Einfluss einer Spermin- oder Nukleotidzulage auf ...

Aus dem Institut für Tierernährung
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Institut für Tierernährung der Universität Hohenheim
Einfluss einer Spermin- oder Nukleotidzulage auf
Aminkonzentrationen und
Enzymaktivitäten im Dünndarm von Ferkeln
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Andrea Schad
aus Backnang
Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung
Prof. Dr. R. Mosenthin
Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 30. 5. 2002

Für meinen lieben Jo und Rick
und besonders Mama und Vater
sowie meiner Pe, Wolfe und Dedden,
eben der ganzen Familie
und den Bären.

VORWORT
Ziel des durch das Land Baden-Württemberg geförderten Projektes (Landesforschungsschwerpunktprogramm)
„Nutritive Regulation der Darmproliferation und -differenzierung“
war es, Pilotstudien über die nutritive Beeinflussung des Darmwachstums beim Ferkel
durchzuführen. Im Vordergrund stand hierbei die Wirkung bestimmter Milchinhaltsstoffe auf
die Zellteilung, -differenzierung und den programmierten Zelltod (Apoptose).
Das Projekt wurde interdisziplinär bearbeitet. Zu den beteiligten Instituten der Universität
Hohenheim gehören das Institut für Tierhaltung, Fachgebiet Tierhaltung und
Leistungsphysiologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Claus (Antragsteller und
Sprecher), das Institut für Umwelt und Tierhygiene, Fachgebiet Anatomie und Physiologie
der Haustiere unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Amselgruber sowie das Institut für
Tierernährung, Fachgebiet Futtermittelkunde unter der Leitung von Herrn Prof. Dr.
Mosenthin (Stellvertretender Leiter) in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Zentek vom
Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

GLIEDERUNG
1 EINLEITUNG............................................................................................................. 23
2 LITERATURÜBERSICHT....................................................................................... 24
2.1 Morphologie und Funktion des Dünndarmes.......................................................... 24
2.1.1 Proliferation, Differenzierung und Apoptose...................................................... 25
2.1.2 Postnatale Veränderungen des Dünndarmes ....................................................... 26
2.1.2.1 Morphologische Veränderungen............................................................ 27
2.1.2.2 Funktionelle Veränderungen.................................................................. 27
2.1.3 Veränderungen in der Darmstruktur zum Zeitpunkt des Absetzens vom
Muttertier............................................................................................................. 30
2.1.4 Regulation des Darmwachstums ......................................................................... 30
2.2 Biogene Amine ............................................................................................................ 32
2.2.1 Chemische Struktur und Eigenschaften............................................................... 32
2.2.1.1 Monoamine............................................................................................. 32
2.2.1.2 Polyamine............................................................................................... 33
2.2.2 Polyamine in der Zelle......................................................................................... 35
2.2.2.1 Polyamintransportsysteme in Zellen ...................................................... 38
2.2.2.2 Abbau von Aminen ................................................................................ 38
2.2.3 Aminresorption aus Nahrungsstoffen.................................................................. 39
2.2.4 Aminbildung in Mikroorganismen...................................................................... 40
2.2.5 Amine in Lebensmitteln tierischer und pflanzlicher Herkunft sowie Milch
verschiedener Spezies.......................................................................................... 40
2.2.6 Intoxikationen durch biogene Amine .................................................................. 42
2.2.7 Physiologische Effekte der Amine ...................................................................... 43

2.2.7.1 Exogene Aminzufuhr und Amine aus de novo Synthese ....................... 43
2.2.7.2 Polyamine und ihre Effekte am Darm.................................................... 44
2.3 Purin- und Pyrimidinnukleotide............................................................................... 48
2.3.1 Struktur der Nukleotide ....................................................................................... 48
2.3.2 Biosynthese der Nukleotide................................................................................. 48
2.3.3 Abbau der Nukleotide.......................................................................................... 50
2.3.4 Vorkommen der Nukleotide ................................................................................ 51
2.3.5 Nukleotide und ihre Effekte auf Zellen und Gewebe.......................................... 53
2.4 Analytik der Amine mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.............. 55
2.4.1 Prinzip der HPLC ................................................................................................ 55
2.4.2 HPLC-Verfahren mit chemischer Derivatisierung.............................................. 55
2.4.2.1 Methoden zur Vorsäulenderivatisierung................................................ 57
2.4.2.1.1 Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethylchloroformiat ... 57
2.4.2.1.2 Vorsäulenderivatisierung mit Dansylchlorid ................................. 58
2.4.2.1.3 Vorsäulenderivatisierung mit Phenylisothiocyanat (PITC) ........... 59
2.4.2.1.4 Weitere Vorsäulenderivatisierungsverfahren................................. 59
2.4.2.2 Nachsäulenderivatisierungsverfahren .................................................... 60
2.4.2.2.1 Derivatisierung mit ortho-Phtaldialdehyd (OPA) .......................... 60
2.4.2.2.2 Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin ..................................... 61
2.4.2.2.3 Nachsäulenderivatisierung mit Fluorescamin ................................ 61
2.4.2.3 Vor- und Nachteile der Derivatisierungsverfahren................................ 62
3 MATERIAL UND METHODEN.............................................................................. 63
3.1 Zielsetzung................................................................................................................... 63
3.2 Tierexperimentelle Untersuchungen ........................................................................ 64
3.2.1 Versuchsaufbau ................................................................................................... 64
3.2.2 Tiere und Haltung................................................................................................ 66

3.2.3 Futter und Fütterung............................................................................................ 68
3.2.3.1 Rationszusammensetzung ...................................................................... 68
3.2.3.2 Versuchsrationen.................................................................................... 69
3.2.3.3 Fütterung ................................................................................................ 69
3.2.4 Euthanasie der Ferkel .......................................................................................... 70
3.2.5 Probenahme aus den einzelnen Kompartimenten des Intestinaltraktes............... 70
3.2.5.1 Gewebeentnahme ................................................................................... 70
3.2.5.2 Aufarbeitung und Lagerung der Proben................................................. 72
3.2.5.2.1 Darmgewebe und Chymus ............................................................. 72
3.2.5.2.2 Blutplasma...................................................................................... 72
3.3 Analytische Verfahren ............................................................................................... 73
3.3.1 Aminanalytik ....................................................................................................... 74
3.3.1.1 Fragestellung .......................................................................................... 74
3.3.1.2 HPLC-Anlage, Geräte und Chemikalien................................................ 74
3.3.1.2.1 HPLC-Anlage................................................................................. 74
3.3.1.2.2 Sonstige Geräte und Laborzubehör................................................ 75
3.3.1.2.3 Verwendete Chemikalien ............................................................... 76
3.3.2 Bestimmung von Enzymen.................................................................................. 78
3.3.2.1 Laktase- und Maltase-Bestimmung im Chymus .................................... 78
3.3.2.1.1 Probenaufarbeitung ........................................................................ 79
3.3.2.1.2 Bestimmung der Disaccharidasen .................................................. 79
3.3.2.1.2.1 Disaccharidspaltung ........................................................................79
3.3.2.1.2.2 Farbreaktion ....................................................................................80
3.3.2.1.3 Auswertung .................................................................................... 80
3.3.2.1.4 Verwendete Chemikalien und Geräte ............................................ 80
3.3.2.1.5 Qualitätskriterien der Methode zur Disaccharidasebestimmung ... 82
3.3.2.2 Leucinarylamidasebestimmung im Chymus .......................................... 83

3.3.2.2.1 Qualitätskriterien zur Bestimmung der LAP-Aktivität .................. 83
3.3.2.3 Trockensubstanz der Chymusproben ..................................................... 84
3.4 Statistische Auswertung............................................................................................. 84
4 ERGEBNISSE............................................................................................................. 86
4.1 Fütterungsversuch...................................................................................................... 86
4.1.1 Zootechnische Parameter..................................................................................... 86
4.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von Aminen in Chymus und
Darmgewebe................................................................................................................ 87
4.2.1 Voruntersuchungen.............................................................................................. 87
4.2.2 Analyseverfahren zur Aminbestimmung............................................................. 90
4.2.2.1 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Chymusproben
und des Aminstandards .......................................................................... 90
4.2.2.2 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Gewebeproben,
des internen Standards und des Aminstandards ..................................... 92
4.2.2.3 HPLC-Bedingungen zur Trennung der Amine ...................................... 95
4.2.3 Validierung der HPLC-Methode zur Aminbestimmung im Chymus und
Darmgewebe...................................................................................................... 101
4.2.3.1 Überprüfung der Linearität .................................................................. 101
4.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit ................................................... 105
4.2.3.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze .................................................... 105
4.2.3.4 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im Chymus ............ 107
4.2.3.5 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im
Darmgewebe......................................................................................... 108
4.3 Ergebnisse der Aminbestimmung........................................................................... 110
4.3.1 Amingehalte im Dünndarmchymus................................................................... 110
4.3.2 Amingehalte im Darmgewebe........................................................................... 115
4.3.3 Prozentuale Anteile der Amine des Chymus und Darmgewebes
im distalen Jejunum........................................................................................... 126

4.4 Aktivität der Disaccharidasen und der Leucinarylamidase im Chymus des
Dünndarmes.............................................................................................................. 127
4.4.1 Maltaseaktivität ................................................................................................. 127
4.4.2 Laktaseaktivität ................................................................................................. 130
4.4.3 Leucinarylamidaseaktivität ............................................................................... 132
5 DISKUSSION ........................................................................................................... 136
5.1 Aminbestimmung ..................................................................................................... 136
5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen....................................................................... 139
5.3 Diskussion der Ergebnisse der Amin- und Enzymbestimmung........................... 140
5.3.1 Amine im Chymus und Darmgewebe sowie Ergebnisse der
Darmmorphologie und Proliferationsparameter................................................ 141
5.3.2 Enzymaktivitäten im Chymus ........................................................................... 146
5.3.2.1 Maltase ................................................................................................. 146
5.3.2.2 Laktase ................................................................................................. 147
5.3.2.3 Leucinarylamidaseaktivität .................................................................. 148
5.4 Schlussfolgerungen................................................................................................... 149
6 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................... 150
7 SUMMARY............................................................................................................... 152
8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................ 154
9 ANHANG .................................................................................................................. 174

VERZEICHNIS DER TABELLEN
Tab. 1: Nukleotidgehalt im Kolostrum verschiedener Spezies..................................... 51
Tab. 2: Puringehalte verschiedener Lebensmittel......................................................... 52
Tab. 3: Versuchsaufbau ................................................................................................ 64
Tab. 4: Versuchsablauf ................................................................................................. 65
Tab. 5: Zusammensetzung der Basisdiät (% Originalsubstanz) ................................... 68
Tab. 6: Übersicht über verwendete Analysemethoden ................................................. 73
Tab. 7: Regressionsgeradengleichung (y = ax + b) und Korrelationskoeffizient ......... 83
Tab. 8: Zootechnische Parameter des Fütterungsversuches ......................................... 86
Tab. 9: Aufarbeitung der Chymusproben ..................................................................... 91
Tab. 10: Aufarbeitung des Aminstandards für die Chymusproben ................................ 91
Tab. 11: Derivatisierung der Chymusproben (ebenso Standard).................................... 92
Tab. 12: Aufarbeitung der Darmgewebeproben ............................................................. 94
Tab. 13: Aufarbeitung des internen Standards 1,8-Diaminooktan ................................. 94
Tab. 14: Aufarbeitung des Aminstandards für die Gewebeproben................................. 94
Tab. 15: Probenderivatisierung (ebenso Standard)......................................................... 95
Tab. 16: Gradientenprogramm zur Amintrennung nach der Derivatisierung................. 96
Tab. 17:
Tab. 18:
Tab. 19:
Tab. 20:
Tab. 21:
Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung nach Derivatisierung
mit FMOC-Cl. ................................................................................................ 105
Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenze (BG) für die Fluoreszenzdetektion
von Aminen nach Derivatisierung mit FMOC-Cl. ......................... 106
Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine
im Chymus...................................................................................................... 108
Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine
im Darmgewebe.............................................................................................. 109
Anteile der Amine (in Mol.%) am Gesamtamingehalt im Chymus (C)
und Darmgewebe (D) des distalen Jejunums ................................................. 126

Tab. 22:
Spermidin/Spermin-Quotient (SPD/SPN) im Duodenum (Gewebe)
der einzelnen Fütterungsgruppen ................................................................... 142
Tab. 23: Proliferationsparameter Ki-67 und Thymidinkinaseaktivität......................... 143
Tab. 24: Enzymaktivitäten des Chymus im distalen Jejunum ...................................... 146
Tab. I: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe Immunozog ® ......................................................... 174
Tab. II: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe PorVit Lak ® .......................................................... 175
Tab. III: Durchschnittliche Analyse des Molkefettkonzentrates .................................. 176
Tab. IV: Zusammensetzung der Mineralstoff-/Vitamin-Mischung .............................. 177
Tab. V: Putrescingehalte des Chymus im proximalen Jejunum .................................. 178
Tab. VI: Putrescingehalte des Chymus im distalen Jejunum........................................ 178
Tab. VII: Cadaveringehalte des Chymus im proximalen Jejunum................................. 179
Tab. VIII: Cadaveringehalte des Chymus im distalen Jejunum ...................................... 179
Tab. IX: Spermidingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ................................ 180
Tab. X: Spermidingehalte des Chymus im distalen Jejunum ...................................... 180
Tab. XI: Spermingehalte des Chymus im proximalen Jejunum.................................... 181
Tab. XII: Spermingehalte des Chymus im distalen Jejunum ......................................... 181
Tab. XIII: Putrescingehalte des Darmgewebes (Duodenum) .......................................... 182
Tab. XIV: Putrescingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum)............................ 182
Tab. XV: Putrescingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum) ................................. 183
Tab. XVI: Putrescingehalte des Darmgewebes (Ileum)................................................... 183
Tab. XVII: Cadaveringehalte des Darmgewebes (Duodenum)......................................... 184
Tab. XVIII: Cadaveringehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum).......................... 184
Tab. XIX: Cadaveringehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)................................ 185
Tab. XX: Cadaveringehalte des Darmgewebes (Ileum)................................................. 185

Tab. XXI: Spermidingehalte des Darmgewebes (Duodenum) ........................................ 186
Tab. XXII: Spermidingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum).......................... 186
Tab. XXIII: Spermidingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)................................ 187
Tab. XXIV: Spermidingehalte des Darmgewebes (Ileum)................................................. 187
Tab. XXV: Spermingehalte des Darmgewebes (Duodenum) ........................................... 188
Tab. XXVI: Spermingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum)............................. 188
Tab. XXVII: Spermingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)................................... 189
Tab. XXVIII: Spermingehalte des Darmgewebes (Ileum).................................................... 189
Tab. XXIX: Maltaseaktivität des Chymus im Duodenum.................................................. 190
Tab. XXX: Maltaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................................... 190
Tab. XXXI: Maltaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum......................................... 191
Tab. XXXII: Maltaseaktivität des Chymus im Ileum .......................................................... 191
Tab. XXXIII: Laktaseaktivität des Chymus im Duodenum.................................................. 192
Tab. XXXIV: Laktaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................................... 192
Tab. XXXV: Laktaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum......................................... 193
Tab. XXXVI: Laktaseaktivität des Chymus im Ileum .......................................................... 193
Tab.XXXVII: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Duodenum ................................ 194
Tab.XXXVIII: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................ 194
Tab. XXXIX: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum....................... 195
Tab. XL: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Ileum ........................................ 195

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Abb. 1: Kompartimentierung der Zotten/Krypten-Einheit............................................ 25
Abb. 2: Chemische Strukturformeln einiger Amine...................................................... 34
Abb. 3: Biosynthese von Polyaminen............................................................................ 37
Abb. 4: Schema zur Purinnukleotidbiosynthese............................................................ 49
Abb. 5:
Abb. 6:
Abb. 7:
Abb. 8:
Abb. 9:
Abb. 10:
Abb. 11:
HPLC-Chromatogramm eines Standardgemisches der FMOC-Cl-
Derivate von Aminen (0,25 µmol/ml) .............................................................. 97
HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen
einer aminarmen Chymusprobe (Putrescin und Cadaverin n.n.)...................... 98
HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen
einer aminreichen Chymusprobe ...................................................................... 99
HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen
einer Darmgewebeprobe (Cadaverin n.n.)...................................................... 100
Eichreihen mit 1,7-Diaminoheptan als internem Standard für
Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin............................................... 102
Eichreihen mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard für
Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin............................................... 103
Eichreihen mit 1,8-Diaminooktan als internem Standard für
Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin............................................... 104
Abb. 12: Putrescingehalte des Chymus im proximalen Jejunum .................................. 111
Abb. 13: Putrescingehalte des Chymus im distalen Jejunum........................................ 112
Abb. 14: Cadaveringehalte des Chymus im proximalen Jejunum................................. 112
Abb. 15: Cadaveringehalte des Chymus im distalen Jejunum ...................................... 113
Abb. 16: Spermidingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ................................ 113
Abb. 17: Spermidingehalte des Chymus im distalen Jejunum ...................................... 114
Abb. 18: Spermingehalte des Chymus im proximalen Jejunum.................................... 114

Abb. 19: Spermingehalte des Chymus im distalen Jejunum ......................................... 115
Abb. 20: Putrescingehalte im Darmgewebe (Duodenum)............................................. 118
Abb. 21: Putrescingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum) .............................. 118
Abb. 22: Putrescingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum).................................... 119
Abb. 23: Putrescingehalte im Darmgewebe (Ileum) ..................................................... 119
Abb. 24: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Duodenum) ........................................... 120
Abb. 25: Cadaveringehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)............................. 120
Abb. 26: Cadaveringehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) .................................. 121
Abb. 27: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Ileum).................................................... 121
Abb. 28: Spermidingehalte im Darmgewebe (Duodenum) ........................................... 122
Abb. 29: Spermidingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum) ............................ 122
Abb. 30: Spermidingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) .................................. 123
Abb. 31: Spermidingehalte im Darmgewebe (Ileum) ................................................... 123
Abb. 32: Spermingehalte im Darmgewebe (Duodenum) .............................................. 124
Abb. 33: Spermingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)................................ 124
Abb. 34: Spermingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) ..................................... 125
Abb. 35: Spermingehalte im Darmgewebe (Ileum)....................................................... 125
Abb. 36: Maltaseaktivität des Chymus im Duodenum.................................................. 128
Abb. 37: Maltaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................................... 128
Abb. 38: Maltaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum......................................... 129
Abb. 39: Maltaseaktivität des Chymus im Ileum .......................................................... 129
Abb. 40: Laktaseaktivität des Chymus im Duodenum.................................................. 130
Abb. 41: Laktaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................................... 131
Abb. 42: Laktaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum......................................... 131
Abb. 43: Laktaseaktivität des Chymus im Ileum .......................................................... 132
Abb. 44: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Duodenum................................ 133

Abb. 45: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum................. 133
Abb. 46: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum....................... 134
Abb. 47: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Ileum ........................................ 134

VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN
Abb.
ABTS
ACTH
AG
ADAM
AMP
Best. Nr.
bidest.
bzw.
C
ca.
CaCo
CAD
CN
CH
CMP
Co
d
D
Dabsyl-Cl
Dansyl-Cl
DEAE
DNA
EGF
et al.
Fa.
Fluorescamin, Fluram
FMOC-Cl
fmol
FNBT
Abbildung
2,2-Azini-di-(3-ethylbenzthiazolin)
Adrenocorticotropes Hormon
Aktiengesellschaft
1-Aminoadamantan
Adenosin-5-phosphat, Adenosinmonophosphat
Bestellnummer
bidestilliert
beziehungsweise
Kohlenstoff
circa
colorectal adenocarcinoma cell line
Cadaverin
Cyanid
Schweiz
Cytidin-5-phosphat, Cytidinmonophosphat
Cooperation
Tag
Deutschland
Dabsylchlorid
Dansylchlorid, 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid
Diethylaminoethyl
Desoxyribonukleinsäure
Epidermaler Wachstumsfaktor
et alii
Firma
4-Phenylspiro[furan-2(3H),1`phtalan]-3,3`-dion
9-Fluorenylmethylchloroformiat
Femtomol
4-Fluor-3-nitrobenzotrifluorid

g
Gramm
GLMP
General Linear Models Procedure
GmbH
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GMP
Guanosin-5-phosphat, Guanosinmonophosphat
H 2
HIST
HSQC
HPLC
IEC
IgG
IMP
i.v.
k
kg
KM
l
LAP
LS-Means
MAO
Min./Vit.-Mischung
min
mg
µg Mikrogramm
ml
Milliliter
mmol
Millimol
µmol
Mikromol
mU
Milliunits
n
Anzahl
NaOH
Natronlauge
NDA
Naphthalendialdehyd
n. n. nicht nachweisbar
nm
Nanometer
Wasserstoff
Histamin
N-Hydroxysuccinimidyl 6-Quinolinyl-Carbamat
High Performance Liquid Chromatography
(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
Intestinal epithelial cell line
Immunglobulin G
Inosin-5-phosphat, Inosinmonophosphat
intravenös
Korrelationskoeffizient
Kilogramm
Körpermasse
Liter
Leucinarylamidase, Leucinaminopeptidase
Least Square Means
Monoaminooxidase
Mineralstoff- und Vitaminmischung
Minute
Milligramm

nmol
Nanomol
n. s. nicht signifikant
ODC
Ornithindecarboxylase
OPA
ortho-Phthaldialdehyd
p. a. zur Analyse
PEOC
2-(1-Pyrenyl)Ethylchloroformiat
pH
potentia hydrogenii
PITC
Phenylisothiocyanat
pmol
Picomol
PRPP
Phosphoribosylpyrophosphat
PUT
Putrescin
® Eingetragenes Warenzeichen
R- Rest
R 2
RNA
RP
s
S
Bestimmtheitsmaß
Ribonukleinsäure
Reversed Phase (Umkehrphase)
Sekunde
Schwefel
S. Seite
SAM-DC
S-Adenosylmethionin-Decarboxylase
SPD
Spermidin
SPN
Spermin
s. u. siehe unten
Tab.
Tabelle
TRIS
Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan
TS
Trockensubstanz
u. und
U
Units (Einheiten)
u.a.
unter anderem
UMP
Uridin-5-phosphat, Uridinmonophosphat
usw.
und so weiter
UV
Ultraviolett

VIS
Sichtbares Licht (visible)
Vk
Variationskoeffizient
Vol %
Volumenprozent
arithmetischer Mittelwert
z.B.
zum Beispiel
°C Grad Celsius
x g
mal Erdbeschleunigung
± s Standardabweichung
± SEM Standard Error of the Mean, Standardfehler

Einleitung
1 Einleitung
Die postnatale Phase stellt bei der Ferkelaufzucht einen besonders kritischen Lebensabschnitt
dar. Verschiedene Faktoren wie hohe Wurfgröße, geringes Geburtsgewicht, unzureichende
Adaptation, Alter der Sau, schlechter Hygienestatus, Streß usw. bedingen eine hohe
Sterblichkeitsrate in dieser Zeit (SVENDSEN 1992).
Die in dieser Phase auftretenden Anpassungsphänomene des Gastrointestinaltraktes sind von
großer Bedeutung für die Verdauung und Absorption aufgenommener Inhaltsstoffe der im
zeitlichen Ablauf zur Verfügung stehenden Nahrung. Die Regulation sowie der Verlauf dieser
intestinalen Anpassungsprozesse sind bisher kaum bekannt. Zum Zeitpunkt der Geburt
scheint der Anstieg an Glucocorticoiden mit den Differenzierungsvorgängen in den
Darmmukosazellen in Verbindung zu stehen (SANGILD et al. 1995). Eine Beteiligung bei der
Stimulation des intestinalen Zellwachstums wird auch für bioaktive Substanzen
(Wachstumsfaktoren, Hormone) des Kolostrums angenommen (ODLE et al. 1996). Neben
Wachstumsfaktoren und Hormonen (JAEGER et al. 1987) zählen dazu auch Polyamine, wobei
Spermidin und Spermin hier die größte Fraktion darstellen (MOTYL et al. 1995, KELLY et al.
1991 a). Des Weiteren enthält Milch verschiedener Spezies Nukleotide (Purine und
Pyrimidine) in unterschiedlichen Konzentrationen, wobei hohe Gehalte hauptsächlich im
frühen Laktationsstadium ermittelt werden (CARVER u. WALKER 1995). Studien über die
Wirkungen exogener Polyamin- und Nukleotidzufuhr weisen auf deren Beteiligung bei der
Differenzierung und Proliferation des intestinalen Epithels hin (RAAB 1998; KAOUASS et al.
1996; BARDOCZ et al. 1995; CAPANO et al. 1994; HARADA et al. 1994; KAOUASS et al. 1994;
BARDOCZ 1993; BUTS et al. 1993; WILD et al. 1993; MCCORMACK u. JOHNSON 1991; DUFOUR
et al. 1988).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluß von exogen zugeführtem Spermin und
Nukleotiden auf den Entwicklungszustand des Intestinaltraktes von Ferkeln bis zum Alter von
drei Wochen zu untersuchen. Als Parameter wurden die Aminkonzentrationen im Chymus
und Darmgewebe sowie intestinale Enzymaktivitäten zur Charakterisierung des
Funktionszustandes des Darmes bestimmt.
23

Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Morphologie und Funktion des Dünndarmes
Der Darmkanal, dessen Aufgabe der Aufschluss und die Resorption von lebensnotwendigen
Bestandteilen der Nahrung, aber auch die Schutzfunktion gegenüber schädigenden
Futterinhaltsstoffen oder Bakterien ist, besitzt eine den verschiedenen Leistungen des Dünnund
Dickdarmes angepasste innere Wandung, die Schleimhaut oder Tunica mucosa (Mukosa)
(JANKOWSKI et al. 1994; NICKEL et al. 1987). Die Oberfläche der Schleimhaut des
Dünndarmes wird durch die Darmzotten, Villi intestinales, erheblich vergößert. Es handelt
sich hierbei um 0,5 bis 1 mm lange Ausstülpungen der Lamina propria mucosae, deren
inneres retikuläres Gewebe glatte Muskelzellen, Blut- und Lymphgefäße enthält (NICKEL et
al. 1987). Am Zottengrund bildet das Epithel Vertiefungen, die Glandulae intestinales oder
Lieberkühnschen Krypten, in denen undifferenzierte mitotische Zellen neue Zellen
produzieren, um Zellverluste an der Zottenspitze auszugleichen. Die abgestoßenen
Epithelzellen zerfallen im Darmlumen und setzen auch dort Verdauungsenzyme frei
(SILBERNAGL u. DESPOPOULOS 1991).
Der Dünndarm stellt mit einer sehr hohen Zellteilungsrate in den Krypten eines der
dynamischsten Gewebe des Körpers dar. Dadurch erfolgt die Bildung von einem Gramm
Darmgewebe (ca. 10 9 Zellen) innerhalb von 5 Tagen bei der Maus bzw. innerhalb von ca. 20
min beim Menschen (POTTEN 1992). Bei den in den Krypten kontinuierlich gebildeten Zellen
handelt es sich um entero-endokrine Zellen, Paneth´sche Zellen, schleimbildende
Drüsenzellen und Saumzellen oder Enterozyten (WRIGHT 1997). Die Enterozyten stellen mit
90 – 95 % den vorherrschenden Zelltyp des Darmepithels dar, die ihre Funktionsfähigkeit
während ihrer Wanderung entlang der Darmzotte erhalten. Nach zwei bis fünf Tagen
erreichen diese Zellen die Villusspitze und werden dort in das Darmlumen abgestoßen
(FREEMAN 1995).
24

Literaturübersicht
2.1.1 Proliferation, Differenzierung und Apoptose
Dieser Abstoßungsprozeß, die Apoptose, ist ein kontrollierter, natürlicher Prozess, der nach
einer Überproduktion von Zellen stattfindet oder abläuft, wenn Zellen Schäden an ihrer
Desoxyribonukleinsäure (DNA) aufweisen. Apoptose, der programmierte Zelltod
(JANKOWSKI et al. 1994) dient auch dazu, einen Gleichgewichtszustand im Gewebe zu
erhalten (POTTEN 1992), das einer hohen mechanischen und funktionellen Belastung z. B.
durch die Nahrung ausgesetzt ist. Der Zellverlust wird durch die Bereitstellung neuer,
arbeitsfähiger Zellen ausgeglichen.
Die Lokalisationen der Zellneubildung (Proliferation), der Differenzierung und der Apoptose
im Darmepithel sind streng voneinander getrennt (s. Abb. 1). Dieses Phänomen wurde bereits
im Jahre 1888 von dem italienischen Wissenschaftler Bizarro beschrieben, bewiesen wurde
die Hypothese jedoch erst 1948 (CREAMER 1967).
3.
3. Abstoßungszone
(Verschleiß/Apoptose)
Darmzotte
2.
2. Differenzierungskompartiment
(Differenzierung/Reifung)
1.
1. Proliferationskompartiment
(Stammzellenmitosen)
Abb. 1: Kompartimentierung der Zotten/Krypten-Einheit (modifiziert nach RIEKEN et al.
1989)
25

Literaturübersicht
Die Regenerationsfähigkeit des Darmepithels basiert auf der Teilungsfähigkeit
undifferenzierter Stammzellen endodermalen Ursprungs (WRIGHT 1997), die im unteren
Kryptenbereich lokalisiert sind (POTTEN 1992). Erst nach weiteren 3-4 Teilungen der
entstehenden Tochterzellen findet eine Differenzierung der neuen Zellen statt (WRIGHT 1997,
JOHNSON u. MCCORMACK 1994). Durch die Ausbildung von funktionellen Elementen wie
z. B. einen Mikrovillisaum (SMITH 1985) werden sie auf ihrer Wanderung in Richtung
Zottenspitze (FREEMAN 1995) zur Sekretion von Verdauungsenzymen und zur Resorption
befähigt. Diese spezialisierten Zellen, die Enterozyten, sind nicht mehr teilungsfähig
(WRIGHT 1997). Der Differenzierung der Darmzellen folgt zwangsläufig der spätere
Zellverlust durch Zelltod (Apoptose), der aber unter Gleichgewichtsbedingungen (steadystate)
mit der Zellproliferation in der Krypte ausbalanciert wird (POTTEN 1995).
2.1.2 Postnatale Veränderungen des Dünndarmes
Die erste Phase nach der Geburt stellt eine besonders risikoreiche Periode dar.
Untersuchungen über die Häufigkeit von Ferkelverlusten zeigen, dass annähernd die Hälfte
der Todesfälle in der ersten Lebenswoche auftreten (SVENDSEN 1992; BOLLWAHN 1982). Die
Verlustrate wird unter anderem durch den Verlauf der Geburt, das Geburtsgewicht der Ferkel,
die Umgebungstemperatur, die Kolostralmilchaufnahme, die Eisenversorgung sowie die
Funktion des Verdauungstraktes beeinflußt (HUBER 1992).
Jungtiere werden sowohl zum Zeitpunkt der Geburt als auch beim Absetzen vom Muttertier
mit einem mehr oder weniger abrupten Wechsel in der Zusammensetzung der zugeführten
Nahrung konfrontiert. Vor der Geburt wird Fruchtwasser abgeschluckt, anschließend folgt die
Milchaufnahme während der Säugeperiode, der sich mit dem Absetzen die feste
Nahrungsaufnahme anschließt (BUDDINGTON 1994). Mit dem nach der Geburt stattfindenden
Übergang von plazentärer zur intestinalen Nährstoffversorgung des Neugeborenen tritt der
Gastrointestinaltrakt erstmals mit dem nährstoffreichen Kolostrum in Kontakt. Dies führt zu
gravierenden morphologischen und funktionellen Veränderungen (XU 1996).
26

Literaturübersicht
2.1.2.1 Morphologische Veränderungen
Untersuchungen von SMITH und JARVIS (1978) über die Zottenmorphologie des Dünndarmes
von Ferkeln zeigen, dass in den ersten zehn Tagen post natum die Höhe und der Durchmesser
der Darmzotten stark zunimmt. Während die Zotten beim Neugeborenen überwiegend die
gleiche Länge aufweisen, scheint es neun Tage post natum zwei verschiedene
Zottengenerationen zu geben: Es werden sowohl sehr lange Zotten (doppelte Länge im
Vergleich zu Zotten neugeborener Ferkel) als auch sehr kurze Zotten gefunden. Die Autoren
gehen davon aus, dass die ausgedehnten Villi sich aus den bereits bei der Geburt vorhandenen
Zotten entwickeln, während die kurzen Zotten erst postnatal gebildet werden. Im Gegensatz
dazu berichten PAUER et al. (1991), dass die Villi neugeborener Ferkel verschiedene Längen
besitzen, während 2 Wochen alte Tiere über einheitlich geformte Darmzotten verfügen.
In den ersten Lebenstagen weist der Dünndarm säugender Ferkel im Vergleich zum
Gesamtkörperwachstum das stärkste Wachstum, d.h. die höchste Zellproliferationsrate auf.
Die Erhöhung des Darmgewichtes pro Längeneinheit wird durch einen größeren Querschnitt
des Darmkanals und den damit verbundenen höheren Proteingehalt bedingt. Im Gegensatz
hierzu vermindert sich die relative Darmlänge bezogen auf die Körpermasse eines Tieres.
Diese Angaben beziehen sich auf einen Untersuchungszeitraum einer 30-tägigen
Säugeperiode (TARVID et al. 1994). Ähnliche Ergebnisse erzielten XU et al. (1992), die über
eine Erhöhung des Darmgewichtes, Zunahme des Durchmessers des Darmes und der
Darmlänge sowie der intestinalen Villushöhe und des Zottendiameters post natum berichten.
2.1.2.2 Funktionelle Veränderungen
Diese morphologischen Veränderungen am Darm haben Auswirkungen auf die Funktion des
Gastrointestinaltraktes. Die Mukosa des Dünndarmes mit ihren Villi und Mikrovilli besteht
aus den teilungsfähigen Kryptenzellen an der Zottenbasis und den für die Verdauung
zuständigen Zellen entlang der Zotte, den differenzierten Enterozyten (FORTIN-MAGANA et al.
1970). Bestimmte Enzyme können unterschiedlichen Bereichen der Zotten-Krypteneinheit
zugeordnet werden, d. h. diese Enzyme werden erst während der Wanderung der Enterozyten
27

Literaturübersicht
entlang der Darmzotte gebildet und stellen somit Parameter für den Differenzierungs- oder
den Proliferationszustand von Zellen des Dünndarmes dar (RAAB 1998). Die Thymidinkinase
wird z. B. vorrangig im Bereich der Krypten gefunden und dient als Proliferationsmarker,
während die Laktase ihr Aktivitätsmaximum in der Bürstensaummembran der mittleren
Zottenabschnitte besitzt und die Differenzierung von Zellen charakterisiert (FORTIN-MAGANA
et al. 1970). Die von den Enterozyten gebildeten Aminopeptidasen und Dipeptidasen sind in
der Bürstensaummembran oder aber im Zytoplasma der Zelle lokalisiert (CRANWELL 1995).
Die Leucinaminopeptidasen, eine der trivialen Bezeichnungen für Aminopeptidasen mit
breiter Spezifität, sind im Zytoplasma der Enterozyten lokalisiert (SJÖSTRÖM u. NORÉN 1986).
Verschiedene Enzymaktivitäten im Dünndarm von Ferkeln wurden eingehend von JAMES et
al. (1987) untersucht. In den ersten vier Lebenstagen ist die Aktivität der Maltase und der
Saccharase in der Dünndarmmukosa gering (0,4 bzw. 0,1 µmol umgesetztes Substrat/h/mg
Protein). Anschließend steigen die Werte bis zum 10. Tag post natum an, wobei das Enzym
Saccharase im Vergleich zur Maltase eine höhere Aktivität aufweist. Im Gegensatz dazu
verringert sich die Aktivität von Laktase in der Dünndarmschleimhaut im Verlaufe der
Wachstumsentwicklung des Ferkels (KELLY et al. 1991 c). Aus den Untersuchungen lässt sich
ableiten, dass Ferkel, die ausschließlich mit Kolostralmilch, d. h. mit einem relativ hohen
Anteil proliferations- und differenzierungsfördernder Substanzen gefüttert werden, eine
deutliche Aktivitätsabnahme der Laktase aufweisen. Geringere Aktivitätsabnahmen werden
bei Tieren festgestellt, die mit Milch der späteren Laktationsphase gefüttert wurden. Die
genauen Regulationsmechanismen der Enzymsekretion sind noch nicht vollständig geklärt.
Vergleichbare Ergebnisse wurden in früheren Untersuchungen von MANNERS und STEVENS
(1972) erzielt. Sie bestimmten die Aktivität der Disaccaridasen Laktase und Saccharase bei
neugeborenen Ferkeln bis hin zu ausgewachsenen Tieren. Trotz großer Variation in den
Enzymaktivitäten zwischen den einzelnen Tieren konnten die Autoren zeigen, dass die
Laktaseaktivität neugeborener Tiere hoch ist und ein Maximum in den vorderen Abschnitten
des Dünndarmes aufweist. Innerhalb der ersten Lebenswoche nach der Geburt ist ein
deutlicher Rückgang der Aktivität in den proximalen Dünndarmabschnitten zu verzeichnen.
Tiere im Altersbereich von ein bis vier Wochen zeigten erhebliche Variationen in der
Enzymaktivität (Laktase, Saccharase), wodurch keine eindeutige Aussage möglich war. Ein
28

