05 0,35 0,21 0,01 0,03 0,03
0,05 0,35 0,22 0,00 0,03 0,01
0,05 0,35 0,21 0,00 0,02 0,02
0,05 0,38 0,22 0,00 0,01 0,02
0,04 0,40 0,24 0,00 0,03 0,02
0,04 0,33 0,19 0,01 0,04 0,01
0,05 0,33 0,19 0,00 0,03 0,03
0,04 0,36 0,19 0,00 0,03 0,02
0,03 0,17 0,10 0,00 0,01 0,02
0,05 0,40 0,21 0,00 0,02 0,01
0,04 0,37 0,22 0,01 0,02 0,02
0,06 0,41 0,26 0,01 0,02 0,03
0,07 0,33 0,20 0,00 0,03 0,01
0,05 0,38 0,22 0,00 0,05 0,01
0,04 0,31 0,18 0,00 0,03 0,01
54,36 16,67 12,38 9,92 3,24 2,42
50,50 16,50 12,22 8,92 3,31 2,39
60,41 17,25 13,04 9,59 3,28 2,42
75,66 18,14 13,78 9,12 3,25 2,39
41,39 16,78 12,77 8,94 3,14 2,40
43,79 16,25 12,38 8,50 3,75 2,72
47,86 16,15 12,20 10,30 3,38 2,48
57,93 16,52 12,54 7,00 3,10 2,22
39,41 16,42 12,34 12,08 2,87 2,06
49,98 15,91 12,40 19,33 3,36 2,51
44,56 15,07 11,46 14,80 3,40 2,51
40,47 16,95 12,85 6,85 3,27 2,27
58,02 15,39 11,36 15,27 3,32 2,39
47,73 16,77 12,97 9,14 3,23 2,32
58,85 15,66 11,88 9,72 3,30 2,40
1928,28 7,38 20,28 65,21 4,09 3,09
2103,79 18,87 18,09 66,46 4,00 2,97
2086,69 21,21 13,29 61,97 3,87 2,93
2143,00 20,13 12,03 73,14 4,05 2,91
2046,61 19,78 12,87 66,49 3,90 2,99
2038,77 23,35 14,04 70,45 3,87 2,71
2402,74 26,58 19,08 87,86 4,69 3,55
1902,98 20,30 12,73 97,06 62,03 5,43
2210,68 22,49 14,37 93,08 4,70 3,44
1883,97 20,49 12,96 77,31 4,44 3,23
2064,06 22,53 14,60 75,70 4,78 3,35
1671,27 20,39 13,07 87,28 4,72 3,44
1998,46 21,53 14,00 77,65 4,51 3,28
2212,11 22,53 14,65 83,18 4,45 3,21
2035,35 24,10 15,27 80,30 4,30 3,14
163

