Deutsch (5.2 MB) - Nagra

Nagra
Nationale
Genossenschaft
für die Lagerung
radioaktiver Abfälle
Cedra
Societe cooperative
nationale
pour I'entreposage
de dechets radioactifs
Cisra
Societa cooperativa
nazionale
per I'immagazzinamento
di scorie radioattive
TECHNISCHER
BERICHT 89-14
MIKROBIELLER ABBAU
VON BITUMEN
MARKUS WOLF
APRIL 1989
Institut für Pflanzen biologie der
Universität Zürich
Parkstrasse 23 5401 Baden / Schweiz Telephon 056/205511

Der vorliegende Bericht wurde im Auftrag der Nagra erstellt. Die Autoren haben ihre eigenen Ansichten und
Schlussfolgerungen dargestellt. Diese müssen nicht unbedingt mit denjenigen der Nagra übereinstimmen.
Le présent rapport a été préparé sur demande de la Cédra. Les opinions et conclusions présentées sont celles
des auteurs et ne correspondent pas nécessairement à celles de la Cédra.
This report was prepared as an account of work sponsored by N agra. The viewpoints presented and
conculusions reached are those of the author(s) and do not necessarily represent those of Nagra.
Dieser Bericht erscheint gleichzeitig ais Nagra Technischer Bericht und ais Dissertation zur Erlangung der
philosophischen DoktofWÜrde des Autors an der Universitat Zürich.

1
Kune Zusammenfassung
Bitumen wird aIs Matrixmaterial für die Verfestigung bestimmter schwach- und mittelradioaktiver AbfaJ1e
verwendet. Da in einem Endlager die Anwesenheit von Mikroorganismen nicht ausgeschlossen werden kann,
ist es wichtig, den mikrobiellen Abbau von Bitumen ru quantifizieren. Entsprechende Untersuchungen
wurden mit verschiedenen Kulturen sowohl unter aeroben aIs auch unter anaeroben Bedingungen
durchgeführt. Es konnte festgestellt werden, dass Bitumen abbauende Mikroorganismen ubiquitâr sind; sie
bilden einen Biofilm an der Bitumenoberflâche. Die beobachtete Bitumenabbaurate ist im wesentlichen
unabhângig von der am Anfang des Versuches inokulierten Kultur: unter aeroben Bedingungen liegt sie
zwischen 20 und 50 g Bitumen pro m 2 und J ahr; dies entpricht einer CO2-Entwicklung zwischen 15 und 40
Liter (STP) pro m 2 und Jahr. Unter anaeroben Bedingungen sinkt die Abbaurate auf ungefahr ein Prozent
dieser Werte. Durch eine lineare Extrapolation der Ergebnisse unter anaeroben Bedingungen unter der
Anahme eines für Endlagerbedingungen (200 Liter-Fasser) typischen Verhâltnisses von Obeflâche ru
Volumen lâsst sich eine Bitumenabbaurate in der Grôssenordnung 0,3 bis 0,8 Prozent pro 1000 J ahre
ableiten.
Stichworter: Schwach- und mittelaktive AbfaJ1e, CO2
Résumé succinct
On utilise le bitume pour immobiliser certains déchets radioactifs de faible et moyenne activité. Comme l'on
ne saurait exclure la présence de microorganismes dans un dépôt final, il est important de pouvoir quantifier
les effets de la dégradation microbienne du bitume. Des essais ont été menés à bien aussi bien sous conditions
anaérobes qu'aérobes en utilisant plusieurs cultures différentes. On a observé que les microorganismes
capables de dégrader le bitume sond omniprésents et forment des biofùms à la surface du bitume. On a
constaté que le taux de dégradation du bitume est essentiellement indépendant de la culture inoculée au
début de l'essai: sous conditions aérobes, ce taux se situe entre 20 et 50 g de bitume par m 2 et par année; il en
résulte un taux de production de C02 de 15 à 40 litres à STP par m 2 et par année. Sous conditions anaérobes,
le taux de dégradation se monte à environ 1 pour cent des valeurs ci-dessus. En extrapolant les résultats sous
conditions anaérobes et en faisant l'hypothèse que le rapport surface/volume du bitume est d'un ordre de
grandeur typique pour les déchets radioactifs (fûts de 200 litres), on obtient un taux de perte de matrice de
bitume de l'ordre de 0,3 à 0,8 pour cent par 1000 ans.
Mots-clefs: Déchets faiblement et moyennement radioactifs, C02
Abstract
Bitumen is used as a matrix to immobilize low and intermediate level radioactive wastes. Since the presence
of microorganisms in nuclear waste repositories cannot be ruled out, it is important to quantify the microbial
degradation of bitumen. Invstigations were carried out both under aerobic and anaerobic conditions using a
variety of cultures. It was observed that bitumen degrading microorganisms are ubiquitous and form biofùms
on bitumen surfaces. In the long term bitumen degradation rates were found to be essentially independent of
the culture initially inoculated. Unter aerobic conditions this rate lies between 20 and 50 g of bitumen per m 2
and year, leading to the production of 15 to 40 litres m- 2 a- 1 of CO2 at STP. Under anaerobic conditions the
degradation rate is only about 1 percent of that under aerobic conditions. A linear extrapolation for anaerobic
conditions and for a surface to volume ratio typical for nuclear waste (200 litre drums) lead to 0.3 to 0.8
percent loss of bitumen matrix within 1000 years.
Keywords: Low and intermediate level waste, C02

INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG
1.1. Das Konzept der Endlagerung schwach- und mittelradioaktiver
Abfälle in der Schweiz
1.2. Bitumen als Immobilisierungsmaterial für schwach- und
mittelradioakti ve Abfälle
1.3. Quantifizierung des mikrobiellen Abbaus von Bitumen:
Problemstellung und Vorgehen
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. Bitumen
2.1.1. Oberflächenvergrösserung und Suspendierung von
Bitumen
5
6
8
10
12
12
13
2.2.
2.3.
2.4.
Isolierung und Anreicherung Bitumen abbauender MikroorganIsmen
Kultivation Bitumen abbauender Mikroorganismen
2.3.1. Aerobes Kultivations- und Messsystem
2.3.2. Anaerobes Kultivations- und Messsystem
Analytische Methoden
2.4.1. Nassaufschluss unter Druck
2.4.2. Multielement-Analyse
2.4.3. Bestimmung der Grössenverteilung suspendierter
Partikel
2.4.4. Epifluoreszenzmikroskopie
2.4.5. Rasterelektronenmikroskopie
15
17
17
22
24
24
24
25
25
26
- 1 -

