PLATELIATM CHLAMYDIA IgG TMB - Bio-Rad
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PLATELIA TM <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong> 62767<br />
NACHWEIS VON HUMANEN <strong>IgG</strong>-ANTIKÖRPERN<br />
GEGEN <strong>CHLAMYDIA</strong> IN HUMANSERUM MITTELS<br />
ENZYM- IMMUNOASSAY<br />
IVD
INHALTSVERZEICHNIS<br />
1- KLINISCHE BEDEUTUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49<br />
2- TESTPRINZIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49<br />
3- PRODUKTINFORMATIONEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50<br />
4- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN . . . . . . . . .51<br />
5- PROBEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54<br />
6- TESTVERFAHREN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54<br />
6.1. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54<br />
6.2. REKONSTITUTION DER REAGENZIEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55<br />
6.3. LAGERUNG GEÖFFNETER BZW. REKONSTITUIERTER REAGENZIEN . . . . . . . . . . .55<br />
6.4. TESTDURCHFÜHRUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56<br />
7- BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE . . . . . .58<br />
7.1. QUALITÄTSKONTROLLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58<br />
7.2. BERECHNUNG DES GRENZWERTS (GW) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58<br />
7.3. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58<br />
8- GRENZEN DES VERFAHRENS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59<br />
9- LEISTUNGSMERKMALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59<br />
9.1. LEISTUNGSMERKMALE MIT PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong> (62767) . . . . . . . . .59<br />
9.2. LEISTUNGSMERKMALE MIT PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> OPD (62766) . . . . . . . . .61<br />
10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS . . . . . . . . . . . . . . . .62<br />
11- LITERATUR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62<br />
48
1- KLINISCHE BEDEUTUNG<br />
Chlamydia trachomatis, die bei Geschlechtskrankheiten am häufigsten<br />
nachgewiesene Spezies, ist aufgrund ihrer Komplikationen sehr gefährlich:<br />
Sie kann zu Sterilität, Extrauteringravidität, Konjunktivitis und Lungenerkrankungen<br />
beim Neugeborenen führen. Die nur selten beim Menschen<br />
nachgewiesene Spezies Chlamydia psittaci verursacht Lungenerkrankungen<br />
und Endokarditis. Die sehr häufig nachgewiesene Spezies Chlamydia<br />
pneumoniae verursacht Atemwegsinfektionen. Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper<br />
erreichen bei Atemwegsinfektionen (C. trachomatis, C. psittaci),<br />
Geschlechtskrankheiten in der chronischen Phase (C. trachomatis) und bei<br />
Reinfektionen immer hohe Konzentrationen.<br />
Ein signifikanter Anstieg der Antikörperkonzentration zwischen zwei<br />
Serumproben, die im Abstand von 3 Wochen von einem Patienten<br />
entnommen und parallel getestet wurden, deutet auf eine aktive Infektion hin.<br />
PLATELIA ® <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong> ist ein in-vitro-Diagnostik-Kit zum Nachweis<br />
von <strong>IgG</strong>-Antikörpern gegen Chlamydia (C. trachomatis, C. psittaci,<br />
C. pneumoniae) in Humanserum. Dieser Testkit dient der Bestimmung des<br />
Immunstatus bei Verwendung mit einer einzigen Serumprobe bzw. dem<br />
Nachweis einer zurückliegenden Infektion bei Verwendung mit gepaarten<br />
Seren.<br />
2- TESTPRINZIP<br />
Dieser Test ist ein immunenzymatischer Festphasenassay, (indirekter ELISA).<br />
Die Chlamydia trachomatis-Antigene (Serotyp L2) sind an den Boden der<br />
Vertiefungen gebunden. Ein monoklonaler, mit Peroxidase markierter und für<br />
humane Gammaketten (<strong>IgG</strong>) spezifischer Antikörper wird als Konjugat<br />
