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Material und Methoden 50
3.4 Vorversuche zur Immunhistochemie und Immunfluoreszenz
Im Rahmen dieser Dissertation sollten Mastzellen sowie IgE-positive Zellen immunhistochemisch
sichtbar gemacht werden. Dazu war außer immunhistochemischen
Einzelfärbungen von IgE und c-kit, eine immunhistochemische Doppelmarkierung
von IgE und c-kit vorgesehen. Obwohl die Einzelreaktionen zum Nachweis von IgE
und c-kit immer positiv verliefen, konnte eine gleichzeitige Darstellung dieser Epitope
mittels Doppelfäbung nicht erzielt werden. Die Etablierung einer geeigneten immunhistochemischen
Fäbemethode wurde trotz Einsatz verschiedener Antikörper (direkt
gekoppelte bzw. ungekoppelte Primärantikörper und Primär-/Sekundärantikörper
verschiedener Firmen), unterschiedlicher Detektionssysteme (ABC-Methode mit und
ohne Tyraminsignalverstärkung, AP-ABC-Methode), unterschiedlicher Demaskierungslösungen
(Citratpuffer, Demaskierungslösung G, Pronase E, Proteinase K, Protease
XIV sowie eine doppelte Demaskierung mit Citratpuffer und den verschiedenen
anderen Demaskierungslösungen), und Färbereagenzien (Histogreen ® , VectorBlue ® ,
DAB) nicht erreicht. Auch mittels Variieren der Inkubationszeiten, Verdünnungsstufen
und der Reihenfolge der eingesetzten Antikörper konnte keine eindeutige Doppelmarkierung
erzielt werden. In einem weiteren Anlauf wurde versucht, mittels Immunfluoreszenz
eine Doppelmarkierung von IgE und c-kit zu erzielen (direkt gekoppelter
IgE-FITC Antikörper sowie anti-CD117 Primärantikörper mit Cy3 Sekundärantikörper,
Absorptionsspektrum 495 bzw. 550 nm). Obwohl auch hier die Einzelreaktionen gelangen,
konnte eine gleichzeitige Darstellung der Epitope nicht erzielt werden