Literaturübersicht
oder mehrere Aktivitätsmaxima konnten im gesamten Dünndarm der untersuchten Tiere
nachgewiesen werden, die sich hauptsächlich auf verschiedene Abschnitte des Jejunums
erstreckten. Mit zunehmenden Alter trat weiterhin eine Aktivitätsabnahme auf, wobei
Aktivitätsmaxima im proximalen Darmbereich zu finden waren. Die Saccharaseaktivität
verhielt sich gegensätzlich und nahm mit dem Alter der Tiere zu.
Auch AUMAITRE und CORRING (1973) befassten sich mit der Entwicklung der Enzymaktivität
bei Ferkeln, und zwar an Föten bis hin zu 8 Wochen alten Saugferkeln. Bei Föten (105.
Entwicklungstag) konnte sowohl Laktase- als auch Maltaseaktivität in der Dünndarmmukosa
festgestellt werden, während eine Saccharaseaktivität erst in der ersten Woche post natum
nachgewiesen werden konnte. Die spezifische Aktivität von Laktase (bezogen auf den
Proteingehalt des Darmgewebes) zeigte ein Maximum in der ersten Woche post natum, in den
nachfolgenden Wochen verminderte sich die Enzymaktivität. In der 2. Lebenswoche konnten
die Autoren ein Maximum der spezifischen Aktivität von Maltase und Saccharase
verzeichnen. Die Maltaseaktivität nahm von der 2.- 4. Lebenswoche ab, um anschließend
wieder anzusteigen, während sich die spezifische Saccharaseaktivität bis zur 8. Lebenswoche
kontinuierlich verringerte.
BUDDINGTON (1994) faßt die möglichen Ursachen für die postnatale Veränderung intestinaler
Enzymaktivitäten wie folgt zusammen: Durch die Proliferation von Enterozyten nach der
Geburt ist die Zahl funktionell unreifer Enterozyten erhöht, die noch nicht über
funktionierende Hydrolasen verfügen. Außerdem führen Änderungen in der Expression von
Genen zu Unterschieden in der Zusammensetzung und dem Vorkommen von Proteinen der
Bürstensaumembran, welche die Bausteine der Enzyme darstellen. Ein weiterer Faktor, der
die Zellfunktion beeinflußt, ist die jeweilige Aktivität der vorhandenen Proteine. Genetisch
vorprogrammierte altersabhängige Veränderungen der intestinalen Morphologie und Funktion
können zwar durch den Einfluß der aufgenommenen Nahrung verzögert, jedoch nicht
verhindert werden.
29

Literaturübersicht
2.1.3 Veränderungen in der Darmstruktur zum Zeitpunkt des Absetzens vom
Muttertier
Das Absetzen führt zu deutlichen Veränderungen in der Struktur der Mukosa des
Dünndarmes. Ergebnisse von HAMPSON (1986) und MILLER et al. (1986) zeigen, dass die
Kryptentiefe nach dem Absetzen zunimmt, während bis zum 5. Tag nach dem Absetzen eine
Verminderung der Zottenhöhe (Villusatrophie) um fast 50 % festzustellen ist. In den distalen
Abschnitten des Dünndarmes erscheint die Kryptenvertiefung deutlicher (HAMPSON 1986). Im
Gegensatz dazu werden im proximalen Dünndarm kürzere Darmzotten gefunden. Auch die
Anzahl der Kryptenzellen pro Darmzotte erhöht sich signifikant am fünften Tag nach dem
Absetzen.
Auch KELLY et al. (1991 b) berichten, dass das Absetzen zu einer weiteren Verkürzung der
Zottenlänge und Vertiefung der Krypten führt. Die vor dem Absetzen fingerförmigen Zotten
werden nach dem Absetzen in zungenförmige, gedrungenere Villi umgewandelt, wodurch
sich deren Oberfläche und dadurch die Verdauungskapazität der intestinalen Mukosa
verringert (CERA et al. 1988). Hierin sehen die Autoren eine mögliche Ursache für die
Anfälligkeit frisch abgesetzter Ferkel, an enteralen Infektionen, Diarrhoe, Dehydratation oder
Malabsorption zu erkranken.
Diese strukturellen Veränderungen resultieren in einer verminderten Absorptionsfläche und
einer erhöhten Anzahl von unreifen Enterozyten. Auch HAMPSON (1986) vermutet, dass
dieses Phänomen zu einer erhöhten Anfälligkeit der Ferkel für Diarrhöen und zum eventuell
auftretenden Wachstumsrückstand in der Absetzphase beiträgt.
2.1.4 Regulation des Darmwachstums
Unter Wachstum versteht man sowohl die Vergrößerung von Zellen (Hypertrophie) als auch
die Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie). Die Teilung undifferenzierter Stammzellen führt zur
Proliferation der gastrointestinalen Mukosa, d.h. zur Zunahme der Zellzahl. Anschließend
folgt die Differenzierung der aus den Stammzellen hervorgegangenen Zellen, wodurch diese
30

Literaturübersicht
die Funktionsfähigkeit maturer Zellen erhalten und sich in ihrem Phänotyp unterscheiden
können. Funktionen reifer Zellen sind beispielsweise die Absorption bestimmter Nährstoffe,
Sekretionsvorgänge, Kontraktilität sowie die Reaktion auf bestimmte Signale (MCCORMACK
u. JOHNSON 1991). Die Zellen können von nun an ihre Aufgaben der Absorption und
Verdauung erfüllen. An der Villusspitze werden die reifen Zellen im Mittel nach 3 Tagen in
das Darmlumen abgestoßen, somit erneuert sich die Epithelschicht in kürzester Zeit
(BARDOCZ 1993).
Das Epithel des Verdauungstraktes weist die höchste Zellturnover-Rate und
Stoffwechselaktivität des Säugerorganismus auf (BARDOCZ 1993). Das Wachstum der
intestinalen Mukosa wird durch verschiedene Faktoren stimuliert: Gastrointestinale Peptide
(Gastrin, Secretin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), O´LOUGHLIN et al. 1985), luminale
Faktoren (Polyamine, Purine) und Hormone, die nicht gastrointestinalen Ursprungs sind,
beeinflussen die Entwicklung der Mukosaauskleidung des Verdauungstraktes (ORTEGA et al.
1995; MCCORMACK u. JOHNSON 1991). Sie sind essentiell für die mukosale Proliferation
(GINTY et al. 1989) und die Differenzierung des Gastrointestinaltraktes (DUFOUR et al. 1988).
Gastrin fördert die Proliferation von Zellen der gastrointestinalen Mukosa, Secretin hemmt
diesen Prozess (JOHNSON 1988). Auch EGF besitzt eine mitogene Wirkung. Untersuchungen
an Zellkulturen (IEC-6-Zellen) zeigten, dass EGF die DNA-Synthese steigert (SIMMONS et al.
1995).
31

Literaturübersicht
2.2 Biogene Amine
2.2.1 Chemische Struktur und Eigenschaften
Die Amine können als Derivate des Ammoniaks in primäre (R-NH 2 ), sekundäre (R-NH-R)
und tertiäre (R-NR-R) Amine eingeteilt werden (BEUTLING et al. 1996). Als niedermolekulare
organische Basen besitzen sie die Struktur von aliphatischen, aromatischen bzw.
heterozyklischen Verbindungen. Sie werden im Stoffwechsel von Mensch, Tier, Pflanze und
Mikroorganismen gebildet und metabolisiert (ASKAR u. TREPTOW 1986) und entstehen aus
proteinogenen Aminosäuren durch Abspaltung der CO 2 -Gruppe (BEUTLING et al. 1996):
R-CH(NH 2 )-COOH → R-CH 2 -NH 2 + CO 2
Die Reaktion erfordert das Vorhandensein von geeigneten Decarboxylasen. Diese sind meist
substratspezifisch und können nur eine bestimmte Reaktion katalysieren. Darüber hinaus sind
sie spezifisch für die L-Konfiguration der jeweiligen Aminosäure.
Anhand der Anzahl der im Molekül vorhandenen Aminogruppen werden Mono- und
Polyamine unterschieden. Die biogenen Amine sind aufgrund der großen Zahl ihrer
Reaktionsmöglichkeiten in vielfältiger Weise am Stoffwechsel lebender Zellen beteiligt
(BEUTLING et al. 1996). Einige Verbindungen aus der Gruppe der biogenen Amine haben
Bedeutung als Wachstumsfaktoren, wirken als Hormone oder sind für die Nukleinsäure- und
Proteinsynthese notwendig. Teilweise sind sie für die Funktion des Nervensystems, die
Regulation der Körpertemperatur, die Darmmotorik, die Aktivität des Gehirns und den Wach-
Schlaf-Rhythmus wichtig (ASKAR u. TREPTOW 1986).
2.2.1.1 Monoamine
Fast alle Monoamine stammen von der Aminosäure Tyrosin bzw. deren Derivaten ab, wobei
nur wenige der vorkommenden Monoamine von physiologischer Bedeutung sind.
32

Literaturübersicht
Die Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin zählen zu den wichtigsten Monoaminen, da
sie die Funktion des Nervensystems regulieren. Sie werden ausschließlich endogen aus
Tyrosin über Dioxyphenylalanin (DOPA) und Dopamin in den chromaffinen Zellen des
Nebennierenmarkes und den sympathischen Nervenendigungen gebildet. Katecholamine sind
in geringen Mengen in tierischem Eiweiß enthalten und werden nach der Aufnahme durch
Verdauungs- oder aminabbauende Enzyme inaktiviert (BEUTLING et al. 1996).
Andere Monoamine (Tyramin, Octopamin, β-Phenylethylamin) kommen häufig in größeren
Mengen in der Nahrung vor und können enteral resorbiert werden. Dies kann deutliche
Reaktionen im Organismus hervorrufen, wie z. B. lebensbedrohlichen Bluthochdruck,
kreislaufbedingte Übelkeit und Schwindelgefühl, Diarrhoe und Kopfschmerzen (BEUTLING et
al. 1996).
Die basisch reagierenden Monoamine sind sehr hitzebeständig und werden deshalb auch bei
der Zubereitung von Speisen nicht zerstört. Sie sind in einem weiten pH-Bereich von pH 5 bis
pH 11 chemisch stabil und physiologisch wirksam. Monoamine sind gut resorbierbar und
können Zellwände leicht passieren, mit Ausnahme der Blut-Hirn-Schranke. Diese wird
allerdings bei sehr hohen Konzentrationen überschritten (BEUTLING et al. 1996).
2.2.1.2 Polyamine
Zu den Polyaminen gehören sowohl die Indolabkömmlinge (Serotonin, Tryptamin) als auch
die Imidazolderivate (Histamin) und die aliphatischen Amine mit zwei oder mehr
Aminogruppen (z.B. Putrescin, Cadaverin, Spermidin, Spermin und Agmatin). Polyamine mit
in Ringformen integrierten Aminogruppen sind weniger reaktiv als solche mit freien
endständigen Aminogruppen. Die chemischen Strukturformeln einiger Amine sind in Abb. 2
dargestellt.
33

Literaturübersicht
Cadaverin
Putrescin
Spermidin
Spermin
Histamin
Abb. 2: Chemische Strukturformeln einiger Amine (BEUTLING et al. 1996)
Die Resorbierbarkeit der Polyamine ist aufgrund ihrer Größe weniger gut als diejenige der
Monoamine. Sie sind, ebenso wie die Monoamine, sehr hitze- (> 100 °C über mehrere
Stunden) und pH-stabil.
Polyamine besitzen eine Schutzfunktion für Desoxyribonukleinsäure (DNA) und
Ribonukleinsäure (RNA), indem sie mit den freien Phosphatgruppen von Nukleinsäuren
stabile Komplexe bilden und diese somit vor denaturierenden Faktoren (wie hohen
34

Literaturübersicht
Temperaturen (TABOR u. TABOR 1984), Wassermangel und osmotischen Belastungen (SCHLEE
1992)) schützen. Das Gewebshormon Histamin liegt größtenteils an Eiweißstoffe gebunden
vor und kann aufgrund seiner Aminogruppen in primärer, sekundärer und tertiärer Bindung
als Monoamin und als Diamin reagieren. Es kommt in zwei stereoisomeren Formen vor und
besitzt eine flexible Konfiguration. Seine Reaktionsmöglichkeiten sind daher sehr variabel
(BEUTLING et al. 1996).
Spermin und Spermidin konnten erstmals in Seminalplasma nachgewiesen werden, woher
sich ihre Bezeichnung ableitet. Die Bezeichnung von Cadaverin und Putrescin stammt von
ihrem typischen Verwesungsgeruch (BARDOCZ 1993). Sie werden bei der Eiweißzersetzung
gebildet und wurden deshalb ursprünglich den „Ptoaminen“ (Leichengiften) zugeordnet.
Heute ist jedoch bekannt, dass es sich bei den auftretenden Giften um Bakterientoxine handelt
(SCHEUER u. RÖDEL 1995).
Zu den in lebenden Zellen am häufigsten vorkommenden Polyaminen gehören Putrescin und
Spermidin, während Spermin nicht in allen biologischen Materialien zu finden ist (TABOR u.
TABOR 1985). Während Prokaryonten hauptsächlich Putrescin und Spermidin synthetisieren,
bilden Eukaryonten zusätzlich Spermin. Das Diamin Cadaverin wird fast auschließlich von
Bakterien synthetisiert (BARDOCZ 1993).
Histamin wird hauptsächlich in der Granula von Mukosa- und Bindegewebemastzellen,
basophilen Granulozyten und Histiozyten des Gastrointestinaltraktes gespeichert. Auch die
Nervenendigungen des Zentralnervensystemes dienen als Histaminspeicher (MEJSTRIK 1996).
2.2.2 Polyamine in der Zelle
Für das Wachstum und die Differenzierung von Zellen sind Polyamine essentiell. Vielen
Mikroorganismen und höheren Pflanzen ist es möglich, Putrescin aus Agmatin, das mit Hilfe
des Enzyms Arginindecarboxylase aus Arginin entsteht, zu bilden. In den Zellen von
Säugetieren kommt dieses Enzym nicht vor und Putrescin kann nur über die
Decarboxylierung von Ornithin synthetisiert werden. Ornithin wird über das Plasma zur
Verfügung gestellt, aber auch eine Synthese in der Zelle aus Arginin unter Einwirkung des
35

Literaturübersicht
Enzyms Arginase ist möglich (PEGG u. MCCANN 1982). Cadaverin entsteht durch die
Decarboxylierung von Lysin fast ausschließlich in Mikroorganismen und Pflanzen (BARDOCZ
1993).
Die endogene Polyaminsynthese in der Säugerzelle unterliegt differenzierten
Regulationsmechanismen (MAUDSLEY 1979). Die Bildung erfolgt im Cytoplasma der Zelle
(BARDOCZ 1993). Vier Enzyme sind für die Polyaminsynthese wichtig (s. Abb. 3). Es handelt
sich hierbei um zwei Decarboxylasen und zwei Synthasen. Das Enzym Ornithindecarboxylase
(ODC) leitet den ersten Schritt, die Decarboxylierung der Aminosäure Ornithin ein, wobei
Putrescin entsteht. Die ODC besitzt eine sehr kurze Halbwertszeit von 10-20 Minuten (IWAMI
et al. 1990) und fungiert als limitierender Faktor in der Polyaminsynthese. Werden Zellen zur
Proliferation angeregt, steigt die ODC-Aktivität stark an. So besitzen z.B. Tumorzellen durch
eine hohe Aktivität der Ornithindecarboxylase eine sehr hohe Synthesekapazität für
Polyamine (BARDOCZ 1993). In der Mukosa des Rattendünndarmes ist die ODC vorrangig in
den differenzierten Villusenterozyten lokalisiert, nicht jedoch in den Kryptenzellen
(FITZPATRICK et al. 1986). Beim abgesetzen Ferkel besitzen die differenzierten
Villusenterozyten nur eine geringe ODC-Aktivität, im Gegensatz zu neugeborenen Ferkeln,
bei denen die ODC-Aktivität um ein Vielfaches höher ist (M´RABET-TOUIL et al. 1995;
BLACHIER et al. 1992). Durch verschiedene Stimuli (Geweberegeneration, Hormone,
Medikamente, Wachstumsfaktoren) ist das Enzym ODC sehr schnell induzierbar (SEIDEL
1986; MAUDSLEY 1979).
Als weiterer Syntheseschritt wird aus S-Adenosylmethionin durch Einwirkung der S-
Adenosyl-L-Methionin-Decarboxylase eine Propylamingruppe freigesetzt. Durch die
Anlagerung dieser Propylamingruppe an Putrescin mit Hilfe der Spermidinsynthase entsteht
Spermidin. Eine weitere Propylaminanlagerung an Spermidin mittels der Sperminsynthase
führt zur Bildung von Spermin. Auch eine Rückwandlung von Spermin zu Spermidin und von
Spermidin zu Putrescin ist möglich. Hierfür sind die Enzyme Spermidin-N-Acetyltransferase
und die Polyaminoxidase notwendig.
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Literaturübersicht
Ornithin
S-Adenosylmethionin
Decarboxylase
Ornithin-
S-Adenosyl-L-Methionin-
Decarboxylase
Putrescin
NH 2 (CH 2 ) 4 NH 2
Propylamingruppe
(CH 2 ) 3 NH 2
Spermidin-Synthase
Spermidin
NH 2 (CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NH 2
Spermin-Synthase
Spermin
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NH 2
Abb. 3: Biosynthese von Polyaminen (nach MAUDSLEY 1979)
Verschiedene Substanzen hemmen die Synthese von Polyaminen. So hemmt beispielsweise
α-Difluoromethylornithin (DFMO) das Enzym ODC (PEGG u. MCCANN 1982). Darüber
hinaus besteht eine negative Rückkopplung zwischen hohen Putrescinkonzentrationen und
der ODC-Aktivität (IWAMI et al. 1990). Weitere Inhibitoren hemmen verschiedene Enzyme
(S-Adenosyl-L-Methionin-Decarboxylase, Spermidin-Synthase, Spermin-Synthase), die an
der Biosynthese der Polyamine beteiligt sind (PEGG u. MCCANN 1982).
Obwohl jede Zelle von Säugetieren die Fähigkeit zur Polyaminsynthese besitzt, ist ein
kontinuierliches Angebot an Polyaminen durch die Nahrung nötig, falls der Bedarf durch die
Biosynthese nicht gedeckt werden kann (BARDOCZ 1993).
37

Literaturübersicht
2.2.2.1 Polyamintransportsysteme in Zellen
Transportsysteme für Polyamine sind in vielen Zellen vorhanden (PEGG u. MCCANN 1982).
Sie dienen sowohl der Aufnahme von Polyaminen als auch ihrer Exkretion.
Wachstumsfaktoren, Hormone und die Hemmung der intrazellulären Polyaminsynthese
können eine vermehrte Aufnahme aus dem Extrazellulärraum bedingen. Zellen in der
Ruhephase nehmen im Gegensatz zu proliferierenden Zellen weniger Polyamine auf
(MORGAN 1990).
Zum Transport von Polyaminen wird Energie benötigt. Der Vorgang verläuft
temperaturabhängig, ist sättigbar und kann auch entgegen einem Konzentrationsgefälle
stattfinden (MORGAN 1990). Eine Beteiligung von unterschiedlichen Transportsystemen
wurde festgestellt, wobei ein gemeinsamer Carrier für Spermidin und Spermin vorliegt
(SEILER u. DEZEURE 1990). Die Putrescinaufnahme unterliegt einem davon unabhängigen
Carrier (KUMAGAI et al. 1989).
2.2.2.2 Abbau von Aminen
Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten zum Abbau von Aminen zu physiologisch
unwirksamen Verbindungen, wobei die Oxidation zu Carbonsäuren vorherrschend ist und
durch Aminoxidasen katalysiert wird (BEUTLING et al. 1996).
Die Monoaminoxidasen (MAO) oxidieren annähernd alle biogenen Amine und einfache
aliphatische Amine (ASKAR u. TREPTOW 1986). Diaminoxidasen bauen Diamine und
Polyamine ab, Polyaminoxidasen (BEUTLING et al. 1996) oxidieren Polyamine. Aminoxidasen
kommen beispielsweise in der Leber, Lunge, Niere, Haut, Placenta und besonders in der
Dünndarmmukosa vor. Somit stellen sie eine körpereigene Kontrolleinrichtung zur
Regulation biogener Amine (wie z.B. Adrenalin und Serotonin) und exogen zugeführter
Amine dar (ASKAR u. TREPTOW 1986).
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Literaturübersicht
Der Aminoxidation liegt folgende Reaktion zugrunde:
R-CH 2 -NH 2 + H 2 O + O 2 → R-CHO + H 2 O 2 + NH 3
Amine können daher als N-Donatoren im Stoffwechsel fungieren.
Des Weiteren sind N- und O-Methylierung, N-Acetylierung, Hydroxylierung und oxidative
Decarboxylierung bekannt. Es ist nicht genau geklärt, wodurch die jeweiligen
Abbauvorgänge eingeleitet werden (BEUTLING et al. 1996).
2.2.3 Aminresorption aus Nahrungsstoffen
Der Säugerorganismus verfügt über Regelmechanismen zur Aufnahme von Stoffen in Zellen
und Gewebe und für den Stoffaustausch zwischen Gewebe, Blut und lebenswichtigen
Organsystemen. Amine werden aus der Nahrung in Abhängigkeit von physikalischen
Einflüssen und anderen Inhaltsstoffen resorbiert. Des Weiteren spielt die zeitgleiche
Aufnahme adsorbierender Nahrungsbestandteile und die Muzinbildung im Verdauungstrakt
eine entscheidende Rolle. Die Resorptionsraten sind daher nicht nur aminspezifisch, sondern
von einer Vielzahl von Faktoren abhängig (BEUTLING et al. 1996).
Von den enteral aufgenommenen Polyaminen wird Putrescin zu 80 % mittels der
Diaminoxidase metabolisiert und hauptsächlich zu Aminosäuren abgebaut, während
Spermidin und Spermin zu 75 % in ihrer ursprünglichen Form verbleiben (BARDOCZ 1995).
Da diese beiden Substanzen für die weitere Nutzung im Organismus unverändert vorliegen
und vorrangig absorbiert werden, liegt die Vermutung nahe, dass sie von größerer
physiologischer Bedeutung sind, im Gegensatz zu Putrescin, welches rasch abgebaut wird
(BARDOCZ 1993).
39

Literaturübersicht
2.2.4 Aminbildung in Mikroorganismen
Bereits in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde die Aminbildung durch Mikroben
genauer untersucht. Besonders die Histaminbildung fand aufgrund zahlreicher
nahrungsbedingter Intoxikationen Beachtung. Die Enterobacteriaceae stellen die größte und
artenreichste Gruppe der Histaminbildner dar. Enterokokken, Pediokokken und Laktobazillen
stellen die Hauptvertreter der tyraminbildenden Mikroorganismen dar. Tryptamin konnte bei
Bazillen und Clostridien nachgewiesen werden.
Auch Spermidin, Putrescin, Cadaverin und Octopamin können bakterieller Herkunft sein
(BEUTLING 1996).
2.2.5 Amine in Lebensmitteln tierischer und pflanzlicher Herkunft sowie Milch
verschiedener Spezies
Alle vorkommenden Polyamine können in Lebensmitteln enthalten sein (BEUTLING et al.
1996), wobei vor allem das Histamin als Ursache von Lebensmittelintoxikationen eine
bedeutende Rolle spielt (ASKAR u. TREPTOW 1986). Mit einem vermehrten Vorkommen von
biogenen Aminen ist in solchen Lebensmitteln zu rechnen, in denen biochemische und
mikrobielle Eiweißveränderungen stattgefunden haben. Vor allem verdorbene Lebensmittel
weisen größere Mengen an biogenen Aminen auf, was in der Qualitätskontrolle von
Lebensmitteln berücksichtigt wird.
Eine Gefahr für den Menschen stellen biogene Amine in Lebensmitteln nur dann dar, wenn
sie in erhöhter Konzentration vorkommen und dadurch die körpereigenen
Kontrollmechanismen überlastet werden bzw. wenn die Kontrollfunktionen gegen Amine
insuffizient sind.
In Nahrungsmitteln, denen Nitrit zugesetzt wurde oder in denen Nitrit gebildet werden kann
(z.B. Pökelware), müssen Amine auch hinsichtlich der Bildung von karzinogenen
Nitrosaminen berücksichtigt werden (ASKAR u. TREPTOW 1986).
40

Literaturübersicht
Histamin ist in frischen Fischen und Meerestieren nur in geringen Mengen enthalten, während
in Fischprodukten, z.B. aus Makrelen, Hering und Thunfisch, höhere Konzentrationen an
Histamin enthalten sein können (ASKAR 1984). Die Bildung von biogenen Aminen, hier
insbesondere Histamin, ist auf eine bakterielle Decarboxylierung von Aminosäuren (Histidin)
zurückzuführen (ASKAR 1994). Es besteht ein Zusammenhang zwischen dem Frischegrad von
Fischen, der Verarbeitung und der damit einhergehenden mikrobiellen Kontamination, und
dem Histamingehalt. Aufgrund dieses Zusammenhanges erstellte KARMAS (1981) einen Index
(BAI = Biogenic Amine Index) zur Bestimmung des Verderbnisgrades von Fisch:
Biogenic Amine Index (BAI) =
Histamin + Putrescin + Cadaverin
1 + Spermin + Spermidin
Er konnte nachweisen, dass Veränderungen der Amingehalte im Verlauf des Verderbs von
Thunfisch auftreten. Während es zu einer Zunahme von Cadaverin, Histamin und Putrescin
kommt, sinken die Gehalte an Spermidin und Spermin. Ein BAI-Wert >10 deutet auf eine
mindere Qualität hin (ASKAR u. TREPTOW 1986). In fortgeschrittenem Fäulnisstadium besteht
die Möglichkeit, dass der Gehalt an biogenen Aminen wieder abnimmt, obwohl eine hohe
Keimbelastung vorherrscht. Dieses Phänomen kann durch aminabbauende Mikroorganismen
erklärt werden (BEUTLING 1987).
Frischfleisch enthält Spermin (BLACHIER 1991), ist aber im Gegensatz zu Fleischerzeugnissen
arm an biogenen Aminen. Auch in Weinen, Bier, Sauerkraut, Früchten und Gemüsen sind
Amine in den unterschiedlichsten Mengen enthalten (ASKAR et al. 1996). Früchte, Gemüse,
die kein Chlorophyll enthalten, sowie Käse stellen die Hauptquelle für Putrescin dar.
Spermidin ist vor allem in chlorophyllhaltigem Gemüse enthalten (BLACHIER 1991).
Auch in Milch und ihren Verarbeitungsprodukten sind Amine nachweisbar. Während der
Reifung von Käse entstehen aus freien Aminosäuren durch die Wirkung mikrobieller
41

Literaturübersicht
Decarboxylasen biogene Amine wie Tyramin, Tryptamin, Phenylethylamin, Cadaverin und
Putrescin. Die Gehalte steigen mit dem Alter des Käses an (ASKAR u. TREPTOW 1986).
Untersuchungen zum Amingehalt in Kuh- (MOTYL et al. 1995; SANGUANSERMSRI 1974) und
Sauenmilch zeigten, dass Spermin mit Konzentrationen von 5,16 µmol/l in der 5.
Laktationswoche bis zu 21,6 µmol/l in der 1. Laktationswoche das vorherrschende Polyamin
in der Sauenmilch ist (MOTYL et al. 1995). In Kuhmilch hingegen lagen die Werte für
Spermidin in den meisten Fällen über der Sperminkonzentration. Frühere Untersuchungen
(KELLY et al. 1991 a) über die Aminkonzentrationen in Sauenmilch der 1. bis 8.
Laktationswoche führten zu der Aussage, dass sich der Spermidingehalt in den ersten 3-4
Laktationswochen konstant verhält und dann bis zur 7. Woche auf die vierfache
Konzentration (~ 20 µmol/l) ansteigt. Spermin und Putrescin konnten in diesen Milchproben
nicht nachgewiesen werden. Frauenmilch enthält hauptsächlich Spermidin und Spermin, die
Putrescinkonzentrationen sind jedoch deutlich geringer als die Spermidin- und
Sperminkonzentrationen. Auch Rattenmilch enthält ähnlich hohe Putrescin- und
Sperminkonzentrationen wie Frauenmilch, während der Spermidingehalt um ein Vielfaches
höher ist (POLLAK et al. 1992). Der signifikante Anstieg der Aminkonzentration in der ersten
Woche post partum beim Menschen könnte ein Hinweis auf die biologische Wichtigkeit der
Polyamine für das Neugeborene sein. Auch bei anderen Spezies kann dieses Phänomen
beobachtet werden. So geht beispielsweise die Zunahme des Spermidingehaltes der
Sauenmilch mit einer Erhöhung des mukosalen RNA-Gehaltes, höheren intestinalen
Spermidinkonzentrationen und einer verstärkten Aktivität der Disaccharidase Maltase beim
Ferkel einher (BUTS et al. 1995).
2.2.6 Intoxikationen durch biogene Amine
Histamin steht an erster Stelle bei Lebensmittelintoxikationen durch Amine. Durch die
Aufnahme histaminhaltiger Nahrungsmittel kann bereits nach kurzer Inkubationszeit von 30
Minuten eine Histaminintoxikation auftreten. Die Symptome sind sehr variabel, wobei
sowohl Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, Hautrötung, Durchfall als auch Störungen des
Sensoriums sowie Schwindelgefühl und Blutdruckabfall vorkommen können. Das
42

Literaturübersicht
Erkrankungsbild wird am häufigsten durch Fisch und Fischerzeugnisse ausgelöst und wird
deshalb auch als „Scombroid fish poisoning“ bezeichnet (BEUTLING 1996).
Durch die Aufnahme von Tyramin können ebenfalls Blutdruckkrisen entstehen. Da die
toxische Dosis mit 25-250 mg jedoch relativ hoch liegt, wird es von gesunden Menschen
meist gut vertragen (BEUTLING 1996). Auch andere Amine wie Cadaverin, Tryptamin und
Ethylamin u. a. können Störungen verursachen, sie scheinen aber weniger toxisch zu sein
(ASKAR u. TREPTOW 1986). Ihnen kommt jedoch Bedeutung zu, wenn sie gemeinsam mit
anderen Aminen auftreten und deren Wirkung verstärken. Putrescin und Cadaverin
beispielsweise hemmen den Abbau von Histamin und können damit seine negative Wirkung
steigern (BEUTLING 1996).
2.2.7 Physiologische Effekte der Amine
2.2.7.1 Exogene Aminzufuhr und Amine aus de novo Synthese
Alle Organe eines Organismus benötigen Polyamine für das Wachstum, die Erneuerung von
Zellen und ihren Stoffwechsel. Lange Zeit wurde angenommen, dass Zellen ihren
Polyaminbedarf durch die Eigensynthese abdecken. Die Konzentrationen von Polyaminen in
Körperflüssigkeiten befinden sich im Bereich von pmol/ml und sind somit sehr gering. Nur
die Samenflüssigkeit ist reich an Polyaminen. Heute ist bekannt, dass Polyamine exogener
Herkunft somit von großer Bedeutung für den Organismus sind (BARDOCZ 1993).
Je nach Herkunft werden Polyamine exogenen Ursprungs und aus de novo Synthese
unterschieden. Exogene Quellen stellen die Nahrung, das Blut, exokrines Pankreassekret
(BUTS et al. 1995; OSBORNE u. SEIDEL 1990) und die Mikroorganismen des Darmtraktes dar
(BLACHIER 1991). Außerdem können bei der Lyse abgeschilferter Enterozyten Polyamine
freigesetzt werden (MCCORMACK u. JOHNSON 1991). Folglich kann der Polyaminpool in der
Darmzelle einerseits durch exogene Polyamine aus dem Darmlumen (apikal) und andererseits
über die basolaterale Membran aus dem zirkulierenden Blut (basolateral) aufgefüllt werden
(BARDOCZ 1993). Für die Homöostasis des Polyaminhaushaltes muss der Organismus seinen
Polyaminbedarf durch Absorption aus dem Darmlumen decken (BARDOCZ 1993).
43

Literaturübersicht
Nach M´RABET et al. (1995) stellen exogene Polyamine bei Ferkeln die Hauptquelle für den
intrazellulären Polyaminpool von Enterozyten dar. Ihren Untersuchungen zufolge unterliegt
die Aufnahme von Polyaminen in die Darmzelle (apikal und basolateral) folgender
Hierarchie: Es dominiert die Resorption von Spermin, es folgt Spermidin und an letzter Stelle
steht die Putrescinaufnahme. Dies entspricht auch dem Muster der intrazellulären
Polyaminkonzentrationen dieser Amine.
Positiv geladene Metallionen wie Mg 2+ oder Ca 2+ können die Wirkung von Polyaminen in
nicht-spezifischen Reaktionen ersetzen. Andere Funktionen sind für die Polyamine spezifisch
und können durch andere Polykationen nicht hervorgerufen werden. Deshalb sind Polyamine
für das Wachstum und die Proliferation von Zellen essentiell (BARDOCZ 1993).
2.2.7.2 Polyamine und ihre Effekte am Darm
Die Wirkung von Polyaminen am Intestinaltrakt wurde sowohl an säugenden als auch bei
abgesetzten Tieren untersucht. Bei Neonaten spielen Polyamine eine wichtige Rolle in der
Entwicklung des Intestinaltraktes. In der Literatur existieren mehrere Studien über die Effekte
einer exogenen Polyaminzufuhr, diese Untersuchungen wurden größtenteils in vivo an Ratten
oder in vitro durchgeführt.
Untersuchungen in vivo:
Die Polyaminsynthese ist essentiell für den Zellturnover der intestinalen Mukosa. Wird die
Aktivität der ODC durch DFMO gehemmt, sinkt der DNA-, RNA- und Proteingehalt in der
Mukosa des Jejunums und Ileums von Ratten stark ab. Exogenes Spermin und Spermidin
können dies jedoch verhindern, indem sie intrazellulär gebildete Amine ersetzen (WANG et al.
1991).
DUFOUR et al. (1988) befaßten sich mit der Wirkung einer Spermin- bzw.
Spermidinapplikation bei 15 Tage alten Ratten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivität der
Bürstensaummembranenzyme Maltase und Saccharase in beiden Fällen anstieg, während die
Laktaseaktivität abnahm. Auch die Morphologie des Intestinums deutete auf einen
Reifungsprozess hin. Die Villusenterozyten der Kontrollgruppe wiesen als Zeichen der
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Literaturübersicht
Unreife noch supranucleäre Vakuolen auf, die im Falle der polyaminbehandelten Tiere nicht
mehr vorhanden waren. Vergleichbare Ergebnisse stammen von WILD et al. (1993), die in
ihren Untersuchungen über eine Sperminverabreichung an junge Ratten ebenfalls eine
Veränderung der intestinalen Enzymaktivitäten nachweisen konnten, die mehr dem
Enzymmuster adulter Tiere entsprachen.
Ähnliche Beobachtungen wurden von KAOUASS et al. (1996) mitgeteilt. Eine orale
Sperminapplikation bei säugenden Rattenjungtieren führte zur Veränderung morphologischer
und biochemischer Parameter im Dünndarm. An der Villusspitze trat vermehrt eine
Zellabschilferung auf, während der intestinale DNA- und Proteingehalt sank. Dies führte
dazu, dass der DNA- und Proteingehalt sowie die Disaccharidaseaktivität im Chymus erhöht
waren. Nur wenige Stunden nach der Sperminapplikation kam es zu einer Verminderung der
Laktaseaktivität im Jejunum und Ileum, während die Aktivität der Enzyme Maltase und
Saccharase anstieg.
Auch BUTS et al. (1993) analysierten die Wirkung von oral zugeführtem Spermin auf die
Entwicklung des Dünndarmes bei 2 Wochen alten, säugenden Ratten. Spermin in einer Dosis
>1 µmol/d bedingte einen Anstieg der Maltase, Saccharase und einer Aminopeptidase in den
Enterozyten, während eine frühzeitige Abnahme der Laktaseaktivität zu beobachten war.
Über eine dosisabhängige Korrelation zwischen einer Spermingabe und der intestinalen
Disaccharidaseaktivität berichten auch HARADA et al. (1994). Bei Rattenjungtieren trat eine
Verminderung der Laktaseaktivität bei gleichzeitigem Anstieg der Maltaseaktivität auf. Auch
die Absorption von exogen zugesetztem bovinen IgG war bei den sperminbehandelten Tieren
vermindert, was für eine frühzeitige Ausbildung der Barrierefunktion des Darmes spricht.
Weitere Ergebnisse von CAPANO et al. (1994) belegen, dass an Ratten verabreichtes
Spermidin die Aktivität des Enzyms Saccharase erhöht und zu morphologischen
Veränderungen im distalen Dünndarm, wie z.B. das Verschwinden supranukleärer Vakuolen,
führt.
DORHOUT et al. (1997) befaßten sich mit der Verteilung von oral zugeführten, radioaktiv
markierten Polyaminen im Organismus. Die Ergebnisse zeigen, dass Polyamine nicht nur im
45

Literaturübersicht
Darm, sondern auch in sämtlichen untersuchten Organen (Herz, Leber, Milz, Gehirn)
nachzuweisen waren. SEIDEL et al. (1985) infundierten Putrescin in das Lumen des Ileums
von Ratten, wodurch in diesem Darmabschnitt lokal begrenztes verstärktes Mukosawachstum
auftrat. Die Autoren stellten jedoch keine Veränderung im Polyamingehalt der proliferierten
Mukosa fest und werteten dieses als ein Indiz für die empfindliche Regulation der
Polyaminkonzentration innerhalb der Zelle.
In einem Versuchsansatz mit Ratten erfassten NOACK et al. (1996) die Auswirkungen einer
polyaminarmen und einer polyaminreichen Diät auf den endogenen Polyamingehalt und die
mikrobielle Polyaminsynthese im Intestinaltrakt. Demnach ist Putrescin das am stärksten
endogen gebildete Polyamin des Colongewebes, unabhängig von dem Polyamingehalt der
Nahrung. Bei Ratten, die über einen keimfreien Intestinaltrakt verfügten, war Putrescin das
vorherrschende Polyamin in den Faeces. Unabhängig vom Polyamingehalt der Nahrung
wurden hohe Spermidinkonzentrationen im Darminhalt konventioneller Ratten nachgewiesen.
Die Autoren gehen davon aus, dass es sich hierbei hauptsächlich um mikrobiell gebildetes
Spermidin handelt.
Untersuchungen über die Wirkung von Streß bei Ratten zeigten, dass aufgrund einer
Streßbelastung Schädigungen der intestinalen Mukosa auftreten und ein Anstieg der ODC zu
verzeichnen ist (WANG u. JOHNSON 1989). Wird die endogene Polyaminsynthese durch
DFMO gehemmt, fördert exogenes Spermin und Spermidin die Heilung solcher
Mikroulzerationen mehr als Putrescin (WANG u. JOHNSON 1992). Auch hier wird deutlich,
dass exogene Polyamine die endogen gebildeten Polyamine ersetzen können.
Der Einfluß von Polyaminen aus der Nahrung bzw. mikrobiellen oder intrazellulären
Ursprungs auf intestinale Funktionen wurde ebenfalls eingehend von DELOYER et al. (1996)
untersucht. Die Autoren testeten sowohl den Einfluß einer Polyaminrestriktion in der
Nahrung als auch die Wirkung verschiedener Inhibitoren der Polyaminsynthese. Die
Ergebnisse zeigten, dass der Entzug mikrobieller Polyamine bzw. von Polyaminen aus der
Nahrung nur in Verbindung mit dem Einsatz von Syntheseinhibitoren zu deutlichen
Veränderungen intestinaler Funktionen führt. OSBORNE und SEIDEL (1990) gelang es, anhand
von Versuchen mit Ratten einen enterohepatischen Kreislauf für Putrescin nachzuweisen.
46