verwendet.<br />
Erster Schritt:<br />
Die Kontroll- und Testseren werden im Verhältnis 1 : 21 verdünnt und<br />
anschließend in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Während<br />
dieser Inkubation über 1 Stunde ± 5 Minuten bei 37°C ± 1°C binden die in<br />
der Probe vorhandenen Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper an das an die Festphase<br />
gebundene Chlamydia-Antigen. Unspezifische <strong>IgG</strong>-Antikörper sowie andere<br />
Serumproteine werden durch Waschschritte nach der Inkubation<br />
ausgewaschen.<br />
49
Zweiter Schritt:<br />
Das Konjugat (monoklonaler, mit Peroxidase markierter und für humane<br />
Gammaketten spezifischer Antikörper) wird in jede Vertiefung der<br />
Mikrotiterplatte gegeben. Während dieser zweiten Inkubation über<br />
1 Stunde ± 5 Minuten bei 37°C ± 1°C bindet der markierte Antikörper<br />
an die <strong>IgG</strong>-Antikörper im Serum, die zuvor mit den Chlamydia-Antigenen<br />
reagiert haben. Ungebundenes Konjugat wird durch Waschgänge am<br />
Ende dieser Inkubationsphase ausgewaschen.<br />
Dritter Schritt:<br />
Das Vorliegen von Immunkomplexen (aus Chlamydia-Antigen, Serum-<br />
Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper, Anti-<strong>IgG</strong>-Konjugat) wird durch Zugabe von<br />
Substrat in jede Vertiefung sichtbar gemacht.<br />
Vierter Schritt:<br />
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur (+18-30°C)<br />
wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 1N Schwefel-säurelösung<br />
gestoppt. Die optische Dichte bei 450/620 nm ist proportional zur<br />
Menge an Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper in der Probe. Durch Ablesen des<br />
Ergebnisses über einem Grenzwert erfolgt der Nachweis und die<br />
quantitative Bestimmung der Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper in der Probe. Die<br />
Interpretation dieses Tests bei Verwendung gepaarter Seren dient als<br />
Hilfsmittel für die Bestimmung einer zurückliegenden Infektion.<br />
3- PRODUKTINFORMATIONEN<br />
Weitere Informationen zu den Lagerbedingungen des Kits und sowie das<br />
Verfallsdatum entnehmen Sie bitte dem Etikett des Kits.<br />
Etikett<br />
Reagenzien<br />
R1 Microplate Mikrotiterplatte : 12 Streifen mit je 8<br />
Vertiefungen, beschichtet mit inaktivierten<br />
Chlamydia trachomatis-Antigenen (Serotyp L2)<br />
R2<br />
Concentrated<br />
Washing<br />
Solution<br />
Konzentrierte Waschlösung (10fach):<br />
TRIS-NaCl-Puffer (pH 7,4), 1% Tween ®<br />
20.Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal.<br />
Darreichungsform<br />
1<br />
1 x 100 mL<br />
50
R3<br />
Etikett<br />
Negative<br />
Control<br />
Reagenzien<br />
Negative Kontrolle: Humanserum, negativ für<br />
Chlamydia-Antikörper und nicht reaktiv für<br />
Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs Ag),<br />
Antikörper gegen Hepatitis-C-Virus (HCV) und<br />
Antikörper gegen humane Immundefizienzviren<br />
(HIV1+2).<br />
Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal.<br />
R4a Cut-off control Grenzwert-Kontrolle: Humanserum, positiv für<br />
Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper und nicht reaktiv für<br />
HIV1- und HIV2-Antikörper, HBs-Antigen und<br />
HCV-Antikörper.<br />
Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal<br />
R4b<br />
Positive<br />
Control<br />
Positive Kontrolle: Humanserum, positiv für<br />
Chlamydia-<strong>IgG</strong>-Antikörper und nicht reaktiv für<br />
HIV1- und HIV2-Antikörper, HBs-Antigen und<br />
HCV-Antikörper.<br />
Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal.<br />
R6 Conjugate Konzentriertes Konjugat (100fach):<br />
Monoklonaler Anti-Human-Gammaketten-<br />
Antikörper (Maus), gebunden an Peroxidase.<br />