2.4.6. Infrarotspektroskopie 26
2.4.7. Gaschromatographie 26
2.4.8. Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffs 27
2.4.9. Dosimetrie 27
2.5. Berechnungen 28
2.5.1. Berechnung der Oberfläche suspendierter Bitumen-
Partikel 28
2.5.2. Quantifizierung des aeroben Bitumenabbaus 29
2.5.3. Quantifizierung des anaeroben Bitumenabbaus 30
3. RESULTATE UND DISKUSSION 33
3.1. Bitumen als Substrat für mikrobielle Aktivität 33
3.1.1. Elementarzusammensetzung von Bitumen 33
3.1.2. Charakterisierung der Bitumen-Suspension 35
3.1.3. Oberfläche der suspendierten Bitumen-Partikel 39
3.2. Mikrobielle Aktivität unter aeroben Bedingungen 42
3.2.1. Kontakt der Mikroorganismen mit dem Substrat 42
3.2.2. Charakterisierung der mikrobiellen Aktivität mit
Bitumen als Substrat 45
3.2.2.1. Kohlendioxid-Freisetzung als Mass für die
mikrobielle Aktivität 45
3.2.2.2. Abhängigkeit der mikrobiellen Aktivität
von der Substratoberfläche 45
3.2.2.3. Einfluss der Mikroflora auf den mikrobiellen
Bitumenabbau
49
-2-

3.2.2.4. Einfluss von Umgebungsfaktoren auf die
mikrobielle Aktivität 54
3.2.2.4.1. Einfluss der Temperatur auf die
mikrobielle Aktivität 54
3.2.2.4.2. Einfluss des pR auf die mikrobielle
Aktivität 55
3.2.2.4.3. Auswirkung radioaktiver Strahlung
auf die mikrobielle Aktivität 57
3.2.3. Quantifizierung des aeroben Abbaus von Bitumen 58
3.3. Mikrobielle Aktivität unter anaeroben Bedingungen 61
3.3.1. Einfluss von Mikroflora und Umgebungsbedingungen
auf die mikrobielle Aktivität 61
3.3.2. Quantifizierung des anaeroben Abbaus von
Bitumen 69
4. INTERPRETATION UND EXTRAPOLATION DER
MIKROBIELLEN ABBAURATEN VON BITUMEN 74
4.1. Interpretation der Resultate 74
4.2. Extrapolation der mikrobiellen Abbauraten von Bitumen
auf eine lange Zeit 77
4.3. Vergleich der Resultate mit Daten anderer Arbeitsgruppen 79
4.4. Schlussfolgerungen 81
5. ZUSAMMENFASSUNG 82
6. LITERATURVERZEICHNIS 83
7. VERDANKUNGEN 90
- 3 -

1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG
Bitumen findet seit frühester Zeit Verwendung als Werkstoff. Prähistorische
Funde bitumenähnlicher Stoffe (Peche, Teere, Asphalte) belegen deren
Anwendung als Klebe- und Kittmaterial, als Oberflächenschutz und
Dichtemasse (Elektrowatt 1983). Schriftliche Zeugnisse aus dem alten Orient
berichten von der Herstellung und dem Einsatz des Baustoffes Asphalt. Schon
um 3000 v. ehr. sind Verfahren bekannt zur Gewinnung von Bitumen aus
Asphalt und Asphaltöl. Es wird berichtet von Asphaltvorkommen in
Kleinasien, Aegypten, Palästina, Mesopotamien, Persien und Indien. Auch die
Bibel erwähnt Asphaltquellen (Gen. 14. 10). Die Anwendung ist vielfältig: als
Schutzmaterial von Wasserleitungen, Hochbauten und Schiffen, im
Strassenbau, etc. Als Beispiele seien erwähnt die asphaltierten Wasserleitungen
der Gärten der Semiramis in Ninive, die Verwendung von Bitumen als Mörtel
beim Turmbau zu Babel (Gen. 11. 3) und die Imprägnierung von Noahs Arche
mit Bitumen (Gen. 6.4). Die Geschichte des Werkstoffes und die Entwicklung
der Verfahrenstechnik seiner Gewinnung und Aufbereitung werden ausführlich
dargestellt von Abraham (1918) und PoIl (1962). Einen Ueberblick gibt im
weiteren die Literaturstudie der Elektrowatt (1983).
In heutiger Zeit werden Bitumen grässtenteils im Strassenbau eingesetzt.
Weitere Anwendungsgebiete finden sich im Hochbau als Dichte- und
Schutzmaterial von Dächern und Rohrleitungen, in der Automobilindustrie, der
Kunststoffindustrie und vielen anderen Spezüilgebieten (Eschrich 1980).
Seit 1964 wird Bitumen auch für die Entsorgung radioaktiver Abfälle
verwendet. In diesem Jahr wird in Mol (Belgien) die erste Bituminierungsanlage
in Betrieb genommen. Heute werden weltweit schwach- und
mittelradioaktive Abfälle mit Bitumen verfestigt. Die Technologie der
Abfallkonditionierung, die Immobilisierung der Abfallkonzentrate mit Bitumen
und die Charakterisierung der Abfallgebinde sind Gegenstand ausführlicher
Untersuchungen (Seminar of the bituminization of low and medium level
radioactive wastes 1976, Eschrich 1980, Kluger et al. 1980, Elektrowatt 1985).
- 5 -

Bitumenähnliche Verbindungen können mehr als 15'000 Jahre überdauern, was
sich zum Beispiel anhand von Funden aus den Höhlen von Lascaux beweisen
lässt (Elektrowatt 1985). Als Bestandteil von Rohöl überdauert Bitumen gar
Zeiträume von Hunderten von Millionen Jahren (Ourisson et al. 1984). Es zeigt
sich jedoch auch, dass es unter gewissen Bedingungen sehr rasch abgebaut
werden kann. 1935 erscheint eine erste Arbeit, die den mikrobiellen Abbau von
Bitumen beschreibt (Hundeshagen 1935). In der Folge wird die Zerstörung von
Asphaltstrassenbelägen, bituminösen Anstrichen unterirdischer Leitungen,
Dichtungen, Dachpappen, etc., Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen
(ZoBell 1946, Burgess 1956, Harris 1956, Harris et al. 1956, Kulman 1958,
Jones 1965, Traxler et al. 1965).
Bitumen erweist sich als äusserst beständiges Material, wie die jahrmillionen
lange Einbettung in geologischen Schichten oder die beträchtliche
Langzeitstabilität asphalthaltiger" Fundgegenstände beweist. Unter gewissen
Umgebungsbedingungen kann es aber sehr schnell zerstört werden. Bei der
Verwendung von Bitumen als Immobilisierungsmaterial für radioaktive
Abfälle ist es daher von grösster Wichtigkeit, zu wissen, wie schnell Bitumen
unter Bedingungen, welche mikrobielle Aktivität begünstigen, abgebaut wird.
1.1. Das Konzept der Endlagerung schwach- und mittelradioaktiver
Abfälle in der Schweiz
Im Projektbericht Gewähr der Nagra (1985a) wird das Konzept der Endlagerung
wie folgt dargestellt: "Bei ihrer Endlagerung sollen radioaktive Abfälle
durch mehrere hintereinander geschaltete Sicherheitsbarrieren an der Rückkehr
von ihrem Lagerort in die Biosphäre gehindert werden ... Die Szenarien­
Analyse zeigt, dass Wasser das einzige wahrscheinliche Medium zum
Transport der Abfallstoffe zur Biosphäre darstellt. Die Sicherheitsbarrieren
werden deshalb darauf ausgewählt, wie sie den Grundwasserfluss durch das
Endlager beschränken, wie sie den Uebertritt der radioaktiven Stoffe aus dem
Lagergut ins Wasser begrenzen, wie sie den Transport des allfällig
kontaminierten Wassers vom Lagerort zur Erdoberfläche verhindern oder
verlangsamen und wie sie radioaktive Stoffe aus dem kontaminierten Wasser
während seines Weges zur Erdoberfläche zurückhalten können.
- 6-