Literaturübersicht
Luminales Putrescin gelangte aus dem Colon über die Blutbahn in die Leber sowie in die
Bauchspeicheldrüse und wurde von dort mit der Galle und dem Pankreassekret wieder in das
Duodenum sezerniert. Dies lässt vermuten, dass die im proximalen Dünndarm nachweisbaren
Polyamine hauptsächlich von der Mikroflora des Dickdarmes gebildet wurden und über den
enterohepatischen Kreislauf die proximalen Darmabschnitte erreichten. Die geringe Aktivität
der ODC in den proximalen Dünndarmabschnitten unterstützt diese Vermutung.
Untersuchungen in vitro:
Der Einfluß von exogen zugeführtem Putrescin auf Darmepithelzellkulturen wurde von
GINTY et al. (1989) untersucht. Die Autoren stellten fest, dass Putrescin die DNA-, RNA- und
Proteinsynthese in der Zellkultur steigert.
Der Polyamingehalt isolierter Enterozyten neugeborener Ferkel wurde von BLACHIER et al.
(1992) erfaßt. Spermin war hierbei das vorherrschende Amin. Die Aktivität der ODC lag zum
Zeitpunkt der Geburt deutlich höher als am Tag 2 post natum. Entgegen den Erwartungen
wurde bei Ferkeln trotz der in dieser Phase typisch hohen Wachstumsrate der Mukosa keine
gesteigerte ODC-Aktivität festgestellt. Die Vermutung, dass die ODC-Enzymaktivität
aufgrund eines vermehrten Angebotes an exogenen Polyaminen durch die Aufnahme der
Sauenmilch mit Beginn des Säugens absinkt, hat sich durch Untersuchungen an Tieren, denen
nach der Geburt keine Nahrung angeboten wurde, nicht bestätigt. Trotzdem scheint die
Hauptfraktion der Polyamine in den Enterozyten externen Ursprungs zu sein und wird nicht
durch de novo Synthese gebildet.
JOHNSON et al. (1995) konnten nachweisen, dass die Hemmung der intestinalen
Polyaminsynthese durch DFMO die maximale Transportrate von D-Glucose in Enterozyten
von Kaninchen vermindert. Die gleichzeitige orale Verabreichung von Putrescin, Spermidin
oder Spermin hemmt diesen Effekt und unterstützt somit die Vermutung, dass exogene
Polyamine solche aus einer de novo Synthese in der Zelle ersetzen können.
47

Literaturübersicht
2.3 Purin- und Pyrimidinnukleotide
Nukleotide sind Bausteine der Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA)
und deshalb essentiell für Zellen, die sich in Teilung befinden. Wie auch die Polyamine
stellen sie wichtige Metabolite für Zellen dar und sind in vielfältiger Weise in strukturelle,
metabolische, energetische und regulatorische Funktionen eingebunden, wie z.B. als Co-
Faktoren von Enzymen oder als Energieträger (RUDOLPH 1994 a).
2.3.1 Struktur der Nukleotide
Nukleotide bestehen aus einer stickstoffhaltigen heterocyklischen Purin- oder Pyrimidinbase,
einer Pentose (D-Ribose oder 2´-Desoxyribose) und anorganischem Phosphat. Verbindungen,
die nur aus einer Purin- oder Pyrimidinbase und einer Pentose bestehen, werden als
Nukleoside bezeichnet. Nukleoside mit einem Phosphatrest werden als Mononukleotide
(Nukleosidmonophosphat), solche mit zwei oder drei Phosphatresten als Nukleosiddi- bzw.
triphosphat definiert (BUDDECKE 1989). Nukleotide, die D-Ribose enthalten, dienen als
Baustein der RNA. Für die Synthese der DNA werden Nukleotide mit 2´-Desoxyribose
verwendet. Zu den Purinbasen gehören Adenin, Guanin, Hypoxanthin und Xanthin, während
Thymin, Cytosin und Uracil den Pyrimidinbasen zugeordnet werden (RUDOLPH 1994 a).
2.3.2 Biosynthese der Nukleotide
Es bestehen zwei Möglichkeiten der Biosynthese von Nukleotiden (LELEIKO u. WALSH 1995):
- De novo Synthese, hauptsächlich aus den Vorstufen Glutamin, Glycin und
Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP).
- „Salvage pathway“, wobei entweder Nukleoside oder Basen aus bereits in der Zelle
vorhanden Nukleotiden, oder aber aus Nukleotiden, die in der Nahrung enthalten sind, für
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Literaturübersicht
die Resynthese von Nukleinsäuren verwendet werden. Auch Purinnukleotide, die aus
abgestoßenen Darmzellen freigesetzt werden, können wiederverwertet werden.
Die entstehenden Mononukleotide werden umgehend in Nukleosiddi- oder -triphosphate
umgewandelt, weshalb die Nukleosidtriphosphatkonzentration höher ist als die der Monound
Nukleosiddiphosphate (RUDOLPH 1994 a). Durch sukzessive Anlagerung kleinster
Molekülgruppen, die hauptsächlich aus dem Aminosäurestoffwechsel stammen, an Ribose-5-
Phosphat entsteht das Mononukleotid Inosin-5-phosphat (IMP). Über weitere
Syntheseschritte (s. Abb. 4) wird Adenosin-5-phosphat (AMP) bzw. Guanosin-5-phosphat
(GMP) gebildet (BUDDECKE 1989).
Ribose-5´-phosphat
Inosin-5´-phosphat (IMP)
Adenosin-5´-phosphat
Guanosin-5´-phosphat (GMP)
Abb. 4: Schema zur Purinnukleotidbiosynthese (modifiziert nach BUDDECKE 1989)
49

Literaturübersicht
Ursprünglich wurde angenommen, dass ein Organismus in der Lage ist, den für Wachstum
und Entwicklung notwendigen Nukleotidpool durch de novo Synthese aufrecht zu erhalten
(YAMAMOTO et al. 1997) und somit die in der Nahrung enthaltenen Nukleotide nicht genutzt
werden (RUDOLPH 1994 b). Jetzt ist bekannt, dass z.B. Leberzellen, wenn Nukleotide aus der
Nahrung zur Verfügung stehen, einerseits Purin- und Pyrimidinbasen über den „salvage
pathway“ wiederverwerten können, während bei einem Nukleotiddefizit in der Nahrung die
de novo Synthese dieser Substanzen einsetzt (UAUY 1994). Darmepithelzellen hingegen
besitzen nur eine begrenzte Fähigkeit zur de novo Synthese von Purinnukleotiden
(MACKINNON u. DELLER 1973). Ebenso wie die intestinale Mukosa verfügen auch das
Knochenmark, die hämatopoetischen Stammzellen und das Gehirn über eine begrenzte
Kapazität zur de novo Synthese von Nukleotiden und Nukleosiden. Sie sind deshalb auf die
Wiederverwertung von Nukleotiden oder Basen über den „salvage pathway“ angewiesen
(YAMAMOTO et al. 1997).
Offensichtlich besitzen Nukleotide exogener Herkunft (z.B. aus der Nahrung) eine große
Bedeutung für die Optimierung der Funktionsfähigkeit von Geweben, vor allem weil durch
ihre Nutzung die energieaufwendige de novo Synthese oder eine Wiederverwertung über den
„salvage pathway“ eingeschränkt werden kann (CARVER 1994).
2.3.3 Abbau der Nukleotide
Urat (Salz der Harnsäure) ist das Endprodukt des Purinkatabolismus beim Menschen und
höheren Primaten, während andere Säugetiere (mit Ausnahme des Dalmatiners) Urat mit
Hilfe der Uricase weiter zu Allantoin abbauen. Die Bildung des Urats findet vorrangig in der
Leber statt; die Ausscheidung erfolgt über die Niere durch die aktive Exkretion im
Tubulussystem. Eine vermehrte Purinsynthese oder eine beeinträchtigte renale Ausscheidung
kann zur Gichterkrankung führen. Hierbei treten aufgrund der schweren Löslichkeit der
Harnsäure Ablagerungen von Natrium-Monouratkristallen in den Gelenken auf, die zu
schmerzhaften Entzündungen führen können. Darüber hinaus kann es zur Bildung von
Nierensteinen kommen (BUDDECKE 1989).
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Literaturübersicht
Die Endprodukte des Pyrimidinabbaues sind β-Alanin und β-Aminoisobutyrat, beide
Substanzen sind gut löslich und werden leicht ausgeschieden (RUDOLPH 1994 a).
2.3.4 Vorkommen der Nukleotide
Nukleotide kommen in hoher Konzentration im menschlichen Kolostrum sowie in der
Muttermilch vor und sind für die Ernährung Neugeborener notwendig (BARNESS 1994). GIL
und SANCHEZ-MEDINA (1981) bestimmten die Nukleotidgehalte in der Milch von
Wiederkäuern (Kuh, Ziege, Schaf) und in menschlicher Muttermilch (GIL u. SANCHEZ-
MEDINA 1982). Guanosin-5-phosphat (GMP) konnte nur in Schaf- (3,4-34,6 µmol/l) und
Humanmilch (3,2-5,0 µmol/l) nachgewiesen werden, während Adenosin-5-phosphat (AMP),
Cytidin-5-phosphat (CMP) und Uridin-5-phosphat (UMP) in allen Proben enthalten war. Im
Vergleich zu Muttermilch anderer Spezies stellen Adenin- und Cytidinderivate den
Hauptanteil des Gesamtnukleotidgehaltes in menschlicher Muttermilch dar. Höhere
Nukleotidkonzentrationen im Anfangsstadium der Laktation (CARVER u. WALKER 1995)
könnten ein Hinweis auf die biologische Bedeutung der Nukleotide für das Neugeborene sein.
In Tab. 1 sind Nukleotidgehalte des Kolostrums verschiedener Spezies dargestellt.
Tab. 1: Nukleotidgehalt im Kolostrum verschiedener Spezies; Angaben in µmol/l
CMP AMP GMP UMP
Humanmilch 55,1 33,4 3,3 17,7
Kuhmilch 52,5 61,8 - 390,0
Ziegenmilch 64,5 47,0 - 537,7
Schafmilch 327,5 297,3 34,6 1133,0
Quelle: GIL und SANCHEZ-MEDINA (1981 und 1982)
Lebensmittel oder Nährstoffe mit zellulären Komponenten enthalten Nukleotide, die meist an
Proteine gebunden vorliegen (CARVER u. WALKER 1995). Innereien, Fisch und Leguminosen
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Literaturübersicht
(Erbsen, Bohnen, Linsen) sind besonders purinreich (CLIFFORD u. STORY 1976; KOJIMA
1974). GMP kommt in höheren Konzentrationen in Hefeextrakten und Shiitakepilzen vor,
während IMP vor allem in frischem Fisch und Fleisch enthalten ist. Früchte enthalten geringe
Nukleotidkonzentrationen (KOJIMA 1974). In Tab. 2 sind Puringehalte verschiedener
Lebensmittel dargestellt.
Tab. 2: Puringehalte verschiedener Lebensmittel; Angaben in mg/100 g Frischsubstanz
Puringehalt
Leber
Herz
Fisch
(frisch)
Fisch
(Konserve)
Leguminosen
Rind
Schwein
Huhn
Schaf
Rind
Huhn
Schaf
Lachs
Sardinen
Lachs
Sardinen
Bohnen
Linsen
Erbsen
197
289
243
147
171
223
171
250
345
88
399
56 – 213
222
195 - 230
Weizenmehl 19
Reis 29
Kartoffeln 8
Quelle: CLIFFORD und STORY (1976) und KOJIMA (1974)
52

Literaturübersicht
2.3.5 Nukleotide und ihre Effekte auf Zellen und Gewebe
Verschiedene Studien über die Effekte einer exogenen Nukleotidzufuhr sind in der Literatur
beschrieben, wobei sowohl Untersuchungen in vivo (vorrangig an Ratten) als auch in vitro
durchgeführt wurden:
Untersuchungen in vivo:
Ein Nukleotiddefizit in der Nahrung verminderte die spezifische Aktivität von Enzymen der
Bürstensaummembran (Alkalische Phosphatase, Leucinaminopeptidase, Maltase, Laktase und
Saccharase) von Ratten (ORTEGA et al. 1995). Die Autoren leiten daraus einen deutlichen
Zusammenhang zwischen der Nukleotidzufuhr aus der Nahrung und der Ausreifung des
Dünndarmepithels ab.
Die Wirkung einer ausschließlich parenteralen Ernährung sowie einer parenteralen Nukleotidund
Nukleosidzufuhr auf die Enzymaktivitäten der Darmenterozyten wurden von IIJIMA et al.
(1995) an Ratten untersucht, und zwar nach einer Resektion von 80 % des gesamten
Dünndarmes. Während sich die Enzymaktivitäten der Bürstensaummembran nicht signifikant
veränderten, stieg die intestinale Zellturnover-Rate und die mukosale Atrophie wurde
abgeschwächt. Für die nachhaltige Beeinflussung der mukosalen Funktion scheint die
intraluminale Präsenz der Nukleotide von großer Bedeutung zu sein.
BUENO et al. (1994) berichten über die positiven Wirkungen einer mit AMP, GMP, IMP,
CMP und UMP angereicherten Diät auf intestinale Reparationsprozesse nach chronischer
Diarrhoe. Während bei Ratten, die eine nukleotidarme Diät erhielten, histologisch eine
Reduktion des Mikrovillisaumes der Enterozyten nachzuweisen war und signifikante
intraepitheliale Lymphozyteninfiltrationen am Intestinum auftraten, konnten diese
Veränderungen der intestinalen Struktur bei der Nukleotidgruppe weitgehend verhindert
werden. Jedoch scheint der Nutzen der Purin- oder Pyrimidinnukleotide von ihrer Dosis und
vom Grad einer bereits bestehenden Schädigung des Darmes abhängig zu sein. Die Aufnahme
von Nukleotiden bzw. Nukleosiden mit der Nahrung und deren Wirkung am Darm ist nicht
53

Literaturübersicht
grundsätzlich von Vorteil. Durch 3-Nitrobenzolsulfonsäure induzierte Schäden der
Kolonschleimhaut waren bei den Tieren, die eine nukleotid- und nukleosidfreie Diät
erhielten, deutlich geringer (ADJEI et al. 1996). Dieses Ergebnis führte die Autoren zu der
Hypothese, dass eine zu hohe Nukleotid- bzw. Nukleosidzufuhr zu
Überempfindlichkeitsreaktionen führen kann, die deren ansonsten positive Wirkung
verhindert.
Neuere Studien zeigen, dass die Nukleotidversorgung eines Organismus dessen Immunstatus
beeinflussen kann. Durch die Anreicherung von menschlicher Milch oder Säuglingsnahrung
mit Nukleotiden kam es bei den untersuchten Säuglingen zu einer signifikant höheren
Antikörperbildung nach Immunisierung gegen Haemophilus influenca im
Untersuchungszeitraum vom 6. bis 12. Lebensmonat (PICKERING et al. 1998).
Untersuchungen in vitro:
Studien von HE et al. (1993) an einer humanen Darmkrebszellinie (CaCo-2) und an IEC-6
(Kryptenzellinie von Ratten) hinsichtlich der Wirkung einer exogenen Nukleotidzufuhr auf
die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen zeigten, dass ein signifikanter Anstieg der
Zellproliferation und –differenzierung zu verzeichnen war. Als Differenzierungsmarker
dienten hierbei die Enzymaktivitäten der alkalischen Phosphatase und der Saccharase. Dabei
wurde deutlich, dass Enterozyten auf die exogene Zufuhr von Nukleotiden angewiesen sind,
um ihr Funktionspotential optimal ausschöpfen zu können (SANDERSON u. HE 1994). Im
Gegensatz dazu unterscheiden TANAKA et al. (1995) zwischen der Wirkungsweise der
einzelnen Nukleotide. Sie vertreten die These, dass AMP vermehrt die Differenzierung von
Darmepithelzellen fördert, während andere Nukleotide hauptsächlich die Proliferation der
Kryptenzellen verstärken.
54

Literaturübersicht
2.4 Analytik der Amine mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
2.4.1 Prinzip der HPLC
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography;
HPLC) ermöglicht die Analyse löslicher fester und flüssiger Substanzgemische. Hierzu
werden zwei verschiedene Phasen, die stationäre und die mobile Phase, benötigt. Die
Probenkomponenten werden in der mobilen Phase durch eine Trennsäule, in der sich die
stationäre Phase befindet, transportiert. Aufgrund von Wechselwirkungen (physikalische und
chemische Adsorption, z. B. van-der-Waals´sche Kräfte; Dipol-Dipol-Wechselwirkungen)
(SCHWEDT 1994) mit der stationären Phase werden die Moleküle von dieser unterschiedlich
lang zurückgehalten. Hierdurch erfolgt eine Separierung der einzelnen Komponenten, welche
die Säule anschließend räumlich und zeitlich voneinander getrennt verlassen. Die Substanzen
des Probengemisches können dann von einem Detektor aufgrund bestimmter physikalischer
oder chemischer Eigenschaften erfaßt werden. Durch die HPLC ist es möglich, komplexe
Substanzgemische zu trennen und Stoffkomponenten qualitativ oder quantitativ mit Hilfe von
geeigneten Detektoren zu bestimmen (ACED u. MÖCKEL 1991).
2.4.2 HPLC-Verfahren mit chemischer Derivatisierung
Methoden mit chemischer Derivatisierung werden in der Chromatographie benutzt, um
Nachweisgrenzen abzusenken und um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. In einigen
Fällen wird die Derivatisierung auch eingesetzt, um die zu bestimmenden Substanzen
überhaupt erst chromatographier- und detektierbar zu machen (KIRSCHBAUM 1995). Nicht
derivatisierte Amine können mit Hilfe der Ionenaustauschchromatographie oder der
Ionenpaarchromatographie getrennt werden. Nur wenige heteroaromatische Amine und
Aminosäuren sind so hydrophob, dass sie underivatisiert an Reversed-Phase-Materialien
(Umkehrphasenchromatographie, RP-Materialien) chromatographiert werden können (HURST
55

Literaturübersicht
u. TOOMEY 1981). Durch die Derivatisierung kann auch eine Steigerung der Hydrophobizität
der Aminoverbindungen erreicht werden (KIRSCHBAUM 1995), wodurch ihre Trennung
erleichtert wird.
Die Detektion von Aminen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Anhand ihrer UV-
Absorption lassen sich Imidazol-, Benzol-, Phenol-, Catechol- und Indolamine u. a. in
underivatisierter Form erfassen (SCHOLLENBERGER 1993). Neben der UV-Detektion bietet die
Messung der natürlichen Fluoreszenz eine weitere Möglichkeit zur Detektion bestimmter
Amine. SCHOLLENBERGER (1993) berichtet über eine natürliche Fluoreszenz bei Phenol-,
Catechol- und Indolaminen. Auch aromatische oder heterocyclische Amine wie 2-
Phenylethylamin, Tyramin, Tryptamin und Serotonin besitzen eine natürliche Fluoreszenz
oder UV-Absorption (HURST u. TOOMEY 1981). Aliphatische Mono-, Di- und Polyamine
verfügen jedoch nicht über funktionelle Gruppen, die ihre empfindliche und spezifische
Detektion ermöglichen würden (SCHOLLENBERGER 1993). Deshalb muss vor ihrer Detektion
eine chemische Derivatisierung durchgeführt werden, durch die eine Fluoreszenz- oder
Absorptionsfähigkeit auf die zu bestimmenden Substanzen übertragen wird (KIRSCHBAUM
1995).
Es gibt grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren zur chemischen Derivatisierung von
Aminen. Bei der Nachsäulenderivatisierung (post-column derivatization) erfolgt die
chromatographische Trennung der noch underivatisierten Amine und anschließend findet die
Derivatisierung statt. Im Gegensatz zur Nachsäulen- wird bei der Vorsäulenderivatisierung
(pre-column derivatization) die chromatographische Trennung der bereits derivatisierten
Amine durchgeführt (KIRSCHBAUM 1995).
56

Literaturübersicht
2.4.2.1 Methoden zur Vorsäulenderivatisierung
2.4.2.1.1 Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethylchloroformiat (FMOC-Cl)
CARPINO und HAN (1972) verwendeten FMOC-Cl ursprünglich zum Schutz von
Aminogruppen bei der Synthese von Peptiden. Im Jahr 1983 setzten EINARSSON et al. (1983)
FMOC-Cl erstmals zur Analyse von Aminosäuren ein.
9-Fluorenylmethylchloroformiat reagiert schnell und vollständig sowohl mit primären als
auch mit sekundären Aminogruppen zu stabilen, fluoreszierenden Carbamaten. Die Reaktion,
bei der HCl abgespalten wird, läuft im leicht alkalischen Milieu innerhalb von 30 Sekunden
bis drei Minuten ab (KIRSCHBAUM u. LUCKAS 1994; GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990; BETNÉR u.
FÖLDI 1986). HARDUF et al. (1988) und BETNÉR und FÖLDI (1988) berichten über die gute
Stabilität der entstehenden Derivate. Auch EINARSSON et al. (1983) zeigten, dass die
Derivatisierungsprodukte von zwanzig untersuchten Aminosäuren eine hohe Stabilität
aufweisen, mit Ausnahme des Derivatisierungsproduktes von Histidin. Des Weiteren ist die
hohe Empfindlichkeit der Methode mit einer Nachweisgrenze im femtomolaren Bereich von
großem Vorteil (GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990; BETNÉR u. FÖLDI 1988; COHEN u. STRYDOM
1988; EINARSSON et al. 1983). Deshalb ist diese Reaktion gut für die Vorsäulenderivatisierung
von Aminoverbindungen geeignet (KIRSCHBAUM 1995).
Im Gegensatz zu ortho-Phtaldialdehyd (OPA) und Dansylchlorid ist FMOC-Cl selbst
fluoreszierend. Um eine quantitative Reaktion zu ermöglichen, muss es im Überschuß
eingesetzt werden (BETNÉR u. FÖLDI 1988). Überschüssiges FMOC-Cl und fluoreszierende
Nebenprodukte dürfen die Analyse der fluoreszierenden Aminderivate nicht durch Koelution
stören. Da jedoch die derivatisierten Aminosäuren und das FMOC-Cl-Reagenz annähernd
übereinstimmende Excitations- und Emissionsspektren sowie auch übereinstimmende
Retentionszeiten aufweisen (GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990), muss das unverbrauchte FMOC-
Cl nach dem Derivatisierungsvorgang wieder entfernt werden (FÜRST et al. 1990; COHEN u.
STRYDOM 1988; SCHUSTER 1988). Die Extraktion des Überschusses mit Pentan (EINARSSON et
al. 1983) zeigte keine ausreichende Reproduzierbarkeit (HAYNES et al. 1991 b; GUSTAVSON u.
BETNÉR 1990), da hydrophobe Aminosäuren zu einem großen Anteil mitextrahiert werden.
57

Literaturübersicht
Andere Autoren (BETNÉR u. FÖLDI 1988) versuchten, den FMOC-CL-Überschuß mit 1-
Aminoadamantan (ADAM) zu entfernen, indem es nach der Aminosäurenderivatisierung dem
Derivatisierungsansatz zugegeben wird. Das hierbei entstehende Derivat eluiert deutlich nach
den derivatisierten Aminosäuren und stört daher deren Bestimmung nicht. HAYNES et al.
(1991 a) beschrieb eine Methode zur Analyse von Aminosäuren, bei der eine Extraktion von
überschüssigem FMOC-Cl nach dem Derivatisierungsvorgang nicht notwendig ist.
Bei der Untersuchung von Aminen in Lebensmitteln wurde FMOC-Cl ebenfalls angewendet
(SCHEUER u. RÖDEL 1995; KIRSCHBAUM et al. 1994), wobei HARDUF et al. (1988) eine
Reaktion von Histamin mit FMOC-Cl weder in Fleischextrakten, denen Histamin zugesetzt
wurde, noch in Standard-Lösungen nachweisen konnte. Verschiedene Aminoverbindungen
(Diaminohexan, Diaminoheptan, Diaminooktan, Diaminononan, Heptylamin und
Methylamin) wurden von KIRSCHBAUM (1995) hinsichtlich ihrer Eignung zur Entfernung des
FMOC-Cl-Überschusses untersucht. Die besten Resultate lieferte die Verwendung von
Heptylamin, da hierbei keinerlei Koelution mit den FMOC-Derivaten der untersuchten
biogenen Amine auftrat. MAIER-ROSENKRANZ (1995) setzte die polare Aminosäure Glycin
zur Entfernung des FMOC-Cl-Überschusses ein, da diese wesentlich früher als die
Aminderivate eluiert. Glycin wird auch in der Methode von PIETRZAK (1997) zur Bestimmung
von Aminen in Kot- und Chymusproben von Hunden angewendet, welche die Grundlage der
im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Aminanalytik darstellt.
2.4.2.1.2 Vorsäulenderivatisierung mit 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid
(Dansyl-Cl)
5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid (Dansyl-Cl) reagiert mit primären und
sekundären Aminen unter Abspaltung von Salzsäure zu Dansylderivaten. Auch mit Phenolen,
Imidazolen, Alkoholen und Kohlenhydraten kann Dansyl-Cl Derivate bilden (KOTZABASIS et
al. 1993; HAYMAN et al. 1985; SEILER 1977). Dansyl-Derivate sind sehr stabil. Nach BROSSAT
et al. (1983) sind die Derivate bei Aufbewahrung im Dunkeln und einer
Umgebungstemperatur von 4 °C bis zu einer Woche stabil. Aufgrund ihrer ausgeprägten
Fluoreszenz sind Dansyl-Cl Derivate mit hoher Empfindlichkeit detektierbar (KIRSCHBAUM
1995; KOTZABASIS et al. 1993). MARCÉ et al. (1995) bestimmten die Polyamingehalte in
58

Literaturübersicht
pflanzlichem und tierischem Gewebe nach Vorsäulenderivatisierung mit Dansyl-Cl und
anschließender Fluoreszenzdetektion. Hierbei lagen die Nachweisgrenzen im Bereich von 0,5
bis 1 pmol.
Als Nachteil dieser Methode sind die lange Reaktionszeit (>30 min) und die schlechtere
Auftrennung der hydrophoben Dansyl-Derivate an einer RP-C 18-Säule im Vergleich zu den
entsprechenden Phenylisothiocyanat (PITC)- und OPA-Derivaten zu erwähnen (KIRSCHBAUM
1995). Auch die Bildung fluoreszierender Nebenprodukte und die ungenügende
Derivatisierung von Aminosäuren, wenn diese in geringer Konzentration in komplexen
Matrizes vorkommen, muss berücksichtigt werden (FÜRST et al. 1990; EINARSSON et al. 1983;
NEADLE u. POLLIT 1965).
2.4.2.1.3 Vorsäulenderivatisierung mit Phenylisothiocyanat (PITC)
Phenylisothiocyanat bildet mit primären und sekundären Aminen in alkalischer Lösung ein
stabiles Phenylthiocarbamyl-Derivat (KIRSCHBAUM 1995). Durch anschließendes Ansäuern
entsteht ein sehr stabiles Phenylhydantoin, welches durch UV-Detektion bestimmt werden
kann (KIRSCHBAUM 1995; O´HARE et al. 1987).
Der Nachteil dieser Methode ist die geringere Empfindlichkeit gegenüber der Bestimmung
von OPA- oder FMOC-Cl-Derivaten (FÜRST et al. 1990; BETNÉR u. FÖLDI 1986).
2.4.2.1.4 Weitere Vorsäulenderivatisierungsverfahren
Wie TAIBI und SCHIAVO (1993) setzten auch SCHENKEL et al. (1995) Benzoylchlorid als
Derivatisierungsreagenz in der Aminanalytik ein. In einer Untersuchung über Amingehalte in
pflanzlichem Material verwendeten KOTZABASIS et al. (1993) ebenfalls Benzoylchlorid zur
Derivatisierung. Nach der Vorsäulenderivatisierung können die Derivate anhand ihrer UV-
Absorption bestimmt werden.
LIN et al. (1975) verwendeten Dabsylchlorid (Dabsyl-Cl) zur Vorsäulenderivatisierung von
Aminosäuren, mit denen es rot- gelborangene Derivate bildet. Nachfolgend wurde Dabsyl-Cl
auch für die Derivatisierung primärer und sekundärer Amine eingesetzt (LIN et al. 1982). Mit
Hilfe der Vorsäulenderivatisierung durch Dabsylchlorid konnten auch KRAUSE et al. (1995)
59

Literaturübersicht
die Gehalte an Aminosäuren und biogenen Aminen in biologischen Geweben und
Nahrungsmitteln bestimmen. Dabsylderivate sind außerordentlich stabil und ihre Detektion
erfolgt im VIS-Bereich bei 436-460 nm mit einer Nachweisgrenze im picomolaren Bereich
(CHANG et al. 1983; CHANG et al. 1981 a; CHANG et al. 1981 b).
4-Fluor-3-Nitrobenzotrifluorid (FNBT) wurde zur Vorsäulenderivatisierung von Putrescin,
Spermidin und Spermin in einer Untersuchung von SPRAGG und HUTCHINGS (1983)
verwendet.
CICHY et al. (1993) nutzten erstmals 2-(1-Pyrenyl)Ethylchloroformiat (PEOC) zur
Vorsäulenderivatisierung von Aminen in Serum mit anschließender Fluoreszenzdetektion.
PEOC reagiert mit primären und sekundären Aminen zu fluoreszierenden Carbamaten.
Ein Verfahren zur Vorsäulenderivatisierung mit N-Hydroxysuccinimidyl 6-Quinolinyl-
Carbamat (HSQC) wurde von WEISS et al. (1997) beschrieben. HSQC findet sowohl in der
Aminosäuren- als auch in der Aminanalytik Anwendung.
SCHOLLENBERGER (1993) optimierte ein Derivatisierungsverfahren für Aminosäuren mit
Naphthalendialdehyd/Kaliumcyanid (NDA/CN), so dass es zur Bestimmung biogener Amine
verwendet werden konnte.
2.4.2.2 Nachsäulenderivatisierungsverfahren
2.4.2.2.1 Derivatisierung mit ortho-Phtaldialdehyd (OPA)
Schon im Jahre 1959 stellten SHORE et al. (1959) ortho-Phtaldialdehyd als
Derivatisierungsreagenz für die fluorimetrische Bestimmung von Histamin vor. ROTH (1971)
beschrieb ein Verfahren zur Derivatisierung primärer Amine und Aminosäuren mit OPA in
Gegenwart einer Mercaptoverbindung (R-SH) mit einer Nachweisgrenze im nanomolaren
Bereich. OPA wurde aufgrund der geringen Stabilität der Derivate (SKAADEN et al. 1982;
CHEN et al. 1979) häufiger zur Nachsäulenderivatisierung verwendet (SCHOLLENBERGER
1993; SUZUKI et al. 1990; LÖSER et al. 1988), aber auch die Vorsäulenderivatisierung von
60

Literaturübersicht
Aminosäuren und Aminen mit OPA wurde beschrieben (VAN EIJK et al. 1996). OPA reagiert
wie Fluorescamin nur mit primären Aminogruppen (CHEN et al. 1979).
2.4.2.2.2 Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin
Ninhydrin wurde als erstes Derivatisierungsreagenz für Aminosäuren in der
Flüssigchromatographie eingesetzt. Es reagiert sowohl mit primären als auch mit sekundären
Aminogruppen zu Derivaten. Der dabei entstehende blaue Farbstoff besitzt ein
Absorptionsmaximum bei 570 nm für primäre Amine bzw. 450 nm für sekundäre Amine wie
Prolin (KATZ 1996).
SPACKMANN et al. stellten 1958 einen automatischen Aminosäurenanalyzer auf der Basis
einer Ionenaustauschchromatographie mit anschließender Nachsäulenderivatisierung mit
Ninhydrin und UV/VIS-Detektion vor. Die ersten Methoden zur Trennung von Aminen auf
Ionenaustauschersäulen in umgebauten Aminosäurenanalysatoren stammen von WALL
(1968), MORRIS et al. (1969) und HATANO et al. (1970). DIERICK et al. (1976) und SCHNEIDER
et al. (1989) bestimmten auf diese Weise mit Hilfe von Ninhydrinderivaten die Aminosäurenbzw.
Amingehalte in der Digesta von Schweinen. Auch SAYEM-EL-DAHER et al. (1983)
setzten Ninhydrin zur Nachsäulenderivatisierung bei der Aminanalytik von Lebensmitteln
ein.
Nachteile der Ninhydrin-Methode sind der hohe apparative Aufwand durch die Messung im
UV/VIS-Bereich und die relativ geringe Empfindlichkeit (ALGERMISSEN et al. 1989).
2.4.2.2.3 Nachsäulenderivatisierung mit Fluorescamin
4-Phenylspiro[furan-2(3H),1`phtalan]-3,3`-dion (Fluorescamin, Fluram) reagiert mit primären
Aminen und Aminosäuren zu stark fluoreszierenden Pyrrolidon-Derivaten. Diese Reaktion
erfolgt bei einem pH-Wert von 9 innerhalb weniger Sekunden (KIRSCHBAUM 1995). VEENING
et al. (1974) setzte Fluorescamin zur Nachsäulenderivatisiserung in der Polyaminanalytik ein,
es wurde aber auch zur Nachsäulenderivatisierung von Aminosäuren eingesetzt (VOELTER u.
ZECH 1975). SCHOLLENBERGER (1993) verwendete Fluorescamin bei der
Nachsäulenderivatisierung von Aminen und berichtet über die Nachteile des
61

Literaturübersicht
Derivatisierungsreagenz, wie dessen Unlöslichkeit im wässrigen Millieu und die relativ hohen
Kosten.
2.4.2.3 Vor- und Nachteile der Derivatisierungsverfahren
Für die Nachsäulenderivatisierung muss die Reaktion schnell und vollständig oder in einem
eindeutig reproduzierbaren Umsetzungsgrad verlaufen. Auch müssen die hierbei entstehenden
Produkte zumindest bis zur erfolgten Detektion stabil sein. Um die Derivatisierungsreaktion
zu beschleunigen ist eine beheizbare Reaktionskapillare vorteilhaft. Das
Derivatisierungsreagenz muss meist in hohem Überschuß zugesetzt werden und darf im
Detektor kein Signal erzeugen. Schließlich ist noch eine weitere Pumpe zur Zufuhr des
Derivatisierungsreagenz notwendig (KIRSCHBAUM 1995; ACED u. MÖCKEL 1991; MEYER
1980).
Im Gegensatz zur Nachsäulen- müssen für die Vorsäulenderivatisierung folgende
Bedingungen erfüllt sein: Die Reaktionsprodukte müssen in einer vollständig ablaufenden
Reaktion entstehen und die Derivate müssen stabil sein. Zusätzlich müssen sie
chromatographier- und gut detektierbar sein. Von Vorteil ist die Möglichkeit zu längeren
Reaktionszeiten sowie der geringere Verbrauch an Derivatisierungsreagenz. Auch das
Reagenz selbst darf im Detektor ein Signal geben. Nebenprodukte, die bei der Derivatisierung
entstehen, können die nachfolgende Chromatographie aber auch stören (KIRSCHBAUM 1995;
ACED u. MÖCKEL 1991; MEYER 1980).
62

Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Zielsetzung
Ziel der Untersuchungen war es, die Effekte einer polyamin- bzw. purinangereicherten Diät
auf den Entwicklungszustand des Darmes beim drei Wochen alten Ferkel zu bestimmen. Als
Indikatoren für den Funktionszustand des Darmgewebes wurden verschiedene intestinale
Enzyme gewählt. Des Weiteren wurde der Amingehalt in Chymus- und Darmgewebeproben
bestimmt.
Im Rahmen dieser Fragestellung wurde eine Methode zur Aminbestimmung (ZENTEK u.
PIETRZAK 1997) modifiziert, um die Messung in Chymus- und Gewebeproben von Ferkeln zu
ermöglichen.
Aufgrund dessen gliederte sich der experimentelle Teil des Versuches in zwei Bereiche:
- Im tierexperimentellen Teil wurden Ferkel nach der Kolostralperiode abgesetzt und mit
Milchaustauscher ohne bzw. mit Spermin- oder Purinzusatz gefüttert. Nach dreiwöchiger
Versuchsdauer wurden die Tiere zur Probengewinnung euthanasiert.
- Modifikation und Entwicklung einer Methode zur quantitativen und qualitativen
Bestimmung von Aminen in Ferkelchymus und Darmgewebe anhand der
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
63

Material und Methoden
3.2 Tierexperimentelle Untersuchungen
Der Tierversuch wurde vom Regierungspräsidium Stuttgart geprüft und genehmigt (Aktenzeichen
Nr. V134/97 THs „Nutritive Regulation der Darmproliferation und -
differenzierung“).
3.2.1 Versuchsaufbau
Die tierexperimentellen Untersuchungen wurden am Institut für Tierernährung der Universität
Hohenheim mit Ferkeln der Kreuzung Deutsche Landrasse x Piétrain durchgeführt. Die vom
Versuchsgut „Unterer Lindenhof“ stammenden Muttersauen wurden zum Abferkeln ca. zwei
Wochen vorher in den Versuchseinrichtungen des Institutes für Tierhaltung aufgestallt. Der
Versuchsaufbau ist in Tab. 3 dargestellt.
Tab. 3: Versuchsaufbau
Behandlung Ferkel (n) Fütterung
Kontrollgruppe 5 Milchaustauscher 230 g TS/d
(polyamin- und purinarm)
Polyamingruppe 7 wie Kontrollgruppe, Zusatz von Spermin 1
(23,5 µmol/l Milchaustauscher)
Puringruppe 5 wie Kontrollgruppe, Zusatz von
Adenosinmonophosphat 2 und Guanosinmonophosphat 3
(1,28 mmol bzw.1,23 mmol/l Milchaustauscher)
1 Spermine Free Base, Best.Nr. S 3256; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Postfach, D-82039 Deisenhofen
2 Adenosin-5´-monophosphorsäure Dinatriumsalz Hexahydrat,
Best.Nr.1.01428.0025; Merck KGaA, Frankfurter Str. 250, D-64293 Darmstadt
3 Guanosin-5´-monophosphat Dinatriumsalz,
Best. Nr.51090, Fluka Chemie AG, Industrie Str.25, CH-9471 Buchs SG 1
64