R7 Diluent Proben- und Konjugatverdünnungsmittel<br />
(gebrauchsfertig): TRIS-NaCI-Puffer (pH 7,6),<br />
BSA, Tween ® (0,1%) und Phenolrot.<br />
Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal.<br />
R8<br />
R9<br />
R10<br />
<strong>TMB</strong><br />
Substrate<br />
Buffer<br />
Chromogen:<br />
<strong>TMB</strong> Solution<br />
Stopping<br />
Solution<br />
Substrat-Puffer (gebrauchsfertig): 0,05M<br />
(pH 5,6) Zitronensäure und Natriumcitrat,<br />
0,03 % Wasserstoffperoxid.<br />
Konservierungsmittel: 0,01% Thimerosal.<br />
Chromogen:<br />
Tetramethylbenzidinlösung (<strong>TMB</strong>).<br />
4- VORSICHTSMASSNAHMEN<br />
Darreichungsform<br />
1 x 1 mL<br />
1 x 1 mL<br />
1 x 1 mL<br />
1 x 0,4 ml<br />
1 x 80 ml<br />
1 x 60 ml<br />
1 x 5 ml<br />
Stopplösung (gebrauchsfertig):<br />
1 x 28 ml<br />
1N Schwefelsäure<br />
Klebefolie 4<br />
Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der Einhaltung folgender<br />
GLP-Richtlinien ab:<br />
51
• Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.<br />
• Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen innerhalb einer<br />
Messreihe vermischen oder miteinander verwenden.<br />
ANMERKUNG: Von folgenden Reagenzien kann auch eine andere<br />
Charge als die im Kit vorhandene, jedoch immer nur jeweils eine pro<br />
Testansatz, verwendet werden: Waschlösung (R2, Etiketten-Kennung: 10x<br />
blau gefärbt), Substratpuffer (R8, Etiketten-Kennung: <strong>TMB</strong> buf,. blau<br />
gefärbt), Chromogen (R9, Etiketten-Kennung: <strong>TMB</strong> sol. grün gefärbt) und<br />
Stopplösung (R10, Etiketten-Kennung: 1N, rot gefärbt). Diese Reagenzien<br />
können mit anderen Produkten unserer Firma verwendet werden. Auskunft<br />
hierzu erteilt Ihnen unsere Technikabteilung.<br />
• Vor Gebrauch müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht<br />
werden (ca. 30 Min.).<br />
• Reagenzien vorsichtig auflösen oder verdünnen und jegliche<br />
Kontamination vermeiden.<br />
• Den Test nicht in Gegenwart reaktiver Dämpfe (von Säuren, Alkalien,<br />
Aldehyden) oder Staub durchführen. Die Enzymaktivität des Konjugats<br />
könnte dadurch beeinträchtigt werden.<br />
• Wenn möglich, Einmalartikel verwenden. Glaswaren müssen vor Gebrauch<br />
gründlich gereinigt und mit entionisiertem Wasser gespült werden.<br />
• Die enzymatische Reaktion weist gegenüber Metallen oder Metallionen<br />
eine hohe Sensitivität auf. Daher dürfen Metallelemente nicht mit den<br />
verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen in Berührung kommen.<br />
• Die verdünnte Chromogenlösung (Substratpuffer + Chromogen) muss<br />
farblos sein. Eine spontane blaue Farbentwicklung in den Minuten nach<br />
der Rekonstitution deutet auf den Zerfall der Reagenzien hin. Um<br />
zerfallenes Reagenz zu ersetzen, muss frisches Chromogen-Substrat<br />
hergestellt werden. Die Lösung in einem sauberen Einweggefäß aus<br />
Kunststoff oder Glas, das zuvor mit 1 N HCl gewaschen und mit<br />
destilliertem Wasser gespült und getrocknet wurde, herstellen. Die<br />
Lösung unter Lichtabschluss aufbewahren.<br />
• Für jede neue Probe die Pipettenspitze wechseln.<br />
• Das Waschen der Mikrotiterplatte ist ein wesentlicher Arbeitsgang: Die<br />
vorgeschriebene Zahl der Waschzyklen ist unbedingt einzuhalten.<br />
Weiterhin ist darauf zu achten, dass alle Vertiefungen vollständig<br />
gefüllt und danach wieder vollständig geleert werden. Nicht korrekt<br />
durchgeführte Waschgänge können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.<br />
52
• Die Mikrotiterplatte zwischen dem Ende der Waschgänge und dem<br />
Pipettieren der Reagenzien nicht austrocknen lassen.<br />
• Niemals dasselbe Gefäß für die Verteilung der Entwicklungslösung<br />
verwenden.<br />
• Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen.<br />