Verfestigungs-
~in;~~~!tumen. c
11
• Begrenzt Freisetzung
Container
mit Verfüllung
(Beton/
Fliess-Zement)
• Begrenzt Wasserzutritt
• Begrenzt Freisetzung (Diffusion)
Lagerkaverne
mit Verfüllung
(Beton/
Sonder-Beton)
-a·-·
\"~
(/'':;'i::\::>::\ .... '. .' .
"
• Begrenzt Wasserzutritt
• Verzögert Beginn der Freisetzung
(Diffusions-Durchbruchszeit)
• Begrenzt Freisetzung (Diffusion)
• Sorgt tür günstigen Chemismus (pH)
Geosphäre:
• Lange Wasserfliesszeiten
• Zusätzliche Verzögerung der mit Wasser
transportierten radioaktiven Stoffe
(Sorption, Matrixdiffusion)
• Langzeitstabilität der hydrogeologischen
Bedingungen gegenüber klimatischen
und geologischen Veränderungen
Wirtgestein
Lagerzone:
• Begrenztes Wasserangebot
• Günstiger Chemismus (Redox-Potential)
• Geologische Langzeitstabilität
Abb. 1: Uebersicht über das System der Sicherheitsbarrieren bei der Endlagerung
schwach- und mittelaktiver Abfälle (N ag ra Projektbericht
Gewähr 1985a).
- 7 -

Als Sicherheitsbarrieren dienen sowohl technisch errichtete Einschlussmassnahmen
als auch die Anlage des Endlagers in geeigneten geologischen
Formationen. Bei schwach- und mittelaktiven Abfällen umfasst das System der
technischen Sicherheitsbarrieren die Verfestigungsmatrix der Abfälle, die
Umhüllung der Abfallfässer im Container durch Fliesszement, den Endlagercontainer
aus Beton, die Verfüllung der verbliebenen Lagerhohlräume mit
Sonderbeton, die Betonauskleidung der Lagerkavernen und die Versiegelung
der Zugangswege bei Lagerverschluss" (Abb. 1).
Die Verfestigungsmatrix dient zum einen der sicheren und einfachen
Handhabung der radioaktiven Abfälle während Betrieb, Zwischenlagerung und
Transport, zum andem sollte sie für möglichst lange Zeit die Radionuklide am
Ort ihrer Lagerung zurückhalten. Als Matrixmaterial wird Zement, Bitumen
oder Kunststoff eingesetzt. In einem schweizerischen Endlager beträgt der
Anteil der bituminierten Abfälle am Totalvolumen ungefähr 5 %. Dies
entspricht einer Gesamtmenge von 3'400 Tonnen Bitumen (Nagra Projektbericht
Gewähr 1985a).
1.2. Bitumen als Immobilisierungsmaterial für schwach- und mitteIradioaktive
Abfälle
Eschrich (1980) erwähnt folgende Vorzüge, welche zur Wahl von Bitumen als
Immobilisierungsmaterial geführt haben mögen: ein im Vergleich mit anderen
Einschlussmaterialien (z.B. Beton) beträchtlicher Volumenanteil fester Abfälle,
der mit Bitumen vermischt werden kann (ca. 50-60%); homogenes Bitumen­
Abfall-Gemisch; geringe Auslaugungsrate eingeschlossener Nuklide;
Beständigkeit gegenüber einer Vielzahl von Säuren, Basen und Salzen und
Langzeitstabilität, vor allem erwiesen durch die Beständigkeit natürlicher
Asphaltlagerstätten während Millionen von Jahren.
Eschrich (1980) diskutiert aber auch die problematischen Eigenschaften von
Bitumen wie Brennbarkeit und Beeinträchtigung der Integrität durch radioakti
ve Strahlung.
- 8 -