Material und Methoden
Der Versuch erwies sich aufgrund der hohen Fütterungsfrequenz, der täglichen Blutentnahme
(für Analysen durch das Institut für Tierhaltung) sowie der Katheterpflege als sehr
betreuungsintensiv. Aus organisatorischen Gründen resultierte hieraus eine zeitlich versetzte
Aufstallung der Ferkel, so dass mindestens vier und maximal neun Ferkel zur gleichen Zeit
betreut wurden. Der Versuch wurde in zwei Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt bestand
aus zwei sich überschneidenden Aufstallungen von je vier Ferkeln (Versuchsabschnitt 1); im
zweiten Versuchsabschnitt wurden 9 Ferkel gleichzeitig eingestallt. Ein Schema zum
Versuchsablauf ist in Tab. 4 wiedergegeben.
Tab. 4: Versuchsablauf
Tage post natum
Behandlung
Abschnitt 1 Abschnitt 2
0-5 0-6 • Haltung bei der Muttersau
5 6 • Absetzen der Versuchstiere
• Wiegen
• Katheterimplantation in die V.cephalica antebrachii bzw. V.
jugularis
• Gruppeneinteilung und Adaptation an die Versuchsdiäten
5-6 6-7 • Fütterung von 100 ml Versuchsdiät in 2h - Intervallen
7-21 8-21 • Fütterung von 200 ml Versuchsdiät im Vierstundenrhythmus
(mit bzw. ohne Zusatz)
21 21 • Euthanasie der Ferkel 1h postprandial
• Entnahme des Probematerials
6-21 7-21 ⇒Tägliche Blutentnahme (8.00 Uhr) 1
1 Die Blutentnahme via Katheter war nicht immer möglich, so dass alternativ eine Venenpunktion durchgeführt wurde
65

Material und Methoden
3.2.2 Tiere und Haltung
Insgesamt standen 17 Tiere mit einem mittleren Körpergewicht von 2,4 ± 0,3 kg von vier
verschiedenen Sauen für den Versuch zur Verfügung. Um mögliche Unterschiede in den
Versuchsergebnissen aufgrund von Geschlechtsunterschieden auszuschließen, wurden nur
weibliche Ferkel ausgewählt.
Die Tiere verblieben bis einschließlich zum Tag 4 (Versuchsabschnitt 1) bzw. bis zum Tag 5
(Versuchsabschnitt 2) nach der Geburt bei der Muttersau. In der Zeit vor dem Absetzen stand
den Sauen mit Nachzucht jeweils eine Einzelbucht (ca. 3 x 2,5 m) mit Ferkelnest und
Stroheinstreu zur Verfügung. Die Sauen wurden vor dem Abferkeln ad libitum mit
Immunozog ®4 bzw. nach dem Abferkeln mit PorVit Lak ®5 gefüttert. Die Deklarationen der
Inhaltsstoffe und Komponenten der Futtermittel sind im Anhang (Tab. I und Tab. II)
dargestellt.
Am Tag 5 (Versuchsabschnitt 1) bzw. Tag 6 (Versuchsabschnitt 2) erfolgte das Absetzen und
unmittelbar daran anschließend die Operation zur Verlegung eines Venenverweilkatheters in
die Vena cephalica antebrachii bzw. in die Vena jugularis (Claus et al. 1990). Die tägliche
Blutentnahme diente zur Probengewinnung für Analysen des Institutes für Tierhaltung,
Fachgebiet Tierhaltung und Leistungsphysiologie. Die Vena jugularis wurde katheterisiert,
falls die Vena cephalica antebrachii für die Katheterimplantation aufgrund von
tierindividuellen Einflüssen schwer zugänglich war. Nach der Operation wurden die Tiere auf
die einzelnen Versuchsgruppen verteilt, wie es in Tab. 3 beschrieben ist.
Während des Versuches wurden die Tiere einzeln in Stoffwechselkäfigen gehalten.
Die Stoffwechselkäfige bestanden aus einem mit Rollen versehenen Stahlgestell, das mit
4
Energie- und wirkstoffreiches Geburtsvorbereitungsfutter für Sauen; Raiffeisen Kraftfutterwerke SÜD,
Nördliche Hafenstraße 12, 97080 Würzburg
5
Energie- und wirkstoffreiches Alleinfutter für säugende Sauen; Raiffeisen Kraftfutterwerke SÜD,
Nördliche Hafenstraße 12, 97080 Würzburg
66

Material und Methoden
einer transparenten Polyacrylplatte zu den Seiten hin abgegrenzt war. Zur Stabilisierung war
es auf der Außenseite zusätzlich noch mit einem Edelstahlgitter versehen. Der Bodenbelag
bestand aus einer PVC-Grundkonstruktion (Tenderfoot ®6 ), die dem Wärmebedürfnis der
Tiere entgegenkam und leicht zu reinigen war. Zwei Auffangschalen für Urin bzw. Kot waren
unter dem Boden angebracht und leicht zugänglich. Jedem Ferkel stand eine Grundfläche von
0,475m 2 zur Verfügung. Aufgrund dieser Konstruktion war ein ständiger Sicht- sowie
akustischer und olfaktorischer Kontakt zwischen den Tieren gewährleistet.
Einmal täglich wurden die Käfige und deren Umgebung gereinigt und desinfiziert.
Die mit einem Thermohygrographen aufgezeichnete Umgebungstemperatur und relative
Luftfeuchte (ca. 70 %) konnte durch Inbetriebnahme der Heizung und durch den Einsatz von
Wärmelampen den jeweiligen Bedürfnissen der Tiere angepaßt werden. Die
Umgebungstemperatur betrug ca. 30 °C am Anfang des Versuches und wurde auf ca. 28 °C in
der zweiten und ca. 26 °C in der dritten Woche gesenkt.
Um die Eisenversorgung sicherzustellen, wurde den Tieren am zweiten Tag post natum ein
Milliliter eines Eisen-Vitamin-Präparates 7 in die Halsmuskulatur caudal des Ohrgrundes
injiziert (Eisen-Dosis ca. 190 mg pro Tier).
Die Ferkel wurden am Absetztag gewogen. An den Tagen 10, 16 und 21 erfolgte zusätzlich
eine Wiegung vor der 7.00 Uhr Fütterung, um das Körpergewicht zu kontrollieren.
6
Stallböden Vertriebs GmbH, Am Sportzentrum 7, 49479 Ibbenbüren
7
Ferrum u. Vitamin-Rosco ® für Tiere, Fa. Atarost GmbH u. Co., 27239 Twistringen
67

Material und Methoden
3.2.3 Futter und Fütterung
3.2.3.1 Rationszusammensetzung
Alle Versuchsgruppen erhielten einen Milchaustauscher als Basisdiät, der im institutseigenen
Futterlabor hergestellt wurde. Die Zuammensetzung des Milchaustauschers wird nachfolgend
in Tab. 5 dargestellt. Die Einzelkomponenten wurden so ausgewählt, dass ein möglichst
niedriger Amin- und Puringehalt gewährleistet war.
Die Zusammensetzung des Milchaustauschers orientierte sich an den Bedarfsangaben des
NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1988) für Schweine im Gewichtsbereich von 1-5 kg
Lebendmasse.
Tab. 5: Zusammensetzung der Basisdiät (% Originalsubstanz)
Komponente Anteil [%]
Laktose 36,3
Molkenfettkonzentrat 30,0
Natrium-Caseinat 28,0
Mineralstoff/Vitamin-Vormischung 2,5
CaHPO 4 1,5
CaCO 3 1,0
Na 2 HPO 4 0,7
Die Bezugsquellen der Rationskomponenten und die Zusammensetzung des
Molkefettkonzentrates sowie der Mineralstoff-/Vitamin-Vormischung sind im Anhang (Tab.
III und Tab. IV) aufgeführt.
68

Material und Methoden
3.2.3.2 Versuchsrationen
Die Versuchsration mit einem definierten Gehalt an Spermin wurde zubereitet, indem der
Tagesration Spermin in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt wurde (35 µmol in ca. 3 ml
Aqua bidest gelöst). Es wurde ein Spermingehalt von 23,5 µmol/l angestrebt, da die Wirkung
der Substanz im physiologischen Bereich getestet werden sollte. Die hier gewählte
Konzentration entsprach der von Sauenmilch; die täglich aufgenommene Sperminmenge
betrug max. 28 µmol.
Für die Puringruppe wurden der Tagesration je 0,5 g AMP und GMP, ebenfalls in wässriger
Lösung von ca. 2 ml, zugegeben. Dies entspricht einer Konzentration von 1,23 mmol/l
Milchaustauscher AMP bzw. 1,28 mmol/l Milchaustauscher GMP. Die täglich maximal
aufgenommene Menge lag somit bei 1,54 mmol AMP und 1,48 mmol GMP. Die zugesetzte
Purinmenge wurde anhand von Literaturangaben aus Versuchen an Ratten abgeleitet
(ORTEGA et al. 1995; BUENO et al. 1994). Bei höheren Konzentrationen wurde über
Unverträglichkeitsreaktionen berichtet und bei niedrigerer Dosierung waren keine Effekte auf
die Darmmukosa festzustellen.
3.2.3.3 Fütterung
Jedes Ferkel erhielt täglich 230 g Milchaustauscher ohne (Kontrollgruppe) oder mit dem
entsprechenden Zusatz an Spermin (Polyamingruppe) bzw. Adenosinmonophosphat/
Guanosinmonophosphat (Puringruppe).
Zur Morgenfütterung (7.00 Uhr) wurden die Tagesrationen frisch zubereitet. Der
Milchaustauscher wurde in 1500 ml Wasser mit einer Anfangstemperatur von 40-45 °C
suspendiert. Während der Zubereitung und der Verteilung auf die Futtertröge kühlte der
Milchaustauscher ab und war zum Zeitpunkt der Fütterung handwarm. Die verbleibenden
Tagesrationen wurden bis zur nächsten Futtergabe im Kühlschrank aufbewahrt und vor dem
Einfüllen in die Tröge in der Mikrowelle bei kleinster Stufe auf ca. 40 °C erhitzt.
Während der Anfütterungsphase an den Tagen fünf und sechs (Versuchsabschnitt 1) bzw.
sechs und sieben (Versuchsabschnitt 2) wurden 100 ml des Milchaustauschers im
69

Material und Methoden
Zweistundenrhythmus verabreicht. Ab Tag 7 (Versuchsabschnitt 1) bzw. Tag 8
(Versuchsabschnitt 2) erhielten die Ferkel sechsmal täglich jeweils 200 ml Milchaustauscher
und zwar um 7.00 Uhr, 11.00 Uhr, 15.00 Uhr, 19.00 Uhr, 23.00 Uhr und 3.00 Uhr.
Frisches Wasser wurde den Ferkeln ad libitum angeboten.
Falls die Ferkel den Milchaustauscher nicht vollständig innerhalb von 30 min aufgenommen
hatten, wurde die restliche Milchmenge volumetrisch bestimmt. Somit ließ sich die
aufgenommene Futtermenge berechnen und daraus die aufgenommene Spermin- bzw.
Purinmenge ableiten.
3.2.4 Euthanasie der Ferkel
Das Einschläfern der Tiere erfolgte durch die intravenöse Gabe einer Überdosis Narcoren ®8
(> 60 mg/kg KM). Der venöse Zugang war durch den Venenverweilkatheter bis auf wenige
Ausnahmen gegeben. In diesen Fällen wurde, nach einer vorherigen Sedierung mit Ketamin ®9
(10 mg/kg KM) und Stresnil ®10 (10 mg/kg KM), eine Überdosis Narcoren ® per injectionem
intracardial verabreicht.
3.2.5 Probenahme aus den einzelnen Kompartimenten des Intestinaltraktes
3.2.5.1 Gewebeentnahme
Die Entnahme der Untersuchungsmaterialien Dünndarmchymus und Dünndarmgewebe
erfolgte aus jeweils vier anhand der Anatomie definierten Bereichen des Dünndarmes:
Duodenum, proximales Jejunum, distales Jejunum und Ileum (Definition proximales und
8
Narcoren ® , Rhone Merieux GmbH, 88471 Laupheim
9
Ketamin ® , Wirtschaftsgenossenschaft Deutscher Tierärzte eG, 30827 Garbsen
10
Stresnil ® , Janssen GmbH, 41460 Neuss
70

Material und Methoden
distales Jejunum s. u.). Um Verunreinigungen zu vermeiden, wurde diese Entnahme unter
möglichst sterilen Bedingungen durchgeführt. Es wurden sterile Instrumente und sterile
Einmalhandschuhe verwendet. Die Oberflächen der Tische, auf denen gearbeitet wurde,
wurden mit 70%igem Alkohol gereinigt.
Sofort nach Eintritt des Todes wurde die Bauchhöhle mit Hilfe einer Skalpellklinge in der
Medianen vom Sternum bis zum Beckeneingang eröffnet. Hierbei lagen die Ferkel in
Rückenlage. Der gesamte Magen-Darm-Trakt wurde daraufhin vorgelagert und am Pylorus
und Rektum eine Klemme gesetzt. An diesen Stellen erfolgte eine Durchtrennung des
Gewebes durch einen Schnitt mit dem Skalpell. Nach dem Absetzen des Gekröses und der
großen mesenterialen Gefäße wurde der nun freigelöste Darmtrakt sofort in eisgekühlte
physiologische Kochsalzlösung gelegt.
Es folgte das Aufsuchen des Duodenums, dessen Anfangsabschnitt durch das Ende des
Pylorus am Magenausgang definiert ist. Das Duodenumende konnte durch das Ligamentum
duodenocolicum bestimmt werden. Das Gewebe und der Chymus des gesamten Duodenums
wurde als Probe gewonnen. Jeweils ein Meter Gewebe wurde sowohl vom proximalen als
auch vom distalen Jejunum entnommen. Der proximale Teil begann am Übergang
Duodenum/Jejunum und konnte anhand des Ligamentum duodenocolicum aufgesucht werden.
Der distale Abschnitt endete am Übergang ins Ileum, was durch die Plica ileocaecalis
gekennzeichnet war. Der mittlere Abschnitt wurde verworfen bzw. teilweise für histologische
Untersuchungen vom Institut für Umwelt und Tierhygiene, Fachgebiet Anatomie und
Physiologie der Haustiere der Universität Hohenheim verwendet.
Der Beginn des Ileums wurde anhand der Plica ileocaecalis erkannt und das Ostium
ileocaecale definierte dessen Ende. Das Ileumgewebe und der Chymus des Ileums wurden
komplett als Probematerial gewonnen.
71

Material und Methoden
3.2.5.2 Aufarbeitung und Lagerung der Proben
3.2.5.2.1 Darmgewebe und Chymus
Als erstes wurde aus den einzelnen Darmabschnitten durch vorsichtiges Ausstreichen
eventuell vorhandener Chymus entfernt und in Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf ® ) à 1,5 ml
Inhalt abgefüllt. Im Hinblick auf die mögliche rasche Abnahme der Enzymaktivität erfolgte
dies so schnell wie möglich. Anschließend wurden die Darmabschnitte mit kalter NaCl-
Lösung gespült. Das Gewebe lagerte bis zur weiteren Verarbeitung in eiskalter
physiologischer Kochsalzlösung. Nach der Eröffnung des Darmrohres entlang seiner
Längsseite sowohl auf der gekrösezu- als auch auf der gekröseabgewandten Seite wurde das
Gewebe in kleine, ca. 1 cm kurze Stücke geschnitten. Die einzelnen Gewebeteile wurden in
Flüssigstickstoff schockgefroren und zur Aufbewahrung in Plastikgefäße verteilt. Bis zur
Analyse lagerten die Proben in einem Tiefgefrierschrank bei –74 °C.
3.2.5.2.2 Blutplasma
Pro Blutentnahme wurden maximal 4 ml Blut entnommen und direkt in EDTA-Röhrchen (zur
Hemmung des Gerinnungsvorganges) aufgefangen. Die anschließende Zentrifugation des
Blutes erfolgte bei 4 °C und 2500 x g über eine Zeitdauer von 15 min. Das durch
Abpipettieren gewonnene Plasma wurde dann bei –20 °C bis zur Analyse durch das Institut
für Tierhaltung, Fachgebiet Tierhaltung und Leistungsphysiologie, tiefgefroren.
72

Material und Methoden
3.3 Analytische Verfahren
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag sowohl in der Methodenentwicklung zur
Bestimmung der Aminkonzentrationen im Darmgewebe und Chymus von Ferkeln, als auch in
der Bestimmung von Parametern zur Charakterisierung der funktionellen Differenzierung der
Dünndarmmukosa. Die gewählten Parameter und Analysemethoden wurden in Tab. 6
zusammenfassend dargestellt.
Tab. 6: Übersicht über verwendete Analysemethoden
Parameter Meßprinzip Substrat Probenahmestelle
Amine HPLC Chymus Proximales und
distales Jejunum
Amine HPLC Gewebe Duodenum,
proximales und
distales Jejunum,
Ileum
Maltase
Photometrische
Bestimmung
Chymus
Duodenum,
proximales und
distales Jejunum,
Ileum
Laktase
Photometrische
Bestimmung
Chymus
Duodenum,
proximales und
distales Jejunum,
Ileum
Leucinarylamidase
Photometrische
Bestimmung
Chymus
Duodenum,
proximales und
distales Jejunum,
Ileum
73

Material und Methoden
3.3.1 Aminanalytik
3.3.1.1 Fragestellung
Das Ziel der analytischen Vorversuche war es, die Amingehalte im Chymus und Darmgewebe
von Ferkeln qualitativ und quantitativ erfassen zu können. Die durch PIETRZAK (1997)
beschriebene HPLC-Methode zur Bestimmung von Aminen in verschiedenen biologischen
Substraten konnte aufgrund von Unterschieden bezüglich der Probenmatrix (Probenmaterial
Chymus/Darmgewebe und nicht Kot; andere Tierart; geringere Aminkonzentrationen) nicht
unverändert auf das zu untersuchende Material übertragen werden. Deshalb war es
notwendig, das Analyseverfahren zu modifizieren (s. Abschnitt 4.2 Methodenentwicklung zur
Bestimmung von Aminen in Chymus und Darmgewebe).
3.3.1.2 HPLC-Anlage, Geräte und Chemikalien
3.3.1.2.1 HPLC-Anlage
Eine HPLC-Anlage der Firma Merck Hitachi, Darmstadt, wurde zur Aminbestimmung
eingesetzt. Diese Anlage bestand aus einer LiChroGraph ® Gradienten-Pumpe L-6200A,
einem D6000 Interface und LC-Organizer (alle Geräte Merck Hitachi), einem Fluorescence
Spectrophotometer F-1050 (Merck Hitachi) und einem Hewlett-Packard Autosampler Series
1100. Von der Firma Grom Herrenberg wurde eine Säule zur Bestimmung von FMOC-Cl-
Derivaten (GROM-SIL Polyamin 2, 250 x 4 mm, Art. GSPO20510R2504) zur Analyse von
Aminen bezogen. Die Reinigungs- (Art. GSOD22010V0404) und Vorsäule (Art.
GSPO20510V0104V) stammten ebenfalls von der Firma Grom. Ein Wasserbad der Firma
Gebr. Haake, Berlin-Lichterfelde wurde eingesetzt, um die Trennsäule zu temperieren.
74

Material und Methoden
3.3.1.2.2 Sonstige Geräte und Laborzubehör
Dichtscheiben Naturkautschuk
(Art. CD0821010)
Durapore ® Membrane Filters
(Art. GVWP01300)
Feinwaage (BP 221 S)
Filterhalter Swinnex (Art. SX0001300)
Gefriertrocknungsanlage Alpha 2-4
Nr. 100402
Gefriertrocknungsanlage Modell 12 K
Supermodulyo Freeze Dryer
Gewindeflaschen (Art. VT1100210)
Hamilton Mikroliter-Spritze
(Art. 716710SNR)
Mörsermühle Pulverisette Typ 02.102
Nr. 3209
Pipetten: Eppendorf Reference
(10-100 µl und 100-1000 µl)
Schraubkappen (Art. CT11S1010)
Silikonringe für Swinnex Filterhalter
(Art. SON0002905)
Ultraschallbad Sonorex RK 100
Vortex Schüttler
Zentrifuge Minifuge RF
Fa. Poeck Analytik-Zubehör GmbH, Langen
Fa. Millipore, Eschborn
Fa. Sartorius, Göttingen
Fa. Millipore, Eschborn
Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen
GmbH, Osterode am Harz
Fa. Edwards, West Sussex, England
Fa. Poeck Analytik-Zubehör GmbH, Langen
Fa. Macherey-Nagel, Düren
Fa. Fritsch, Idar-Oberstein
Fa. Eppendorf, Hamburg
Fa. Poeck Analytik-Zubehör GmbH, Langen
Fa. Millipore, Eschborn
Fa. Bandelin Elektronic GmbH, Berlin
Fa. Heidolph, Kehlheim
Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Hanau
75

Material und Methoden
3.3.1.2.3 Verwendete Chemikalien
Aceton zur Analyse Art. 100014 Fa. Merck, Darmstadt
Acetonitril LiChrosolv ® für die
Flüssigkeitschromatographie
Art. 114291
Fa. Merck, Darmstadt
Borsäure zur Analyse Art. 100165 Fa. Merck, Darmstadt
Cadaverin Dihydrochlorid Art. C-8561 Fa. Sigma, Deisenhofen
1,7-Diaminoheptan Art. D-3266 Fa. Sigma, Deisenhofen
1,6-Diaminohexan Art. H-2381 Fa. Sigma, Deisenhofen
1,8-Diaminooktan Art. 983 5000 Fa. Grom, Herrenberg
Essigsäure (Eisessig) zur Analyse Art. 100063 Fa. Merck, Darmstadt
9-Fluorenylmethylchloroformiat Art. F-0378 Fa. Sigma, Deisenhofen
Glycin Hydrochlorid Art. G-2879 Fa. Sigma, Deisenhofen
Histamin Dihydrochlorid Art. H-7250 Fa. Sigma, Deisenhofen
HPLC-Wasser LiChrosolv ® für die
Flüssigkeitschromatographie
Art. 115333
Fa. Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid Plätzchen zur Analyse Art. 6498 Fa. Merck, Darmstadt
Perchlorsäure Art. 100519 Fa. Merck, Darmstadt
Putrescin Dihydrochlorid Art. P-7505 Fa. Sigma, Deisenhofen
Spermidin Trihydrochlorid Art. S-2501 Fa. Sigma, Deisenhofen
Spermin Tetrahydrochlorid Art. S-2876 Fa. Sigma, Deisenhofen
76

Material und Methoden
Daraus hergestellt:
Eluent A: 200 ml Acetonitril, 800 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 4,4: 6 ml Eisessig
wurden in 900 ml HPLC Wasser gelöst, mit NaOH [30 %ig] auf pH 4,4 eingestellt und auf
1000 ml aufgefüllt.); im Ultraschallbad entgast.
Eluent B: 100 % Acetonitril
Spüllösung: 950 ml Acetonitril, 50 ml HPLC-Wasser
Perchlorsäure (0,6 M): 51 ml Perchlorsäure wurden in 1 l HPLC-Wasser gelöst.
Natronlauge: 30 %ig
Amin-Standard-Lösung: Zur Herstellung einer Amin-Standard-Lösung wurden jeweils 2,5
µmol der einzelnen Aminhydrochloride (Putrescin Dihydrochlorid, Cadaverin
Dihydrochlorid, Histamin Dihydrochlorid, Spermidin Trihydrochlorid, Spermin
Tetrahydrochlorid) pro ml HPLC-Wasser gelöst. Unterschiedliche Standardkonzentrationen
wurden durch Verdünnung dieser Stammlösung hergestellt. Die Lagerung der Lösungen
erfolgte bei -20 °C.
Interne Standard-Lösung: 100 mg 1,6-Diaminohexan bzw. 1,7-Diaminoheptan wurden in 100
ml HPLC-Wasser gelöst. Vor dem Gebrauch erfolgte eine weitere Verdünnung (1:20) mit
HPLC-Wasser. Der interne Standard 1,8-Diaminooktan wurde als fertige Lösung (1 µmol/ml)
von der Firma Grom bezogen und unverdünnt eingesetzt.
Boratpuffer (0,5 M, pH 9,0): 3,09 g Borsäure wurden in 90 ml HPLC-Wasser gelöst. Nach
dem Einstellen des pH-Wertes auf pH 9,0 mit 30 %iger NaOH wurde auf 100 ml aufgefüllt.
FMOC-Cl Reagenz: 387 mg 9-Fluorenylmethylchloroformiat wurden in 50 ml Aceton gelöst.
EVA-Reagenz: 120 mg Glycin wurden in 20 ml Boratpuffer (0,5 M, pH 9,0) gelöst. Daraus
wurde täglich vor dem Derivatisieren 1 ml entnommen und mit 1 ml Aceton frisch angesetzt.
77

Material und Methoden
Verdünnungspuffer: 30 ml Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 4,2), 70 ml Acetonitril
Natriumacetatpuffer: 3 ml Eisessig werden in 1000 ml HPLC-Wasser gelöst. Einstellen des
pH-Wertes auf pH 4,2 mit 30 %iger NaOH.
3.3.2 Bestimmung von Enzymen
Um mögliche Effekte der unterschiedlichen Fütterungsvarianten auf die funktionelle
Differenzierung der Dünndarmmukosa nachzuweisen, wurde die Aktivität der
Disaccharidasen Laktase (β-Galactosidase, EC 3.2.1.23) und Maltase (α-Glucosidase, EC
3.2.1.20) sowie der Aminopeptidase Leucinarylamidase (Leucinaminopeptidase, LAP, EC
3.4.11) im Chymus verschiedener Darmabschnitte (Duodenum, proximales Jejunum, distales
Jejunum, Ileum) bestimmt.
3.3.2.1 Laktase- und Maltase-Bestimmung im Chymus
Die Bestimmung der Enzyme Laktase und Maltase erfolgte photometrisch in Anlehnung an
DAHLQVIST (1968), BERGMEYER und BERNT (1974) und DAHLQVIST (in: BERGMEYER 1974).
Dieser Methode liegen zwei Reaktionsschritte zugrunde. Zuerst erfolgt die
Disaccharidspaltung, anschließend wird eine Farbreaktion zur photometrischen Bestimmung
der gebildeten Glucose durchgeführt.
Mit Hilfe von Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauscher wird die im Chymus bereits
endogen vorhandene Glucose abgetrennt (RAAB 1998). Die Probe wird mit dem Substrat
(Laktose bzw. Maltose) für eine definierte Zeit unter optimalen Bedingungen inkubiert und
die Reaktion durch Zugabe von Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (Trispuffer)
abgestoppt. Die durch das Enzym freigesetzte Glucose wird mit Hilfe der Glucose-Oxidase zu
Glucuronsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Wasserstoffperoxid reagiert unter
Einwirkung von Peroxidase mit dem Farbreagenz 2,2 Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)
(ABTS) zu einem blaugrünen Farbstoff. Dieser wird bei 405 nm photometrisch bestimmt.
78

Material und Methoden
3.3.2.1.1 Probenaufarbeitung
Der bei ca. –74 °C gelagerte Chymus wurde nach dem Auftauen zur Gewinnung eines
partikelfreien Überstandes zentrifugiert (14200 x g; 3 °C; 60 min). Anschließend wurden 100
µl des Chymusüberstandes zur Abtrennung der endogen vorhandenen Glucose mit dem
DEAE-Anionenaustauscher wie folgt aufgearbeitet:
1 ml Phosphatpuffer (25 mM; pH 7,4) wurde zur Vorbereitung des Ionentauschers mit 100
mg DEAE-Cellulose auf einem Vortex-Schüttler gemischt, zentrifugiert (2500 x g; 4 °C; 15
min) und der Überstand verworfen. Zu diesem Ionentauscher wurden erneut 900 µl
Phosphatpuffer (25 mM; pH 7,4) und 100 µl des Chymusüberstandes pipettiert. Nach dem
Mischen (Vortex-Schüttler) wurde dieser Ansatz 60 min bei 4 °C geschüttelt, zentrifugiert
(2500 x g; 4 °C; 15 min) und der Überstand verworfen. Anschließend wurde die Probe
zweimal mit je 5 ml Phosphatpuffer (25 mM; pH 7,4) gewaschen, wonach jeweils
zentrifugiert (2500 x g; 4 °C; 15 min) und der Überstand verworfen wurde. Zur Elution der
Enzyme folgte die Zugabe von 0,5 ml Elutionspuffer und erneutes Schütteln für 30 min bei 4
°C. Der durch Zentrifugation (2500 x g; 4 °C; 15 min) erhaltene Überstand wurde auf Eis
gelagert. Nach der nochmaligen Zugabe von 0,5 ml Elutionspuffer zum DEAE-Probe-
Gemisch (1 min Mischen am Vortex-Schüttler) und Zentrifugation (2500 x g, 4 °C; 15 min)
wurden beide Überstände vereinigt und bis zur Auftragung auf die Mikrotiterplatte auf Eis
gekühlt.
3.3.2.1.2 Bestimmung der Disaccharidasen
3.3.2.1.2.1 Disaccharidspaltung
10 µl der biologischen Probe (unverdünnt bzw. 1:10 verdünnt mit physiologischer
Kochsalzlösung) wurden mit 10 µl Substratpuffer (Maltose- bzw. Laktosesubstratpuffer) für
eine definierte Zeit unter optimalen Bedingungen (25 °C, 30 min) nach der Auftragung auf
die Mikrotiterplatte inkubiert. Hierbei katalysieren die Disaccharidasen die Spaltung der
entsprechenden Disaccharide unter Freisetzung von Glucose. Nach der Inkubation erfolgte
das Abstoppen der Disaccharidspaltung mit 200 µl trishaltigem Testpuffer.
79

Material und Methoden
3.3.2.1.2.2 Farbreaktion
Zur Durchführung der Farbreaktion wurde nochmals für weitere 30 min bei 30 °C inkubiert.
Die Glucose wird dabei zu Glucuronsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt.
Wasserstoffperoxid reagiert mit dem Farbreagenz ABTS zu einem blaugrünen Farbstoff,
welcher bei 405 nm photometrisch bestimmt werden kann.
Für den Probenblindwert wurden 10 µl Probe (unverdünnt) mit 10 µl Maleinsäurepuffer
versetzt. Für die Glucoseeichkurve (10 µl) und den Reagenzienblindwert (10 µl) wurde
ebenfalls Maleinsäurepuffer eingesetzt.
3.3.2.1.3 Auswertung
Die Menge umgesetzter Glucose (µg Glucose/ml) wurde unter Berücksichtigung des Probenund
Reagenzienblindwertes bestimmt. Ein Unit (U) wurde als 1 µmol umgesetztes
Substrat/min bei 25 °C definiert. Die Aktivität wurde in mU/ml berechnet und auf die
Trockensubstanz der Probe bezogen.
3.3.2.1.4 Verwendete Chemikalien und Geräte
Substanzen:
ABTS (2,2 Azini-di-(3-ethylbenzthiazolin))
α-D(+)-Glucose
Diethylaminoethyl (DEAE) 32 Cellulose
Di- Natriumhydrogenphosphat p. a.
D(+)-Laktose Monohydrat
D(+)-Maltose Monohydrat
Glucoseoxidase
Art. A 1888, Fa. Sigma, Deisenhofen
Art. 5250, Fa. Sigma, Deisenhofen
Art. 45058, Fa. Serva, Heidelberg
Art. 6586, Fa. Merck, Darmstadt
Art. 61345, Fa. Fluka Chemie, CH-Buchs
Art. 63419, Fa. Fluka Chemie, CH-Buchs
Art. G7141, Fa. Sigma, Deisenhofen
80

Material und Methoden
Maleinsäure (mono)
Natriumchlorid p. a.
Natriumhydroxid p. a.
Peroxidase
Salzsäure p. a.
TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)
Art. M 5757, Fa. Sigma, Deisenhofen
Art. 6404, Fa. Merck, Darmstadt
Art. 6498, Fa. Merck, Darmstadt
Art. 413470, Fa. Boehringer/Mannheim
Art. 317, Fa. Merck, Darmstadt
Art. 8382, Fa. Merck, Darmstadt
Puffer und Lösungen:
• Maleinsäurepuffer: 0,1 M; pH 6,0
• Elutionspuffer (DEAE): 0, 1 M Maleinsäurepuffer pH 6,0 + 0,5 M Natriumchlorid
• Substratpuffer:
- Für Laktasebestimmung: 0,1 M Maleinsäurepuffer pH 6,0 + 0,056 M Laktose
- Für Maltasebestimmung: 0,1 M Maleinsäurepuffer pH 6,0 + 0,056 M Maltose
• Testpuffer: 490 ml TRIS-Puffer + 1,5 U/ml Peroxidase +
• TRIS-Puffer: 0,5 M; pH 7,0
9 U/ml Glucoseoxidase + 0,092 mM/ml ABTS
• Phosphatpuffer: 0,025 M; pH 7,4
• Glucose-Standard: 10 mg Glucose/10 ml Aqua bidest.
• Kalibrierlösungen: Glucosekonzentrationen (µg/ml): 400; 300; 200; 100; 75; 50; 10
81

Material und Methoden
Geräte:
• Spectrophotometer für Mikrotiterplatten (DU ® 640, Fa. Beckman Instruments, München)
• Zentrifuge (Sigma GK 10, Fa. Sigma, Osterode am Harz)
• Sorvall Superspeed Zentrifuge (RC2-B, Fa. Du Pont, Bad Homburg)
• Vortex Schüttler (Fa. Heidolph, Kehlheim)
• Wärmeschrank (Typ UM/100, Fa. Memmert, Schwabach)
• Kolbenhubpipetten: Multipette und Eppendorf Research (5-20 µl, 20-200 µl und
100-1000 µl, Fa. Eppendorf, Hamburg)
• Feinwaage Sartorius Basic (Sartorius Ag, Göttingen)
3.3.2.1.5 Qualitätskriterien der Methode zur Disaccharidasebestimmung
Empfindlichkeit:
1,25 µg/ml Glucose
Reproduzierbarkeit:
Laktasebestimmung: Intraassayvarianz für Chymus (n = 6) 2,0 %
Maltasebestimmung: Intraassayvarianz für Chymus (n = 6) 2,0 %
82

Material und Methoden
Linearität am Beispiel Maltase:
Die Überprüfung der Linearität der resultierenden Extinktion der durch die Maltase
freigesetzten Glucose erfolgte durch die Bestimmung der Regressionsgeradengleichung (y =
ax + b) sowie den Korrelationskoeffizienten.
Die Regressionsgeradengleichung und der Korrelationskoeffizient sind in Tab. 7 dargestellt.
Tab. 7: Regressionsgeradengleichung (y = ax + b) und Korrelationskoeffizient
a b k
Extinktion 0,0034 - 0,0177 0,995
(y = Extinktion; x = eingesetzte Menge Chymus in µl)
3.3.2.2 Leucinarylamidasebestimmung im Chymus
Die Bestimmung der Leucinarylamidase (LAP)-Aktivität im Chymus erfolgte mit Hilfe eines
Testsatzes der Fa. Boehringer, Mannheim (Art. 204 323). Hierbei wird L-Leucin-p-nitroanilid
durch die LAP zu L-Leucin und p-Nitroanilin gespalten. Die Enzymaktivität wird über die
Intensität der Gelbfärbung durch p-Nitroanilin bei 405 nm photometrisch bestimmt. Da der
Testsatz nur zur Untersuchung von Serum eingesetzt wird, dienten Vorversuche zur
Abklärung der Frage, ob auch Chymusproben damit analysiert werden können. Zur Messung
der Aktivität der LAP wurde die Chymusprobe zentrifugiert (14200 x g; 3 °C; 60 min) und
ein Aliquot des Überstandes (45 µl) in das Analyseverfahren eingesetzt. Die Enzymaktivität
wurde in U/ml berechnet und auf die Trockensubstanz des Chymus bezogen.
3.3.2.2.1 Qualitätskriterien der Methode zur Bestimmung der
Leucinarylamidaseaktivität
Reproduzierbarkeit: Intraassayvarianz für Chymus (n = 6) 1,0 %
Wiedergewinnung: 99,6 %
83

Material und Methoden
3.3.2.3 Trockensubstanz der Chymusproben
Für die Bestimmung der Trockensubstanz (TS) wurde ein Aliquot jeder Probe bei –20 °C
vorgefroren und dann in einer Gefriertrocknungsanlage (Edwards Model 12K Supermodulyo
Freeze Dryer, Fa. Edwards, West Sussex, England ) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
3.4 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde mit Hilfe von EXCEL 7.0 ® (Programm
Winstat, Winstat für EXCEL ® (BENEKE u. SCHWIPPERT 1999)) und des SAS ® -Statistik-
Programms (SAS Institute Inc., Cary, NC 27512- 8000, USA) durchgeführt. Berechnet
wurden die arithmetischen Mittelwerte () und die Standardabweichung (± s). Bei fehlenden
Daten wurde auf die Darstellung der Mittelwerte verzichtet, sofern weniger als vier
Messwerte pro Gruppe zur Verfügung standen.
Die Normalverteilung der Daten der einzelnen Parameter wurde mit dem Shapiro Wilk Test
(SAS ® , Univariate Procedure) überprüft.
Für normalverteilte Daten wurden die Einflüsse der Faktoren durch Varianzanalyse (General
Linear Models Procedure (GLMP); SAS ® 1990) geprüft. Neben den geplanten Faktoren (fixer
Effekt; Spermin- bzw. Purinzulage) wurden auch die Einflüsse des Muttertieres, des
Anfangsgewichtes, der täglichen Milchaustauscheraufnahme sowie der täglichen Zunahme als
zufällige Effekte im Varianzmodell berücksichtigt. Anschließend wurden die adjustierten
Mittelwerte (LS-Means) und Standardfehler der Mittelwerte (± SEM) berechnet. Um die
Signifikanz der Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu prüfen, wurden die LS-
Means durch die Option PDIFF miteinander verglichen.
Bei den nicht normalverteilten Daten wurde als nicht parametrisches Testverfahren der
Kruskall-Wallis Test zur Überprüfung der Ergebnisse auf statistische Signifikanz eingesetzt,
welche dann gruppenweise mit dem U-Test (nach Mann und Whitney) verglichen wurden.
84