• Das Testverfahren darf nicht geändert werden.<br />
WARNHINWEISE UND SICHERHEITSVORSCHRIFTEN<br />
• Beim Umgang mit Reagenzien Einweghandschuhe tragen.<br />
• Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt.<br />
• Nicht mit dem Mund pipettieren.<br />
• Das Humanmaterial zur Vorbereitung der Reagenzien wurde getestet und<br />
als nicht reaktiv für Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs Ag), Antikörper<br />
gegen das Hepatitis-C-Virus (anti-HCV) und gegen das humane<br />
Immundefizienz-Virus (anti-HIV1 und anti-HIV2) befunden. Da keine<br />
Testmethode eine potentielle Infektionsgefahr mit absoluter Sicherheit<br />
ausschließen kann, müssen alle Reagenzien, die Humanmaterial enthalten,<br />
und Patientenproben als potentiell infektiös behandelt werden.<br />
• Alle Materialien einschließlich der Waschlösung, die mit Proben und<br />
Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen,<br />
sollten als potentiell infektiös betrachtet werden.<br />
• Spritzer von Proben oder Proben enthaltenden Lösungen sind zu<br />
vermeiden. Ist die verunreinigende Lösung eine Säure, die Oberflächen<br />
zunächst mit Natriumbircarbonat neutralisieren, anschließend mit<br />
Natriumhypochloritlösung reinigen und mit Papiertüchern abtrocknen. Das<br />
für die Reinigung verwendete Material ist in einen Behälter für Sondermüll<br />
zu geben.<br />
• Die Patientenproben und Reagenzien humanen Ursprungs sowie<br />
kontaminierte Materialien und Produkte dürfen nur nach einer<br />
Dekontaminierung entsorgt werden<br />
- entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit 1 Teil<br />
Natriumhypochloritlösung (15% Natriumhypochlorit) auf 10 Teile<br />
Waschlösung oder Wasser für die Dauer von 30 Minuten oder<br />
- durch Sterilisieren in einem Autoklaven bei 121°C über 2 Stunden.<br />
• Natriumhypochlorithaltige Lösungen nicht in den Autoklaven stellen.<br />
• Substratpuffer, Chromogen und Waschlösung dürfen nicht mit der Haut<br />
oder den Schleimhäuten in Berührung kommen.<br />
53
• Das Materialiensicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich.<br />
• Die Chlamydia-Antigene wurden durch Behandlung mit CHAPS-SDS<br />
inaktiviert.<br />
5- PROBEN<br />
1. Dieser Test wird mit in Trockenröhrchen entnommenem Serum durchgeführt.<br />
2.Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und<br />
Lagerung der Serumproben beachten:<br />
- Bei der Entnahme aller Serumproben die routinemäßigen<br />
Vorsichtsmaßnahmen beachten.<br />
- Die Proben vor der Zentrifugation vollständig gerinnen lassen.<br />
- Probenröhrchen stets verschlossen halten.<br />
- Nach der Zentrifugation das Serum trennen und in einem fest<br />
verschlossenen Aufbewahrungsröhrchen lagern.<br />
- Die Proben können bei +2 - 8°C aufbewahrt werden, sofern sie<br />
innerhalb von 24 Stunden getestet werden. Wird der Test nicht<br />
innerhalb von 24 Stunden durchgeführt bzw. für den Versand die<br />
Proben bei –20°C oder kälter einfrieren.<br />
- Die Proben vorzugsweise nur einmal auftauen. Zuvor tiefgefrorene<br />
Proben sollten nach dem Auftauen und vor der Analyse gründlich<br />
gemischt werden.<br />
3. Interferenzen aufgrund von hohen Hämoglobin-, Lipide-, Albumin- und<br />
Bilirubinkonzentrationen sind nicht bekannt.<br />
4. Proben nicht erhitzen.<br />
6- TESTVERFAHREN<br />
54<br />
6.1 - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL<br />
• Destilliertes oder entionisiertes Wasser.<br />
• Natriumhypochlorit und Natriumbicarbonat.<br />
• Saugfähige Papiertücher.<br />
• Einweg-Latexhandschuhe.<br />
• Schutzbrille.<br />
• Einwegröhrchen.<br />
• Automatische oder halbautomatische, bewegliche oder feste Pipetten<br />
für 10 - 1000 µl und 1, 2 und 10 ml.<br />
• Zylinder mit Maßeinteilung für 25, 50, 100 und 1000 ml.