Seit Beginn der Bituminierungstechnologie werden Untersuchungen durchgeführt
bezüglich der mechanischen, physikalischen und chemischen Eigenschaften
und Langzeitstabilität von Bitumen und Bitumen-Abfallgebinden. Es
existieren zahlreiche Arbeiten zur Auslaugung, zur Radiolyse und Thermolyse,
zur mechanischen und chemischen Beständigkeit und zur Alterung von
Bitumen (Körner und Dagen 1971, Zeger und Knotik 1977, Smailos et al.
1978, Dagen 1980, Eschrich 1980, Kluger et al. 1980, Brodersen et al. 1983,
Peltonen und Niemi 1983, Hietanen et al. 1985, Snellmann und Valkiainen
1985, Valkiainen und Vuorinen 1985, u.a.).
Der Problematik der mikrobiellen Beeinträchtigung der Integrität und
Langzeitstabilität von Bitumen wird erst seit wenigen Jahren Beachtung
geschenkt, obwohl bekannt ist, dass Bitumen unter Bedingungen, welche
mikrobielle Aktivität ermöglichen, zerstört werden kann (Kap.l). Wichtige
Schlussfolgerungen aus bisherigen Untersuchungen besagen, dass Bitumen
abbauende Mikroorganismen überall zu finden sind und die Geschwindigkeit
des Abbaus massgeblich durch die chemische Zusammensetzung und den
physikalischen Zustand des Bitumens sowie die vorherrschenden
Umgebungsbedingungen bestimmt wird. In allen Fällen, auch unter optimalen
Bedingungen für mikrobielles Leben, erfolgt der Abbau von Bitumen sehr
langsam (Drent 1972, ZoBell und Molecke 1978, Eschrich 1980, Bachofen et
al. 1984).
Bis in die frühen 80er Jahre existieren keine Arbeiten, aufgrund derer
quantitative Aussagen bezüglich der Langzeitstabilität von Bitumen gemacht
werden können. Die wenigen experimentellen Untersuchungen, die quantitative
Angaben zum mikrobiellen Abbau von Bitumen enthalten, sind kaum
vergleichbar, da keine einheitlichen Abbauparameter Anwendung fanden, mit
unterschiedlichsten Bitumen gearbeitet wurde und die Kultivationsbedingungen
zum Teil stark variierten (Bachofen et al. 1984).
Da die im Endlager herrschenden Verhältnisse mikrobielle Aktivitäten nicht
ausschliessen (Nagra Projektbericht Gewähr 1985a), werden auf Anstoss der
Nagra experimentelle Untersuchungen durchgeführt, mit dem Ziel, den
mikrobiellen Abbau von Bitumen zu quantifizieren.
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1.3. Quantifizierung des mikrobiellen Abbaus von Bitumen: Problemstellung
und Vorgehen
In der vorliegenden Arbeit wird das Phänomen des mikrobiellen Abbaus von
Bitumen, eines schwer abbaubaren, wasserunlöslichen Substrates, untersucht.
Die Verbreitung der Fähigkeit, das für die Immobilisierung radioaktiver
Abfälle vorgesehene Bitumen abzubauen, wird abgeklärt, mikrobielles
Wachstum auf diesem Bitumen genauer analysiert. Um Aussagen machen zu
können, in welchem Ausmass mikrobielle Aktivität über eine lange Zeit die
Integrität und somit Langzeitstabilität von Bitumen zu beeinträchtigen vermag,
wird der mikrobielle Abbau quantifiziert.
Bitumen ist ein komplexes Substrat, zusammengesetzt aus einer Vielzahl von
Komponenten (Kap. 2.1). Verschiedene Bitumen können bezüglich ihrer
chemischen Zusammensetzung und physikalischen Eigenschaften stark
variieren. Diese Unterschiede bestimmen unter Umständen massgeblich die
Geschwindigkeit des mikrobiellen Abbaus (ZoBell und Molecke 1978). Aus
diesem Grunde ist es wichtig, den experimentellen Untersuchungen das in der
Schweiz verwendete Bitumen (Ebano B 15, Esso) zugrunde zu legen.
Bitumen ist ein wasserunlösliches Substrat. Die Abbaugeschwindigkeit wird
daher massgeblich von seiner gemeinsamen Oberfläche mit dem wässrigen
Medium bestimmt. Da es auch unter optimalen Bedingungen nur sehr langsam
metabolisiert wird (ZoBell und Molecke 1978), muss die Oberfläche erheblich
vergrössert werden, um unter zeitlich beschränkten experimentellen
Bedingungen quantitativerfassbare Messwerte zu erhalten. Das Verfahren der
Oberflächenvergrösserung darf das Bitumen bezüglich seiner chemischen
Zusammensetzung nicht verändern.
Mikrobielle Aktivitäten sind unter natürlichen Bedingungen immer solche
mikrobieller Oekosysteme, bestehend aus einer Vielzahl verschiedener Species
mit unterschiedlichen stoffwechselphysiologischen Eigenschaften. Im Vergleich
zu Reinkulturen, welche normalerweise nur Teilschritte auszuführen in
der Lage sind, bauen Mischkulturen Naturstoffe, wie beispielsweise auch
Bitumen, in der Regel vollständig ab. Da wir in erster Linie an der Erreichung
eines vollständigen Abbaus und nicht an der Abklärung bestimmter
Abbauwege interessiert sind, werden die Abbauversuche mit Mischpopulationen
durchgeführt.
- 10 -

Da über die Umgebungsbedingungen, welche in einelD: Endlager vorherrschen
werden, nur unzulängliche Angaben gemacht werden können (Elektrowatt
1985) und die Bedingungen sich zudem im Verlaufe der Zeit verändern,
werden die experimentellen Untersuchungen unter möglichst optimalen
Bedingungen durchgeführt. Dieses Vorgehen erlaubt zum einen, die
Versuchsdauer erheblich zu verkürzen, zum andem bringt es den Vorteil mit
sich, die ermittelten Daten im Rahmen einer Sicherheitsanalyse als konservative
Werte betrachten zu können (Kap. 4.1).
Am Anfang dürften im Endlager aerobe Bedingungen vorherrschen. Nach
dessen Versiegelung wird mit der Zeit der für Mikroorganismen verfügbare
Sauerstoff verbraucht. Es werden sich zunehmend anaerobe Verhältnisse
einstellen. Der mikrobielle Abbau von Bitumen muss somit sowohl unter
aeroben als auch anaeroben Bedingungen untersucht werden.
Um die vorgegebenen Fragestellungen bezüglich des mikrobiellen Abbaus von
Bitumen beantworten zu können, sind vorerst folgende Vorarbeiten durchzuführen:
- Zubereitung von Bitumen als mikrobielles Substrat durch Ob erflächenvergrösserung
und Suspendierung in wässrigem Medium
- Isolierung und Anreicherung Bitumen abbauender Mikroorganismen
- Aufbau von Kultivationssystemen für aerobe und anaerobe Bedingungen
und Evaluation optimaler Wachstumsparameter
- Definition von Messgrössen, die mit dem mikrobiellen Abbau von Bitumen
korrelieren und Wahl geeigneter analytischer Methoden zu deren
quantitativer Erfassung.
- 11 -

2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. Bitumen
Bitumen sind definiert als" ... bei Aufarbeitung geeigneter Erdöle gewonnene,
schwerflüchtige, dunkelfarbige, hochviskose, thermoplastische Gemische organischer
Substanzen ... " (Neumann 1980). Je nach Art der Aufbereitung
(Raffination) entstehen Bitumen mit unterschiedlichen Eigenschaften:
Destillierte Bitumen, Oxidationsbitumen, Hartbitumen oder Kaltbitumen.
Bezüglich der chemischen Zusammensetzung von Bitumen schreibt Neumann
(1980): "Von keinem einzigen Bitumen ist die Zusammensetzung aus den
Komponenten bekannt. Die Zahl der ein Bitumen bildenden Komponenten
kann nicht einmal in ihrer Grössenordnung abgeschätzt werden." Bekannt ist
der dominierende Anteil verschiedenster Kohlenwasserstoffe. U eberwiegend
auftretende Verbindungen sind alkylsubstituierte Naphthenaromaten, Alkylary
le, Cycloalkane und geradkettige und verzweigte Alkane. Der Anteil an
Nicht-Kohlenwasserstoffen ist relativ hoch. Sie setzen sich zusammen aus
Schwefelverbindungen, zur Hauptsache Merkaptane, Sulfide, Thiophene sowie
Benz- und Alkylthiophene, Sauerstoffverbindungen, vor allem Naphthensäuren,
Phenole und Fettsäuren und den noch wenig untersuchten, überwiegend
heterocyclischen Stickstoffverbindungen. Metallverbindungen liegen hauptsächlich
in Form anorganischer Salze, Metallseifen und organischer Metallund
Komplexverbindungen vor. Die prozentualen Anteile der wichtigsten in
Bitumen vorkommenden Elemente werden ungefähr wie folgt angegeben;
Kohlenstoff 80-88%, Wasserstoff 8-11 %, Sauerstoff 1-15%, Schwefel 1-8%,
Stickstoff ca. 1 % (ZoBell und Molecke 1978, Eschrich 1980, Neumann 1980,
Elektrowatt 1985).
Unterschiedlich zusammengesetzte Bitumen zeigen ähnliche Eigenschaften.
Diese werden vor allem von der Struktur bestimmt. Bitumen sind kolloidale
Systeme, die zwei Gruppen kolloidal dispergierter Anteile enthalten: die
Asphaltene, welche aus relativ polaren Verbindungen mit einem grossen Anteil
an Heteroatomen und darin eingeschlossenen Salzen aufgebaut sind und die
Erdölharze, die überwiegend aus alkylsubstituierten naphthenaromatischen
- 12-

