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Material und Methoden 55
3.5.4.2 Protokoll der c-kit-Reaktion
1. Entparaffinierung der formalinfixierten Paraffinschnitte in Rotihistol (Fa. Roth C.
GmbH & Co. KG, Karlsruhe), 3x5 Minuten.
2. Rehydrierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (Isopropanol,
90%iger und 70%iger Alkohol, jeweils 5 Minuten).
3. 30 minütige Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5%igem Wasserstoffperoxid
(Fa. VWR TM International GmbH, Darmstadt) bei Raumtemperatur.
4. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Thermische Demaskierung der Antigene mit Citratpuffer (Fa. Quartett, Berlin) für
20 Minuten bei 90°C in der Mikrowelle.
6. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Objektträger auf Shandon Coverplates TM und in Shandon Sequenza ® -Slide
Racks überführen (beides von der Fa. Thermo Electron, Dreieich).
8. Überschichten der Gewebsschnitte mit 1:5 verdünntem, inaktiviertem Ziegen-
Normalserum in PBS, 20 minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
9. Inkubation der Schnitte mit Kaninchen anti-Mensch CD117 Primär-Antikörper
(Fa. DakoCytomation GmbH, Hamburg), Verdünnung 1:500 in 1%igem bovinem
Serumalbumin (BSA) für 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank.
10. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Inkubation der Schnitte mit dem Sekundär-Antikörper (biotinyliertes Ziege anti-
Kaninchen IgG der Firma Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornien,
USA).
12. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Inkubation der Schnitte mit ABC-Reagenz für 30 Minuten bei Raumtemperatur
(Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornien).
14. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
15. Überschichten der Gewebsschnitte mit 0,5%igem Tyramin ( Fa. Pierce, Rockford
Illinois, USA).
16. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
17. Erneute Inkubation der Schnitte mit ABC-Reagenz für 15 Minuten bei Raumtemperatur.