Technische Universität München Wissenschaftszentrum ...

Material und Methoden 47
wurden bei den unstimulierten Kontrollen (6 wells / Probe) 50 µl RPMI-Medium bzw.
bei den mitogenstimulierten wells (6 / Probe) entsprechend 25 µl PHA (s.u.) und 25
µl RPMI 1640-Medium pipettiert.
Das im Test als Mitogen verwandte Phytohämagglutinin (=PHA, Sigma-Aldrich,
Steinheim, BRD) stimuliert in vitro unspezifisch eine Vielzahl von Lymphozytenklonen
zur Proliferation (= mitogeninduzierte Proliferation).
Nach 48 h Inkubation bei 37°C, 94% RLF und 5% C0 2 erfolgte die Markierung der
Zellen durch Zugabe von 10 µl 100µM BrdU-Labelinglösung 1 je well, dann wurden
die Platten für weitere 24 h inkubiert. Zur Entfernung des Labeling-Mediums wurde
die Platte dann bei 300 g 10 Min. zentrifugiert und anschließend ausgeschlagen.
Nach dem Trocknen der Platte 1 h bei 60°C wurden die Zellen durch die Zugabe von
jeweils 200µl FixDenat-Lösung 1 pro well (30 min bei RT) fixiert, gleichzeitig begann
die Denaturierung der DNA. Die Denaturierung des DNA-Stranges ist zur Detektion
des inkorporierten BrdU-Moleküls durch den im nächsten Schritt zugesetzten
Peroxidase-markierten Antikörper 1 (=POD Antibody-Konjugat, 100µl, 40 min bei RT)
notwendig. Nach der Inkubation wurden die Antibody-Konjugate durch ausschlagen
der Mikrotiterplatte und dreimaliges Waschen mit 200µl Waschlösung 1 entfernt.
Danach wurde den wells 100µl Peroxidase-Substratlösung 1 zugesetzt, die entsprechend
der Bindungsmenge des POD Antibody-Konjugates an die in der DNA
inkorporierten BrdU-Moleküle, an diesen enzymmarkierten Antikörper bindet. Über
den Farbumschlag, der aus der Bindungshöhe der Substratlösung resultiert, konnte
dann im ELISA-Reader (Rosys Anthos 2010, Wals, Österreich) bei einer Wellenlänge
von 405 nm die Absorption gemessen werden.
Der Stimulationsindex der jeweiligen Probe errechnete sich aus dem Mittel der sechs
mitogenversorgten wells dividiert durch das der sechs unstimulierten wells. Die
Lymphozytenproliferation wurde im Sauenversuch sowie im Ferkelversuch als
immunologischer Untersuchungsparameter herangezogen.
3.6.4.2 Rotes Blutbild, Leukozytenkonzentration und Differentialblutbild
Die Bestimmung der Erythrozyten- und Leukozytenkonzentration sowie die Quantifizierung
von Hämoglobin und Hämatokrit erfolgten aus dem heparinisierten Vollblut
1 Zubehör Cell Proliferation ELISA, Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, BRD