Kohlenwasserstoffen und basischen organischen Stickstoffverbindungen bestehen.
Asphaltene und Erdölharze sind stabil in einer öligen Phase, auch
Maltene genannt, kolloidal dispergiert (Neumann 1980).
Eingeteilt werden Bitumen im wesentlichen nach dem Kriterium der
Konsistenz, einer wichtigen Eigenschaft aus der Anwendung im Strassenbau.
Die Normierung erfolgt in den meisten Fällen nach der Anzahl Zehntelmillimeter,
um welche eine mit lOg belastete, genormte Nadel bei 25° C
innerhalb von fünf Sekunden in das Bitumen eindringt (Neumann 1980).
In der Bituminierungsanlage des Kernkraftwerks Gösgen-Däniken findet
Normbitumen Ebano B 15, ein hartes Destillationsbitumen, Verwendung.
Seine Spezifikation kann Tab. 1 entnommen werden.
2.1.1. Oberflächenvergrösserung und Suspendierung von Bitumen
Die Abbaurate eines wasserunlöslichen Substrates ist direkt abhängig von der
Oberfläche der Substrat-Wasser-Grenzschicht. Der quantitative Nachweis
biologischer Abbauprozesse mit Bitumen als Substrat unter zeitlich limitierten
experimentellen Bedingungen wird daher erleichtert durch das Vorhandensein
einer möglichst grossen Substratoberfläche. Bei der Zubereitung der Suspension
darf das Bitumen bezüglich seiner chemischen Zusammensetzung und
seiner Eigenschaften nicht verändert werden. Die Suspension muss während
langer Zeit haltbar sein und unter verschiedensten Umgebungsbedingungen,
_ wie hohe und tiefe pH-Werte, unterschiedliche Temperaturen, mechanische
Belastung, etc., stabil bleiben. Es ist besonders darauf zu achten, dass die
Suspension ausser Bitumen keine weiteren organischen Komponenten enthält.
Folgendes Verfahren erlaubt eine diesen Anforderungen entsprechende
Bitumen-in-Wasser-Suspension herzustellen: Eintauchen einer eingewogenen
Menge Bitumen in flüssigen Stickstoff (-196° C) für kurze Zeit (ca. 1 Minute),
feines Zerreiben des erhärteten Bitumens im Mörser und anschliessendes
Aussieben grober Partikel (Siebrnaschenweite 1 mm), Beimischung von 10
Gewichtsprozenten Tixoton zum pulverisierten Bitumen (Tixoton ist ein mit
Soda und Magnesiumhydroxid aktivierter Naturbentonit, welcher sich aus ca.
70% Montmorillonit sowie den Begleitmineralien Hlit, Kaolinit und Quarz
- 13 -

zusammensetzt) und Suspendierung des Bitumen-Bentonit-Gemisches in
einem definierten Volumen Kultivationsmedium.
Penetrationsgrad (25 0 C)
1-2 mm
Penetrationsabnahme nach Erhitzen < 40%
Erweichungspunkt (Ring und Kugel)
Erweichungspunkterhöhung nach Erhitzen
Brechungspunkt
Brechungspunkterhöhung nach Erhitzen
Flammpunkt
Brennpunkt
67-72 0 C
< 6 0 C
3 0 C
< 50 C
320 0 C
410 0 C
Gewichtsverlust nach 5 Std. bei 163 0 C < 1 Gew. %
Duktilität
Duktilität nach Erhitzen
> 5 cm
> 2 cm
Dichteverhältnis (H 2
0/Bitumen) 1.04
Paraffingehalt < 2 Gew. %
Aschegehalt
< 0.5 Gew.%
Tab.l: Spezifikation von Normbitumen Ebano B 15. Angaben aus Elektrowatt
(1985).
- 14-

2.2. Isolierung und Anreicherung Bitumen abbauender Mikroorganismen
ZoBell und Molecke (1978) schreiben, dass nur eine relativ geringe Anzahl
von Species in der Lage sind, Asphalte zu verwerten, dass solche Organismen
jedoch überall vorkommen, hauptsächlich in Böden. Ein screening-Programm
zur Selektion Bitumen abbauender Organismen drängt sich daher nicht auf. Um
jedoch abzuklären, in welchem Ausrnass unterschiedliche mikrobielle
Oekosysteme den Abbau von Bitumen beeinflussen, werden Abbauversuche
mit Mikrofloren verschiedener Herkunft durchgeführt.
Die Beimpfung aerober Versuchsansätze erfolgt mit Inokuli, welche aus
Gartenerde und asphalthaltiger Erde einer Asphaltmine (Travers NE) zubereitet
werden. Wenig Erde wird nach schonender mechanischer Zerkleinerung in
Kultivationsmedium aufgeschlemmt. Nach Entfernung grober Partikel durch
Sedimentation (ca. 1 Minute) wird ein definiertes Volumen der Suspension als
Inokulum einem Versuchsansatz zugegeben. Die mikrobielle Aktivität von
Impfmaterial aus natürlichen Oekosystemen wird verglichen mit derjenigen
Bitumen-adaptierter Kulturen. Die Anreicherung erfolgt in Perkolationssystemen
und Schüttelkulturen.
In Perkolationssystemen werden Bodenproben (Gartenerde und asphalthaltige
Erde) und mechanisch zerkleinertes Bitumen im Verhältnis 1: 1 vermischt und
in ein mit Gummistopfen verschlossenes Glasrohr (20 x 4.5 cm) eingefüllt.
Mittels Begasung durch Luft wird Kultivationsmedium (Kap. 2.3.1) aus einem
Reservoir in Umlauf gebracht; damit wird die kontinuierliche Feuchthaltung
des Boden-Bitumen Gemisches garantiert (Abb. 2). Die Kultivation erfolgt bei
Zimmertemperatur. Das Anfangs-pH wird auf 7.0 eingestellt, und Licht wird
durch Abdecken der Gefässe von den Organismen ferngehalten. Nach ca.
dreimonatiger Anreicherung entnimmt man dem Reservoir ein definiertes
Volumen als Inokulum zur Beimpfung aerober Versuchsansätze.
In Erlenmeyer-Kolben (250 ml) werden nicht beimpfte, unsterile Bitumen­
Suspensionen bei Zimmertemperatur, einem Anfangs-pH von 7.0 und einer
Rührdrehzahl von 160 U / Min. im Dunkeln kultiviert. Das Ziel ist, abzuklären,
ob sich aus unsterilen Anfangsbedingungen mikrobielle Aktivität etablieren
kann.
- 15 -