Material und Methoden
Zur Prüfung der Signifikanzen wurden die folgenden Irrtumswahrscheinlichkeiten festgelegt:
p> 0,05 nicht signifikant,
p≤ 0,05
signifikant.
In den Tabellen im Anhang wurden zur Kennzeichnung signifikanter Differenzen Buchstaben
verwendet. Wurden Mittelwerte nicht mit demselben Buchstaben überschrieben, so
unterscheiden sie sich signifikant.
Die Regressionsgeradengleichungen zur Überprüfung der Linearität der HPLC-Methode
sowie der Methode zur Disaccharidasenbestimmung wurden mit Hilfe von EXCEL 7.0 ®
berechnet.
85

Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Fütterungsversuch
4.1.1 Zootechnische Parameter
Die Rekonvaleszenz der Ferkel nach dem operativen Eingriff verlief unproblematisch und die
Tiere zeigten trotz des Frühabsetzens von der Muttersau eine gute Adaptation an die
Stoffwechselkäfige. Die schnelle Gewöhnung an das Betreuungspersonal erleichterte das
„Handling“ der Tiere. Die Akzeptanz des Milchaustauschers war hoch. Die daraus
resultierenden mittleren täglichen Milchaustauscheraufnahmen und die mittleren täglichen
Zunahmen erreichten in der Puringruppe die numerisch höchsten Werte und sind in Tab. 8
dargestellt.
Tab. 8: Zootechnische Parameter des Fütterungsversuches (arithmetischer Mittelwert und
Standardabweichung)
Kontrollgruppe Polyamingruppe Puringruppe
± s ± s ± s
Milchaustauscheraufnahme
(ml/d)
1112 54 1099 84 1139 42
Zuwachs (g/d) 196 19 193 33 214 15
Daraus ergibt sich für die Polyamingruppe eine mittlere Sperminaufnahme von 26 µmol/d.
Die Ferkel der Puringruppe nahmen durchschnittlich 0,38 g AMP/d bzw. GMP/d mit dem
Futter auf.
86

Ergebnisse
4.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von Aminen in Chymus und
Darmgewebe
4.2.1 Voruntersuchungen
Die Voruntersuchungen waren nötig, da die Methode PIETRZAK (1997) für die quantitative
Aminbestimmung in den zu untersuchenden Matrizes modifiziert werden musste. Bei der dort
beschriebenen Methode werden vor der Aminanalytik mehrere Schritte zur Aufbereitung der
zu untersuchenden Proben durchgeführt: Für die Analyse von Kot- und Chymusproben ist
eine Extraktion der Amine vor der eigentlichen Probenaufarbeitung durch die Zugabe einer
0,6 M Perchlorsäure notwendig. Nach der Homogenisation mit Hilfe eines Ultraturrax-
Gerätes und der Zentrifugation bei 1000 x g über 10 min werden 200 µl des Überstandes zur
Probenvorbereitung eingesetzt. Hierzu wird das Untersuchungsmaterial bzw. die Standard-
Lösung mit einer 1,6-Diaminohexan-Lösung als interner Standard versetzt und homogenisiert.
Anschließend folgt eine Eiweißfällung mit Aceton. Nach der Zentrifugation über 10 min bei
2500 x g wird ein Aliquot des Überstandes zur Vorsäulenderivatisierung eingesetzt und mit
0,2 M Boratpuffer (pH 8,5) versetzt. Hierdurch entsteht ein alkalisches Milieu, das als
Voraussetzung für die folgenden Reaktionschritte notwendig ist. Es folgt die Zugabe des
Derivatisierungsreagenzes 9-Fluorenylmethylchloroformiat (FMOC-Cl). Nach 3 min
Reaktionszeit wird der hierbei auftretende Überschuß an FMOC-Cl durch die Zugabe der
polaren Aminosäure Glycin (EVA-Reagenz) abgefangen. Zur Verdünnung und Ansäuerung
wird dem Probenansatz nach 45 s ein Verdünnungspuffer zugesetzt. Dieser Vorgang wird
nach 5 min nochmals wiederholt. Mit Hilfe einer Spezialsäule zur Analytik von Aminen und
mittels eines binären Gradientensystemes wird daraufhin die Trennung der Amine
durchgeführt. Ihre Detektion erfolgt fluorimetrisch bei 263 nm Excitation und einer Emission
von 310 nm.
Diese Methodenvorschrift konnte nicht ohne Modifikation auf das Probematerial übertragen
werden, da hierbei die Derivatisierung des Spermins unvollständig war und Störpeaks
aufgrund unvollständiger Derivatisierung mit FMOC-Cl die Aminanalytik verhinderten. Des
87

Ergebnisse
Weiteren trat eine Koelution von Matrixbestandteilen mit Putrescin auf. Um diese Probleme
zu lösen, wurden verschiedene Parameter verändert:
Derivatisierung:
• Boratpuffer: Getestet wurden Boratpuffer-Lösungen mit einer Konzentration von 0,2; 0,3;
0,4 bzw. 0,5 M und den pH-Werten 8,5; 9,0 und 9,5.
• FMOC-Cl: Verschiedene Konzentrationen des FMOC-Cl-Reagenz wurden zur
Derivatisierung der Amine eingesetzt (7,74 mg/ml Aceton; 3,87 mg/ml Aceton) und
miteinander verglichen. Des Weiteren wurden unterschiedliche Mengen (80 µl; 160 µl;
250 µl und 320 µl) an Derivatisierungsreagenz einer Konzentration von 7,74 mg/ml zur
Derivatisierung getestet.
• Reaktionszeiten: Die Reaktionszeiten für die Derivatisierung der Amine wurden variiert
von 20 s bis zu 10 min (20 s; 45 s; 90 s; 3 min; 5 min, 7 min und 10 min).
• EVA-Reagenz: Die Effekte unterschiedlicher Konzentrationen der Aminosäure Glycin (3
mg/ml; 1,5 mg/ml) sowie die Variation der anderen Komponenten der Lösung (getestet
wurden Boratpuffer (pH-Wert 8,5 und 9,0), HPLC-Wasser, Perchlorsäure und Aceton in
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen) wurden geprüft.
• Interne Standard-Lösungen: Verschiedene Substanzen (1,6-Diaminohexan, 1,7-Diaminoheptan,
1,8-Diaminooktan) wurden hinsichtlich ihrer Eignung als interne Standard-
Lösung überprüft.
88

Ergebnisse
Trennung:
• Eluenten: Zwei verschiedene Zusammensetzungen des Eluenten A (Acetonitril und
Natriumacetatpuffer [0,1 M, pH 4,4] im Verhältnis 1:5 bzw. 1:6) wurden getestet.
• Gradientenprogramme: Verschiedene Gradientenprogramme wurden hinsichtlich ihrer
Eignung zur Trennung der Amine untersucht.
Der Einsatz unterschiedlich konzentrierter Boratpuffer zeigte, dass bei der Verwendung eines
0,5 M Boratpuffers ausreichend Pufferkapazität vorlag. Ein pH-Wert von 9,0 der Pufferlösung
führte zur höchsten Fluoreszenzausbeute und wurde deshalb für die Derivatisierung
verwendet.
Die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des FMOC-Cl-Derivatisierungsreagenz
ergab, dass bei höherer Konzentration (7,74 mg/ml) eine vollständige Derivatisierung der
Amine gewährleistet war und der Überschuß durch die anschließende Zugabe von Glycin
abgefangen wurde. Die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Derivatisierungsreagenz sowie
die Verlängerung der Reaktionszeit führte zu keiner weiteren Verbesserung.
Eine ausreichende Reaktion des EVA-Reagenz mit dem FMOC-Cl-Überschuß sowie eine
längere Verwendbarkeit durch die Verzögerung von Auskristallisationsprozessen wurde unter
Verwendung des 0,5 M Boratpuffers (pH 9) erzielt.
Die Derivatisierung wurde durch die drei verschiedenen Substanzen, die als interne Standard-
Lösungen eingesetzt wurden, nicht beeinflußt. Kein interner Standard war jedoch für alle
Matrizes geeignet, da Störpeaks koeluierten. Für die Aminanalytik in den Chymusproben
wurde je nach vorliegenden Matrixbestandteilen (die anhand einer Voranalyse bestimmt
wurden) 1,6-Diaminohexan oder 1,7-Diaminoheptan verwendet. Zur Bestimmung des
Amingehaltes in den Darmgewebeproben musste aufgrund störender Matrixbestandteile 1,8-
89

Ergebnisse
Diaminooktan als interner Standard eingesetzt werden, da diese Substanz deutlich getrennt
von Matrixbestandteilen im Chromatogramm erschien.
Eluent A im Mischungsverhältnis 1:5 wurde dem Mischungsverhältnis 1:6 vorgezogen,
Unterschiede in der Elution waren nahezu nicht feststellbar.
Bei der Testung verschiedener Gradientenprogramme kam es teilweise zu unvollständiger
Trennung der Amine bzw. Überlagerung mit Störpeaks.
4.2.2 Analyseverfahren zur Aminbestimmung
Folgendes chromatographisches Untersuchungsverfahren resultierte aus den oben
aufgeführten Voruntersuchungen:
4.2.2.1 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Chymusproben und des
Aminstandards
Die Probenvorbereitung nach PIETRZAK (1997) wurde modifiziert. Bei einem Teil der Proben
wurde der interne Standard 1,6-Diaminohexan (100 mg/100 ml) durch 1,7-Diaminoheptan
(100 mg/100 ml) ersetzt, wenn dies aufgrund von Störpeaks nötig war. In einer ersten
Analyse erfolgte die Abschätzung der zu erwartenden Aminmenge und aufgrund dessen
wurde die zur Analyse eingesetzte Chymusmenge und der interne Standard festgelegt.
Probenvorbereitung der Chymusproben (s. Tab. 9): Zuerst wurden mindestens 50 µl und
maximal 150 µl der aufgetauten Chymusprobe (je nach Ergebnis der Voranalyse) mit HPLC-
Wasser auf 200 µl aufgefüllt, bzw. es wurden 200 µl Amin-Standard-Lösung (0,025 µmol/ml)
eingesetzt. Es folgte eine Homogenisation mit 20 µl der jeweiligen internen Standard-Lösung.
Nach der Aminextraktion durch die Zugabe von 500 µl 0,6 M Perchlorsäure wurde eine
Proteinfällung mit 600 µl Aceton durchgeführt. Die Probenaufarbeitung des Aminstandards
ist in Tab. 10 dargestellt. Ein Aliquot des nach der Zentrifugation bei 2500 x g über 10 min
vorliegenden Überstandes wurde zur Derivatisierung eingesetzt (Tab. 11).
90

Ergebnisse
Tab. 9: Aufarbeitung der Chymusproben
50 – 150 µl Chymus werden
ad 200 µl mit HPLC-Wasser aufgefüllt. Anschließend
20 µl 1,6-Diaminohexan- bzw.
1,7-Diaminoheptan-Lösung zupipettieren,
homogenisieren (Vortex-Schüttler) und mit
500 µl 0,6 M Perchlorsäure versetzen.
Nach erneuter Homogenisation
600 µl Aceton zugeben,
homogenisieren und zentrifugieren.
Tab. 10: Aufarbeitung des Aminstandards für die Chymusproben
200 µl Amin-Standard-Lösung mit
20 µl 1,6-Diaminohexan- bzw.
1,7-Diaminoheptan-Lösung versetzen,
homogenisieren und
500 µl 0,6 M Perchlorsäure zugeben.
Nach erneuter Homogenisation
600 µl Aceton zupipettieren und nochmals
homogenisieren.
Aus diesem Probenaufarbeitungsansatz (bzw. Standard-) werden 20 µl zur Proben-(bzw.
Standard-)derivatisierung eingesetzt.
91

Ergebnisse
Tab. 11: Derivatisierung der Chymusproben (ebenso Standard)
20 µl des Überstandes aus der Aufarbeitung der Probe mit
60 µl Boratpuffer (0,5 M, pH 9,0) auf einem Vortex-Schüttler mischen,
anschließend
80 µl FMOC-Cl-Lösung zur Derivatisierung zugeben (mittels einer
Hamilton Glasspritze). Nach 45 s werden
100 µl EVA- Reagenz zupipettiert und nach weiteren 45 s wird der Ansatz
mit
140 µl Verdünnungspuffer versetzt. Nach 5 min wird nochmals mit
400 µl Verdünnungspuffer verdünnt.
Mit Hilfe des automatischen Probengebers werden aus diesem Derivatisierungsansatz 20 µl
auf die Säule injiziert.
4.2.2.2 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Gewebeproben, des internen
Standards und des Aminstandards
Zur Aminbestimmung wurde das aufgetaute Darmgewebe mit Hilfe einer Skalpellklinge grob
zerkleinert, in Petrischalen eingewogen, tiefgefroren und für die Bestimmung der
lufttrockenen Substanz 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert (ein Teil der
Proben in der Anlage der Fa. Edwards, nach Geräteausfall wurde das Modell der Fa. Christ
eingesetzt). Das getrocknete Material, dessen Trockensubstanz als prozentualer Anteil des
Frischgewichts berechnet wurde, wurde in einer quarzbeschichteten Mörsermühle mindestens
15 min zu einem feinen, homogenen Pulver vermahlen. Als interner Standard wurde 1,8-
Diaminooktan eingesetzt, da in den Darmgewebeproben störende Matrixsubstanzen
gleichzeitig mit den im Chymus verwendeten internen Standards eluierten, während 1,8-
Diaminooktan deutlich getrennt von störenden Matrixsubstanzen im Chromatogramm
erschien. Für die Bestimung der Amine in den Gewebeproben wurde, im Gegensatz zu den
Chymusproben, das Gewebe sowie der interne Standard 1,8-Diaminooktan separat für die
Derivatisierung vorbereitet, wie im folgenden dargestellt:
92

Ergebnisse
Probenvorbereitung der Darmgewebeproben (s. Tab. 12): 50 mg der gefriergetrockneten
Darmgewebeprobe wurden mit 200 µl HPLC-Wasser und 1000 µl Perchlorsäure zur
Proteinextraktion versetzt und mit Hilfe eines Vortex-Schüttlers homogenisiert. Die
Proteinfällung erfolgte durch die Zugabe von 1200 µl Aceton, wonach die Probe erneut
homogenisiert und anschließend zentrifugiert wurde. Die Aufarbeitung des internen Standards
und des Aminstandards (0,25 µmol/ml) sind in den Tab. 13 und Tab. 14 dargestellt. Ein
Aliquot des nach der Zentrifugation bei 2500 x g über 10 min vorliegenden Überstandes
wurde zur Derivatisierung eingesetzt (Tab. 15).
93

Ergebnisse
Tab. 12: Aufarbeitung der Darmgewebeproben
50 mg gefriergetrocknete Darmgewebeprobe mit
200 µl HPLC-Wasser und
1000 µl Perchlorsäure versetzen und homogenisieren (Vortex-Schüttler).
Nach der Zugabe von
1200 µl Aceton
nochmals homogenisieren und anschließend zentrifugieren.
Tab. 13: Aufarbeitung des internen Standards 1,8-Diaminooktan
150 µl 1,8-Diaminooktan-Lösung mit
100 µl HPLC-Wasser und
1000 µl Perchlorsäure versetzen und homogenisieren (Vortex-Schüttler).
Nach der Zugabe von
1200 µl Aceton
nochmals homogenisieren.
Tab. 14: Aufarbeitung des Aminstandards für die Gewebeproben
250 µl Amin-Standard-Lösung mit
1000 µl Perchlorsäure versetzen und homogenisieren (Vortex-Schüttler).
Nach der Zugabe von
1200 µl Aceton
nochmals homogenisieren.
94

Ergebnisse
Tab. 15: Probenderivatisierung (ebenso Standard)
20 µl des Überstandes aus der Aufarbeitung der Probe
(bzw. Amin-Standard-Lösung) mit
10 µl des Überstandes aus der Aufarbeitung des Internen Standards 1,8-
Diaminooktan und
180 µl Boratpuffer (0,5 M, pH 9,0) auf einem Vortex-Schüttler mischen,
anschließend
240 µl FMOC-Cl-Lösung zur Derivatisierung zugeben (mittels einer
Hamilton Glasspritze). Nach 45 s werden
300 µl EVA- Reagenz zupipettiert und nach weiteren 45 s wird der Ansatz
mit
420 µl Verdünnungspuffer versetzt. Nach 5 min wird nochmals mit
1200 µl Verdünnungspuffer verdünnt.
Mit Hilfe des automatischen Probengebers werden aus diesem Derivatisierungsansatz 10 µl
auf die Säule injiziert.
4.2.2.3 HPLC-Bedingungen zur Trennung der Amine
In Anlehnung an die von PIETRZAK (1997) beschriebene Methode erfolgte die Trennung der
derivatisierten Amine mittels eines binären Gradientenprogrammes auf einer RP-C 18 Säule
(Grom-SIL Polyamin 2, 250 x 4 mm) bei einer Säulentemperatur von 40 °C. Verschiedene
Flußraten (0,6 ml/min; 1 ml/min) wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur Separierung der
Amine überprüft. Eine Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase von 1 ml/min lieferte hierbei
die deutlichste Trennung der auszuwertenden Peaks.
95

Ergebnisse
Folgendes Gradientenprogramm (Tab. 16) ergab die beste Trennung der zu untersuchenden
Substanzen:
Tab. 16: Gradientenprogramm zur Amintrennung nach der Derivatisierung
Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%]
0 35 65
15 35 65
58 47 53
65 56 44
73 56 44
83 75 25
104 75 25
105 35 65
112 Stopp Stopp
Die Quantifizierung (siehe Abb. 5 bis Abb. 8) erfolgte über die Peakfläche. Eine Amin-
Standard-Lösung wurde nach jeder vierten zu analysierenden Probe-Lösung injiziert.
Aufgrund der Retentionszeiten konnten die Amine identifiziert und anhand von Eichreihen
quantitativ bestimmt werden.
Innerhalb des Analysezeitraumes wurden verschiedene Vorsäulen bzw. Säulen derselben
Sorte (wie angegeben) verwendet. Je nach Säule und Säulenalter wurden die
chromatographischen Bedingungen leicht modifiziert, woraus sich Verschiebungen der
Retentionszeiten ergeben konnten. Innerhalb der einzelnen Analyseserien waren die
Retentionszeiten stabil.
96

Ergebnisse
3
4
5
6
7
1
2
0 50 100
Abb. 5: HPLC-Chromatogramm eines Standardgemisches der FMOC-Cl-Derivate von
Aminen (0,25 µmol/ml); Abszisse: Zeit [min], Ordinate: Fluoreszenz der FMOC-Cl-Derivate
1: Putrescin
2: Cadaverin
3: 1,6-Diaminohexan
5: 1,8-Diaminooktan
6: Spermidin
7: Spermin
4: 1,7-Diaminoheptan
97

Ergebnisse
1
2
3
0 50 100
Abb. 6: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer aminarmen
Chymusprobe (Putrescin und Cadaverin n.n.); Abszisse: Zeit [min], Ordinate: Fluoreszenz der
FMOC-Cl-Derivate
1: 1,6-Diaminohexan
2: Spermidin
3: Spermin
98

Ergebnisse
2
1
3
4
5
0 50 100
Abb. 7: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer aminreichen
Chymusprobe; Abszisse: Zeit [min], Ordinate: Fluoreszenz der FMOC-Cl-Derivate
1: Putrescin
2: Cadaverin
4: Spermidin
5: Spermin
3: 1,7-Diaminoheptan
99

Ergebnisse
3 4
2
1
0 50 100
Abb. 8: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer
Darmgewebeprobe (Cadaverin n.n.); Abszisse: Zeit [min], Ordinate: Fluoreszenz der FMOC-
Cl-Derivate
1: Putrescin
4: Spermin
2: 1,8-Diaminooktan
3: Spermidin
100

Ergebnisse
4.2.3 Validierung der HPLC-Methode zur Aminbestimmung im Chymus und
Darmgewebe
4.2.3.1 Überprüfung der Linearität
Über den gesamten Untersuchungszeitraum verteilt wurden Eichreihen mit den verschiedenen
internen Standards erstellt. Für 1,6-Diaminohexan und 1,7-Diaminoheptan wurde die
Linearität der resultierenden Fluoreszenz für die Amine Putrescin und Cadaverin durch
Einzelmessungen bei 6 verschiedenen Konzentrationen im Bereich zwischen 0,33 und 6,61
nmol/ml Aufarbeitungsansatz bestätigt. Dies entspricht für Putrescin und Cadaverin einer auf
die Säule injizierten Menge Amin von 0,165 – 3,3 pmol. Für Spermidin und Spermin lag die
auf die Säule injizierte Menge Amin bei 0,165 – 1,65 pmol und es wurden Einzelmessungen
bei 5 verschiedenen Konzentrationen im Bereich zwischen 0,33 und 3,31 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz durchgeführt. Innerhalb dieses Konzentrationsbereiches war die
Beziehung zwischen Peakfläche und Aminkonzentration linear (s. Abb. 9 und Abb. 10).
Für 1,8-Diaminooktan wurde die Linearität der resultierenden Fluoreszenz für alle
untersuchten Amine (PUT, CAD, SPD und SPN) bei 6 verschiedenen Konzentrationen im
Bereich zwischen 1,85 und 37,04 nmol/ml Aufarbeitungsansatz bestätigt. Dies entspricht
einer auf die Säule injizierten Menge je Amin von 0,08 – 1,57 pmol. Auch hier war die
Beziehung zwischen Peakfläche und Aminkonzentration linear (s. Abb. 11).
101

Ergebnisse
Peakfläche/1000
30000
20000
10000
Putrescin
R 2 = 0,999
Peakfläche/1000
40000
30000
20000
10000
Cadaverin
R 2 = 1,000
0
0 1 2 3 4
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 1 2 3 4
Injizierte Menge Amin (pmol)
Peakfläche/1000
16000
12000
8000
4000
Spermidin
R 2 = 0,993
Peakfläche/1000
18000
12000
6000
Spermin
R 2 = 0,993
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
Abb. 9: Eichreihen mit 1,7-Diaminoheptan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin,
Spermidin und Spermin; 6 bzw. 5 Werte pro Eichreihe (0,165 - 3,3 (bzw. -1,65) injizierte
Menge Amin (pmol)).
102

Ergebnisse
Peakfläche/1000
30000
20000
10000
Putrescin
R 2 = 1,000
Peakfläche/1000
40000
30000
20000
10000
Cadaverin
R 2 =1,000
0
0 1 2 3 4
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 1 2 3 4
Injizierte Menge Amin (pmol)
Peakfläche/1000
16000
12000
8000
4000
Spermidin
R 2 = 0,993
Peakfläche/1000
18000
12000
6000
Spermin
R 2 = 0,993
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
Abb. 10: Eichreihen mit 1,6- Diaminohexan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin,
Spermidin und Spermin; 6 bzw. 5 Werte pro Eichreihe (0,165 - 3,3 (bzw. -1,65) injizierte
Menge Amin (pmol)).
103

Ergebnisse
Peakfläche/1000
3000
2000
1000
Putrescin
R 2 = 0,999
Peakfläche/1000
8000
6000
4000
2000
Cadaverin
R 2 = 0,997
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin(pmol)
Peakfläche/1000
8000
6000
4000
2000
Spermidin
R 2 = 0,999
Peakfläche/1000
12000
8000
4000
Spermin
R 2 = 0,999
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
0
0 0,5 1 1,5 2
Injizierte Menge Amin (pmol)
Abb. 11: Eichreihen mit 1,8- Diaminooktan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin,
Spermidin und Spermin; 6 Werte pro Eichreihe (0,08 –1,57 injizierte Menge Amin (pmol)).
104

Ergebnisse
4.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit
Um die Reproduzierbarkeit der Detektionsreaktion für die Derivatisierung mit FMOC-Cl für
biogene Amine zu überprüfen, wurden die Variationskoeffizienten der Peakflächen von
jeweils 5 Messwerten ermittelt. Die Konzentration der Amin-Standard-Lösung lag bei 8,20
nmol/ml Aufarbeitungsansatz für die einzelnen Amine. Tab. 17 gibt die Reproduzierbarkeit,
ausgedrückt durch den entsprechenden Variationskoeffizienten (V K ), wieder.
Tab. 17: Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung nach Derivatisierung mit FMOC-Cl (n
= 5), ausgedrückt durch die Variationskoeffizienten der Flächenwerte der Substanzen.
Peakfläche/1000
Amin ± s V K (%)
Putrescin 9441 233,4 2,5
Cadaverin 12341 364,8 3,0
Spermidin 11823 443,6 3,8
Spermin 13847 437,1 3,2
4.2.3.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Bei der Bestimmung der Nachweisgrenze (NG) können verschiedene Verfahren angewendet
werden. Zum einen kann der reine Analyt in unterschiedlichen Konzentrationen direkt mittels
eines Analysesystemes vermessen werden (analytisches Grundverfahren), er kann vor der
Messung einer definierten Matrix (Leerwert) zugesetzt worden sein, oder aber der Analyt
wird auf eine reale Probe aufgestockt und durchläuft das komplette „clean-up“-Verfahren
(Standard-Addition). Im letztgenannten Verfahren liegen die bestimmbaren Konzentrationen
zwangsläufig höher, als beim analytischen Grundverfahren, da die „clean-up“-bedingten
105

Ergebnisse
Streuungen, also Matrixeffekte, mit eingehen. Da die Nachweisgrenze in Abhängigkeit der
Matrix sehr stark schwanken kann, interessiert in der Regel die minimale Menge Analyt, die
mittels des verwendeten Analysesystemes nachgewiesen werden kann. Dies ist eine
vergleichsweise feststehende Größe, ansonsten müßte das aufwendige Verfahren für jede
einzelne Matrix gesondert durchgeführt werden und wäre dann aber trotzdem nicht auf andere
Proben übertragbar.
Die Bestimmungsgrenze (BG) wird in diesem Beispiel als zweifacher Wert der
Nachweisgrenze definiert.
Prinzip: Zur Charakterisierung der Leistungsfähigkeit des instrumentellen Analyseverfahrens
erfolgte mittels verdünnter Amin-Standard-Lösungen die Ermittlung der Nachweisgrenze.
Durch die Chromatographie immer geringerer Mengen einzelner Aminstandards, die den
unter 4.2.2.1 beschriebenen Aufarbeitungs- und Derivatisierungsvorgang durchliefen, wurde
die Nachweisgrenze bestimmt, die als jenes Signal definiert wurde, das die 3-fache Höhe des
Rauschens der Basislinie besitzt (Signal/Rausch-Verhältnis von 3). Die Ergebnisse sind in
Tab. 18 zusammengefasst. Hierbei wird die Menge Amin (in fmol) angegeben, die mit Hilfe
der beschriebenen Methode absolut bestimmt werden kann. Daraufhin wurde die
Bestimmungsgrenze rechnerisch ermittelt.
Tab. 18: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenze (BG) für die Fluoreszenzdetektion von
Aminen nach Derivatisierung mit FMOC-Cl (gemessen mit dem Fluorescence
Spectrophotometer F 1050 der Fa. Merck Hitachi).
Amin NG (fmol) BG (fmol)
Putrescin
15
30
Cadaverin
15
30
Spermidin
1,5
3
Spermin
0,75
1,5
106

Ergebnisse
Bei Einsatz von 100 µl Chymus in der Aufarbeitung (wie unter 4.2.2.1 beschrieben),
anschließender Derivatisierung und Injektion von 20 µl auf die Säule sind somit theoretisch
396 pmol Putrescin bzw. Cadaverin pro ml Chymus nachweisbar. Die Werte für Spermidin
und Spermin liegen bei 39,6 pmol/ml bzw. 19,8 pmol/ml Chymus.
Bei Einsatz von 50 mg gefriergetrocknetem Darmgewebe in die Aufarbeitung (wie unter
4.2.2.2 beschrieben), anschließender Derivatisierung und Injektion von 10 µl auf die Säule
sind 8,7 nmol Putrescin bzw. Cadaverin, 0,87 nmol Spermidin bzw. 0,44 nmol Spermin pro g
TS Darmgewebe nachweisbar. Die Amingehalte des Darmes wurden aber auf die
Frischsubstanz des Darmes bezogen. Die durchschnittliche Trockensubstanz des Darmes lag
bei 14,9 % TS. Bei Einsatz von 50 mg gefriergetrocknetem Darmgewebe in die Aufarbeitung
und Derivatisierung sowie einer Injektion von 10 µl auf die Säule sind 1,3 nmol Putrescin
bzw. Cadaverin, 0,13 nmol Spermidin und 0,065 nmol Spermin pro g Frischsubstanz Darm
nachweisbar.
4.2.3.4 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im Chymus
Zur Bestimmung der Wiedergewinnung in der Matrix Chymus wurde eine aminarme Probe
ohne und mit dem Zusatz von 25/50/100 µl einer Amin-Standard-Lösung (0,25 µmol/ml)
aufgearbeitet, derivatisiert und chromatographisch bestimmt. Durch den Einsatz von 100 µl
Chymus, 25 - 100 µl Amin-Standard, 25 µl 1,6-Diaminohexan sowie 200-275 µl HPLC-
Wasser (je nach Anteil Amin-Standard) betrug das Gesamtvolumen des
Aufarbeitungsansatzes 1525 µl.
107

Ergebnisse
Tab. 19: Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine im Chymus
Amin-Standard-Lösung (0,25 µmol/ml)
4,1 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
8,2 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
16,4 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
Amin WG V K WG V K WG V K
Putrescin 111 5,3 95 1,7 102 2,9
Cadaverin 100 5,3 102 2,0 99 1,4
Spermidin 107 16,8 95 18,4 102 14,4
Spermin 97 11,9 90 9,7 99 11,1
WG = Wiedergewinnung in %
V K = Variationskoeffizient aus 6 Ansätzen in %
Der Zusatz von 4,1/8,2/16,4 nmol/ml Aufarbeitungsansatz entspricht bei Einsatz von 100 µl
Chymus in die Aufarbeitung (wie oben beschrieben) einer Konzentration von
62,5/125,0/250,0 nmol/ml Chymus. Die Wiedergewinnungen beziehen sich auf einen
niedrigen Konzentrationsbereich, da diese in der Matrix Chymus relevant sind. Bei geringen
Aminkonzentrationen fallen Verunreinigungen durch die Matrix besonders ins Gewicht,
wodurch erhöhte Variationskoeffizienten bedingt werden.
4.2.3.5 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im Darmgewebe
Zur Bestimmung der Wiedergewinnung in der Matrix Darmgewebe wurde eine aminarme
Probe ohne und mit dem Zusatz von 200/300/400 µl einer Amin-Standard-Lösung (0,25
µmol/ml) aufgearbeitet, derivatisiert und chromatographisch bestimmt. Das Gesamtvolumen
des Aufarbeitungsansatzes betrug 2750 µl.
108

Ergebnisse
Tab. 20: Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine im Darmgewebe
Amin-Standard-Lösung (0,25 µmol/ml)
18,2 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
27,3 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
36,4 nmol/ml
Aufarbeitungsansatz
Amin WG V K WG V K WG V K
Putrescin 115 5,7 106 2,8 91 1,8
Cadaverin 105 2,1 103 4,0 94 1,9
Spermidin 107 7.0 105 3,9 101 3,0
Spermin 102 8,3 101 4,8 95 3,6
WG = Wiedergewinnung in %
V K = Variationskoeffizient aus 6 Ansätzen in %
Der Zusatz von 18,2/27,3/36,4 nmol/ml Aufarbeitungsansatz entspricht bei Einsatz von 50 mg
TS Darmgewebe in die Aufarbeitung einer Konzentration von 1000/1500/2000 nmol/g TS
Darmgewebe. Die Amingehalte des Darmes wurden aber auf die Frischsubstanz des Darmes
bezogen. Die durchschnittliche Trockensubstanz des Darmes lag bei 14,9 % TS. Daraus ergibt
sich: Der Zusatz von 18,2/27,3/36,4 nmol/ml Aufarbeitungsansatz entspricht somit bei
Einsatz von 50 mg TS Darmgewebe in die Aufarbeitung einer durchschnittlichen
Konzentration von 148,5/222,8/297,0 nmol/g Frischsubstanz.
109

Ergebnisse
4.3 Ergebnisse der Aminbestimmung
4.3.1 Amingehalte im Dünndarmchymus
Die Ergebnisse zur Bestimmung der Amingehalte des Chymus im proximalen und distalen
Jejunum sind in Abb. 12 bis Abb. 19 dargestellt. Die Amingehalte in den Chymusproben der
Einzeltiere waren in den jeweiligen Darmabschnitten durch eine starke interindividuelle
Variation geprägt (s. Tab. V bis Tab. XII im Anhang).
In der Kontroll-, der Polyamin- und in der Puringruppe war das Verhältnis der einzelnen
Amine zueinander, auch im Hinblick auf den „Gradienten“ der beiden untersuchten
Darmabschnitte (höhere Gehalte im distalen Dünndarm), einer ähnlichen Verteilung
unterworfen. Der mittlere Amingehalt war, unabhängig von der Art des Amins und der
Behandlungsgruppe, im distalen Abschnitt des Jejunums konstant höher als im proximalen
Jejunum. Der Gesamtamingehalt (Summe von Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin
im proximalen und distalen Jejunum) der Polyamingruppe betrug 416,3 nmol/ml Chymus, die
Kontrollgruppe hatte einen Gesamtamingehalt von 232,1 nmol/ml Chymus. Die Puringruppe
wies im Chymus einen Gesamtamingehalt von 227,4 nmol/ml auf. Das Amin mit der
geringsten Konzentration war Spermidin, wobei im proximalen Jejunum der Einfluß einer
Sperminzufuhr zu erkennen war. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Polyamingruppe
und der Kontroll- bzw. Puringruppe ließ sich außerdem für den Spermingehalt im distalen
Jejunum nachweisen.
Im proximalen Jejunum wurde im Chymus der Kontrollgruppe ein Putrescingehalt von 25,0
nmol/ml bestimmt, die Polyamingruppe besaß 19,6 nmol/ml und die Puringruppe hatte einen
Putrescingehalt von 7,8 nmol/ml. Der Cadaveringehalt des Chymus im proximalen Jejunum
der Kontrollgruppe betrug 27,7 nmol/ml, in der Polyamin- bzw. Puringruppe wurde ein
Cadaveringehalt von 42,5 nmol/ml bzw. 10,7 nmol/ml bestimmt. Alle drei Gruppen enthielten
im proximalen Jejunum niedrige Spermidingehalte (≤ 3,0 nmol/ml). Die Kontrollgruppe hatte
einen Spermingehalt von 7,7 nmol/ml Chymus im proximalen Jejunum, die Polyamingruppe
wies 65,1 nmol/ml Chymus auf und der Spermingehalt der Puringruppe lag bei 3,0 nmol/ml.
110

Ergebnisse
Im distalen Jejunum wurde im Chymus der Kontrollgruppe ein Putrescingehalt von 50,0
nmol/ml gemessen, die Polyamingruppe wies 52,3 nmol/ml auf und der Putrescingehalt der
Puringruppe lag bei 28,6 nmol/ml. Der Cadaveringehalt betrug 67,6 nmol/ml in der
Kontrollgruppe, 82,1 nmol/ml in der Polyamingruppe und 51,9 nmol/ml in der Puringruppe.
Die Kontrollgruppe hatte einen Spermidingehalt von 9,1 nmol/ml. Dieser betrug in der
Polyamingruppe 10,0 nmol/ml und in der Puringruppe 15,2 nmol/ml. Im distalen Jejunum
wurde der höchste Spermingehalt im Chymus der Polyamingruppe mit 141,7 nmol/ml
bestimmt. Der Spermingehalt der Kontrollgruppe lag bei 44,6 nmol/ml und die Puringruppe
wies 110,1 nmol/ml auf.
70
60
50
nmol / ml
40
30
20
10
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 12: Putrescingehalte des Chymus im proximalen Jejunum
111

Ergebnisse
nmol / ml
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
G ruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 13: Putrescingehalte des Chymus im distalen Jejunum
nmol / ml
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 14: Cadaveringehalte des Chymus im proximalen Jejunum
112

Ergebnisse
250
200
nmol / ml
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 15: Cadaveringehalte des Chymus im distalen Jejunum
nmol / ml
14
12
10
8
6
4
2
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Kontrolle vs. Polyamine p < 0,05; Purine vs. Polyamine p < 0,05
Abb. 16: Spermidingehalte des Chymus im proximalen Jejunum
113

Ergebnisse
nmol / ml
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 17: Spermidingehalte des Chymus im distalen Jejunum
nmol / ml
300
250
200
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 18: Spermingehalte des Chymus im proximalen Jejunum
114

Ergebnisse
nmol / ml
300
250
200
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Kontrolle vs. Polyamine p < 0,05 (LS-Means)
Abb. 19: Spermingehalte des Chymus im distalen Jejunum
4.3.2 Amingehalte im Darmgewebe
Die Ergebnisse der Amingehalte im Darmgewebe der vier verschiedenen
Dünndarmabschnitte (Duodenum, proximales Jejunum, distales Jejunum und Ileum) sind in
Abb. 20 bis Abb. 35 dargestellt. Auch die Amingehalte in den Darmgewebeproben der
Einzeltiere waren durch eine starke interindividuelle Variation geprägt (s. Tab. XIII bis Tab.
XXVIII im Anhang).
Insgesamt betrachtet scheint die Menge an Putrescin in den caudalen Abschnitten des
Dünndarmes bei allen drei Fütterungsgruppen tendenziell höher zu sein. Dieser von den
proximalen zu den distalen Abschnitten zu beobachtende „Gradient“ zeigte sich außerdem
sowohl in der Spermidin- als auch in der Sperminkonzentration der Polyamin- und
Puringruppe. In allen drei Behandlungsgruppen wies Cadaverin mit Konzentrationen von 0,4
nmol/g im Ileum der Puringruppe bis zu 2,9 nmol/g im Ileum der Kontrollgruppe insgesamt
den geringsten Anteil am Gesamtspektrum der Amine des Darmgewebes auf, im Gegensatz
115

