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Material und Methoden 53
Prozedur ist eine wesentliche Vermehrung von gebundener Peroxidase, was eine
erhebliche Signalverstärkung bewirkt.
3.5.3 Spezifitätskontrollen
Spezifitätskontrollen, auch Negativ- bzw. Positivkontrollen genannt, dienen der Überprüfung
der Reaktivität der eingesetzten Reagenzien und ermöglichen die Beurteilung,
ob eine immunhistochemische Reaktion spezifisch oder unspezifisch ist. Als
Positivkontrollen für die IgE-Reaktionen wurden Hautschnitte eines an allergischer
Dermatitis erkrankten Hundes verwendet. Die H.E gefärbten Hautschnitte wiesen
zahhlreiche Mastzellen, eosinophile Granulozyten und Plasmazellen auf. Zum Nachweis
von c-kit wurden Schnitte eines gut differenzierten, kaninen Mastzelltumors sowie
die obengenannten Hautschnitte mitgeführt. Als Negativkontrolle wurde pro 10 zu
untersuchende Schnitte jeweils ein Gewebeschnitt eines Kontrollhundes mit normaler
Darmmorphologie eingesetzt. Anstelle des Erstantikörpers für c-kit wurde Kaninchenserum
nicht immunisierter Kaninchen verwendet. Hiermit wird eine potentielle
unspezifische Bindung von im Primärantikörper enthaltenen Proteinen nachgeahmt.
Das Kaninchenserum wurde in einer Konzentration von 1:3000 unter Verwendung
von 1%igem PBS direkt vor Gebrauch frisch angesetzt. Bei der IgE-Reaktion wurde
statt des Erstantikörpers gepuffertes PBS eingesetzt.
3.5.4 Durchführung der Immunhistochemie (ABC-Methode)
3.5.4.1 Protokoll der IgE-Reaktion
1. Entparaffinierung der formalinfixierten Paraffinschnitte in Rotihistol (Fa. Roth C.
GmbH & Co. KG, Karlsruhe), 3x5 Minuten.
2. Rehydrierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (Isopropanol,
90%iger und 70%iger Alkohol, jeweils 5 Minuten).
3. 30 minütige Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5%igem Wasserstoffperoxid
(Fa. VWR TM International GmbH, Darmstadt) bei Raumtemperatur.
4. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Enzymatische Demaskierung der Antigene mit Pronase E (Fa. Merck, Darmstadt)
für 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank.