Technische Universität München Wissenschaftszentrum ...

46 Material und Methoden
bis 8°C temperiert war und zur weiteren Analyse bzw. Verarbeitung ins Labor des
Fachbereiches Tierernährung transportiert.
3.6.4.1 Messung der Lymphozytenproliferation
Das Ausmaß der Lymphozytenproliferation wurde in Anlehnung an die von RUPPERT
und PETERS (1987) veröffentlichte Methode mit einem Test-Kit (Cell Proliferation
ELISA, Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, BRD) bestimmt. Testprinzip ist die
Quantifizierung des Einbaus eines Markers (hier Bromdesoxyuridin = BrdU) in die
neusynthetisierte DNA der proliferierenden Zellen. Hieraus kann dann unter
Verwendung eines gegen BrdU gerichteten monoklonalen Antikörpers der Grad der
Blastogenese abgeleitet werden. Hierfür war es zunächst erforderlich, die
Lymphozytenfraktion aus dem mit Li-Heparin ungerinnbar gemachten Vollblut mittels
Ficoll-Dichtezentrifugation (Histopaque 1077, Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) in
Anlehnung an die von STRASSER et al. (1998) beschriebene Methode abzutrennen.
Lymphozytengewinnung:
2 ml heparinisiertes Vollblut wurden mit 2 ml einer gepufferten Salzlösung (Phosphat
Buffered Saline = PBS, Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) gemischt und vorsichtig auf
3 ml Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD) geschichtet. Nach 35
Minuten Zentrifugation bei 400 g und 18 bis 20°C wurde die Lymphozytenschicht
abgenommen, in 6 ml PBS überführt und anschließend bei 80 g, 18 bis 20 °C 10 Min.
zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt,
dazwischen erfolgte jeweils die Resuspension des Zellpellets in 6 ml PBS. Das
Zellpellet wurde dann in der Neubauer-Zählkammer (Fa. Marienfeld, Lauda-
Königshofen, BRD) mit RPMI 1640-Kulturmedium (Sigma-Aldrich, Steinheim, BRD)
auf eine Konzentration von 1*10 6 Zellen /ml eingestellt.
Die Lebensfähigkeit der Lymphozyten wurde unter Verwendung des Trypanblauausschlusstestes
untersucht (LINDL und BAUER, 1989). Bei dieser Vitalfärbung geht
man davon aus, dass bei lebenden Zellen bestimmte Farbstoffe nicht in das
Zellinnere gelangen können, während sich tote Zellen anfärben lassen.
Zell Proliferation ELISA:
Um das Ausmaß der Proliferation zu ermitteln wurden 50 µl der auf 1*10 6 Zellen pro
ml eingestellten Zellsuspension in Mikrotiterplattennäpfe (= wells) pipettiert. Dazu