Diss Nikki final - TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule ...

Material und Methoden 56
18. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
19. Überführen der Gewebsschnitte aus den Coverplates zurück in Küvetten.
20. Enzymhistochemische Reaktion mit gefiltertem 3’3 Diaminobenzidin-
Tetrahydrochlorid (DAB, Sigma-Aldrich), gelöst in PBS mit 0,05%igem H 2 O 2 für
10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer.
21. Einmaliges Waschen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
22. Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Minuten spülen.
23. Gegenfärben der Schnitte mit Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlruhe) für 10 Sekunden
bei Raumtemperatur.
24. Bläuen der Schnitte in fließendem Leitungswasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
25. Entwässern der Gewebsschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50%iger,
70%iger, 96%igerAlkohol; 2 x Essigsäure-n-butylester, jeweils 5 Minuten).
26. Eindecken der Objektträger mit Roti ® -Histokitt (Fa. Roth, Karlsruhe).
3.5.5 Unspezifische Hintergrundfärbung
Um eine unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden wurden bei der Durchführung
der immunhistochemischen Untersuchungen verschiedene Maßnahmen ergriffen.
Zum einen gilt es, die endogene Enzymaktivität des Gewebes zu unterbinden
und zum anderen, unspezifische Antikörperbindungen zu vermeiden. Um die endogene
Peroxidase des Darms zu hemmen, welche bei einer Detektion mit dem ABC-
System stört, wurden die Schnitte nach der Entparaffinierung des Gewebes in
0,5%igem Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) gespült. Um eine unspezifische Bindung von
Antikörper an Gewebeproteine zu vermeiden, wurden die Schnitte zuvor mit 1:5 verdünntem,
inaktiviertem Ziegen-Normalserum überschichtet. Durch die Serumproteine
werden hydrophobe Wechselwirkungen abgeschirmt und die anschließende Inkubation
mit dem Primärantikörper führt ausschließlich zur spezifischen Bindung an dessen
Epitope. Das hierbei verwendete Blockserum stammt aus der Tierspezies, in
welcher der Sekundärantikörper hergestellt wurde, was zusätzlich eine unspezifische
Bindung des Sekundärantikörpers vermeidet. Eine weitere Maßname, um die Bindung
des hydrophoben Erstantikörpers an Gewebeproteine zu vermeiden, stellt die