Druckausgleichöffnung
+-- Gummistopfen
+-- Anreicherungsmaterial
+-- Glaswatte
~ Steigrohr
~~~I +-- Anreicherungsmedium
Lufteinlass
Abb.2: Aufbau einer Perkolationsapparatur nach Audus (1946), abgeändert.
Das Impfmaterial für anaerobe Versuchsansätze wird aus Gartenerde
zubereitet. Das Aufbereitungsverfahren entspricht demjenigen für aerobe
Versuchsansätze. Im weiteren wird ein Rübenschwemmwasser-Klärschlamm­
Gemisch, entnommen einer als Anaerobenfilter betriebenen Pilotanlage (Da
Pra 1987), als Inokulum verwendet. Durch Beimpfung von Bitumen-Suspensionen
mit Gartenerde, Rübenschwemmwasser-Klärschlamm-Gemisch und
Seesediment und anschliessender Kultivation dieser Versuchsansätze auf
Laborschüttlem, werden Bitumen-adaptierte, anaerobe Kulturen selektioniert.
Die Kulturen werden in Schottflaschen unter Heliumatmosphäre kultiviert. Das
Anfangs-pH der Ansätze ist auf 7.2 eingestellt. Die Kultivation erfolgt bei
Zimmertemperatur und einer Rührdrehzahl von 160 U / Min. im Dunkeln.
- 16 -

2.3. Kultivation Bitumen abbauender Mikroorganismen
2.3.1. Aerobes Kultivations- und Messsystem
Um die Abbauversuche unter möglichst optimalen Bedingungen durchführen
zu können (Kap. 1.3), ist darauf zu achten, dass neben dem Vorhandensein
einer möglichst grossen Substrat-Wasser-Grenzschicht alle für mikrobielles
Leben notwendigen Elemente (Kohlenstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Schwefel, Phosphor, Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen und Spurenelemente)
im Kultivationsmedium vorhanden sind. Dieser Anforderung
entsprechend verwenden wir das nachfolgende Medium (Tab. 2).
(NH 4 )2S04 5 mM
MgS0 4 · 7H 2
O 1 mM
CaC1 . 2
2H 2
O 0.5 mM
NaCl 5 mM
KCI 2.5 mM
KN0 3
1 mM
KH 2
P0 4
10 mM
Spurenelemente:
CuS0 4
' 5H 2
O 0.03 JlM
Fe 2 (S04)3 · 5H 2 O 10 JlM
MoN~04' 2H 2 O 0.2 JlM
Co(N0 3
)2 . 6H 2
O 0.8 J.lM
ZnS0 4 · 7H 2
O 0.5 J.lM
MnS0 4 ·H 2
O 0.45 JlM
H 3
B0 3
0.25 JlM
NiC1 2
. 6H 2
O 0.1 JlM
V 2
0 S
0.01 JlM
Kohlenstoffquelle: Bitumen
Tab. 2: Nährmedium für die Kultivation Bitumen abbauender Mikroorganismen
unter aeroben Bedingungen.
Das pH der Nährlösung wird auf 7.0 eingestellt.
- 17 -

Der Sauerstoftbedarf für die vollständige Oxidation von Kohlenwasserstoffen
ist hoch. Der theoretische Sauerstoffverbrauch für die Oxidation von 1 g Rohöl
beträgt 3-4 g Sauerstoff (Roffey und Hjalmarsson 1983). Da die Löslichkeit
von Sauerstoff in Wasser sehr gering ist (ca. 20 ml 02 / Liter H 2
0, unter
Normalbedingungen), ist eine ausreichende und kontinuierliche Sauerstoffversorgung
für die Gewährleistung optimaler Wachstumsbedingungen von
grosser Wichtigkeit. Hoher Sauerstoffeintrag lässt sich am besten erfüllen
durch Kultivation in einem Bioreaktor bei kontinuierlicher Gaszufuhr und
hoher Rührdrehzahl. Durch Rühren wird der Massetransfer von Sauerstoff aus
der Gas- in die wässrige Phase erhöht, was eine optimale Sauerstoffversorgung
der Kultur ermöglicht.
Bioreaktoren erlauben ferner, die wichtigsten Umgebungsparameter kontinuierlich
zu überwachen und konstant zu halten. Durch Vorgabe folgender
Parameter simulieren wir möglichst optimale Wachstumsbedingungen: Temperatur
30° C, Belüftungsrate 0.5 1 / Min., Rührdrehzahl 500 U / Min. Licht
wird durch Abdecken von der Kultur femgehalten.
Die technischen Daten der verwendeten Bioreaktoren wurden bereits mehrfach
detailliert beschrieben (Schneider und Frischknecht 1977, Muster et al. 1983).
Es handelt sich um Kultivationsgefässe mit einem Nutzvolumen von 1.8 Liter,
Deckel und Boden enthalten gasdichte Durchführungen für Zu- und Abluft und
die Sensoren für pH- und Temperatur-Messungen. Die Rührwelle wird durch
einen stufenlos regulierbaren Elektromotor angetrieben (Abb. 3).
Als Messgrösse zur Quantifizierung der biologischen Aktivität dient das unter
aeroben Bedingungen anfallende Stoffwechselendprodukt Kohlendioxid. (Bei
vollständiger Oxidation wird der nicht in Form von Biomasse assimilierte
Kohlenstoffanteil des Substrates als Kohlendioxid freigesetzt, Kap. 3.2.3). Um
Kohlendioxid biogenen Ursprungs erfassen zu können, muss neben absoluter
Gasdichtheit des Kultivationsgefässes und Messsystems die Kultur mit CO 2
-
freier Luft begast werden können. Dies wird erreicht, indem die Zuluft vor
Eintritt in den Bioreaktor durch. eine mit Natronkalk gefüllte Säule geleitet
wird. Diese vermag den Kohlendioxidanteil der für die Begasung der Kultur
verwendeten Luft vollständig zu adsorbieren. Zur Ueberprüfung der
Adsorptionsleistung des Natronkalks wird die Zuluft zeitweise direkt dem
Analysegerät (Kap. 2.4.6) zugeführt. Die Umleitung des Gases erfolgt durch
Mikromagnetventile, deren Steuerung durch eine Schaltuhr. Zur Entfernung
des die Analyse beeinträchtigenden Wasserdampfes (sich überschneidende
- 18 -

Infrarotspektren von Wasser und Kohlendioxid) strömt die Abluft vor Eintritt
in das Analysegerät durch eine mit Silicagel gefüllt Säule. Die Belüftungsrate
wird mittels einer Druckreduzierstation und Drosselventilen reguliert und am
Ausgang mit einem Rotameter kontinuierlich überwacht.
Abb. 3:
Verwendete Bioreaktoren zur Kultivation aerober Versuchsansätze,
mit angeschlossenen Mess- und Regelsystemen.
- 19 -

Beim Beimpfen eines Versuchsansatzes kann zusammen mit dem Inokulum