Ergebnisse
zu den Chymusergebnissen, wo Spermidin den geringsten Anteil am Gesamtspektrum der
Amine besaß. Der Gesamtamingehalt (Summe von Putrescin, Cadaverin, Spermidin und
Spermin im Duodenum, proximalen Jejunum, distalen Jejunum und Ileum) betrug in der
Kontrollgruppe 941,1 nmol/g Darmgewebe. Die Polyamingruppe hatte einen
Gesamtamingehalt von 964,2 nmol/g Darmgewebe und die Puringruppe wies im Darmgewebe
einen Gesamtamingehalt von 826,9 nmol/g auf. In der Kontroll-, der Polyamin- und in der
Puringruppe war das Verhältnis der einzelnen Amine zueinander einer ähnlichen Verteilung
unterworfen. So lagen die Spermidin- und Spermingehalte unabhängig von der
Behandlungsgruppe stets über den Gehalten an Putrescin und Cadaverin. Ein signifikanter
Unterschied zwischen der Polyamin- und Puringruppe ließ sich für den Spermidingehalt im
proximalen und distalen Jejunum nachweisen.
In allen drei Gruppen hatte Spermin den höchsten Anteil am Gesamtspektrum der Amine mit
148,1 nmol/g Darmgewebe in der Kontrollgruppe (distales Jejunum), 169,1 nmol/g
Darmgewebe in der Polyamingruppe (distales Jejunum) und mit 134,7 nmol/g Darmgewebe
in der Puringruppe (distales Jejunum). An zweiter Stelle folgte Spermidin.
Im Duodenum der Kontrollgruppe wurde ein Putrescingehalt von 1,8 nmol/g gemessen. Die
Putrescingehalte der Polyamin- und Puringruppe lagen bei 2,8 nmol/g bzw. 6,7 nmol/g. In
allen drei Fütterungsgruppen waren die Cadaveringehalte im Duodenum niedrig (≤ 1,6
nmol/g). Die Spermidingehalte im Duodenum betrugen in der Kontrollgruppe 72,2 nmol/g
Darmgewebe, in den beiden anderen Gruppen lagen die Spermidingehalte bei 62,0 nmol/g
(Polyamingruppe) bzw. 92,9 nmol/g (Puringruppe). Die Kontrollgruppe hatte einen
Spermingehalt von 97,5 nmol/g Darmgewebe. Die Polyamingruppe besaß einen
Spermingehalt von 103,5 nmol/g und die Puringruppe wies 91,1 nmol/g auf.
Im proximalen Jejunum der Kontrollgruppe wurde ein Putrescingehalt von 8,7 nmol/g
bestimmt. Der Putrescingehalt im Darmgewebe der Polyamingruppe betrug 9,0 nmol/g und
lag bei 4,6 nmol/g in der Puringruppe. Die Cadaveringehalte in diesem Darmabschnitt waren
bei allen drei Gruppen niedrig (≤ 1,2 nmol/g). Im Darmgewebe des proximalen Jejunums
betrug der Spermidingehalt der Kontrollgruppe 70,8 nmol/g und 65,8 nmol/g in der
Polyamingruppe. Die Puringruppe wies einen Spermidingehalt von 48,2 nmol/ml auf. Die
116

Ergebnisse
Spermingehalte lagen bei 130,2 nmol/g (Kontrollgruppe), 120,4 nmol/g (Polyamingruppe)
und 94,0 nmol/g in der Puringruppe.
Im distalen Jejunum wurden Putrescingehalte von 29,4 nmol/g (Kontrollgruppe), 15,3 nmol/g
(Polyamingruppe) und 15,4 nmol/g in der Puringruppe nachgewiesen. Die Cadaveringehalte
in diesem Darmabschnitt waren ebenfalls bei allen drei Gruppen niedrig (≤ 2,3 nmol/g). Die
Kontrollgruppe hatte einen Spermidingehalt von 120,0 nmol/g. Der Spermidingehalt der
Polyamin- und Puringruppe betrug 138,9 nmol/g bzw. 104,3 nmol/g.
Der Putrescingehalt im Ileum der Kontrollgruppe betrug 21,3 nmol/g Darmgewebe. In der
Polyamin- und Puringruppe wurden 22,8 nmol/g bzw. 9,2 nmol/g gemessen. Auch in diesem
Darmabschnitt waren die Cadaveringehalte bei allen drei Gruppen niedrig (≤ 2,9 nmol/g). Im
Ileum wies die Kontrollgruppe einen Spermidingehalt von 112,9 nmol/g auf, in der
Polyamingruppe lag der Spermidingehalt bei 119,3 nmol/g und in der Puringruppe bei 105,6
nmol/g Darmgewebe. Die Sperminkonzentrationen der Fütterungsgruppen waren 122,3
nmol/g (Kontrollgruppe), 131,9 nmol/g (Polyamingruppe) und 112,7 nmol/g in der
Puringruppe.
117

Ergebnisse
25
20
nmol / g
15
10
5
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 20: Putrescingehalte im Darmgewebe (Duodenum)
30
25
nmol / g
20
15
10
5
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 21: Putrescingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)
118

Ergebnisse
70
60
50
nmol / g
40
30
20
10
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 22: Putrescingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum)
140
120
100
nmol / g
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 23: Putrescingehalte im Darmgewebe (Ileum)
119

Ergebnisse
10
8
nmol / g
6
4
2
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 24: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Duodenum)
4
3
nmol / g
2
1
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 25: Cadaveringehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)
120

Ergebnisse
10
8
nmol / g
6
4
2
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 26: Cadaveringehalte im Darmgewebe (distales Jejunum)
8
6
nmol / g
4
2
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 27: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Ileum)
121

Ergebnisse
nmol / g
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 28: Spermidingehalte im Darmgewebe (Duodenum)
120
100
nmol / g
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Purine vs. Polyamine p < 0,05 (LS-Means)
Abb. 29: Spermidingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)
122

Ergebnisse
250
200
nmol / g
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Purine vs. Polyamine p < 0,05 (LS-Means)
Abb. 30: Spermidingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum)
nmol / g
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 31: Spermidingehalte im Darmgewebe (Ileum)
123

Ergebnisse
nmol / g
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 32: Spermingehalte im Darmgewebe (Duodenum)
250
200
nmol / g
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 33: Spermingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)
124

Ergebnisse
350
300
250
nmol / g
200
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 34: Spermingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum)
200
160
nmol / g
120
80
40
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 35: Spermingehalte im Darmgewebe (Ileum)
125

Ergebnisse
4.3.3 Prozentuale Anteile der Amine des Chymus und Darmgewebes im distalen
Jejunum
Vergleicht man den prozentualen Anteil der einzelnen Amine am Gesamtamingehalt, so
zeichnen sich tendenziell gewisse Gruppenunterschiede ab. Diese Beobachtung ist anhand des
Gesamtamingehaltes im distalen Jejunum in Tab. 21 dargestellt.
Tab. 21: Anteile der Amine (in Mol.%) am Gesamtamingehalt im Chymus (C) und
Darmgewebe (D) des distalen Jejunums
Anteil am Gesamtamingehalt im
distalen Jejunum
Behandlung Putrescin Cadaverin Spermidin Spermin
Summe der Amine
(nmol/ml bzw.
nmol/g 100 %)
Kontrollgruppe
(n = 5)
C
D
29,2
9,9
39,5
0,3
5,3
40,2
26,0
49,6
171,3
298,3
Polyamingruppe
(n = 7)
C
D
18,3
4,7
28,7
0,3
3,5
42,8
49,5
52,2
286,1
324,4
Puringruppe
(n = 5)
C
D
13,9
5,9
25,2
0,9
7,4
40,2
53,5
53,0
205,8
259,4
Die Kontrollgruppe wies im Chymus und Darmgewebe einen tendenziell höheren
Putrescinanteil auf. Umgekehrt verhielt es sich mit den Sperminanteilen. Die Kontrollgruppe
hatte einen niedrigeren Sperminanteil im Chymus als die Polyamingruppe. In der Polyaminund
der Puringruppe ist Spermin sowohl im Chymus als auch im Darmgewebe das
126

Ergebnisse
dominierende Amin, obwohl nur die Polyamingruppe eine Sperminzulage mit dem Futter
erhalten hat.
4.4 Aktivität der Disaccharidasen und der Leucinarylamidase im
Chymus des Dünndarmes
Als Parameter für die Differenzierung der Dünndarmmukosa wurde die Aktivität der
Disaccharidasen Maltase (α-Glucosidase, EC 3.2.1.20) und Laktase (β-Galactosidase, EC
3.2.1.23) sowie der Aminopeptidase Leucinarylamidase (EC 3.4.11) im Chymus der vier
verschiedenen Abschnitte (Duodenum, proximales Jejunum, distales Jejunum und Ileum) des
Dünndarmes gewählt. Hierbei sollte geprüft werden, ob die verschiedenen Fütterungsrationen
einen Einfluß auf die Aktivität dieser Bürstensaummembranenzyme haben.
Eine Analyse der Enzymaktivitäten in den ausgewählten Kompartimenten des Dünndarmes
ergab, dass unabhängig vom Enzym und der Fütterungsgruppe die maximale Aktivität im
distalen Jejunum und Ileum zu verzeichnen war. Häufig stand nicht genügend
Untersuchungsmaterial von den einzelnen Tieren zur Verfügung. Dies führte zu noch
geringeren n-Zahlen bei den Chymusproben im Duodenum und Ileum (s. Tab. XXIX bis Tab.
XL im Anhang).
4.4.1 Maltaseaktivität
Die Daten zur Aktivität von Maltase (mU/g TS) im Dünndarmchymus sind aus Abb. 36 bis
Abb. 39 ersichtlich.
127

Ergebnisse
70
60
50
mU/g TS
40
30
20
10
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 1, Polyamingruppe n = 5, Puringruppe n = 3
Abb. 36: Maltaseaktivität des Chymus im Duodenum
mU/g TS
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 37: Maltaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum
128

Ergebnisse
3500
3000
2500
mU/g TS
2000
1500
1000
500
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Kontrolle vs. Purine p < 0,05
Abb. 38: Maltaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum
mU/g TS
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 3, Polyamingruppe n = 4, Puringruppe n = 2
Abb. 39: Maltaseaktivität des Chymus im Ileum
129

Ergebnisse
Aufgrund von fehlendem Probematerial der Tiere der Kontroll- und Puringruppe konnte der
arithmetische Mittelwert der Aktivität des Enzyms Maltase des Chymus im Duodenum nur
für die Polyamingruppe berechnet werden (6 mU/g TS). Die Aktivität von Maltase war
unabhängig von der Behandlungsgruppe stets im distalen Jejunum am höchsten. Die
Maltaseaktivität des Ileums war insgesamt geringer als im distalen Jejunum. Der
arithmetische Mittelwert der Maltaseaktivität im Ileum konnte aber aufgrund der geringen
Anzahl der Analysen in den anderen beiden Gruppen nur in der Polyamingruppe bestimmt
werden (1143 mU/g TS). Die Aktivität der Maltase in den beiden distalen
Dünndarmabschnitten war insgesamt deutlich höher als in den proximalen Darmabschnitten.
4.4.2 Laktaseaktivität
Die Ergebnisse zur Aktivität der Laktase (mU/g TS) im Dünndarmchymus sind aus Abb. 40
bis Abb. 43 ersichtlich.
mU/g TS
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 1, Polyamingruppe n = 6, Puringruppe n = 3
Abb. 40: Laktaseaktivität des Chymus im Duodenum
130

Ergebnisse
700
600
mU/g TS
500
400
300
200
100
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 41: Laktaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum
5000
4000
mU/g TS
3000
2000
1000
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 42: Laktaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum
131

Ergebnisse
3000
2500
mU/g TS
2000
1500
1000
500
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 3, Polyamingruppe n = 4, Puringruppe n = 2
Abb. 43: Laktaseaktivität des Chymus im Ileum
Die Laktaseaktivität im Chymus zeigte eine vergleichbare Verteilung wie die
Maltaseaktivität. Aufgrund von fehlendem Probematerial der Tiere der Kontroll- und
Puringruppe konnte der arithmetische Mittelwert der Aktivität des Enzyms Laktase des
Chymus im Duodenum und Ileum nur für die Polyamingruppe berechnet werden (43 mU/g
TS im Duodenum, 1862 mU/g TS im Ileum). Die Laktaseaktivität war wie die
Maltaseaktivität im distalen Jejunum unabhängig von der Behandlung am höchsten.
4.4.3 Leucinarylamidaseaktivität
Die festgestellten Aktivitäten der Leucinarylamidase (U/g TS) im Dünndarmchymus sind aus
Abb. 44 bis Abb. 47 ersichtlich.
132

Ergebnisse
2
1,6
U/g TS
1,2
0,8
0,4
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 1, Polyamingruppe n = 6, Puringruppe n = 3
Abb. 44: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Duodenum
U/g TS
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 45: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum
133

Ergebnisse
250
200
U/g TS
150
100
50
0
Kontrolle Polyam ine Purine
G ruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert; Gruppenunterschiede n.s.
Abb. 46: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum
250
200
U/g TS
150
100
50
0
Kontrolle Polyamine Purine
Gruppe
X = Einzeltiere, ▬ = Mittelwert;
Kontrollgruppe n = 3, Polyamingruppe n = 4, Puringruppe n = 2
Abb. 47: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Ileum
134

Ergebnisse
Die Leucinarylamidaseaktivität im Chymus zeigte ein ähnliches Verteilungsmuster wie die
Disaccharidasen Maltase und Laktase. Die Aktivität der Leucinarylamidase war stets in den
vorderen Abschnitten des Dünndarmes (Duodenum, proximales Jejunum) niedriger als in den
hinteren Dünndarmabschnitten (distales Jejunum, Ileum). Aufgrund von fehlendem
Probematerial der Tiere der Kontroll- und Puringruppe konnte der arithmetische Mittelwert
der Aktivität des Enzyms Leucinarylamidase des Chymus im Duodenum und Ileum nur für
die Polyamingruppe berechnet werden (0,7 U/g TS im Duodenum, 89 U/g TS im Ileum).
135

Diskussion
5 Diskussion
5.1 Aminbestimmung
Die von PIETRZAK (1997) beschriebene Methode zur Bestimmung von Aminen mit Hilfe der
Vorsäulen-Derivatisierung konnte nicht ohne Modifikation übernommen werden. Hierfür gab
es mehrere Gründe. Die Änderung der Komponenten der HPLC-Anlage führte bereits zu
unterschiedlichen chromatographischen Bedingungen. Die Probenmatrix stammte von einer
anderen Tierart (nicht Hund, sondern Schwein) und war nicht, wie in der beschriebenen
Methode Kot, sondern Chymus bzw. Darmgewebe mit sehr viel geringeren Amingehalten. In
der Arbeit von PIETRZAK (1997) lagen die Amingehalte in einem Berich zwischen 70 und 890
nmol/g Kot, während sich in der vorliegenden Arbeit die Werte in einem Bereich zwischen
0,01 und 179 nmol/g Darmgewebe bzw. 0,2 und 134 nmol/ml Chymus bewegten. Der
niedrigen Aminkonzentration gegenüber stand ein Überschuß an Aminosäuren in der
Probenmatrix. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Extraktionsversuche mit
Ionenaustauschern durchgeführt, die allerdings scheiterten. Eine Aufkonzentrierung der
Amine war nicht möglich. Des Weiteren war bei vorgegebener Methode die Derivatisierung
des Spermins nicht vollständig. Bei Putrescin waren Koelutionen zu verzeichnen, die eine
Auswertung unmöglich machten. Insgesamt erschwerten Störpeaks aufgrund unvollständiger
Reaktion mit FMOC-Cl die Auswertung der Chromatogramme. Daher wurden Versuche
durchgeführt, um eine quantitative Bestimmung der sehr niedrigen Amingehalte im
Dünndarmchymus sowie in Darmgewebeproben von Ferkeln zu ermöglichen.
Die vorliegende Methode basiert auf dem Verfahren von PIETRZAK (1997), einem
Vorsäulenderivatisierungsverfahren zur Fluoreszenzdetektion von Aminen. Hierbei wurde das
Derivatisierungsreagenz 9-Fluorenylmethylchloroformiat eingesetzt. Dies reagiert sowohl mit
primären als auch mit sekundären Aminogruppen zu fluoreszierenden Carbamaten unter der
Abspaltung von HCl. Die dabei entstehenden Derivate werden innerhalb von 30 s bis 3 min
gebildet und sind recht stabil. Bei den eigenen Untersuchungen konnten innerhalb von 48 h
136

Diskussion
nach dem Derivatisierungsvorgang keine Veränderungen der Analyseergebnisse festgestellt
werden, was auf die Stabilität der Derivate hinweist.
Aufgrund von koeluierenden Störpeaks war keiner der internen Standards für alle
untersuchten Matrizes geeignet. Deshalb wurden drei verschiedene Substanzen als interner
Standard verwendet, und zwar je nach Probe unterschiedliche. Die Linearität der
Fluoreszenzdetektion der Methode wurde für Putrescin und Cadaverin mit den internen
Standards 1,6-Diaminohexan und 1,7-Diaminoheptan in einem Meßbereich von 0,33 bis 6,61
nmol/ml Aufarbeitungsansatz bestätigt, für Spermidin und Spermin lag der lineare Bereich
der Fluoreszenzdetektion zwischen 0,33 und 3,31 nmol/ml Aufarbeitungsansatz. Innerhalb
dieser Bereiche war die Beziehung zwischen Peakfläche und Aminkonzentration linear. Mit
dem internen Standard 1,8-Diaminooktan wurde die Linearität der resultierenden Fluoreszenz
in einem Konzentrationsbereich zwischen 1,85 – 37,04 nmol/ml Aufarbeitungsansatz
bestätigt. Das Bestimmtheitsmaß (R 2 ) lag zwischen 0,993 für Spermidin und Spermin und
1,000 für Putrescin und Cadaverin (s. 4.2.3.1).
Im Hinblick auf die Fluoreszenzmessung zeigte die Methode zur quantitativen Bestimmung
der Amine eine gute Reproduzierbarkeit, ausgedrückt durch Peakflächenwerte bei einer
Standardkonzentration von 8,20 nmol/ml Aufarbeitungsansatz, mit Variationskoeffizienten
zwischen 2,47 % für Putrescin und 3,75 % für Spermidin (s. 4.2.3.2).
Die mit dieser Methode erreichte Nachweisgrenze von 15 fmol für Putrescin bzw. 0,75 fmol
für Spermin lag teilweise unter der von anderen Autoren für die Bestimmung von
Aminosäuren angegebenen Nachweisgrenze von 10 fmol (BETNÉR u. FÖLDI 1988; BETNÉR u.
FÖLDI 1986) bzw. 50 fmol (HAYNES et al. 1991 a; HAYNES et al. 1991 b). Die Nachweisgrenze
ist eine Größe zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit des instrumentellen
Analyseverfahrens, die in den eigenen Untersuchungen mittels verdünnter Amin-Standard-
Lösungen charakterisiert wurde. Es handelt sich hierbei nicht um einen Wert, der mittels
Standardaddition erzielt wurde, sondern mit Hilfe eines definierten Leerwertes ohne
schwankende Matrixeffekte (s. 4.2.3.3).
Auch die Wiedergewinnungen lieferten gute Ergebnisse, sowohl für die Chymus- als auch für
die Darmgewebeproben. Die Wiedergewinnungen für Putrescin, Cadaverin, Spermidin und
137

Diskussion
Spermin in der Matrix Chymus lagen in einem Bereich zwischen 90 % und 112 % mit
Variationskoeffizienten von 1,4 % bis 18,4 %. In der Matrix Darmgewebe lagen die
Wiedergewinnungen für die einzelnen Amine zwischen 91 % und 115 % bei
Variationskoeffizienten von 1,8 % bis 8,3 % (s. 4.2.3.2 und 4.2.3.5). Die Wiedergewinnungen
im Chymus beziehen sich auf einen niedrigen Konzentrationsbereich, wodurch
Verunreinigungen durch die Matrix besonders ins Gewicht fallen. Hierdurch werden die
erhöhten Variationskoeffizienten bedingt.
Eine quantitative Bestimmung von Histamin war mit dieser Methode nicht möglich. Zwar
reagierte Histamin mit FMOC-Cl zu mehreren fluoreszierenden Derivaten, diese erschienen
aber im Chromatogramm je nach Matrix an mehreren unterschiedlichen Lokalisationen und
waren kaum reproduzierbar, wodurch eine quantitative Auswertung der
Histaminkonzentration nicht möglich war. Auch PIETRZAK (1997) erläuterte die ungünstigere
Reproduzierbarkeit für Histamin. Diese Tatsache, dass Histamin schwieriger zu quantifizieren
ist als die in dieser Arbeit untersuchten übrigen Amine, wurde bereits von verschiedenen
Autoren beschrieben. Obwohl FMOC-Cl mit primären als auch sekundären Aminen unter
HCl-Abspaltung zu stabilen Derivaten reagiert, können bei ungenügenden
Reaktionsbedingungen alle oder nur einzelne Aminogruppen substituiert werden und somit
ein oder auch mehrere Peaks im Chromatogramm erscheinen. Je nach zugesetzter Menge an
FMOC-Cl setzt sich Histidin zum mono- oder disubstituierten Derivat um. BETNÉR und FÖLDI
(1988) unterdrückten die Bildung des Monoproduktes durch große Überschüsse an
Derivatisierungsreagenz. HARDUF et al. (1988) wendeten diese Derivatisierung erfolgreich auf
die Bestimmung von Tyramin, Tryptamin und 2-Phenylethylamin in Fleischprodukten an. Sie
berichteten aber, dass Histamin weder in Standard-Lösungen noch in Extrakten aus Fleisch,
denen Histamin zugesetzt worden war, mit FMOC-Cl reagierte.
Im Hinblick auf eine empfindliche quantitative Bestimmung der Amine Putrescin, Cadaverin,
Spermidin und Spermin in den beschriebenen Matrizes bietet die in der vorliegenden Arbeit
beschriebene Methode eine weitere Verbesserung der Analyse sehr geringer
Aminkonzentrationen. Auch hier sollte jedoch bedacht werden, wie auch PIETRZAK (1997)
anmerkte, dass Analyseresultate idealerweise mittels einer möglichst verschiedenen zweiten
Methode verifiziert werden sollten (MEYER 1996).
138

Diskussion
5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen
Die Effekte einer polyamin- bzw. purinhaltigen Diät auf verschiedene Enzymaktivitäten und
die Amingehalte im Chymus und Darmgewebe von Ferkeln sollten überprüft werden. Hierzu
standen 5 (Kontroll-, Puringruppe) bzw. 7 Ferkel (Polyamingruppe) bis zur einschließlich
dritten Lebenswoche zur Verfügung. Die institutseigenen Kapazitäten ließen im Hinblick auf
die Betreuung der Tiere und die Bearbeitung der Proben keine höheren Tierzahlen zu. Des
Weiteren handelte es sich um orientierende Untersuchungen mit dem Ziel der Fixierung von
Grunddaten, die in weiterführenden Untersuchungen mit höheren Tierzahlen fortgeführt
werden sollen. Das Absetzen am 5. bzw. 6. Lebenstag post natum und insbesondere die
anschließende Gewöhnung an die Milchaustauscherfütterung verliefen problemlos. In einer
persönlichen Mitteilung berichtete PLUSKE sowohl von der erfolgreichen Anfütterung sehr
früh abgesetzter Ferkel mit Hilfe der Flaschenfütterung als auch der Fütterung aus einem
Behälter ohne Saugeinrichtung. Er hob als bedeutenden Faktor für die erfolgreiche
Anfütterung die regelmäßige Überprüfung der Nahrungsaufnahme in den ersten 36 h hervor.
In dieser Zeit muss den Ferkeln das Trinken regelrecht antrainiert werden, da die Erfahrungen
zeigten, dass diese Phase auch das spätere Trinkverhalten prägt. Trotz der direkt im Anschluss
an das Absetzen durchgeführten Operation zur Verlegung eines Venenverweilkatheters
adaptierten die Ferkel rasch an die neue Situation. Die Fütterung erfolgte mit Zusätzen von
Spermin in der Polyamingruppe bzw. Adenosinmonophosphat und Guanosinmonophosphat in
der Puringruppe anhand von Konzentrationsangaben, die in der Literatur beschrieben wurden
(MOTYL et al. 1995; ORTEGA et al. 1995; BUENO et al. 1994). Auch die Untersuchungen von
BLACHIER et al. (1992), welche zeigten, dass die Sperminaufnahme der Enterozyten aus dem
Extrazellulärraum nach der Geburt ansteigt, die luminale Aufnahme von Putrescin und
Spermidin jedoch nachlässt, unterstützten die Entscheidung, Spermin als Futterzusatz
einzusetzen.
Am 21. Tag post natum, im Anschluss an die Euthanasie der Ferkel, wurden die Proben aus
den einzelnen Kompartimenten des Gastrointestinaltraktes entnommen. Die Aminbestimmung
erfolgte im Darmgewebe und im Chymus, die Enzymaktivitäten wurden im Chymus
gemessen. Aufgrund der geringen Größe des gesamten Verdauungstraktes wurde die
139

Diskussion
komplette Dünndarmwand und nicht nur die Dünndarmmukosa für die Amin-Analyse
verwendet. Die im Chymus bestimmten Enzymaktivitäten dienen dazu, die Tendenz einer
fütterungsbedingten Veränderung durch die einzelnen Zusätze zu erkennen und nicht dazu,
Rückschlüsse auf die tatsächliche Gesamtaktivität einzelner Enzyme zu erhalten. Es muss
berücksichtigt werden, dass auch hier tageszeitliche Schwankungen der Aktivität der im
Chymus vorhandenen Enzyme auftreten können, wie von RAAB (1998) bei der Untersuchung
der Saccharaseaktivität im Chymus von adulten Schweinen festgestellt wurde. Um den
Einfluß der letzten Fütterung vor der Euthanasie auf die Enzymaktivität im Chymus so gering
wie möglich zu gestalten, wurden alle Ferkel zum gleichen Zeitpunkt, d. h. ½ h postprandial,
eingeschläfert.
5.3 Diskussion der Ergebnisse der Amin- und Enzymbestimmung
Die Regulation der Proliferation und die Balance zwischen den Prozessen der Zellneubildung,
Differenzierung und Zellalterung sind das Resultat der Interaktion vieler verschiedener
Faktoren. Dazu gehören die Nährstoffe, aber auch andere Bestandteile der Nahrung und des
Darminhaltes, auch Hormone und Sekrete des Magen-Darmtraktes (PODOLSKY 1994). Die
Amine sind wichtige Bestandteile aller Säugetierzellen und essentiell für normales, adaptives,
aber auch malignes Wachstum von Geweben, d. h. die Proliferation von Zellen, aber auch
deren Differenzierung. In Versuchen an Ratten, die über einen längeren Zeitraum mit einer
polyaminarmen Diät gefüttert wurden, konnten LÖSER et al. (1999) eine Hypoplasie der
Darmmukosa feststellen. An der Leber hingegen waren keine Veränderungen feststellbar, was
wiederum auf die Bedeutung der Amine als wichtige intraluminale Wachstumsfaktoren
hinweist („luminal nutrition“). Die proliferationssteigernde Wirkung von Purinen auf die
Dünndarmmukosa von Schweinen wurde ausführlich von RAAB (1998) beschrieben. Diese
Hypothesen wurden in der vorliegenden Arbeit anhand der Aktivität von Disaccharidasen und
einer Aminopeptidase überprüft.
140

Diskussion
5.3.1 Amine im Chymus und Darmgewebe sowie Ergebnisse der
Darmmorphologie und Proliferationsparameter
Insgesamt variierten die Ergebnisse der Aminbestimmung in den Chymus- und
Darmgewebeproben sehr stark und waren von großen interindividuellen Unterschieden
geprägt.
Die Polyamingruppe wies in wenigen Fällen signifikant höhere Amingehalte in den Chymusbzw.
Darmgewebeproben im Vergleich zu den anderen beiden Gruppen auf. Die signifikanten
Unterschiede des Spermingehaltes im Chymus könnten durch das mit der Fütterung
verabreichte Spermin bedingt sein. Untersuchungen von DUFOUR et al. (1988) über eine
Spermidin- bzw. Sperminapplikation an junge Ratten ergaben, dass der Spermidin- und
Spermingehalt der intestinalen Mukosa in den Versuchsgruppen signifikant erhöht war, was
für die Aufnahme exogener Amine in die Zellen der Darmschleimhaut spricht. Im
Darmgewebe lagen jedoch hinsichtlich des Spermingehaltes keine signifikanten Unterschiede
vor.
In allen drei Fütterungsgruppen war der „Gradient“ der Amingehalte bezüglich der
untersuchten Darmabschnitte einer ähnlichen Verteilung unterworfen. Das bedeutet, dass die
Aminkonzentrationen unabhängig von der Behandlung in den hinteren Darmabschnitten
(distales Jejunum, Ileum) höher waren als in den vorderen Bereichen (Duodenum, proximales
Jejunum). Dieses Verteilungsmuster spiegelt sich auch deutlich bei den untersuchten
Enzymaktivitäten wider (höhere Aktivitäten in den distalen Darmabschnitten). Die
prozentualen Anteile der Amine am Gesamtamingehalt (s. Tab. 21) könnten auf den
Differenzierungsstatus der Enterozyten hinweisen. Nach BARDOCZ (1993) sind hohe
Putrescingehalte ein indirekter Hinweis für einen immaturen Status von Zellen, höhere
Spermidin- und Spermingehalte weisen auf eine gesteigerte metabolische Aktivität hin. Diese
Annahme ließ sich jedoch durch die Ergebnisse nicht eindeutig belegen. Ein hoher
Spermidingehalt kann auch das Resultat einer vermehrten bakteriellen Spermidinbildung sein
und ist nicht unbedingt ein Zeichen für einen erhöhten Differenzierungsstatus abgeschilferter
Darmzellen. Bezüglich der Polyamingruppe spricht das Spermidin/Sperminverhältnis gegen
die Vermutung, dass sich die Enterozyten in einem höher differenzierten Status befinden.
141

Diskussion
Dieser Quotient ist ebenfalls ein Marker für den Reifestatus von Zellen (BARDOCZ 1993;
KELLY et al. 1991 a). Ein niedriger Quotient ist ein Zeichen für eine geringe
Ausdifferenzierung. Mature Zellen weisen einen höheren Quotienten auf.
Tab. 22: Spermidin/Spermin-Quotient (SPD/SPN) im Duodenum (Gewebe) der einzelnen
Fütterungsgruppen
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
SPD/SPN 0,74 0,59 1,02
Der SPD/SPN-Quotient ist in der Polyamingruppe niedriger, steigt zur Kontrollgruppe hin an
und ist bei den purinsupplementierten Ferkeln höher (s. Tab. 22). Diese Daten sprechen gegen
die Hypothese, dass der Zusatz von Spermin in der Ration in physiologischen
Konzentrationen zu einer Steigerung der Differenzierung führt. In Anbetracht des Quotienten
scheint die Supplementierung mit Purinen die Differenzierung der Epithelzellen zu erhöhen.
Diese Beobachtung wird teilweise durch morphologische Kriterien unterstützt
(AMSELGRUBER, persönliche Mitteilung). Die Puringruppe verfügt über die ausgeprägteste
Krypten-Villuslänge im Duodenum (975 µm), an zweiter Stelle folgt die Polyamingruppe
(842 µm). Die Kontrollgruppe besitzt eine Krypten-Villuslänge von 759 µm. Die Daten der
morphologischen Auswertung weisen darauf hin, dass sich die unterschiedlichen
Fütterungsregime am Duodenum, dem Abschnitt, der als erstes mit dem Mageninhalt in
Kontakt tritt, am deutlichsten auswirken. Im Duodenum wurden die längsten Darmzotten
gemessen. Purine scheinen mehr Einfluß auf die Morphologie zu nehmen als Polyamine. Der
Purineffekt steht im Einklang zu den Ergebnissen bei maturen Tieren (RAAB 1998) und
könnte die Hypothese bestätigen, dass auch bei Ferkeln die Purinverfügbarkeit einen Einfluß
auf die Darmmorphologie besitzt. Die Villuslänge ist als Folge einer erhöhten
Zellproliferation in den Krypten zu interpretieren. Es ist anzunehmen, dass die erhöhten
Villus-Kryptenlängen in der Puringruppe das Resultat einer bereits stattgefundenen hohen
Zellproliferation sind. Vergleicht man die Ergebnisse des Proliferationsparameters Ki-67
142

Diskussion
(AMSELGRUBER, persönliche Mitteilung), wird deutlich, dass dieser im Jejunum höher ist als
im Duodenum (Tab. 23). Als Ki-67 wird ein Protein bezeichnet, das proliferierende Zellen im
Zellkern exprimieren. Tendenziell weist die Puringruppe das geringste Ausmaß an
Zellteilungen auf. Der Proliferationsmarker Thymidinkinase zeigt ebenfalls eine tendenziell
höhere Aktivität im distalen Bereich (GUTSCHER, persönliche Mitteilung). Es ließen sich
jedoch keine signifikanten Gruppenunterschiede nachweisen.
Tab. 23: Proliferationsparameter Ki-67 (% positiver Zellen an der Gesamtzellzahl in den
Krypten) und Thymidinkinaseaktivität (U/mg cytosolisches Protein)
Behandlung
Proliferationsparameter
Kontrollgruppe
Polyamingruppe
Puringruppe
(n = 5)
(n = 7)
(n = 5)
Ki-67 1 Duodenum 33,7 34,9 30,4
mittleres Jejunum 47,1 44,9 40,8
proximales Jejunum 22,2 20,1 19,4
Thymidinkinase
2 distales Jejunum 26,2 20,0 23,6
Quelle: 1 AMSELGRUBER und 2 GUTSCHER, persönliche Mitteilung
Zunächst scheint die tendenziell höhere Proliferationsrate in der Kontrollgruppe im
Widerspruch zu den morphologischen Daten zu stehen. Beim Darmepithel handelt es sich
jedoch um ein dynamisches System, so dass die Messungen der Proliferationsparameter im
Gewebe nur eine Momentaufnahme wiedergeben.
Der prozentuale Cadaverinanteil der Darmgewebeproben ist im Gegensatz zu den
Chymusproben in allen drei Fütterungsgruppen gering. Das Diamin Cadaverin wird fast
ausschließlich von Bakterien gebildet. Bei Ornithinmangelsituationen in Geweben kann das
143

Diskussion
Enzym Ornithindecarboxylase (ODC) zusätzlich die Aminosäure Lysin decarboxylieren und
es entsteht Cadaverin (BARDOCZ 1993). Bei den Versuchstieren im Gewebe nachgewiesenes
Cadaverin könnte sowohl endogenen Ursprungs sein, wobei jedoch eine vorliegende
Ornithinmangelsituation unwahrscheinlich ist. Die exogene Herkunft scheint deshalb
wahrscheinlicher. Es ist anzunehmen, dass es sich auch bei dem im Chymus nachgewiesenen
Cadaverin um das Produkt der im Dünndarm befindlichen Bakterienpopulation handelt. Diese
bakterielle Stoffwechselaktivität wurde von DIERICK et al. (1986) hauptsächlich in den
hinteren Abschnitten des Dünndarmes festgestellt, ihre Aktivität im Duodenum wurde als
vernachlässigbar bezeichnet. Ähnliche Verhältnisse spiegeln auch die Ergebnisse der
Cadaverinbestimmung im Chymus der beiden Dünndarmabschnitte (proximales und distales
Jejunum) wider, wenn auch nur tendenziell, so ist doch der Gehalt an Cadaverin im vorderen
Darmbereich geringer.
PIETRZAK (1997) bestimmte die Amingehalte im Mageninhalt und Chymus verschiedener
Darmabschnitte von Ferkeln am Tag 6 nach dem Absetzen nach Verfütterung einer Griebenbzw.
Sojadiät. Putrescin war das dominierende Amin in allen Proben mit einem Maximum im
Jejunum von 1629 nmol/g. Die Cadaveringehalte waren ebenfalls im Jejunum am höchsten
(457 nmol/g), während Histamin in allen Abschnitten nicht detektiert werden konnte. Spermin
war nicht in allen Proben nachweisbar. Im Colon wurde ein Spermidinmaximum von 298
nmol/g gemessen. Da in den eigenen Untersuchungen die Angaben der Aminergebnisse im
Chymus in nmol/ml gemacht wurden, gestaltet sich ein Vergleich der Resultate schwierig. Es
lässt sich jedoch erkennen, dass die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen um ein
Vielfaches unter den oben beschriebenen Analyseresultaten liegen. In der Literatur werden
Angaben über Amingehalte im Magen-Darm-Trakt hauptsächlich in Form von
Aminkonzentrationen der Darmmukosa (DUFOUR et al. 1988; SEIDEL et al. 1985) und selten
als Amingehalt der kompletten Darmwand oder des Chymus angegeben, weshalb
vergleichende Betrachtungen kaum möglich sind. Die Untersuchungen über Amingehalte von
Darmgewebe wurden in erster Linie an Ratten durchgeführt. KELLY et al. (1991 a)
untersuchten erstmals den Amingehalt der Dünndarmmukosa von ein bis acht Wochen alten
Ferkeln. Putrescin wurde vor allem in den vorderen Dünndarmabschnitten nachgewiesen
(0,04 – 40,0 µmol/10 cm Darmlänge). Das Alter der Ferkel hatte keinen signifikanten Einfluß
144