Anhang
Tabelle 43: Kiefern-Toxizitätstest (Punkt 3.5.2); ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen
(Einzelwerte) in Bodensubstrat und Bodenlösung nach 4 Wochen Versuchsdauer in den
jeweiligen Dotierungsklassen.
Nitroaromatenkonz. im Boden (TB)
in mg/kg
Nitroaromatenkonz. in der Boden.-Lsg.
in mg/l
Dotierungsklasse
in mg/kg TNT 4-ADNT 2-ADNT TNT 4-ADNT 2-ADNT
3
3
0
0
3
0
0
0
0,00 0,18 0,14 0,07 0,09 0,04
0,36 0,30 0,20 0,04 0,05 0,05
0,30 0,30 0,19 0,01 0,03 0,02
0,21 0,31 0,23 0,00 0,01 0,00
0,29 0,31 0,20 0,01 0,03 0,01
0,12 0,25 0,12 0,00 0,02 0,02
0,21 0,27 0,16 0,00 0,03 0,01
0,12 0,30 0,15 0,07 0,04 0,03
0,13 0,22 0,17 0,01 0,05 0,01
0,11 0,30 0,18 0,00 0,02 0,03
0,15 0,29 0,18 0,03 0,02 0,02
0,16 0,27 0,14 0,00 0,01 0,01
0,16 0,27 0,15 0,03 0,02 0,03
0,13 0,25 0,17 0,00 0,02 0,01
0,13 0,31 0,18 0,02 0,03 0,03
12,14 19,08 15,64 4,37 3,13 2,68
11,14 18,41 15,01 2,00 3,10 2,65
14,58 18,10 15,42 1,97 3,55 3,09
8,80 18,95 16,10 2,38 3,58 3,09
15,39 17,75 15,30 0,99 2,95 2,59
20,22 18,48 15,40 1,31 2,90 2,48
12,95 18,20 15,13 2,18 3,29 2,76
14,65 18,95 16,21 1,43 3,18 2,89
20,07 18,08 15,46 1,75 3,00 2,70
6,17 17,32 15,11 0,98 2,86 2,57
6,02 16,79 14,55 1,73 3,09 2,65
11,30 18,37 15,92 0,88 3,00 2,69
10,41 17,82 14,37 2,54 3,18 2,75
8,05 19,01 15,81 1,48 3,21 2,73
15,41 18,56 15,50 1,78 3,04 2,67
1809,34 29,67 21,39 72,92 5,65 4,96
2057,69 29,87 20,57 69,11 5,20 4,51
1942,06 28,40 20,49 69,10 5,37 4,62
1529,25 21,63 15,10 64,85 4,98 4,07
2020,24 33,14 25,82 67,81 5,51 4,78
2002,61 30,16 20,68 81,29 5,91 5,05
1983,77 29,22 20,75 64,34 5,46 4,79
1907,96 30,05 21,16 66,82 5,48 4,79
2053,79 30,97 24,05 62,01 5,05 4,46
1863,26 29,94 21,60 65,56 5,37 4,67
1949,10 31,55 23,77 73,18 5,59 4,86
1809,65 28,80 20,18 87,67 6,36 5,28
1811,72 29,23 22,21 70,07 5,67 4,80
1884,38 29,49 21,22 66,36 5,20 4,56
1941,44 27,23 18,76 70,17 5,32 4,45
164

Anhang
Tabelle 44: Kiefern-Toxizitätstest (Punkt 3.5.2); ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen
(Einzelwerte) in Bodensubstrat und Bodenlösung nach 8 Wochen Versuchsdauer in den
jeweiligen Dotierungsklassen.
Nitroaromatenkonz. im Boden (TB)
in mg/kg
Nitroaromatenkonz. in der Boden.-Lsg.
in mg/l
Dotierungsklasse
in mg/kg TNT 4-ADNT 2-ADNT TNT 4-ADNT 2-ADNT
3
3
0
0
3
0
0
0
0,08 0,13 0,05 0,00 0,00 0,12
0,07 0,13 0,05 0,00 0,01 0,01
0,05 0,11 0,02 0,00 0,00 0,02
0,06 0,06 0,01 0,00 0,00 0,01
0,06 0,19 0,07 0,00 0,01 0,01
0,10 0,14 0,06 0,00 0,01 0,02
0,10 0,07 0,04 0,00 0,01 0,01
0,07 0,10 0,01 0,00 0,01 0,01
0,05 0,27 0,08 0,00 0,01 0,02
0,06 0,11 0,04 0,00 0,01 0,02
1,45 12,40 14,03 0,34 1,77 1,51
1,59 13,20 14,53 0,00 1,79 1,56
0,93 11,58 12,83 0,00 0,00 0,00
1,39 14,53 16,74 0,00 1,50 1,44
1,03 12,34 14,56 0,00 1,71 1,44
0,92 11,30 13,38 0,00 1,48 1,39
0,82 11,97 14,16 0,00 1,58 1,45
1,14 13,26 14,29 0,28 1,84 1,68
1,29 14,73 17,68 0,13 2,00 1,72
0,44 12,99 14,56 0,00 1,75 1,58
1714,84 31,32 29,04 76,44 7,35 6,74
1875,82 31,50 28,95 75,43 7,39 6,82
1532,07 25,91 22,79 84,72 7,79 7,02
1813,80 30,19 26,91 65,10 7,30 6,30
1570,53 28,41 26,54 68,97 7,16 6,45
1628,59 28,68 25,90 80,94 7,46 6,69
1563,49 29,02 25,85 66,36 7,14 6,13
1917,00 29,76 27,54 71,06 7,11 6,32
1792,76 29,83 26,87 79,64 8,05 7,07
1618,92 27,62 23,96 ─ ─ ─
165

