Technische Universität München Wissenschaftszentrum ...
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50 Material und Methoden<br />
des nachfolgend beschriebenen ELISA:<br />
1. Coaten der Mikrotiterplatte (=MTP) mit dem Antigen: Zunächst wurde das Rotlauf-<br />
Lysatantigen (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, BRD)) mit Antigenbeschichtungspuffer<br />
(Carbonatpuffer pH 9,6; 0,1M; Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) entsprechend<br />
dem Ergebnis einer Antigenauswertung 1:100 verdünnt. Von dieser Lösung wurden<br />
jeweils 100µl in jede Vertiefung (=well) der ungeraden Reihe der MTP pipettiert.<br />
Anschließend erfolgte die 16- bis 18-stündige Inkubation der ELISA-Platte bei 4°C in<br />
einer feuchten Kammer, danach wurde die MTP im Waschautomat (MRW, Fa.<br />
Dynatech, Ashford, England) viermal mit Waschpuffer (PBS pH 7,2 mit 0,1% Tween<br />
20, Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) gewaschen, ausgeklopft und in einer<br />
Sicherheitswerkbank getrocknet.<br />
2. Blockierung der MTP mit Blockierungspuffer: Um eine unspezifische Bindung zu<br />
verhindern wurden die MTP mit 200µl Blockierungspuffer je well (pH 7,0, eine<br />
Magermilchzubereitung aus „skim milk powder“, Code L31, Fa. Oxoid, Nepean,<br />
Ontario, USA) 45 min bei Raumtemperatur inkubiert.<br />
3. Auftragen der Probandenseren und der Kontrollseren: Die Probandenseren<br />
(Mastschwein-Plasmaproben) und das negative Kontrollserum (Serumpool von 20<br />
Mastschweinen aus der Routinediagnostik als negatives Kontrollserum, mit<br />
negativem Ergebnis im Rotlauf-ELISA vorgetestet) wurden 1:50, der Rotlauf-<br />
Schweineserum-Standard Rs7 (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, BRD) 1:250 mit<br />
Blockierungspuffer verdünnt. Von jeder Serumverdünnung wurden im Doppelansatz<br />
jeweils 100µl pro Vertiefung der ungeraden und der geraden Reihe eingefüllt und<br />
anschließend bei Raumtemperatur 1h inkubiert.<br />
4. Zugabe des Peroxidase-markierten Konjugates: Vom enzymmarkierten Konjugat<br />
(Anti-Schwein-IgG (H+L)-Konjugat, markiert mit Peroxidase, Charge 1325, Fa.<br />
Rockland, Gilbertsville, USA) wurden 100 µl verdünnt in Blockierungspuffer in jedes<br />
well einpipettiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die geeignete<br />
Gebrauchsverdünnung der Konjugate wurde im Voraus in der Schachbretttitration<br />
ermittelt.<br />
5. Zugabe der Substratlösung: Es wurden jeweils 100µl Chromogen-Substrat (ABTS<br />
= 2,2’Azinobis (3ethylbenz-thiazoline-sulfonic acid), Peroxidase-Substrat, Fa.<br />
Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, USA) in die Vertiefungen der MTP gegeben und<br />
für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.