organisches Material ins Reaktionsgefäss eingeschleppt werden. Aus diesem
Grunde wird die Gasbildungsrate jedes Versuchsansatzes verglichen mit
derjenigen eines Bioreaktors, welcher unter äquivalenten Bedingungen
betrieben wird, aber kein Bitumen enthält. Die Abluft beider Reaktoren wird
durch Umschaltung entsprechender Mikromagnetventile dem Analysegerät
zugeleitet. Die Umschaltintervalle werden durch eine Schaltuhr vorgegeben.
Abb. 4 veranschaulicht den Aufbau des Kultivations- und Messsystems aerober
Versuchsansätze.
Abb.4 (S. 21): Aufbau des Kultivations- und Messsystems zur Quantifizierung
des mikrobiellen Abbaus von Bitumen unter aeroben Bedingungen.
Die unbenannten Komponenten des linken Systemteils entsprechen
den im rechten Teil gekennzeichneten analogen Komponenten.
1: Gaseintritt 7: Schaltuhr
e: Gasaustritt 8: Rotameter
B: Bioreaktor 9: Schreiber
A: Infrarot - Analysator 10: Temperaturfühler
1: Druckreduzierstation 11 : Temperaturregler
2: Drosselventil 12: Reizstab
3: Natronkalk - Säule 13: Kühlwasserkreislauf
4: Silicagel / CaCl 2
- Säule 14: Elektromotor
5: Filter 15: Drehzahlregler
6: U mschaltventil 16: pR - Elektrode
17: pR - Regler
- Gasleitung
Flüssigkeitsleitung
Steuerleitung
- 20-

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,
I
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13
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I
I
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I
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- 21 -

2.3.2. Anaerobes Kultivations- und Messsystem
Die zur Aufrechterhaltung der Lebensvorgänge notwendige Energie beziehen
Mikroorganism~n bei chemotropher Lebensweise durch Oxidation anorganischer
oder organischer Verbindungen. Die dabei anfallenden
Reduktionsäquivalente müssen aus dem Organismus entfernt werden. Bei
Fehlen von molekularem Sauerstoff kann dies durch Reduktion relativ
oxidierter anorganischer oder organischer Verbindungen (z.B. N0 -, 3
Mn 3 +,4+,
Fe 3 +, S042-, CO ; 2
Reihenfolge entsprechend dem Normalpotential der
Oxidationsmittel) geschehen. Man spricht in diesem Falle von anaerober
Atmung. Sind in unmittelbarer Umgebung der Mikroorganismen keine
entsprechenden Endakzeptoren vorhanden, können die Organismen sich
überschüssiger Reduktionsäquivalente u.a. durch Gärungsprozesse entledigen.
Bei vollständigem anaerobem Abbau eines Substrates durch ein mikrobielles
Oekosystem wird der nicht assimilierte Anteil des Substrat-Kohlenstoffs in
Form von Kohlendioxid und Methan freigesetzt. Bei Gärungsprozessen und
unvollständiger anaerober Atmung kann ein Teil des nicht assimilierten
Substrat-Kohlenstoffs in Form unvollständig oxidierter organischer Verbindungen
(z.B. Essigsäure, andere kurzkettige Fettsäuren, Alkohole, etc.) ins
Medium abgegeben werden.
Der anaerobe Bitumenabbau wird unter Vorgabe verschiedener Elektronenakzeptoren
(Nitrat, Sulfat, Eisen) untersucht. Ob bei deren Fehlen mikrobielle
Aktivität festgestellt werden kann, wird ebenfalls abgeklärt.
Die Kultivation erfolgt in Flaschen (250 ml Schottflaschen), die mittels einer
Butyl-Kautschuk-Membran gasdicht verschlossen werden. Sauerstofffreie Bedingungen
werden hergestellt durch Evakuierung (ca. 15 Min.) und anschliessende
Begasung des Versuchsansatzes mit Helium. Das Helium wird
vor der Zuleitung zu den Kulturen durch eine mit BASF-Katalysator gefüllte
Säule geleitet, um eventuelle Sauerstoffverunreinigungen des Gases zu
entfernen. Ein Helium Ueberdruck von 0.4 - 0.5 atm erleichtert die spätere
Gasentnahme zu Analysezwecken. Die Flaschen werden im Dunkeln auf einem
Laborschüttier bei einer Rührdrehzahl von 160 U / Min. und einer Temperatur
von 35° C kultiviert. Ein Versuchsansatz enthält eine definierte Menge
Bitumen in mechanisch zerkleinerter, suspendierter Form. Um abzuklären, in
welchem Ausmass Bitumen-fremde Kohlenstoff-Quellen, v.a. durch Eintra-
- 22-

gung mit dem Inokulum, der mikrobiellen Aktivität zugrunde liegen, wird jeder
Bitumen enthaltende Versuchsansatz mit einem unter äquivalenten Bedingungen
kultivierten, jedoch kein Bitumen enthaltenden Ansatz verglichen.
Das Mineralsalzmedium (Tab. 3) enthält alle essentiellen Elemente und die
entsprechenden Elektronenakzeptoren in ausreichender Konzentration.
NH 4
Cl 5 mM
{FeS} 0.123 g/l
MgS0 4
' 7 H 2
0 0.1 mM
MgC1 2
0.5 mM
KH 2
P04 30 mM
CaC1 . 2
2 H 2
0 1 mM
NaCl 1 mM
FeC1 2
0.1 mM
Spurenelemente:
H 3
B0 3
0.25 JlM
MnC1 2 ·4H 2
O 1 JlM
ZnC1 2
0.5 JlM
CuCl ·6H 0
0.25
2 2
JlM
NiC1 2 ·6H 2
O 0.25 JlM
CoS0 ' 4
7H 2
O 0.25 JlM
NazMoO 4 . 2H 2
O 0.5 J.lM
Elektronenakzeptoren:
(falls im Versuchsansatz
vorhanden)
NaN° 3
5 mM
FeCl 3
5 mM
NazS04 5 mM
Kohlenstoffquelle: Bitumen
Tab. 3: Nährmedium für die Kultivation Bitumen abbauender Mikroorganismen
unter anaeroben Bedingungen.
- 23-

Das pH aller Kulturen ist auf 7.2 eingestellt. Da das pH eines Versuchsansatzes
während der Kultivation nicht geregelt werden kann, wird durch Vorgabe des
Aequivalenzpunktes des Phosphat-Puffersystems dessen maximale Pufferkapazität
ausgenützt.
Die Quantifizierung der mikrobiellen Aktivität erfolgt durch Erfassen der in
Form von Kohlendioxid und Methan anfallenden Substrat-Kohlenstoffanteile
mittels Gaschromatographie (Kap. 2.4.7). Ins Medium abgegebene Kohlenstoffverbindungen