Diskussion
auf den Putrescingehalt. Der Spermidingehalt (Angaben in µmol/10 cm Darmlänge) nahm bis
zur siebten Lebenswoche zu und verringerte sich dann in der achten Woche. Die
Sperminkonzentration stieg ebenfalls stetig bis zur fünften Lebenswoche an, um dann dieses
Niveau zu halten. LORET et al. (2000) befaßten sich ebenfalls mit der Wirkung von oral
verabreichtem Spermin bei Ferkeln. Die Autoren untersuchten die Akkumulation des oral
verabreichten Spermins bzw. des natürlicherweise in der Sauenmilch vorkommenden
Polyamins Spermidin in den roten Blutkörperchen sowie im Blutplasma. Obwohl durch die
Sperminapplikation signifikant höhere Aminkonzentrationen in den roten Blutkörperchen und
im Plasma nachgewiesen wurden, konnte der Bezug zum oral aufgenommenen Spermin nicht
zweifelsfrei geklärt werden. Des Weiteren wurde die Aminsekretion in
Bauchspeicheldrüsensekret bei ca. 4 Wochen alten Ferkeln untersucht. Interessanterweise
wurde beobachtet, dass die höchsten Aminkonzentrationen dann gefunden wurden, wenn der
Proteingehalt des Drüsensekretes maximale Werte erreichte. Die Autoren stellten die
Hypothese auf, dass die Pankreas-Polyamine einen Kontrollmechanismus darstellen, der
polyamininduzierte/s Wachstum und Differenzierung des Darmepithels steuert. Außerdem
scheint das natürlich vorkommende, teilweise im Zellkern lokalisierte Polyamin Spermin eine
wichtige Rolle beim Schutz der DNA vor dem Angriff durch freie Radikale zu haben (HA et
al. 1998).
Insgesamt lässt sich aus den Untersuchungen ableiten, dass es bei einer weiteren
Versuchsreihe sicherlich sinnvoll wäre, den Amingehalt zusätzlich in der Darmmukosa zu
bestimmen. Eine vergleichende Betrachtung mit anderen Literaturstellen würde dadurch
einfacher, auch wenn diese sich größtenteils auf Versuche mit Ratten beziehen.
145

Diskussion
5.3.2 Enzymaktivitäten im Chymus
5.3.2.1 Maltase
HENNING stellte 1982 die Hypothese auf, dass differenzierte Enterozyten sich von weniger
differenzierten Enterozyten auch in ihrem Enzymmuster unterscheiden. Während die
spezifische Aktivität des mukosalen Enzyms Laktase mit fortschreitender
Darmdifferenzierung abnimmt, steigt die Aktivität der Enzyme Maltase und Saccharase an.
Die Ergebnisse der Laktase- und Maltasemessung in der vorliegenden Arbeit sind
Momentaufnahmen und erlauben keine Aussage über zeitabhängige Aktivitätsveränderungen.
In der folgenden Tabelle (Tab. 24) wird auf die Ergebnisse der Enzymaktivitäten des Chymus
im distalen Jejunum näher eingegangen. Die Angaben über die Aktivität der Saccharase und
Alkalischen Phosphatase stammen aus einer persönlichen Mitteilung von GUTSCHER.
Tab. 24: Enzymaktivitäten des Chymus im distalen Jejunum
Behandlung
Enzym
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
Laktase (mU/g TS) 1867 1799 3148
Saccharase (mU/g TS) 1 450 676 1196
Maltase (mU/g TS) 886 1372 2160
Leucinarylamidase (U/g TS) 60 61 118
Alkalische Phosphatase (U/g TS) 1 42836 81402 124869
1 Quelle: GUTSCHER, persönliche Mitteilung
146

Diskussion
Die Aktivität der untersuchten Parameter im distalen Jejunum unterschied sich nur im Fall
von Maltase signifikant (Kontrolle vs. Purine p< 0,05). Aufgrund der hohen interindividuellen
Variabilität konnten weitere Gruppenunterschiede nicht statistisch abgesichert werden. Die
Enzyme zeigten eine vergleichbare gruppenabhängige Tendenz, wie für die morphologischen
Parameter im Duodenum gezeigt werden konnte.
Die Apoptoserate (AMSELGRUBER, persönliche Mitteilung) hatte eine ähnliche Verteilung wie
die Proliferationsmarker Ki-67 und die Thymidinkinase (s. 5.3.1). Apoptotische Zellen in der
Darmmukosa wurden mittels eines polyklonalen Antikörpers gegen „single-stranded DNA“
(ssDNA) nachgewiesen. Der höchste Anteil an apoptotischen Zellen wurde in der
Kontrollgruppe (100% ssDNA-positive Zellen) nachgewiesen. Die Apoptoserate der
Polyamingruppe (94% ssDNA-positive Zellen) und Puringruppe (87% ssDNA-positive
Zellen) war geringer als in der Kontrollgruppe. Wie schon bei maturen Tieren gezeigt werden
konnte (RAAB et al. 1998), folgt auch bei den juvenilen Tieren die Apoptoserate der
Mitoserate, die Schrittmacherfunktion ausübt. Die höchste Zellteilungsrate und der höchste
Anteil an apoptotischen Zellen in der Kontrollgruppe lassen auch eine höhere Aktivität der
Bürstensaummembranenzyme erwarten, was jedoch nicht der Fall ist. Als weiteres
morphologisches Merkmal wurde die durchschnittliche Anzahl der Zellen entlang einer
Darmzotte im histologischen Schnitt von der Kryptenbasis bis zur Zottenspitze bestimmt
(AMSELGRUBER, persönliche Mitteilung). Bei genauerer Betrachtung der
Zottengesamtzellzahl (Kontrollgruppe 100%, Polyamingruppe 87%, Puringruppe 133%) ist
auffällig, dass in der Gruppe mit Purinsupplementierung die Zottengesamtzellzahl um ein
Drittel über der durchschnittlichen Zellanzahl einer Darmzotte (histologischer Schnitt) der
Kontrollgruppe liegt. Dies könnte ein Hinweis dafür sein, dass mehr mature Zellen zur
Verfügung stehen und diese in das Darmlumen abgeschilfert werden.
5.3.2.2 Laktase
Die Laktaseaktivität im Chymus zeigte eine vergleichbare Verteilung wie die
Maltaseaktivität. KELLY et al. (1991 c) berichten über die signifikante Abnahme der Laktase
im Verlauf der ersten acht Lebenswochen von Ferkeln. Stärkere Aktivitätsabnahmen wurden
bei Tieren festgestellt, die ausschließlich mit Milch der frühen Laktationsphase gefüttert
147

Diskussion
wurden. Als Ursache dafür werden Inhaltsstoffe der Milch früher Laktationsstadien
angenommen, die jedoch nicht genauer beschrieben wurden. Diese könnten zu kürzerer
Lebenserwartung der Enterozyten, einer verminderten Synthese von Enzymprotein,
veränderten posttranslationalen Modifikationen des Enzymproteins, aber auch zu einer
Kombination all dieser Aspekte führen und in einer verminderten Laktaseaktivität resultieren.
Die Angaben der Enzymaktivität in µmol/min/g Protein und die Messung in Extrakten der
Mukosa verhindert eine vergleichende Betrachtung mit den eigenen Resultaten. Eine Studie
von SANGILD et al. (1991) bestätigt die Abnahme der Laktaseaktivität mit zunehmendem
Alter der Ferkel. Untersuchungen mit Zusätzen an adrenocorticotropem Hormon (ACTH)
hatten keinen signifikanten Einfluß auf die Laktase, die Aktivität von Maltase und Saccharase
stieg jedoch unter ACTH-Einfluß signifikant an. Die Angaben wurden in Units/mg
Mukosaprotein gemacht.
5.3.2.3 Leucinarylamidaseaktivität
Die Leucinarylamidaseaktivität im Chymus zeigte ein ähnliches Verteilungsmuster wie die
Disaccharidasen Maltase und Laktase. Angaben über die Untersuchung dieser
Aminopeptidase beim Schwein liegen in der Literatur kaum vor. Bereits 1971 untersuchten
CAMPBELL et al. die Aktivität der Leucinaminopeptidase (Leucinarylamidase) sowie deren
Verteilung im Dünndarm von Ferkeln mit einem Alter bis zu 14 Tagen. Die
Enzymuntersuchung erfolgte in der kompletten Darmwand und nicht, wie in der vorliegenden
Arbeit, im Chymus. Auch bei dieser Analyse wurden im distalen Bereich des Dünndarmes
höhere Aktivitäten gemessen als in den vorderen Abschnitten.
MAROUX et al. extrahierten 1973 eine ganze Gruppe von Aminopeptidasen aus der
Bürstensaummembranregion des Jejunums und Ileums von maturen Schweinen. Hierbei
interessierte jedoch nicht die Aktivität dieser Enzyme, sondern die chemische
Zusammensetzung und Eigenschaften der extrahierten Moleküle.
148

Schlussfolgerungen
5.4 Schlussfolgerungen
Die Untersuchung zum Einfluss moderater Polyamin- und Puringehalte im Milchaustauscher
für Ferkel im Vergleich zu einer polyamin- und purinarmen Kontrolldiät auf die Amingehalte
von Dünndarmchymus und Darmgewebe sowie die Aktivität von Disaccharidasen und einer
Aminopeptidase zeigte, dass abgesehen von wenigen Ausnahmen keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der genannten Parameter in den Behandlungsgruppen festgestellt
werden konnten. Es ergaben sich gewisse Hinweise auf eine tendenziell verstärkte
Reifung/Differenzierung des Darmes der Puringruppe. Diese Tendenz zeigte sich bei der
Überprüfung des Spermidin/Spermin-Quotienten. Auch die parallel von anderen
Untersuchern ermittelten morphologischen Parameter könnten einen erhöhten Reifestatus des
Darmepithels der Puringruppe andeuten.
Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass weiterführende Untersuchungen mit
höheren bzw. gestaffelten Zulagen an Polyaminen und Purinen einen tieferen Einblick in die
Zusammenhänge der Darmausreifung bei Ferkeln bringen könnten und daher eine sinnvolle
Ergänzung des hier vorgestellten Ansatzes darstellen würden. Anhand der Bestimmung des
Amingehaltes und der Enzymaktivitäten in der Dünndarmmukosa könnten weitere
Erkenntnisse über die Beeinflussung der Darmdifferenzierung durch die verwendeten Zusätze
gewonnen werden. Des Weiteren wären mikrobiologische Untersuchungen des Darminhaltes
sinnvoll, um weitere Rückschlüsse auf die Herkunft der nachgewiesenen Amine besser führen
zu können.
149

Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluß eines polyamin- bzw. purinhaltigen
Milchaustauschers auf die Amingehalte sowie verschiedene Enzyme im Dünndarm beim
Ferkel zu prüfen. Hierzu wurden drei verschiedene Fütterungsgruppen gebildet
(Kontrollgruppe, Polyamingruppe, Puringruppe). Die Ferkel erhielten einen Milchaustauscher
ohne (Kontrollgruppe) bzw. mit einem Zusatz an Spermin (Polyamingruppe) oder
Adenosinmonophosphat und Guanosinmonophosphat (Puringruppe). Die täglich
aufgenommene Polyamin- bzw. Purinmenge wurde rechnerisch ermittelt. Im Alter von 21
Tagen erfolgte die Euthanasie der Ferkel. Die entnommenen Proben (Dünndarmgewebe und
-chymus) wurden bis zur Analyse bei ca. -74°C gelagert.
Methodische Voruntersuchungen dienten der Etablierung eines HPLC-Verfahrens zur
qualitativen und quantitativen Bestimmung von Aminen. Die chromatographische Trennung
und fluorimetrische Bestimmung der Amine Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin
erfolgte nach der Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethylchloroformiat.
Die Untersuchungen ergaben folgende Ergebnisse:
1. Die Ferkel adaptierten rasch an die neue Umgebung sowie die verabreichte Diät. Ihre
Entwicklung verlief altersgemäß, soweit dieses anhand der Körpermassezunahme
beurteilt werden konnte.
2. Der Amingehalt im Dünndarmgewebe und -chymus unterschied sich in den
Fütterungsgruppen in wenigen Fällen signifikant. Den höchsten Anteil am
Gesamtspektrum der Amine hatte in den Gewebeproben Spermin im distalen Jejunum
der Polyamingruppe (169,1 nmol/g). Bei den Chymusproben wies ebenfalls die
Polyamingruppe den höchsten Spermingehalt im distalen Jejunum auf (141,7
nmol/ml). Der Gesamtamingehalt war in der Polyamingruppe sowohl in den Chymus-
(286,1 nmol/ml) als auch in den Gewebeproben (324,4 nmol/g) tendenziell gegenüber
den Vergleichsgruppen erhöht. Der Spermidin/Spermin-Quotient deutet
möglicherweise auf eine fortgeschrittenere Differenzierung der Darmmukosa der
150

Zusammenfassung
Puringruppe hin. Diese Beobachtung wird weiterhin durch die parallel von anderen
Untersuchern erhobenen Ergebnisse der morphologischen Untersuchungen unterstützt.
3. Bei der Untersuchung der Aktivität der Disaccharidasen sowie der Aminopeptidase
konnten keine signifikanten Gruppenunterschiede festgestellt werden. Im distalen
Dünndarmchymus wurden unabhängig vom untersuchten Parameter jeweils höhere
Aktivitäten als im Chymus der proximalen Darmabschnitte gemessen.
4. Die zur Bestimmung von Aminen verwendete Methode erwies sich als gut
reproduzierbar (Variationskoeffizienten zwischen 2,5 % für Putrescin und 3,8 % für
Spermidin). Die Linearität der Fluoreszenzdetektion der Methode wurde für Putrescin
und Cadaverin mit den internen Standards 1,6-Diaminohexan und 1,7-Diaminoheptan
in einem Meßbereich von 0,33 bis 6,61 nmol/ml Aufarbeitungsansatz bestätigt, für
Spermidin und Spermin lag der lineare Bereich der Fluoreszenzdetektion zwischen
0,33 und 3,31 nmol/ml Aufarbeitungsansatz. Mit dem internen Standard 1,8-
Diaminooktan wurde die Linearität der resultierenden Fluoreszenz in einem
Konzentrationsbereich zwischen 1,85 – 37,04 nmol/ml Aufarbeitungsansatz bestätigt.
Die Wiedergewinnungen für die Amine in der Matrix Chymus lagen in einem Bereich
zwischen 90 % und 112 % mit Variationskoeffizienten von 1,4 % bis 18,4 %. Im
Darmgewebe lagen die Wiedergewinnungen für die einzelnen Amine zwischen
91 % und 115 % bei Variationskoeffizienten von 1,8 % bis 8,3 %. Die mit dieser
Methode erreichten Nachweisgrenzen lagen zwischen 15 fmol für Putrescin bzw. 0,75
fmol für Spermin.
Anhand der Untersuchungen konnte in einzelnen Fällen der Einfluß einer Polyamin- oder
Purinzulage auf die Konzentration der Amine im Gewebe und Chymus des Dünndarmes von
Ferkeln gezeigt werden. Die Purinverfügbarkeit könnte ein Faktor für die Differenzierung der
Darmmukosa sein, die eigenen Ergebnisse waren jedoch in vielen Fällen tendenzieller Natur.
Für die abschließende Beurteilung nutritiver Polyamin- bzw. Purinergänzungen auf
Differenzierungs- und Funktionsmerkmale des Dünndarmes sind weiterführende Arbeiten
erforderlich, in denen unter Verwendung größerer Tierzahlen die Wirkung höherer bzw.
gestaffelter Zulagen dieser Substanzen zu prüfen ist.
151

Summary
7 Summary
Schad, Andrea:
The effect of supplemental spermine or nucleotides on amine
concentrations and enzyme activities in the small intestine of piglets.
The objective of the present study was to examine the dietary effect of supplemental
polyamine or purine sources on amine levels and enzyme activities in the small intestine of
piglets. The piglets were allocated to three different treatments (control, polyamine and purine
group). The control was fed a milk replacer that was either supplemented with spermine for
the polyamine group or with a combination of adenosinemonophosphate and
guanosinemonophosphate (purine group). The calculation of the daily polyamine and purine
intake was based on the daily consumption of the milk replacer in these treatments. The
piglets were euthanised at 21 days of age. The samples of small intestinal tissue and digesta
were stored at approximately -74°C until further analyses.
A HPLC method for the quantitative and qualitative determination of amines in tissue and
digesta samples was developed. The pre-column derivatization with 9-
fluorenylmethylchloroformate was followed by chromatographic separation and fluorimetric
analysis of the amines putrescine, cadaverine, spermidine and spermine.
Results:
1. The piglets adapted immediately to the new environment and the different diets, and
the zootechnical variables revealed no abnormalities.
2. Diet composition affected the levels of amines in small intestinal tissue and digesta
samples, although these treatment effects were not always significant. The highest
concentrations of spermine were measured in tissue (169.1 nmol/g) and digesta (141.7
nmol/g) samples obtained from the distal part of the jejunum of the polyamine group.
Accordingly, total amine levels in tissue (324.4 nmol/ml) and digesta samples (286.1
nmol/g) were also higher in the polyamine group compared to the other treatments.
152

Summary
The spermidine/spermine ratio, in agreement with the results of the morphological
analyses, would suggest that the intestinal mucosa of the purine group could be more
differentiated in comparison to the other groups.
3. There was no dietary effect on the activities of both the disaccharidases and the
aminopeptidase in digesta samples, however, the activities were consistently higher in
samples obtained from the distal part of the small intestine as compared to those taken
from the proximal part of the small intestine.
4. The method that was developed for the determination of amines in tissue and digesta
samples revealed a good repeatability with variation coefficients between 2.5 % and
3.8 % for the fluorimetric measurements. The values for putrescine and cadaverine
followed linearity in the range from 0.33 to 6.61 nmol/ml whereas the corresponding
values for spermidine and spermine ranged between 0.33 to 3.31 nmol/ml provided
that 1.6-diaminohexane or 1.7-diaminoheptane were used as internal standards.
However, using 1.8-diaminooctane as an internal standard, linear measurements for
these amines were obtained in the range from 1.85 to 37.04 nmol/ml. The recoveries
for amines in digesta ranged between 90 % and 112 %, with variation coefficients
between 1.4 % and 18.4 %. In small intestinal tissue samples the recovery of these
amines ranged between 91 % and 115 %, with variation coefficients between 1.8 %
and 8.3 %. The detection limit of the present method was obtained at 15.0 and 0.75
fmol for putrescine and spermine, respectively.
The results of the present study suggest that dietary supplementation of polyamines and
purines may affect amine levels in tissue and digesta samples obtained from the small
intestine of piglets. However, the differences between treatments were only in some cases
significant, and further investigations are warranted to confirm these results. There are
indications that the differentiation of the intestinal mucosa was enhanced in the presence of
supplemental purines, but these non significant results need also to be verified. Future
research activities should focus on the effect of higher and/or graded levels of polyamines and
purines on gut differentiation and function of early weaned piglets.
153

Literaturverzeichnis
8 Literaturverzeichnis
ACED,G. u. H. J. MÖCKEL (1991):
Liquidchromatographie.
VCH, Weinheim, New York, Basel, Cambridge
ADJEI, A. A., T. MORIOKA, C. K. AMEHO, K. YAMAUCHI, A. D. KULKARNI, H: M. S.
H. AL-MANSOURI, A. KAWAJIRI u. S. YAMAMOTO (1996):
Nucleoside-nucleotide free diet protects rat colonic mucosa from damage induced by
trinitrobenzene sulphonic acid.
Gut 39, 428-433
ALGERMISSEN, B., M. NÜNDEL u. E. RIEDEL (1989):
Analytik von Aminosäuren mit Fluoreszenz-HPLC.
GIT Fachz. Lab. 9, 783-790
AMSELGRUBER; W. M.; Prof. Dr.
Institut für Umwelt und Tierhygiene, Fachgebiet Anatomie und Physiologie der Haustiere,
Universität Hohenheim
ASKAR, A. (1984):
Histamin und Fleischhygiene.
Z. ges. Hyg. 30, 699-701
ASKAR, A. u. H. TREPTOW (1986):
Biogene Amine in Lebensmitteln.
Eugen Ulmer Verlag, Stuttgart
ASKAR, A., A. DROSS, G. KIELWEIN, H. TREPTOW u. R. WITTKOWSKI (1996):
Biogene Amine in Lebensmitteln.
In: Biogene Amine in der Ernährung. BEUTLING, D. M. (Hrsg.)
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
AUMAITRE, A. u. T. CORRING (1978):
Development of digestive enzymes in the piglet from birth to 8 weeks. II. Intestine and
intestinal disaccharidases.
Nutr. Metab. 22, 244-255
BARDÓCZ, S. (1993):
Review: The role of dietary polyamines.
Europ. J. Clin. Nutr. 47, 683-690
154

Literaturverzeichnis
BARDÓCZ, S., G. GRANT, D. S. BROWN, A. RALPH u. A. PUSZTAI (1993):
Polyamine in food: Implications for growth and health.
J. Nutr. Biochem. 4, 66-71
BARDÓCZ, S., T.J. DUGUID, D. S. BROWN, G. GRANT, A. PUSZTAI, A. WHITE u. A.
RALPH (1995):
The importance of dietary polyamines in cell regeneration and growth.
Br. J. Nutr. 73, 819-828
BARNESS, L. A. (1994):
Dietary sources of nucleotides. From breast milk to weaning.
J. Nutr. 124, 128-130
BAROLIN, G. S., D. M. BEUTLING u. G. R. SCHLENKER (1996):
Gesundheitsstörungen beim Menschen durch biogene Amine.
In: Biogene Amine in der Ernährung. BEUTLING, D. M. (Hrsg.)
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
BARTOS, F., D. BARTOS, D. P. GRETTIE u. R. A. CAMPBELL (1977):
Polyamine levels in normal human serum. Comparison of analytical methods.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 75, 915-919
BENEKE, T. u. W. SCHWIPPERT (1999):
Winstat für EXCEL ®
Benutzerhandbuch
BERGMEYER, H.U. (Hrsg.) (1974):
Methoden der enzymatischen Analyse.
Verlag Chemie, Weinheim/Bergstraße
BERGMEYER, H. U. u. E. BERNT:
Bestimmung mit Glucose-Oxidase und Peroxidase.
In: Methoden der enzymatischen Analyse. BERGMEYER, H. U. (Hrsg.) (1974)
Verlag Chemie, Weinheim/Bergstraße
BETNÉR, I. u. P. FÖLDI (1988):
The FMOC-ADAM approach to amino acid analysis.
LC GC 6, 832-840
BETNÉR, I. u. P. FÖLDI (1996):
New automated amino acid analysis by hplc precolumns derivatization with
fluorenylmethyloxycarbonylchloride.
Chromatographia 22, 381-387
155

Literaturverzeichnis
BEUTLING, D. M. (1987):
Untersuchungen zur Histaminverwertung durch gramnegative Mikroben.
Mh. Vet.-Med. 42, 210-212
BEUTLING, D. M. (1996):
Biogene Amine und Mikroben.
In: Biogene Amine in der Ernährung. BEUTLING, D. M. (Hrsg.)
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
BEUTLING, D. M., H. W. BERGMANN u. G. R. SCHLENKER (1996):
Allgemeines über biogene Amine.
In: Biogene Amine in der Ernährung. BEUTLING, D. M. (Hrsg.)
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
BLACHIER, F. (1991):
Intestinal polyamines.
In: Proceedings of the Vth International Symposium on Digestive Physiology in Pigs.
EAAP Publication No 54 (1991), 222-233
BLACHIER, F., H. M´RABET-TOUIL, L. POSHO, M.-T. MOREL, F. BERNARD, B.
DARCY-VRILLON u. P.-H. DUÉE (1992):
Polyamine metabolism in enterocytes isolated from newborn pigs.
Biochim. Biophys. Acta 1175, 21-26
BOLLWAHN, W. (1982):
Ursachen angeborener und erworbener Saugferkelkrankheiten.
Tierärztl. Prax. 10, 339-346
BROSSAT, B., J. STRACZEK, F. BELLEVILLE, P. NABET u. R. METZ (1983):
Determination of free and total polyamines in human serum and urine by ion-pairing highperformance
liquid chromatography using a radial compression module. Application to blood
polyamine determination in cancer patients treated or not treated with an ornithine
decarboxylase inhibitor.
J. Chromatogr. 277, 87-99
BUDDECKE, E. (1989):
Grundriss der Biochemie.
Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York
BUDDINGTON, R. K. (1994):
Nutrition and ontogenetic development of the intestine.
Can. J. Physiol. Pharmacol. 72, 251-259
156

Literaturverzeichnis
BUENO, J., M. TORRES, A. ALMENDROS, R. CARMONA, M. C. NUNEZ, A. RIOS u. A.
GIL (1994):
Effect of dietary nucleotides on small intestinal repair after diarrhoea. Histological and
ultrastructural changes.
Gut 35, 926-933
BUTS, J.-P., N. DE KEYSER, J. KOLANOWSKI, E. SOKAL u. F. VAN HOOF (1993):
Maturation of villus and crypt cell functions in rat small intestine.
Dig. Dis. Sci. 38, 1091-1098
BUTS, J.-P., N. DE KEYSER, L. DE RAEDEMAEKER, E. COLLETTE u. E. M. SOKAL
(1995):
Polyamine profiles in human milk, infant artificial formulas, and semi-elemental diets.
J. Ped. Gastroenteral. Nutr. 21, 44-49
CAMPBELL, R. M., H. BROUGH u. B. F. FELL (1971):
The development of some digestive enzymes in the intestines of pigs reared artificially.
J. agric. Sci. 76, 531-538
CAPANO, G., K. J. BLOCH, E. J. SCHIFFRIN, J. A. DASCOLI, E. J. ISRAEL u. P. R.
HARMATZ (1994):
Influence of the polyamine, spermidine, on intestinal maturation and dietary antigen uptake in
the neonatal rat.
J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 19, 34-42
CARPINO, L. A. u. G. Y. HAN (1972):
The 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group.
J. Org. Chem. 37, 3404-3409
CARVER, J. D. (1994):
Dietary nucleotides: cellular immune, intestinal and hepatic system effects.
J. Nutr. 124, 144S-148S
CARVER, J. D. u. W. A. WALKER (1995):
The role of nucleotides in human nutrition.
Nutr. Biochem. 6, 58-72
CERA, K. R., D. C. MAHAN, R. F. CROSS, G. A. REINHART u R. E. WHITMOYER
(1988):
Effect of age, weaning and postweaning diet on small intestinal growth and jejunal
morphology in young swine.
J. Anim. Sci. 66, 574-584
157

Literaturverzeichnis
CHANG, J.-Y., R. KNECHT u. D. G. BRAUN (1981 a):
Amino acid analysis at the picomole level.
Biochem. J. 199, 547-555
CHANG, J.-Y., P. MARTIN, R. BERNASCONI u. D. G. BRAUN (1981 b):
High-sensitivity amino acid analysis: measurement of amino acid neurotransmitter in mouse
brain.
FEBS Lett. 132, 117-120
CHANG, J.-Y., R. KNECHT u. D. G. BRAUN (1983):
Amino acid analysis in the picomole range by precolumn derivatization and high-performance
liquid chromatography.
Meth. Enzym. 91, 41-48
CHEN, R. F., C. SCOTT u. E. TREPMAN (1979):
Fluorescence properties of o-phthaldialdehyde derivatives of amino acids.
Biochim. Biophys. Acta 576, 440-455
CICHY, M. A., D. L. STEGMEIER u. H. VEENING (1993):
High-performance liquid chromatographic separation of biogenic polyamines using 2-(1-
pyrenyl)ethylchloroformiat as a new fluorogenic derivatizing reagent.
J. Chromatogr. 613, 15-21
CLIFFORD, A. J. u. D. L. STORY (1976):
Levels of purines in foods and their metabolic effects in rats.
J. Nutr. 106, 435-442
CLAUS, R., A. BINGEL, S. HOFÄCKER u. U. WEILER (1990):
Twenty-four hour profiles of growth hormone (GH) concentrations in mature female and
entire male domestic pigs in comparison to mature wild boars (sus scrofa L.).
Livestock Prod. Sci. 25, 247-255
COHEN, S. A. u. D. J. STRYDOM (1988):
Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanate derivatives.
Anal. Biochem. 174, 1-16
CRANWELL, P. D. (1995):
Development of the neonatal gut and enzyme systems.
In: The neonatal pig: development and survival, M. A. VARLEY (edt.)
CAB International, Wallingford - Oxon, Chapt. 5, 99-153
CREAMER, B. (1967):
The turnover of the epithelium of the small intestine.
Br. Med. Bull. 23, 226-230
158

Literaturverzeichnis
DAHLQVIST, A.:
Disaccharidasen.
In: Methoden der enzymatischen Analyse. BERGMEYER, H. U. (Hrsg.) (1974)
Verlag Chemie, Weinheim/Bergstraße
DAHLQVIST, A. (1968):
Assay of intestinal disaccharidases.
Anal. Biochem. 22, 99-107
DELOYER, P., G. DANDRIFOSSE, C. BARTHOLOMEUS, N. ROMAIN, M. KLIMEK, J.
SALMON, P. GÉRARD u. G. GOESSENS (1996):
Polyamine and intestinal properties in adult rats.
Br. J. Nutr. 76, 627-637
DIERICK, N.A., I. J. VERVAEKE, J. A. DECUYPERE u. H. K. HENDERICKX (1976):
Determination of biogenic amines in intestinal contents by ion-exchange chromatography.
J. Chromatogr. 129, 403-406
DIERICK, N.A., I. J. VERVAEKE, J. A. DECUYPERE u. H. K. HENDERICKX (1986):
Influence of the gut flora and of some growth promoting feed additives on nitrogen
metabolism in pigs. I. Studies in vitro.
Livest. Prod. Sci. 14, 161-176
DORHOUT, B., A. VAN FAASSEN, CH. M. VAN BEUSEKOM, A. W. KINGMA, E. DE
HOOG, G. T. NAGEL, A. KARRENBELD, E. R. BOERSMA u. F. A. J. MUSKIET (1997):
Oral administration of deuterium-labelled polyamines to sucking rat pups: luminal uptake,
metabolic fate and effects on gastrointestinal maturation.
Br. J. Nutr. 78, 639-654
DUFOUR, C., G. DANDRIFOSSE, P. FORGET, F. VERMESSE, N. ROMAIN u. P.
LEPOINT (1988):
Spermine and spermidine induce intestinal maturation in the rat.
Gastroenterology 95, 112-116
EINARSSON, S., B. JOSEFSSON u. S. LAGERKVIST (1983):
Determination of amino acids with 9-fluorenylmethylchloroformate and reversed-phase high
performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. 282, 609-618
FITZPATRICK, L. R., P. WANG, B. E. EIKENBURG, M. K. HADDOX u. L. R. JOHNSON
(1986):
Effect of refeeding on polyamine biosynthesis in isolated enterocytes.
Am. J. Physiol. 250, 709-713
159

Literaturverzeichnis
FORTIN-MAGANA, R., R. HURWITZ, J. J. HERBST u. N. KRETCHMER (1970):
Intestinal enzymes: Indicators of proliferation and differentiation in the jejunum.
Science 167, 1627-1628
FREEMAN, T. C. (1995):
Parallel patterns of cell-specific gene expression during enterocyte differentiation and
maturation in the small intetsine of the rabbit.
Differentiation 59, 179-192
FÜRST, P., L. POLLACK, T. A. GRASER, H. GODEL u. P. STEHLE (1990):
Appraisal of four pre-column derivatization methods for the high-performance liquid
chromatographic determination of free amino acids in biological materials.
J. Chromatogr. 499, 557-569
GIL, A. u. F. SANCHEZ-MEDINA (1981):
Acid-soluble nucleotides of cow´s, goat´s and sheep´s milks, at different stages of lactation.
J. Dairy Res. 48, 35-44
GINTY, D. D., D. L. OSBORNE u. E. R. SEIDEL (1989):
Putrescine stimulates DNA-Synthesis in intestinal epithelial cells.
Am. J. Physiol. 257, 145-150
GUSTAVSSON, B. u. I. BETNÉR (1990):
Fully automated amino acid analysis for protein and peptide hydrolysates by precolumn
derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate and 1-aminoadamantane.
J. Chromatogr. 507, 67-77
GUTSCHER, M.
Institut für Tierhaltung, Fachgebiet Tierhaltung und Leistungsphysiologie,
Universität Hohenheim
HA, H. C., SIRISOMA, N. S., KUPPUSAMY; P., ZWEIER, J. L., WOSTER, P. M. u. R.A.
CASERO jr. (1998):
The natural polyamine spermine functions directly as a free radical scavenger.
Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 11140-11145
HAMPSON, D. J. (1986):
Alterations in piglet small intestinal structure at weaning.
Research in veterinary science 40, 32-40
HARADA, E., Y. HASHIMOTO u. B. SYUTO (1994):
Orally administered spermine induces precocious intestinal maturation of macromolecular
transport and disaccharidase development in suckling rats.
Comp. Biochem. Physiol. 109, 667-673
160

Literaturverzeichnis
HATANO, H., K. SUMIZU, S. ROKUSHIKA u. F. MURAKAMI (1970):
Automatic liquid chromatography of primary mono- and diamines on a cation-exchange resin.
Anal. Biochem. 35, 377-383
HAYMAN, A. R., D. O. GRAY u. S. V. EVANS (1985):
New high-performance liquid chromatography system for the separation of biogenic amines
as their Dns derivatives.
J. Chromatogr. 325, 462-466
HAYNES, P. A., D. SHEUMACK, J. KIBBY u. J. W. REDMOND (1991 a):
Amino acid analysis using derivatisation with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversedphase
high-performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. 540, 177-185
HAYNES, P. A., D. SHEUMACK, L. G. GREIG, J. KIBBY u. J. W. REDMOND (1991 b):
Applications of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate.
J. Chromatogr. 588, 107-114
HE, Y., S. W. CHU u. W. A. WALKER (1993):
Nucleotide supplements alter proliferation and differentiation of cultured human (Caco-2) and
rat (IEC-6) intestinal epithelial cells.
J. Nutr. 123, 1017-1027
HENNING, S. J. (1982):
Role of milk-borne factors in weaning and intestinal development.
Biol. Neonate 41, 265-272
HUBER, H. (1992):
Schweinefütterung: Zuchtsau, Ferkel, Mastschwein.
Leopold Stocker Verlag, Graz, Stuttgart
HURST, W. J. u. P. B. TOOMEY (1981):
High-performance liquid chromatographic determination of four biogenic amines in
chocolate.
Analyst 106, 394-402
IIJIMA, S., T. TSUJINAKA, M. KISHIBUCHI, Y. KIDO, C. EBISUI, K. KANN, M. YANO
u. T. MORI (1996):
A total parenteral nutrition solution supplemented with a nucleoside and nucleotide mixture
sustains intestinal integrity, but does not stimulate intestinal function after massive bowel
resection in rats.
J. Nutr. 126, 589-595
161

Literaturverzeichnis
IWAMI, K., J.-Y. WANG, R. JAIN, S. McCORMACK u. L. R. JOHNSON (1990):
Intestinal ornithine decarboxylase: half-life and regulation by putrescine.
Am. J. Physiol. 258, 308-315
JAEGER, L. A., C. H. LAMAR, G. D. BOTTOMS u. T. R. CLINE (1987):
Growth-stimulating substances in porcine milk.
Am. J. Vet. Res. 48, 1531-1533
JANKOWSKI, J. A., R. A. GOODLAD u. N. A. WRIGHT (1994):
Maintenance of normal intestinal mucosa: function, structure, and adaption.
Gut Suppl. 1, 1-4
JOHNSON, L. R. (1988):
Regulation of gastrointestinal mucosal growth.
Physiol. Rev. 68, 456-502
JOHNSON, L. R., P. D. BROCKWAY, K. MADSEN, J. A. HARDIN u. D. G. GALL (1995):
Polyamines alter intestinal glucose transport.
Am. J. Physiol. 268, 416-423
JOHNSON, L. R. u. S. A. McCORMACK (1994):
Regulation of gastrointestinal mucosal growth.
In: Physiology of the Gastrointestinal Tract. L. R. JOHNSON (edt.)
Raven Press, New York, Third Edit., 611-641
KAOUASS, M., J. SULON, P. DELOYER u. G. DANDRIFOSSE (1994):
Spermine-induced precocious intestinal maturation in suckling rats: possible involvement of
glucocorticoids.
Journal of Endocrinology 141, 279-283
KAOUASS, M., P. DELOYER, I. WERY u. G. DANDRIFOSSE (1996):
Analysis of structural and biochemical events occurring in the small intestine after dietary
polyamine ingestion in suckling rats.
Dig. Dis. Sci. 41, 1434-1444
KARMAS, E. (1981):
Biogenic amines as indicators of seafood freshness.
Lebensm.-Wiss. u. Technol. 14, 273-275
KATZ, E. D. (1996):
High performance liquid chromatography: principles and methods in biotechnology.
Verlag John Wiley & sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore
162

Literaturverzeichnis
KELLY, D., T. P. KING, D. S. BROWN u. M. McFADYEN (1991 a):
Polyamine profiles of porcine milk and of intestinal tissue of pigs during suckling.
Reprod. Nutr. Dével. 31, 73-80
KELLY, D., J. A. SMYTH u. K. J. McCRACKEN (1991 b):
Digestive development of the early weaned pig. 1. Effect of continous nutrient supply on the
development of the digestive tract and on changes in digestive enzyme activity during the first
week post-weaning.
Br. J. Nutr. 65, 169-180
KELLY, D., T.P. KING, M. McFAYDEN u. A. J. TRAVIS (1991 c):
Effect of lactation on the decline of brush border lactase activity in neonatal pigs.
Gut 32, 386-392
KIRSCHBAUM, J. (1995):
Entwicklung und Anwendung von HPLC-Methoden mit chemischer Derivatisierung und
selektiver Detektion zur Erfassung von Schadstoffen natürlicher Herkunft in Lebensmitteln.
Hohenheim, Univ. Hohenheim, Fak. I, Allg. u. Angewandte Naturwiss., Diss.
KIRSCHBAUM, J. u. B. LUCKAS (1994):
Pre-column derivatization of biogenic amines and amino acids with 9-
fluorenylmethylchloroformate and heptylamine.
J. Chromatogr. A 661, 193-199
KIRSCHBAUM, J., B. LUCKAS u. W.-D. BEINERT (1994):
HPLC-Analyse von biogenen Aminen und Aminosäuren in Nahrungsmitteln nach
automatischer Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethyl Chloroformiat (FMOC-Cl).
Deutsche Lebensmittel-Rundschau 90, 224-228
KOJIMA, K. (1974):
Safety evaluation of disodium 5´-inosinate, disodium 5´-guanylate and disodium 5´ribonucleotide.
Toxicology 2, 185-206
KOTZABASIS, K., M. D. CHRISTAKIS-HAMPSAS u. K. A. ROUBELAKIS-ANGELAKIS
(1993):
A narrow-bore HPLC method for the identification and quantitation of free, conjugated, and
bound polyamines.
Anal. Biochem. 214, 484-489
KRAUSE, I., A. BOCKHARDT, H. NECKERMANN, TH. HENLE u. H.
KLOSTERMEYER (1995):
Simultaneous determination of amino acids and biogenic amines by reversed-phase highperformance
liquid chromatography of the dabsyl derivatives.
J. Chromatogr. A 715, 67-79
163