• Vortex.<br />
• Manuelles, halbautomatisches oder automatisches Mikrotiterplatten-<br />
Waschgerät (*).<br />
• Wasserbad oder entsprechenden Mikrotiterplatten-Inkubator, auf<br />
37°C ± 1°C eingestellt.<br />
• Behälter für infektiösen Abfall.<br />
• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm- und 620 nm-Filtern (*).<br />
(*) Weitere Informationen zu den von unserer Technikabteilung<br />
empfohlenen Geräten erhalten Sie direkt bei uns.<br />
6.2. REKONSTITUTION DER REAGENZIEN<br />
R2: 100 ml R2 in 900 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser<br />
verdünnen, um die Wascharbeitslösung (verdünntes R2) herzustellen.<br />
R6: Zur Herstellung des Arbeitskonjugats (verdünntes R6) für eine<br />
Mikrotiterplatte 0,25 ml konzentriertes Konjugat mit 25 ml Verdünnungsmittel<br />
(R7) verdünnen (die Volumina für 1 Streifen durch 10 teilen).<br />
R8 + R9: Das Chromogen (R9) im Verhältnis 1:11 in Substratpuffer (R8)<br />
verdünnen (z.B.: 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8).<br />
Homogenisieren.<br />
6.3. LAGERUNG GEÖFFNETER BZW. REKONSTITUIERTER REAGENZIEN<br />
R1 : Nach dem Öffnen des vakuumversiegelten Beutels sind die Riegel<br />
1 Monat haltbar, sofern sie in dem sorgfältig wieder verschlossenen<br />
Originalbeutel bei +2-8°C aufbewahrt werden (überprüfen Sie, ob<br />
Trockenmittel enthalten ist).<br />
R2 : Nach der Verdünnung kann die Waschlösung (R2) 2 Wochen lang<br />
bei +2-8°C aufbewahrt werden. Nach dem Öffnen kann die konzentrierte<br />
Waschlösung bei +2-25°C ohne Kontamination bis zu dem auf dem<br />
Etikett angegebenen Verfallsdatum aufbewahrt werden.<br />
R6 : Nach der Verdünnung in R7 ist das Reagenz bei Raumtemperatur<br />
(+18-30°C) 8 Stunden bzw. bei +4°C 24 Stunden haltbar.<br />
R9: Nach Verdünnung ist die Lösung bei lichtgeschützter Lagerung bei<br />
Raumtemperatur (+18-30°C) 6 Stunden haltbar.<br />
R3, R4a, R4b, R7, R8 und R10 : Nach dem Öffnen sind die bei +2-8°C<br />
gelagerten Reagenzien ohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett<br />
angegebenen Verfallsdatum haltbar.<br />
55
6.4. TESTDURCHFÜHRUNG<br />
Bitte das Testverfahren strikt befolgen.<br />
Für jeden Test auf jeder Mikrotiterplatte Kontrollseren verwenden.<br />
Alle Reagenzien müssen vor der Verwendung auf Raumtemperatur (+18-30°C)<br />
gebracht werden.<br />
1. Zur Identifizierung der Kontroll- und Testseren in der Mikrotiterplatte ein<br />
Pipettierschema (s.u.) erstellen.<br />
2. Die Waschlösung (verdünntes R2) vorbereiten (siehe Abschnitt 6.2).<br />
3. Den Halterahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen.<br />
4. Die Streifen der Mikrotiterplatte einmal mit Arbeitswaschlösung<br />
(verdünntes R2) waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und die<br />
Vertiefungen durch Ausklopfen der Platte auf saugfähigem Papier trocknen.<br />
5. Die Kontrollen und Proben im Verhältnis 1:21 mit Probenverdünnungsmittel<br />
(R7) entweder direkt in der Mikrotiterplatte oder in separaten Teströhrchen<br />
verdünnen:<br />
a) Verdünnung in der Platte: 200 µI Probenverdünnungsmittel (R7) in jede<br />
Vertiefung pipettieren.<br />
Vertiefung A1 10 µl des negativen Kontrollserums (R3)<br />
Vertiefung B1, C1 10 µl des positiven Serumstandards I (R4a)<br />
Vertiefung D1 10 µl des positiven Serumstandards II (R4b)<br />
Proben: 10 µl jeder Probe in die Vertiefungen angefangen bei E1<br />
pipettieren.<br />
