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Material und Methoden 56 18. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur. 19. Überführen der Gewebsschnitte aus den Coverplates zurück in Küvetten. 20. Enzymhistochemische Reaktion mit gefiltertem 3’3 Diaminobenzidin- Tetrahydrochlorid (DAB, Sigma-Aldrich), gelöst in PBS mit 0,05%igem H 2 O 2 für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer. 21. Einmaliges Waschen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur. 22. Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Minuten spülen. 23. Gegenfärben der Schnitte mit Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlruhe) für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. 24. Bläuen der Schnitte in fließendem Leitungswasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur. 25. Entwässern der Gewebsschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50%iger, 70%iger, 96%igerAlkohol; 2 x Essigsäure-n-butylester, jeweils 5 Minuten). 26. Eindecken der Objektträger mit Roti ® -Histokitt (Fa. Roth, Karlsruhe). 3.5.5 Unspezifische Hintergrundfärbung Um eine unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden wurden bei der Durchführung der immunhistochemischen Untersuchungen verschiedene Maßnahmen ergriffen. Zum einen gilt es, die endogene Enzymaktivität des Gewebes zu unterbinden und zum anderen, unspezifische Antikörperbindungen zu vermeiden. Um die endogene Peroxidase des Darms zu hemmen, welche bei einer Detektion mit dem ABC- System stört, wurden die Schnitte nach der Entparaffinierung des Gewebes in 0,5%igem Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) gespült. Um eine unspezifische Bindung von Antikörper an Gewebeproteine zu vermeiden, wurden die Schnitte zuvor mit 1:5 verdünntem, inaktiviertem Ziegen-Normalserum überschichtet. Durch die Serumproteine werden hydrophobe Wechselwirkungen abgeschirmt und die anschließende Inkubation mit dem Primärantikörper führt ausschließlich zur spezifischen Bindung an dessen Epitope. Das hierbei verwendete Blockserum stammt aus der Tierspezies, in welcher der Sekundärantikörper hergestellt wurde, was zusätzlich eine unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers vermeidet. Eine weitere Maßname, um die Bindung des hydrophoben Erstantikörpers an Gewebeproteine zu vermeiden, stellt die
Material und Methoden 57 Zugabe von 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) zum Verdünnungsmedium des Antikörpers dar. Dabei binden sich die hydrophoben Immunglobuline an die Proteine des Verdünnungsmediums und können somit nicht mehr mit den Gewebsproteinen reagieren. Da bei immunhistochemischen Reaktionen mithilfe eines konventionellen ABC- Systems (pH-Wert von 7,6) häufig eine unspezifische Färbung von Mastzellen auftritt, wurde der pH-Wert des zur Verdünnung der ABC-Substrate verwendeten PBS von 7,4 auf 9,4 erhöht. Diese von BUSSOLATI und GUGLIOTTA (1983) beschriebene Methode verhindert, dass die basischen Gruppen des Avidins mit dem in Mastzellen enthaltenen Heparin reagieren. Ausserdem wurde bei der c-kit-Färbung zur Reduzierung der Hintergrundfärbung eine Verstärkungsreaktion mit Tyramin eingesetzt (siehe dazu Kap. 3.5.2). 3.6 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen Die lichtmikroskopische Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Schnittpräparate erfolgte an einem Mikroskop des Types Axiophot (Fa. Zeiss, Oberkochen) unter Zuhilfenahme eines 12,5 x 12,5 mm großen 10er-Netzmikrometerokulars (Fa. Zeiss, Oberkochen) mit einem 40er Objektiv (400-fache Vergrößerung). Es wurden nur Zellen berücksichtigt, die eine deutliche Färbung aufwiesen und in denen der Zellkern vollständig oder zumindest teilweise zu erkennen war. Die Anzahl der positiv gefärbten Zellen wurde pro Darmabschnitt ermittelt. Zusätzlich wurden die positiven Zellen für Zotten und Krypten separat gezählt. Dazu wurde das 10 x 10 Felder umfassende Gitternetz des Netzokulars so ausgerichtet, dass der untere Rand sich parallel zum Übergang der Zotten/Kryptenregion befand. Anschließend wurde der obere Rand des Gitternetzes zum Zotten/Kryptenübergang ausgerichtet und so die positiven Zellen im Kryptbereich ermittelt. Da es an der Magenschleimhaut keine Zotten gibt, wurde diese in die obere bzw. untere Hälfte der Tunica mucosa unterteilt. Es wurden nur in der Lamina propria lokalisierte Zellen gezählt. Optisch leere Räume, wie Darmlumen oder Lumina von großen Blut- und Lymphgefäßen wurden von der Gesamtfläche substrahiert. Wenn es die Bioptatgröße zuließ, wurden pro Darmlokalisation fünf Zählungen mit Zotten und fünf Zählungen mit Krypten ausgewertet. Die-
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Da bei immunhistochemischen Reaktionen mithilfe eines konventionellen ABC-<br />
Systems (pH-Wert von 7,6) häufig eine unspezifische Färbung von Mastzellen auftritt,<br />
wurde der pH-Wert des zur Verdünnung der ABC-Substrate verwendeten PBS<br />
von 7,4 auf 9,4 erhöht. Diese von BUSSOLATI und GUGLIOTTA (1983) beschriebene<br />
Methode verhindert, dass die basischen Gruppen des Avidins mit dem in Mastzellen<br />
enthaltenen Heparin reagieren. Ausserdem wurde bei der c-kit-Färbung zur Reduzierung<br />
der Hintergrundfärbung eine Verstärkungsreaktion mit Tyramin eingesetzt<br />
(siehe dazu Kap. 3.5.2).<br />
3.6 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen<br />
Die lichtmikroskopische Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Schnittpräparate<br />
erfolgte an einem Mikroskop des Types Axiophot (Fa. Zeiss, Oberkochen)<br />
unter Zuhilfenahme eines 12,5 x 12,5 mm großen 10er-Netzmikrometerokulars (Fa.<br />
Zeiss, Oberkochen) mit einem 40er Objektiv (400-fache Vergrößerung). Es wurden<br />
nur Zellen berücksichtigt, die eine deutliche Färbung aufwiesen und in denen der<br />
Zellkern vollständig oder zumindest teilweise zu erkennen war. Die Anzahl der positiv<br />
gefärbten Zellen wurde pro Darmabschnitt ermittelt. Zusätzlich wurden die positiven<br />
Zellen für Zotten und Krypten separat gezählt. Dazu wurde das 10 x 10 Felder umfassende<br />
Gitternetz des Netzokulars so ausgerichtet, dass der untere Rand sich parallel<br />
zum Übergang der Zotten/Kryptenregion befand. Anschließend wurde der obere<br />
Rand des Gitternetzes zum Zotten/Kryptenübergang ausgerichtet und so die positiven<br />
Zellen im Kryptbereich ermittelt. Da es an der Magenschleimhaut keine Zotten<br />
gibt, wurde diese in die obere bzw. untere Hälfte der Tunica mucosa unterteilt. Es<br />
wurden nur in der Lamina propria lokalisierte Zellen gezählt. Optisch leere Räume,<br />
wie Darmlumen oder Lumina von großen Blut- und Lymphgefäßen wurden von der<br />
Gesamtfläche substrahiert. Wenn es die Bioptatgröße zuließ, wurden pro Darmlokalisation<br />
fünf Zählungen mit Zotten und fünf Zählungen mit Krypten ausgewertet. Die-
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