Anhang
Tabelle 45: Kiefern-Toxizitätstest (Punkt 3.5.2); ermittelte Nitroaromatenkonzentrationen
(Einzelwerte) in Bodensubstrat und Bodenlösung nach 12 Wochen Versuchsdauer in den
jeweiligen Dotierungsklassen.
Nitroaromatenkonz. im Boden (TB)
in mg/kg
Nitroaromatenkonz. in der Boden.-Lsg.
in mg/l
Dotierungsklasse
in mg/kg TNT 4-ADNT 2-ADNT TNT 4-ADNT 2-ADNT
3
3
0
0
3
0
0
0
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,10 0,18 0,14 0,00 0,00 0,00
0,08 0,17 0,12 0,00 0,00 0,00
0,08 0,18 0,14 0,00 0,00 0,00
0,06 0,15 0,10 0,00 0,00 0,00
0,92 13,61 14,20 0,00 1,62 1,85
16,95 13,63 12,79 0,00 1,79 1,56
0,82 12,17 13,07 0,00 1,94 2,12
0,95 15,03 15,06 0,00 2,34 2,39
0,68 11,67 13,06 0,00 1,91 2,10
1790,76 25,64 27,55 61,56 9,60 8,33
1666,28 25,34 27,46 61,77 8,84 7,82
1732,66 24,2 28,03 53,77 7,34 7,40
1240,2 20,88 24,26 57,46 8,51 7,94
1624,66 24,25 24,11 56,40 8,27 7,06
166

Anhang
Abb. 44: herausgefilterte Nitroaromatenpeaks aus dem Chromatogramm eines GC-
Probenlaufs (Pappelwurzel).
167

Anhang
Abb. 45: Massenspektrum des TNT-Signals bei einer Retentionszeit von 26,95 min.
168

Danksagung
An dieser Stelle möchte ich allen Personen danken, die zum Gelingen der vorliegenden Arbeit
beigetragen haben.
In erster Linie gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Wolfgang Heyser für die interessante
Aufgabenstellung, für die Bereitstellung einer Stelle als wissenschaftlicher Mitarbeiter, für
den großen Freiraum bei der Bearbeitung des Themas und für die ständige Diskussionsbereitschaft.
Herrn Prof. Dr. G. O. Kirst danke ich besonders für seine Bereitschaft sich als Gutachter
dieser Arbeit zur Verfügung zu stellen. Auch bei Frau Prof. Dr. J. Filser, Herrn Dr. J.
Warrelmann, Herrn. Dr. habil. Hartmut Koehler sowie Frau Diplom Biologin Antje Seebeck
möchte ich mich für ihre Mitwirkung am Promotionsprüfungsausschuss bedanken.
Ganz besonders danken möchte ich Herrn Peter Behrend für die Messung zahlreicher Bodenund
Pflanzenproben mit der HPLC und GC/MS. Danke Peter!
Mein ganz besonderer Dank gebührt auch Frau Anke Toltz und Frau Helga Wehrkamp für die
große und freundliche Unterstützung im Laboralltag.
Herrn Mario Kröger und Herrn Prof. Dr. G. Fels von der Universität Paderborn gilt mein
besonderer Dank für die Bereitstellung des 14 C-TNT-Radiotracers.
Bei Frau Dr. habil. Heike Bücking möchte ich mich insbesondere für die Hilfestellung in den
Experimenten mit Radiotracern bedanken.
Bei Frau Antje Seebeck, Frau Myrna Landim, Frau Ulrike Jakob, Frau Dr. Maricel Alvarez,
Herrn Dr. Seak Jin Kim, Herrn Rainer Hans und Herrn Dr. Jens Dittmann möchte ich mich für
den Erfahrungsautausch und den besonders freundlichen Umgang miteinander bedanken.
Frau Erika Beilfuß danke ich besonders für das Korrekturlesen dieser Arbeit.
Ausdrücklich bedanken möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für das
freundliche, hilfsbereite und kooperative Arbeitsklima.
Dank gilt dem ‘Tanne-Team’ für die besondere Zusammenarbeit und Durchführung des insitu
Projektes in Clausthal-Zellerfeld.
Zum Schluss möchte ich mich bei meinen Eltern ganz herzlich bedanken, die mich während
des Studiums und der Promotion immer nach Kräften unterstützt haben und meine Launen
ertrugen.