Bei den folgenden Schritten muss unbedingt eine unspezifische<br />
Proteinbindung vermieden werden. Zunächst 200 µI Probenverdünnungsmittel<br />
(R7) in die Vertiefung pipettieren und anschließend<br />
10 µI der Probe bzw. der Kontrollen zugeben und 5 bis 7 mal mischen.<br />
b) Vorverdünnung in Röhrchen:<br />
Die Kontrollen und Proben im Verhältnis 1 : 21 vorverdünnen (zum<br />
Beispiel: 25 µI Serum + 500 µI Probenverdünnungsmittel). Gründlich<br />
mischen. Die vorverdünnten Seren gemäß folgendem Schema<br />
pipettieren:<br />
Vertiefung A1 200 µl des verdünnten negativen Kontrollserums (R3)<br />
Vertiefung B1, C1 200 µl der verdünnten Grenzwertkontrolle (R4a)<br />
Vertiefung D1 200 µl der verdünnten positiven Serumkontrolle (R4b)<br />
Proben: 200 µl jeder Probe in die Vertiefungen angefangen bei E1<br />
pipettieren.<br />
56
6. Die Grenzwert-Kontrolle (R4a) wird in Doppelbestimmung getestet.<br />
Identifizierungstabelle für 2 Streifen:<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12<br />
A R3 P5<br />
B R4a P6<br />
C R4a P7<br />
D R4b P8<br />
E P1 P9<br />
F P2 P10<br />
G P3 P11<br />
H P4 P12<br />
7. Die Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und diese fest auf die Platte<br />
drücken, damit sie fest versiegelt ist. Die Mikrotiterplatte bei 37°C ± 1°C in<br />
einem Trockeninkubator 1 Stunde ± 5 Minuten inkubieren.<br />
8.Vor dem Ende der ersten Inkubationsphase das Arbeitskonjugat<br />
(verdünntes R6) vorbereiten. Für eine Mikrotiterplatte 0,25 ml Konjugat<br />
(R6) in 25 ml Verdünnungsmittel (R7) verdünnen. Gründlich mischen.<br />
9. Nach der ersten Inkubationsphase alle Vertiefungen entleeren und<br />
anschliessend die Mikrotiterplatte dreimal waschen.<br />
10.200 µI Arbeitskonjugatlösung (verdünntes R6) in jede Vertiefung<br />
geben. Die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken.<br />
11.Die Mikrotiterplatte bei 37°C ± 1°C über 1 Stunde ± 5 Minuten<br />
inkubieren.<br />
12.Die Substrat-Chromogen-Lösung vorbereiten (R8 + R9).<br />
13.Nach der zweiten Inkubationsphase alle Vertiefungen entleeren<br />
anschliessend viermal waschen.<br />
14.Direkte Lichteinstrahlung auf die Mikrotiterplatte vermeiden und 200 µl<br />
Substrat-Chromogen-Lösung (R8 + R9) in jede Vertiefung geben.<br />
15.Die Mikrotiterplatte lichtgeschützt bei Raumtemperatur (18-30°C)<br />
30 ± 5 Minuten inkubieren.<br />
16.100 µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge und mit der<br />
gleichen Verteilungsmenge wie die Substratlösung zusetzen.<br />
17.Den Boden der Vertiefungen abwischen.<br />
57
18.Die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte mit einem<br />
Spektrophotometer bei 450/620 nm ablesen. Die Mikrotiterplatten<br />
müssen innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion<br />
abgelesen werden.<br />
19.Vor dem Weiterleiten der Ergebnisse die Übereinstimmung zwischen<br />
dem gemessenen Wert und dem Probenverteilungsplan überprüfen.<br />
7- BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER<br />
ERGEBNISSE<br />
7.1 - Validierung des Assays<br />
Für jeden Test auf jeder Mikrotiterplatte Kontrollseren verwenden. Für<br />
einen gültigen Test müssen folgende Kriterien erfüllt sein:<br />
• OD-Werte:<br />
- OD R3 < 0.175<br />
- OD R4a > 0.175<br />
- OD R4b > 0.500<br />
• Verhältnisse:<br />
- OD R4a/OD R3 > 1.3<br />
- OD R4b/OD R4a > 2<br />
Werden diese Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllt, muss die Messreihe<br />
