Technische Universität München Wissenschaftszentrum ...

50 Material und Methoden
des nachfolgend beschriebenen ELISA:
1. Coaten der Mikrotiterplatte (=MTP) mit dem Antigen: Zunächst wurde das Rotlauf-
Lysatantigen (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, BRD)) mit Antigenbeschichtungspuffer
(Carbonatpuffer pH 9,6; 0,1M; Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) entsprechend
dem Ergebnis einer Antigenauswertung 1:100 verdünnt. Von dieser Lösung wurden
jeweils 100µl in jede Vertiefung (=well) der ungeraden Reihe der MTP pipettiert.
Anschließend erfolgte die 16- bis 18-stündige Inkubation der ELISA-Platte bei 4°C in
einer feuchten Kammer, danach wurde die MTP im Waschautomat (MRW, Fa.
Dynatech, Ashford, England) viermal mit Waschpuffer (PBS pH 7,2 mit 0,1% Tween
20, Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) gewaschen, ausgeklopft und in einer
Sicherheitswerkbank getrocknet.
2. Blockierung der MTP mit Blockierungspuffer: Um eine unspezifische Bindung zu
verhindern wurden die MTP mit 200µl Blockierungspuffer je well (pH 7,0, eine
Magermilchzubereitung aus „skim milk powder“, Code L31, Fa. Oxoid, Nepean,
Ontario, USA) 45 min bei Raumtemperatur inkubiert.
3. Auftragen der Probandenseren und der Kontrollseren: Die Probandenseren
(Mastschwein-Plasmaproben) und das negative Kontrollserum (Serumpool von 20
Mastschweinen aus der Routinediagnostik als negatives Kontrollserum, mit
negativem Ergebnis im Rotlauf-ELISA vorgetestet) wurden 1:50, der Rotlauf-
Schweineserum-Standard Rs7 (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, BRD) 1:250 mit
Blockierungspuffer verdünnt. Von jeder Serumverdünnung wurden im Doppelansatz
jeweils 100µl pro Vertiefung der ungeraden und der geraden Reihe eingefüllt und
anschließend bei Raumtemperatur 1h inkubiert.
4. Zugabe des Peroxidase-markierten Konjugates: Vom enzymmarkierten Konjugat
(Anti-Schwein-IgG (H+L)-Konjugat, markiert mit Peroxidase, Charge 1325, Fa.
Rockland, Gilbertsville, USA) wurden 100 µl verdünnt in Blockierungspuffer in jedes
well einpipettiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die geeignete
Gebrauchsverdünnung der Konjugate wurde im Voraus in der Schachbretttitration
ermittelt.
5. Zugabe der Substratlösung: Es wurden jeweils 100µl Chromogen-Substrat (ABTS
= 2,2’Azinobis (3ethylbenz-thiazoline-sulfonic acid), Peroxidase-Substrat, Fa.
Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, USA) in die Vertiefungen der MTP gegeben und
für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.