Literaturverzeichnis
KUMAGAI, J., R. JAIN u. L. R. JOHNSON (1989):
Characteristics of spermidine uptake by isolated rat enterocytes.
Am. J. Physiol. 256, 905-910
LELEIKO, N. S. u. M. J. WALSH (1995):
Dietary purine nucleotides and the gastrointestinal tract.
Nutrition 11, 725- 730
LIN, J.-K. u. J.-Y. CHANG (1975):
Chromophoric labelling of amino acids with 4-dimethylaminoazobenzene-4´-sulfonyl
chloride.
Anal. Chem. 47, 1634-1638
LIN, J.-K. u. CH.-CH. LAI (1982):
Chromophoric determination of putrescine, spermidine and spermine with dabsyl chloride by
high-performance liquid chromatography and thin-layer chromatography.
J. Chromatogr. 227, 369-377
LÖSER, C., U. WUNDERLICH u. U. FÖLSCH (1988):
Reversed-phase liquid chromatographic separation and simultaneous fluorimetric detection of
polyamines and their monoacetyl derivatives in human and animal urine, serum and tissue
samples: an improved, rapid and sensitive method for routine application.
J. Chromatogr. 430, 249-262
LÖSER, C., A. EISEL, D. HARMS u. U. FÖLSCH (1999):
Dietary polyamines are essential luminal growth factors for small intestinal and colonic
mucosal growth and development.
Gut 44, 12-16
LORET, S., BROLET, P., PIERZYNOWSKI, S., GOUDERS, I., KLIMEK, M.,
DANIELSON, V., ROSTED, A., LESNIEWSKA, V. u. G. DANDRIFOSSE (2000):
Pancreatic exocrine secretions as a source of luminal polyamines in pigs.
Exp. Physiol. 85, 301-308
MACKINNON, A. M. u. D. J. DELLER (1973):
Purine nucleotide biosynthesis in gastrointestinal mucosa.
Biochim. Biophys. Acta 319, 1-4
MAIER-ROSENKRANZ, J. (1995):
Applikations-Service Anleitung. Methode zur empfindlichen Analyse von biogenen Aminen
und Polyaminen wie Cadaverin, Putrescin, Spermin, Histamin und Spermidin durch
Vorsäulenderivatisierung mit FMOC/EVA.
M. Grom, Herrenberger Str. 54, Herrenberg 2
164

Literaturverzeichnis
MANNERS, M. J. u. J. A. STEVENS (1972):
Changes from birth to maturity in the pattern of distribution of lactase and sucrase activitiy in
the mucosa of the small intestine of pigs.
Br. J. Nutr. 28, 113-127
MARCÉ, M., D. S. BROWN, T. CAPELL, X. FIGUERAS u. A. F. TIBURCIO (1995):
Rapid high-performance liquid chromatographic method for the quantitation of polyamines as
their dansyl derivatives: application to plant and animal tissues.
J. Chromatogr. B 666, 329-335
MAROUX, S., LOUVARD, D. u. J. BARATTI (1973):
The aminopeptidase from hog intestinal brush border.
Biochim. Biophys. Acta 321, 282-295
MAUDSLEY, D. V. (1979):
Regulation of polyamine biosynthesis.
Biochemical Pharmacology 28, 153-161
McCORMACK, S. A. u. L. R. JOHNSON (1991):
Role of polyamines in gastrointestinal mucosal growth.
Am. J. Physiol. 260, 795-806
MEJSTRIK, K. (1996):
Quantitative Bestimmung von Histamin im Serum und Plasma des Hundes.
München, Ludwig-Maximilians-Univ., Tierärztl. Fak., Diss.
MEYER, V. (1980):
Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie.
Otto Salle Verlag; Frankfurt a. M., Berlin, München
MEYER, V. R.(1996):
Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern.
Hüthig Verlag, Heidelberg
MILLER, B. G., P. S. JAMES, M. W. SMITH u. F. J. BOURNE (1986):
Effect of weaning on the capacity of pig intestinal villi to digest and absorb nutrients.
J. agric. Sci. 107, 579-589
MORGAN, D. M. L. (1990):
Polyamines and cellular regulation: perspectives.
Biochem. Soc. Trans. 18, 1080-1084
MORRIS, D. R., K. L. KOFFRON u. Ch. J. OKSTEIN (1969):
An automated method for polyamine analysis.
Anal. Biochem. 30, 449-453
165

Literaturverzeichnis
MOTYL, T., T. PLOSZAJ, A. WOJTASIK, W. KUKULSKA u. M. PODGURNIAK (1995):
Polyamines in cow´s and sow´s milk.
Comp. Biochem. Physiol. 111, 427-433
M`RABET-TOUIL, H., F. BLACHIER, N. HELLIO, V. ROBERT, C. CHERBURY, B.
DARCY-VRILLON u. P.-H. DUÉE (1995):
Transglutaminase activity in enterocytes isolated from pig jejunum.
Mol. Cell. Biochem. 146, 49-54
NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1988):
Nutrient requirements of swine.
National Academy Press,
Washington, DC, US, S. 50-51
NEADLE, D.J. u. R. J. POLLIT (1965):
The formation of 1-dimethylaminonaphthalene-5-sulphonamide during the preparation of 1-
dimethylaminonaphthalene-5-sulphonyl-amino acids.
Biochem. J. 97, 607-608
NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (1987):
Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. Band II, 6. Auflage.
Verlag Paul Parey; Berlin, Hamburg
NOACK, J., B. KLEESSEN, A. LORENZ u. M. BLAUT (1996):
The effect of alimentary polyamine depletion on germ-free and conventional rats.
Nutr. Biochem. 7, 560-566
ODLE, J., R. T. ZIJLSTRA, S. M. DONOVAN (1996):
Intestinal effects of milkborne growth factors in neonates of agricultural importance.
J. Anim. Sci. 74, 2509-2522
O´HARE, M. M., O. TORTORA, U. GETHER, H. V. NIELSEN u. T. W. SCHWARTZ
(1987):
High-performance liquid chromatography of phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids
and side-chain derivatized amino acids.
J. Chromatogr. 389, 379-388
O´LOUGHLIN, E. V., M. CHUNG, M. HOLLENBERG, J. HAYDEN, I. ZAHAVI u. D. G.
GALL (1985):
Effect of epidermal growth factor on ontogeny of the gastrointestinal tract.
Am. J. Physiol. 249, 674-678
ORTEGA, M. A., A. GIL u. A. SÁNCHEZ-POZO (1995):
Maturation status of small intestine epithelium in rats deprived of dietary nucleotides.
Life Sci. 56, 1623-1630
166

Literaturverzeichnis
OSBORNE D. L. u. E. R. SEIDEL (1990):
Gastrointestinal luminal polyamines: cellular accumulation and enterohepatic circulation.
Am. J. Physiol. 258, G 576-G584
PAUER, T., L. LENHARDT, R. SKARDA, E. SVICKÝ, D. MAGIC, J. MARCANIK u. T.
HAJOVSKÝ (1991):
On the study of morphological and functional differentiation of the small intestinal mucosa in
pigs.
Folia Veter. 35, 1-2
PEGG, A. E. u. P. P. McCANN (1982):
Polyamine metabolism and function.
Am. J. Physiol. 243, 212-221
PIETRZAK, T. (1997):
Verträglichkeit eiweißreicher Futtermittel beim Hund und Effekte auf einige Parameter
mikrobieller Aktivität im Intestinaltrakt unter besonderer Berücksichtigung der Polyamine.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
PICKERING, L. K., D. M. GRANOFF, J. R. ERICKSON, M. L. MASOR, C. T. CORDLE, J.
P. SCHALLER, T. R. WINSHIP, C. L. PAULE u. M. D. HILTY (1998):
Modulation of the immune system by human milk and infant formula containing nucleotides.
Pediatrics 101, 242-249
PODOLSKY, D. K. (1994):
Peptide growth factors in the gastrointestinal tract.
In: Physiology of the Gastrointestinal Tract. L. R. JOHNSON (edt.)
Raven Press, New York, Third Edit., 129-167
POLLAK, P. F., O. KOLDOVSKY u. K. NISHIOKA (1992):
Polyamines in human and rat milk and in infant formulas.
Am. J. Clin. Nutr. 56, 371-375
POTTEN, C. S. (1992):
The significance of spontaneous and induced apoptosis in the gastrointestinal tract of mice.
Cancer and Metastasis Reviews 11, 179-195
POTTEN, C. S. (1995):
Structure, function and proliferative organisation of mammalian gut.
In: Radiation and Gut. C. S. Potten u. J. H. Hendry (edts.), 1-31
RAAB, S. (1998):
Einfluß nutritiver Faktoren auf die endokrine und parakrine Steuerung von Proliferation,
Funktion und Apoptose im Darm von Schweinen.
Diss. agr., Universität Hohenheim
167

Literaturverzeichnis
RAAB, S., R. LEISER, H. KEMMER u. R. CLAUS (1998):
Effects of energy and purines in the diet on the proliferation, differentation and apoptosis in
the small intestine of the pig.
J. Metabolism 47, 1105-1111
RIEKEN, E. O., A. STALLMACH, M. ZEITZ, J. D. SCHULZE, H. MENGE u. M.
GREGOR (1989):
Growth and transformation of the small intestinal mucosa – importance of connective tissue,
gut associated lymphoid tissue and gastrointestinal regulatory peptides.
Gut 30, 1630-1640
ROTH, M. (1971):
Fluorescence reaction for amino acids.
Anal. Chem. 43, 880-882
RUDOLPH, F. B. (1994 a):
The biochemistry and physiology of nucleotides.
J. Nutr. 124, 124-127
RUDOLPH, F. B. (1994 b):
Symposium: Dietary nucleotides : A recently demonstrated requirement for cellular
development and immune function.
J. Nutr. 124, 1431S-1432S
SANDERSON, I. R. u. Y. HE (1994):
Nucleotide uptake and metabolism by intestinal epithelial cells.
J. Nutr. 124, 131-137
SANGILD, P. T., CRANWELL, P. D., SOERENSEN, H., MORTENSEN, K., NORÉN, O.,
WETTEBERG, L. u. H. SJÖSTRÖM (1991):
Development of intestinal disaccharidases, intestinal peptidases and pancreatic proteases in
sucking pigs. The effects of age and ACTH treatment.
In: Proceedings of the Vth International Symposium on Digestive Physiology in Pigs.
EAAP Publication No 54 (1991), 73-78
SANGUANSERMSRI, J., P. GYÖRGY u. F. ZILLIKEN (1974):
Polyamines in human and cow´s milk.
Am. J. Clin. Nutr. 27, 859-865
SAS ® (1990):
SAS/STAT User´s Guide (Release 6.03).
SAS Institute Inc. Cary, NC.
168

Literaturverzeichnis
SAYEM-EL-DAHER, N., R. E. SIMARD, L. L`HEUREUX u. N. G. ROBERGE (1983):
Determination of mono-, di- and polyamines in foods using a single-column amino acid autoanalyzer.
J. Chromatogr. 256, 313-321
SCHENKEL, E., V. BERLAIMONT, J. DUBOIS, M. HELSON-CAMBIER u. M. HANOCQ
(1995):
Improved high-performance liquid chromatographic method for the determination of
polyamines as their benzoylated derivatives: application to P388 cancer cells.
J. Chromatogr. B 668, 189-197
SCHEUER, R. u. W. RÖDEL (1995):
Bestimmung von biogenen Aminen in fermentierten Fleischerzeugnissen.
Fleischwirtsch. 75, 73-75
SCHLEE, D. (1992):
Ökologische Biochemie.
Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, New York
SCHNEIDER, R., F. KREIENBRING, G. BOLDUAN u. M. BECK (1989):
Biogene Amine in der Digesta von Schweinen.
Arch. Anim. Nutr. 39, 1021-1029
SCHOLLENBERGER, M. (1993):
Die Entwicklung und Anwendung chromatographischer Verfahren mit chemischer
Derivatisierung und selektiver Detektion zur Erfassung von biogenen Aminen und
Aminosäuren aus Lebensmitteln.
Hohenheim, Univ. Hohenheim, Fak. I, Allg. u. Angewandte Naturwiss., Diss.
SCHUSTER, R. (1988):
Determination of amino acids in biological, plant and food samples by automated precolumn
derivatization and high performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. 431, 271-284
SCHWEDT, G. (1994):
Chromatographische Trennmethoden. Theoretische Grundlagen, Techniken und analytische
Anwendungen.
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York
SEIDEL, E.R., M. K. HADDOX u. L. R. JOHNSON (1985):
Ileal mucosal growth during intraluminal infusion of ethylamine or putrescine.
Am. J. Physiol. 249, 434-438
169

Literaturverzeichnis
SEIDEL, E.R. (1986):
Hormonal regulation of postprandial induction of gastrointestinal ornithine decarboxylase
activity.
Am. J. Physiol. 251, 460-466
SEILER, N. (1977):
Review
Chromatography of biogenic amines.
I. Generally applicable separation and detection methods.
J. Chromatogr. 143, 221-246
SEILER, N. (1986):
Review polyamines.
J. Chromatogr. 379, 157-176
SEILER, N. u. F. DEZEURE (1990):
Minireview: Polyamine transport in mammalian cells.
Int. J. Biochem. 22, 211-218
SHORE, P. A., A. BURKHALTER u. V. H. COHN (1959):
A method for the fluorometric assay of histamine in tissues.
J. Pharmacol. Exp. Ther. 127, 182-186
SILBERNAGL, S. u. A. DESPOPOULOS (1991):
Taschenatlas der Physiologie. 4. Auflage.
Georg Thieme Verlag; Stuttgart, New York
SIMMONS, J. G., E. C. HOYT, J. K. WESTWICK, D. A. BRENNER, J. B. PUCILOWSKA
u. P. K. LUND (1995):
Insulin-like growth factor-I and epidermal growth factor interact to regulate growth and gene
expression in IEC-6 intestinal epithelial cells.
Molec. Endocrinol. 9, 1157-1165
SJÖSTRÖM, H. u. O. NORÉN (1986):
Cytosolic peptidases of the small intestine.
In: Molecular and cellular basis of digestion. DESNUELLE, P., H. SJÖSTRÖM u. O.
NORÈN (edts.)(1986)
Elsevier Science Publishers B. V. (Biomedical Division), Chapt. 20, 367-377
SKAADEN, T. u. T. GREIBROKK (1982):
Determination of polyamines by pre-column derivatization with o-phtalaldehyde and
ethanethiol in combination with reversed-phase high-performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. 247, 111-122
170

Literaturverzeichnis
SMITH, M. W. (1985):
Expression of digestive and absorptive function in differentiating enterocytes.
Ann. Rev. Physiol. 47, 247-260
SMITH, M. W. u. L. G. JARVIS (1978):
Growth and cell replacement in the new-born pig intestine.
Proc. R. Soc. Lond. B. 203, 69-89
SPRAGG, B. P. u. A. D. HUTCHINGS (1983):
High-performance liquid chromatographic determination of putrescine, spermidine and
spermine after derivatisation with 4-fluoro-3-nitrobenzotrifluoride.
J. Chromatogr. 258, 289-291
SUZUKI, S., K. KOBAYASHI, J. NODA, T. SUZUKI u. K. TAKAMA (1990):
Simultaneous determination of biogenic amines by reversed-phase high-performance liquid
chromatography.
J. Chromatogr. 508, 225-228
SVENDSEN, J (1992):
Perinatal mortality in pigs.
Anim. Repr. Sci. 28, 59-67
TABOR, C. W. u. H. TABOR (1984):
Polyamines.
Ann. Rev. Biochem. 53, 749-790
TABOR, C. W. u. H. TABOR (1985):
Polyamines in microorganisms.
Microbiol. Rev. 49, 81-99
TAIBI, G. u. M. R. SCHIAVO (1993):
Simple high-performance liquid chromatographic assay for polyamines and their monoacetyl
derivatives.
J. Chromatogr. 614, 153-158
TANAKA, M., K. LEE, O. MARTINEZ-AUGUSTIN, Y. HE, I. R. SANDERSON u. W. A.
WALKER (1996):
Exogenous nucleotides alter the proliferation, differentiation and apoptosis of human small
intestinal epithelium.
J. Nutr. 126, 424-433
TARVID, I., P. D. CRANWELL, L. MA u. R. VAVALA (1994):
The early postnatal development of protein digestion in pigs. II. Small intestinal enzymes.
in: Proceedings of the VIth International Symposium on Digestive Physiology in Pigs.
EAAP Publication No. 80, 181-184
171

Literaturverzeichnis
UAUY, R. (1994):
Nonimmune system responses to dietary nucleotides.
J. Nutr. 124, 157S-159S
VAN EIJK, H. M. H., D. R. ROOYAKKERS u. N. E. P. DEUTZ (1996):
Automated determination of polyamines by high-performance liquid chromatography with
simple sample preparation.
J. Chromatogr. A 730, 115-120
VEENING, H., W. W. PITT u. G. JONES (1974):
Ion-exchange chromatographic separation and fluorometric detection of urinary polyamines.
J. Chromatogr. 90, 129-139
VOELTER, W. u. K. ZECH (1975):
High-performance liquid chromatographic analysis of amino acids and peptide-hormone
hydrolysates in the picomole range.
J. Chromatogr. 112, 643-649
WALL, R. A. (1968):
Accelerated analysis of some amines and amino acids.
J. Chromatogr. 37, 549-551
WANG, J.-Y., u. L. R. JOHNSON (1989):
Induction of gastric and duodenal mucosal ornithine decarboxylase during stress.
Am. J. Physiol. 257, 259-265
WANG, J.-Y., S. A. McCORMACK, M.J. VIAR u. L. R. JOHNSON (1991):
Stimulation of proximal small intestinal mucosal growth by luminal polyamines.
Am. J. Physiol. 261, 504-511
WANG, J.-Y., u. L. R. JOHNSON (1992):
Luminal polyamines substitute for tissue polyamines in duodenal mucosal repair after stress
in rats.
Gastroenterology 102, 1109-1117
WEISS, T., G. BERNHARDT, A. BUSCHAUER, K.-W. JAUCH u. H. ZIRNGIBL (1997):
High-resolution reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of
polyamines and their monoacetyl conjugates by fluorescence detection after derivatization
with N-hydroxysuccinimidyl 6-quinolinyl carbamate.
Anal. Biochem. 247(2), 294-304
WILD, G. E., DALY, A. S., SAURIOL, N. u. G. BENNETT (1993):
Effect of exogenously administered polyamines on the structural maturation and enzyme
ontogeny of the postnatal rat intestine.
Biol. Neonate 63, 246-257
172

Literaturverzeichnis
WRIGHT, N. A. (1997):
Stem cell repertoire in the intestine.
In: Stem Cells. C. S. Potten (edt.)
Academic Press Ltd.,315-330
XU, R-J., D. J. MELLOR, P. TUNGTHANATHANICH, M. J. BIRTLES, G. W.
REYNOLDS u. H. V. SIMPSON (1992):
Growth and morphological changes in the small and large intestine in piglets during the first
three days after birth.
J. Dev. Physiol. 18, 161-172
XU, R-J. (1996):
Development of the newborn gastrointestinal tract and its relation to colostrum/milk intake: a
review.
Reprod. Fertil. Dev. 8, 35-48
ZENTEK, J. u. T. PIETRZAK (1997):
Nachweis biogener Amine mittels HPLC nach FMOC-Derivatisierung in Kotproben von
Hunden.
Proc. Soc. Physiol. 6, 56
173

Anhang
9 Anhang
Produktinformation zu Immunozog ® und PorVit Lak ®
Tab. I: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe Immunozog ®
Rohprotein 16 %
Rohfaser 6 %
Lysin 0,68 %
Calcium 0,6 %
Phosphor 0,6 %
Energiegehalt
Vitamin A
Vitamin D 3
Vitamin E
Phytase
Probiotikum
(Bacillus cereus)
PROVILYT
(Vitaminvormischung)
ASCOGEN
(Nukleotidmischung)
13,6 MJ ME/kg
20.000 I.E./kg
2.000 I.E./kg
100 mg/kg
500 Units/kg
1 x 10 9 KbE/kg
0,5 %
0,5 %
174

Anhang
Tab. II: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe PorVit Lak ®
Rohprotein 17,5 %
Rohfaser 6 %
Lysin 0,9 %
Calcium 0,95 %
Phosphor 0,7%
Energiegehalt
Vitamin A
Vitamin D 3
Vitamin E
Probiotikum
(Bacillus cereus)
13,2 MJ ME/kg
10.000 I.E./kg
2.000 I.E./kg
40 mg/kg
1 x 10 9 KbE/kg
Bezugsquellen und Produktinformation zu den Rationskomponenten
• Laktose, edible Art.Nr.: 347003 Bayrische Milchindustrie eG
Klötzlmüllerstraße 140
84034 Landshut
• Natrium-Caseinat Art.Nr.: 322103 Bayrische Milchindustrie eG
Klötzlmüllerstraße 140
84034 Landshut
• Molkenfettpulver VANA ® -MEL 50AS 002 Zuivelfabriek De Kievit bv
Oilemolenweg 4a
Postfach 189
7940 AD Meppel
Holland
175

Anhang
Produktinformation:
Molkefettkonzentrat auf der Basis von Süssmolkepulver und Fett/Öl
Tab. III: Durchschnittliche Analyse des Molkefettkonzentrates (Herstellerangaben)
Rohfett 50 %
Zucker 37 %
Rohprotein 6 %
Rohasche 5 %
Trockensubstanz 98 %
Energiewert
26,3 MJ ME/kg
Mikrobiologische Daten
Gesamtkeimzahl
Coliforme Keime
max.1000.000/g
nicht nachweisbar
176

Anhang
• Mineralstoff-/Vitamin-Mischung
Milkivit-Werke GmbH
Gempfinger Straße 15
D-86666 Burgheim
Produktinformation:
Tab. IV: Zusammensetzung der Mineralstoff-/Vitamin-Mischung
Vitamin A 2000000 I.E./kg Eisen 8150 mg/kg
Vitamin E 2400 mg/kg Kupfer 200 mg/kg
Vitamin B 1 160 mg/kg Zink 4800 mg/kg
Vitamin B 2 160 mg/kg Mangan 1330 mg/kg
Vitamin B 6 80 mg/kg Kobalt 56 mg/kg
Vitamin B 12 800 µg/kg Jod 159 mg/kg
Vitamin D 3 200000 I.E./kg Selen 21 mg/kg
Vitamin K 3 200 mg/kg Invert-Zucker 0,5 mg/kg
Folsäure 32 mg/kg Stärke 22 %
Calcium-D-Pantothenat 801 mg/kg Lysin 3 %
Nikotinsäure 2000 mg/kg Zitronensäure 380 mg/kg
Biotin 8 mg/kg Sorbinsäure 80 mg/kg
Cholinchlorid 16 mg/kg Calciumformiat 80 mg/kg
Magnesium 2,1 % Calciumpropionat 10 mg/kg
Calcium 2,8 %
Natrium 0,001 %
177

Anhang
Ergebnisse der Aminbestimmung im Chymus
Tab. V: Putrescingehalte [nmol/ml] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 25,0 a 1) ± 25,7 19,6 a ± 26,8 7,8 a ± 17,4
Minimalwert 2,4 0 0
Maximalwert 56,3 64,1 39,0
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. VI: Putrescingehalte [nmol/ml] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 50,0 a 1) ± 52,9 52,3 a ± 59,8 28,6 a ± 45,7
Minimalwert 6,6 0 0
Maximalwert 138,5 167,5 108,9
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
178

Anhang
Tab. VII: Cadaveringehalte [nmol/ml] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 27,7 a 1) ± 32,7 42,5 a ± 66,2 10,7 a ± 22,3
Minimalwert 1,0 0 0
Maximalwert 73,7 151,9 50,5
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. VIII: Cadaveringehalte [nmol/ml] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 67,6 a 1) ± 79,3 82,1 a ± 95,8 51,9 a ± 105,3
Minimalwert 5,7 0 0
Maximalwert 198,4 229,3 240,1
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
179

Anhang
Tab. IX: Spermidingehalte [nmol/ml] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 0,4 a 1) ± 0,8 3,0 b ± 5,2 0,1 a ± 0,3
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 1,8 13,0 0,6
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. X: Spermidingehalte [nmol/ml] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 9,1 ± 6,2 10,0 ± 7,4 15,2 ± 9,6
Minimalwert 0 0 1,9
Maximalwert 15,3 20,9 26,3
LS-Means ± SEM 10,0 a 1) ± 1,9 10,3 a ± 1,8 12,2 a ± 2,0
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
180

Anhang
Tab. XI: Spermingehalte [nmol/ml] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 7,7 a 1) ± 6,9 65,1 a ± 89,6 3,0 a ± 2,4
Minimalwert 2,7 11,6 0,8
Maximalwert 18,9 259,2 6,8
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XII: Spermingehalte [nmol/ml] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 44,6 ± 39,4 141,7 ± 104,8 110,1 ± 90,2
Minimalwert 11,9 8,3 8,9
Maximalwert 110,1 279,6 247,0
LS-Means ± SEM 41,8 a 1) ± 22,6 133,6 b ± 22,3 72,3 ab ± 24,6
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
181

Anhang
Ergebnisse der Aminbestimmung im Darmgewebe
Tab. XIII: Putrescingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Duodenum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 1,8 a 1) ± 2,5 2,8 a ± 5,4 6,7 a ± 8,7
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 5,3 14,3 21,2
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XIV: Putrescingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (proximales Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 8,7 a 1) ± 8,1 9,0 a ± 10,9 4,6 a ± 3,2
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 17,0 27,7 8,7
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
182

Anhang
Tab. XV: Putrescingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (distales Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 29,4 ± 20,9 15,3 ± 15,8 15,4 ± 7,0
Minimalwert 6,1 0 9,9
Maximalwert 62,9 41,1 26,7
LS-Means ± SEM 30,8 a 1) ± 8,0 16,0 a ± 7,8 14,4 a ± 8,2
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
Tab. XVI: Putrescingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Ileum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 21,3 a 1) ± 13,3 22,8 a ± 42,9 9,2 a ± 1,3
Minimalwert 11,5 0 7,6
Maximalwert 44,6 118,2 11,1
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
183

Anhang
Tab. XVII: Cadaveringehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Duodenum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 1,0 a 1) ± 1,3 0,7 a ± 1,3 1,6 a ± 3,5
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 2,6 14,3 7,8
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XVIII: Cadaveringehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (proximales
Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 1,2 a 1) ± 1,7 0,8 a ± 1,5 0,5 a ± 1,2
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 3,7 3,7 2,7
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
184

Anhang
Tab. XIX: Cadaveringehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (distales Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 0,8 a 1) ± 1,1 1,1 a ± 1,4 2,3 a ± 3,6
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 2,3 2,9 8,2
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XX: Cadaveringehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Ileum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 2,9 a 1) ± 2,9 0,8 a ± 1,5 0,4 a ± 1,0
Minimalwert 0 0 0
Maximalwert 6,8 3,7 2,2
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
185

Anhang
Tab. XXI: Spermidingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Duodenum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 72,2 ± 32,0 62,0 ± 19,8 92,9 ± 42,9
Minimalwert 39,5 33,5 48,7
Maximalwert 116,6 86,1 150,0
LS-Means ± SEM 76,5 a 1) ± 15,0 79,8 a ± 14,7 97,3 a ± 15,4
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
Tab. XXII: Spermidingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (proximales
Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 70,8 ± 11,9 65,8 ± 26,6 48,2 ± 21,4
Minimalwert 59,1 29,6 20,1
Maximalwert 86,7 103,9 69,4
LS-Means ± SEM 69,1 ab 1) ± 7,5 69,7 a ± 7,4 47,5 b ± 7,7
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
186

Anhang
Tab. XXIII: Spermidingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (distales Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 120,0 ± 57,6 138,9 ± 49,4 104,3 ± 30,3
Minimalwert 52,4 82,3 65,2
Maximalwert 205,8 228,2 138,4
LS-Means ± SEM 124,8 ab 1) ± 14,6 149,0 a ± 14,2 105,1 b ± 14,9
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
Tab. XXIV: Spermidingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Ileum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 112,9 ± 26,9 119,3 ± 36,2 105,6 ± 9,0
Minimalwert 78,6 70,5 90,6
Maximalwert 151,8 162,4 113,2
LS-Means ± SEM 109,7 a 1) ± 11,3 119,2 a ± 11,0 112,1 a ± 11,5
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
187

Anhang
Tab. XXV: Spermingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Duodenum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 97,5 a 1) ± 37,6 103,5 a ± 37,4 91,1 a ± 41,3
Minimalwert 51,6 61,2 57,3
Maximalwert 146,2 165,8 162,7
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXVI: Spermingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (proximales
Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 130,2 ± 19,4 120,4 ± 60,3 94,0 ± 41,8
Minimalwert 100,9 63,0 34,1
Maximalwert 148,1 242,1 143,6
LS-Means ± SEM 132,2 a 1) ± 16,2 130,3 a ± 15,8 87,7 a ± 16,6
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
188

Anhang
Tab. XXVII: Spermingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (distales Jejunum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 148,1 a 1) ± 51,5 169,1 a ± 64,4 137,4 a ± 36,5
Minimalwert 100,1 116,1 88,7
Maximalwert 232,8 310,7 188,2
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXVIII: Spermingehalte [nmol/g Frischsubstanz] des Darmgewebes (Ileum)
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 122,3 ± 22,3 131,9 ± 37,7 112,7 ± 11,1
Minimalwert 101,5 77,5 97,3
Maximalwert 159,9 185,4 123,6
LS-Means ± SEM 122,9 a 1) ± 12,5 131,9 a ± 12,3 115,9 a ± 12,8
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
189

Anhang
Ergebnisse der Maltase- und Laktasemessung im Chymus
Tab. XXIX: Maltaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im Duodenum
Kontrollgruppe
(n = 1)
Polyamingruppe
(n = 5)
Puringruppe
(n = 3)
± s - - 6 ± 4 - -
Minimalwert - 4 4
Maximalwert 65 13 34
LS-Means 1) ± SEM - - - - - -
1) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXX: Maltaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 66 ± 26 77 ± 74 30 ± 28
Minimalwert 33 1 4
Maximalwert 94 204 74
LS-Means ± SEM 68 a 1) ± 24 64 a ± 24 23 a ± 24
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
190

Anhang
Tab. XXXI: Maltaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 886 a 1) ± 522 1372 ab ± 819 2160 b ± 1069
Minimalwert 245 718 1174
Maximalwert 1571 3179 3339
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXXII: Maltaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im Ileum
Kontrollgruppe
(n = 3)
Polyamingruppe
(n = 4)
Puringruppe
(n = 2)
± s - - 1143 ± 330 - -
Minimalwert 450 732 1505
Maximalwert 734 1485 1747
LS-Means ± SEM - - 1320 ± 299 - -
191

Anhang
Tab. XXXIII: Laktaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im Duodenum
Kontrollgruppe
(n = 1)
Polyamingruppe
(n = 6)
Puringruppe
(n = 3)
± s - - 43 ± 46 - -
Minimalwert - 12 10
Maximalwert 155 136 49
LS-Means 1) ± SEM - - - - - -
1) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXXIV: Laktaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 347 a 1) ± 174 269 a ± 269 135 a ± 123
Minimalwert 165 38 25
Maximalwert 603 701 334
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
192

Anhang
Tab. XXXV: Laktaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 1867 ± 1085 1799 ± 688 3148 ± 1347
Minimalwert 697 685 1411
Maximalwert 3573 2602 4959
LS-Means ± SEM 1785 a 1) ± 460 2466 a ± 453 2679 a ± 458
1) Adjustierte Mittelwerte (LS-Means), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
Tab. XXXVI: Laktaseaktivität [mU/g TS] des Chymus im Ileum
Kontrollgruppe
(n = 3)
Polyamingruppe
(n = 4)
Puringruppe
(n = 2)
± s - - 1862 ± 726 - -
Minimalwert 868 1062 2801
Maximalwert 2044 2484 2901
LS-Means ± SEM - - 2422 ± 631 - -
193

Anhang
Ergebnisse der Leucinarylamidasemessung im Chymus
Tab. XXXVII: Leucinarylamidaseaktivität [U/g TS] des Chymus im Duodenum
Kontrollgruppe
(n = 1)
Polyamingruppe
(n = 6)
Puringruppe
(n = 3)
± s - - 0,7 ± 0,5 - -
Minimalwert - 0,2 0,3
Maximalwert 2 1,4 0,4
LS-Means 1) ± SEM - - - - - -
1) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XXXVIII: Leucinarylamidaseaktivität [U/g TS] des Chymus im proximalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 6 a 1) ± 6 3 a ± 4 1 a ± 1
Minimalwert 1 1 1
Maximalwert 16 11 2
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
194

Anhang
Tab. XXXIX: Leucinarylamidaseaktivität [U/g TS] des Chymus im distalen Jejunum
Kontrollgruppe
(n = 5)
Polyamingruppe
(n = 7)
Puringruppe
(n = 5)
± s 60 a 1) ± 44 61 a ± 26 118 a ± 94
Minimalwert 13 35 17
Maximalwert 115 93 242
LS-Means 2) ± SEM - - - - - -
1) Mittelwerte (), die nicht mit demselben Buchstaben überschrieben sind, unterscheiden sich signifikant
2) keine Angaben, da Daten nicht normalverteilt
Tab. XL: Leucinarylamidaseaktivität [U/g TS] des Chymus im Ileum
Kontrollgruppe
(n = 3)
Polyamingruppe
(n = 4)
Puringruppe
(n = 2)
± s - - 89 ± 20 - -
Minimalwert 42 70 129
Maximalwert 130 117 136
LS-Means ± SEM - - 133 ± 18 - -
195

Backnang, den 15.2.2002
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel
„Einfluß einer Spermin- oder Nukleotidzulage auf Aminkonzentrationen und
Enzymaktivitäten im Dünndarm von Ferkeln“,
abgesehen von den in der Dissertation angegebenen Hilfen und Hilfsmitteln, selbständig
verfaßt habe. Ich habe die Dissertation an den folgenden wissenschaftlichen Institutionen
angefertigt:
Institut für Tierernährung der Universität Hohenheim, Fachgebiet Futtermittelkunde
(Herr Prof. Dr. R. Mosenthin).
Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Herr Prof. Dr. J. Zentek).
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Andrea Schad

Danksagung
Mein aufrichtiger Dank gilt Herrn Prof. Dr. Rainer Mosenthin für die Überlassung des
Themas sowie für die stets gewährte Unterstützung bei der Versuchsdurchführung und der
analytischen Laborarbeit. Danke auch für das stetige Interesse an der Arbeit und die
Motivation, die viel zum Gelingen der Arbeit beigetragen hat.
Besonders danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Jürgen Zentek für dessen Bereitschaft, als
Vertreter einer veterinärmedizinischen Fakultät die wissenschaftliche Betreuung und
gutachterliche Funktion für die vorliegende Arbeit zu übernehmen. Bei Fragen stand er mir
stets mit Rat und Tat zur Seite und sein ständiges Interesse zeigte mir, auf dem richtigen Weg
zu sein. Gedankt sei auch Frau Dr. Tanja Pietrzak für die Unterstützung.
Danke auch an Herrn Prof. Dr. R. Claus in seiner Funktion als Antragsteller des
Forschungsprojektes und für die Arbeitsmöglichkeiten in den Labors des Fachgebietes
Tierhaltung und Leistungsphysiologie.
Herzlichen Dank an Frau Dr. Margit Schollenberger dafür, mir stets mit theoretischer und
praktischer Hilfe bei der analytischen Laborarbeit zur Seite zu stehen. Auch an Frau Silke
Roth ein riesiges Dankeschön für ihre Unterstützung bei sämtlichen Laborarbeiten,
insbesondere der Polyamin-Analytik. Danke für die genaue Dokumentation aller anfallenden
Daten, die ich sehr zu schätzen gelernt habe.
Für die tolle Arbeitsgruppe bedanke ich mich von Herzen bei Monika Gutscher, Dr. Susanne
Raab und Franziska Oettinger. Special thanks to Dr. Ralf Blank und Dr. Uwe Lauber.
Allen weiteren Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes, die mich immer freundlich
unterstützt haben und ein nettes Arbeitsklima ermöglichten, möchte ich vielmals danken.
Besonderer Dank gilt auch Vaida Sileikiene. Ferner bedanke ich mich beim Stallpersonal,
insbesondere bei Frau Stabenow für die Unterstützung bei der Betreuung der Ferkel. Danke
auch Frau Dr. H. Brehm, Frau Dr. U. Weiler und Herrn Dr. H. Kemmer für ihre Hilfe bei
operativen Eingriffen.

Vor allem möchte ich mich unendlich bei meinem lieben Mann Jürgen bedanken, der mit mir
alle Höhen und Tiefen durchstand. Ohne seine immer währende Geduld und Motivation hätte
ich das Ziel nicht erreicht. Danke für alles, Jo. Auch meine Familie unterstützte mich stets
und gab mir die Kraft, durchzuhalten. Von Herzen sei Euch gedankt, liebe Pe, Stibbie, Wolfe
und Dedden und vor allem Euch, liebe Mama und lieber Vater.