wiederholt werden.<br />
7.2 - Berechnung des Grenzwerts (GW)<br />
Der Grenzwert entspricht dem Mittelwert der optischen Dichte des<br />
Grenzwertserums (GW = Mittelwert der OD von R4a).<br />
7.3 – INTERPRETATION DER ERGEBNISSE<br />
Optische Dichte<br />
der Probe<br />
Semi-quantitative<br />
Ergebnisse<br />
Interpretation <strong>IgG</strong><br />
OD s < GW x 0,8 Negatives Serum Keine frühere Exposition gegenüber<br />
Chlamydiae<br />
GW x 0,8 ≤ OD s < GW Fragliches Serum Die Ergebnisse müssen 15-20 Tage nach der<br />
ersten Kontrolle bestätigt werden<br />
OD s ≥ GW Positives Serum Zurückliegende Exposition gegenüber einer<br />
Chlamydia-Infektion: Bestehende Immunität<br />
Die Ergebnisse müssen 15-20 Tage nach der<br />
ersten Kontrolle bestätigt werden.<br />
58
8- GRENZEN DES TESTS<br />
Eine Diagnose einer zurückliegenden Infektion kann nur in Zusammenhang<br />
mit dem klinischen Erscheinungsbild und serologischen Daten erfolgen. Das<br />
Ergebnis einer einzelnen Serumprobe genügt nicht für die Diagnose einer<br />
zurückliegenden Infektion.<br />
Im Falle eines Verdachts auf eine Infektion und bei Ergebnissen im Bereich des<br />
Grenzwertes sollte eine weitere Serumprobe des gleichen Patienten 15 bis<br />
20 Tage später entnommen und mit dem gleichen Assay getestet werden.<br />
9- LEISTUNGSMERKMALE<br />
9.1 – LEISTUNGSMERKMALE MIT PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong><br />
(62767)<br />
9.1.1- PRÄZISION<br />
• Intraassay-Reproduzierbarkeit<br />
Zur Bestimmung der Intraassay-Reproduzierbarkeit wurden 3 positive und<br />
1 negative Probe 30mal in einer Messreihe getestet. Für jede Probe<br />
wurde das Verhältnis P/GW (Probe/Grenzwert) der optischen Dichte<br />
(OD) der Probe zum Mittelwert der Optischen Dichte der<br />
Grenzwertkontrolle (R4a) bestimmt. Das durchschnittliche Verhältnis, die<br />
Standardabweichung (σ) sowie die Variationskoeffizienten (VK%) wurden<br />
berechnet und sind nachstehend aufgeführt:<br />
N=30 Negative Probe Positive Probe 1 Positive Probe 2 Positive Probe 3<br />
Verhältnis (P/GW)<br />
Mittelwert 0,43 1,45 2,65 4,96<br />
σ 0,05 0,11 0,19 0,32<br />
VK% 11,79% 7,51% 7,16% 6,41%<br />
• Interassay-Reproduzierbarkeit<br />
Zur Bestimmung der Interassay-Reproduzierbarkeit wurde jede der<br />
4 Proben (3 positive und 1 negative Probe) in Doppelbestimmung in zwei<br />
Messreihen pro Tag über einen Zeitraum von 20 Tagen getestet. Für jede<br />
Probe wurde das Verhältnis P/GW (Probe/Grenzwert) der optischen<br />
59
Dichte (OD) der Probe zur OD der Grenzwert-Kontrolle (R4a) bestimmt.<br />
Das durchschnittliche Verhältnis, die Standardabweichung (σ) sowie die<br />
Variationskoeffizienten (VK%) wurden berechnet und sind nachstehend<br />
aufgeführt:<br />
Negative Probe Positive Probe 1 Positive Probe 2 Positive Probe 3<br />
Verhältnis (P/GW)<br />
Mittelwert 0,32 1,07 2,17 4,32<br />
σ 0,03 0,13 0,37 0,67<br />
VK% 9,10% 12,62% 17,21% 15,53%<br />
60<br />
Die mit den positiven Seren ermittelten Variationskoeffizienten lagen in den<br />
Intraassay-Studien unter 8% und in den Interassay-Studien unter 17,5%.<br />
9.1.2 - KORRELATIONSSTUDIE<br />
Mit Platelia Chlamydia <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong> (62767) und Platelia Chlamydia<br />
<strong>IgG</strong> OPD (62766) wurde eine Vergleichsstudie durchgeführt.<br />
Die Korrelationsstudie wurde mit 184 (negativen und positiven) Proben<br />
von Blutspendern durchgeführt.<br />
Die Ergebnisse des ersten Tests lauten wie folgt:<br />
Platelia TM Chlamydia <strong>IgG</strong> (62766)<br />
Platelia TM Chlamydia <strong>IgG</strong> <strong>TMB</strong> (62767) Negativ<br />
Nicht<br />
eindeutig<br />
Positiv Gesamt<br />
Negativ 99 2* 1* 102<br />
Nicht eindeutig 6* 7 3* 16<br />
Positiv 1* 0 65 66<br />
Gesamt 106 9 69 184<br />
Nach der Kontrolle beider Tests blieb eine Probe mit nicht<br />
übereinstimmendem Ergebnis übrig: Eine Probe wurde mit OPD als positiv<br />
und mit <strong>TMB</strong> als nicht eindeutig befunden.<br />
Übereinstimmung zwischen den beiden Tests: (172/173)x100=99,4%.<br />
Die Ergebnisse bestätigen, dass die Änderungen des Kits die unten<br />
aufgeführte Leistung des Tests Platelia Chlamydia <strong>IgG</strong> OPD (62766)<br />
nicht beeinflusst.
9.2 - LEISTUNGSMERKMALE MIT PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> OPD<br />
(62766)<br />
9.2.1 – SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT<br />
Die Leistungsmerkmale von PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> (62766) wurden<br />
in 2 unterschiedlichen Laboratorien mittels Immunfluoreszenztechnik und<br />
EIA-Technik unter Verwendung von im Handel erhältlichen Tests als<br />
Vergleichsmethode evaluiert.<br />
• Spezifität<br />
Insgesamt wurden 212 Proben im Labor getestet; die Spezifität von<br />
PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> lag bei 207/212 = 97,6%.<br />
• Sensitivität<br />
196 dokumentierte Proben von Patienten mit nachgewiesener C.<br />
pneumoniae- bzw. C. trachomatis-Infektion wurden getestet. Bei dieser<br />
Population lag die Sensitivität von PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> bei<br />
192/196 = 97,9%.<br />
9.2.2 – KREUZREAKTIVITÄT<br />
120 für CMV, HSV, Mycoplasma pneumoniae und Candida aAlbicans<br />
sowie für Rheumafaktor, Autoantikörper und heterophile Antikörper<br />
positive Proben wurden mit PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> (62766)<br />
getestet.<br />
Die mit PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> als positiv befundenen Proben<br />
wurde mit einem anderen im Handel erhältlichen EIA-Test überprüft. Nicht<br />
übereinstimmende Proben wurden mit einem dritten EIA-Test überprüft.<br />
Von den 120 Proben wurden 48 als negativ, 64 als positiv und in<br />
Übereinstimmung mit zwei anderen Methoden und 8 als nicht<br />
übereinstimmend befunden.<br />
Nach der Kontrolle der nicht übereinstimmenden Proben mit einem EIA-<br />
Test weist PLATELIA <strong>CHLAMYDIA</strong> <strong>IgG</strong> keine potentiellen Interferenzen<br />
mit den getesteten Infektionsmarkern auf.<br />
61
10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS<br />
Alle von der Firma <strong>Bio</strong>-<strong>Rad</strong> hergestellten Reagenzien unterliegen einem<br />
Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der<br />
Fertigprodukte.<br />
Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur<br />
dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht.<br />
Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen<br />
werden bei <strong>Bio</strong>-<strong>Rad</strong> aufbewahrt.<br />
62
11- REFERENCES<br />
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<strong>Bio</strong>-<strong>Rad</strong><br />
0459<br />
3, boulevard Raymond Poincaré<br />
92430 Marnes-la-Coquette France<br />
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