können gesamthaft als "gelöster organischer Kohlenstoff'
gemessen werden.
Bei den Gasanalysen ist der in einem Versuchsansatz herrschende Ueberdruck,
ein eventueller Gasverlust durch Diffusion und der im Medium gelöste
Gasanteil zu berücksichtigen. Für die Kohlenstoff-Bilanzierung ist der als CO 2
in Erscheinung tretende Substratkohlenstoff um den in gelöster Form
vorliegenden Hydrogencarbonatanteil zu ergänzen, wobei der Teil des
Kohlendioxids, welcher als Hydrogencarbonat in Lösung geht, durch das pH
der wässrigen Phase bestimmt wird (Kap. 2.5.3).
2.4. Analytische Methoden
2.4.1. Nassaufschluss unter Druck
Für atomspektroskopische Messungen sind störende organische Komponenten
zu entfernen. Im Falle von Bitumen ist dies möglich durch Nassaufschluss
unter Druck (Kotz et al. 1972). Bitumen (1 g) wird in einem Teflongefäss mit
konzentrierter Salpetersäure (1 ml) versetzt und in einem Edelstahlzylinder im
Heizblock bei 150 0 C während ca. 30 Std. erhitzt. Nach dem Aufschluss wird
die Probe filtriert (Millipore, 0.45 Jlm) und in einem Polystyrolröhrchen
aufbewahrt.
2.4.2. Multielement-Analyse
Die Bestimmung der Elemente Aluminium, Bor, Calcium, Cadmium, Cobalt,
Chrom, Kupfer, Eisen, Quecksilber, Kalium, Lithium~ Magnesium, Mangan,
Molybdän, Natrium, Nickel, Phosphor, Blei, Schwefel, Silicium, Zinn und
Zink erfolgt durch induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissions-Spektroskopie.
- 24-

Bei einer Genauigkeit von ungefähr 1 % lassen sich für die einzelnen Elemente
folgende Konzentrationen noch nachweisen (in J.lM): Al 1.9, B 0.4, Ca 0.3,
Cd 0.02, Co 0.1, Cr 0.1, Cu 0.08, Fe 0.09, Hg 0.02, K 5.1, Li 0.6, Mg 0.04,
Mn 0.02, Mo 0.03, Na 1.3, Ni 0.2, P 0.6, Pb 0.1, S 1.6, Si 0.4, Sn 0.4, Zn 0.02.
Hohe Natriumgehalte einer Probe verringern die Sensitivität der Messung.
Ebenso führen zu hohe Konzentrationen an Salpetersäure zu einer
Abschwächung des Signals. Für zuverlässige quantitative Messungen sollte
generell eine Konzentration von 20 mg / I nicht überschritten werden (Brandl
1987).
2.4.3. Bestimmung der Grässenverteilung suspendierter Partikel
Volumenbestimmung und Grässenverteilung suspendierter Partikel erfolgen
mit einem Malvem Partikel-Zähler (Serie 2600) nach dem Laser-Streulicht­
Prinzip. Ein Aliquot einer Bitumen-Suspension wird in eine mit Wasser
gefüllte Messküvette (15 ml) gegeben. Kontinuierliches Rühren in der
Probenkammer gewährleistet homogene Verteilung der Partikel. Die
Partikelvolumina werden im Messbereich von 11.6 - 1128 J.lm quantitativ
erfasst. Die Auflösung der Partikelgrössenverteilung erfolgt über einen Bereich
von 32 Kanälen. Das Volumen der Bentonit-Partikel wird im Messbereich von
1.9 - 188 J.lm detektiert. Die Berechnung der Oberfläche der suspendierten
Bitumen-Partikel aus deren Grössenverteilung wird in Kap. 2.5 erläutert.
2.4.4. Epifluoreszenzmikroskopie
Zur Visualisierung stoffwechselaktiver Mikroflora wird der Vitalfarbstoff
Carboxy-Fluoreszeindiacetat (CFDA, Molecular Probes Inc.) verwendet. Die
Eigenschaften des Farbstoffes, sein Wirkungsmechanismus und die Problematik
der Probenvorbereitung und -auswertung werden von Brunner et al.
(1987) beschrieben. Das Färbeverfahren erfolgt nach der Methode von Brunner
et al. (1987): Wenig Bitumen-Suspension wird mit dem Farbstoff CFDA
versetzt (Endkonzentration 20 - 30 J.lM) und für 20 - 30 Min. bei Raumtemperatur
im Dunkeln inkubiert. Das pR des Ansatzes wird auf 6.3 eingestellt.
Anschliessend wird die Probe filtriert (Nuclepore-Filter, 0.2 flm). Zur
Verringerung der Hintergrundfluoreszenz werden die Filter vor Gebrauch mit
Irgalan-Schwarz (Ciba-Geigy) behandelt (Hobbie 1977), mit ca. 5 ml
- 25 -

sterilfiltriertem Mineralsalzmedium gewaschen und auf einem Objektträger
fixiert. Die Analyse erfolgt mittels eines Fluoreszenz-Mikroskops (Leitz
Dialux 20) mit einer geeigneten Filterkombination: Anregungslicht 470 - 490
nm, Fluoreszenzemission 515 nm. Für die Photo graphie wird ein Wild
Photoautomat (Mka 4) verwendet.
2.4.5. Rasterelektronenmikroskopie
Die Aufnahmen werden mit einem Cambridge - S4 Rasterelektronenmikroskop
gemacht (Beschleunigungsspannung 20 kV). Für die Photo graphie werden
Ilford Pan-F Filme verwendet. Die Proben werden in 4%-iger Glutaraldehydlösung
über N acht fixiert und anschliessend mehrmals mit
Mineralsalzmedium gewaschen. _Die Gefriertrocknung erfolgt bei 0.02 Torr
während ca. 20 Stunden (Christ Delta I Gefriertrockner). Vor der Analyse wird
das Material mit einer Gold - Paladium Legierung (80 : 20) beschichtet.
2.4.6. Infrarotspektroskopie
Für die kontinuierliche Erfassung des unter aeroben Bedingungen produzierten
Kohlendioxids wird ein Infrarot-Analysator (Beckman 215A oder 865) eingesetzt.
Die Messung der Kohlendioxid - Konzentration erfolgt im Messbereich
0 - 500 ppm und 0 - 100 ppm. Die Messgenauigkeit beträgt + 1 %, die
Empfindlichkeit 0.5 % der vollen Skala. Das Messprinzip beruht auf der
Infrarotabsorption des Kohlendioxids (A. = 4.2 - 4.3 Jlm).
2.4.7. Gaschromatographie
Die Gasanalyse anaerober Versuchsansätze erfolgt mittels Gaschromatographie.
Verwendet wird ein Shimadzu R-IA Gaschromatograph (Shimadzu
Corp., Japan), ausgerüstet mit einem TCD- und FID-Detektor.
Die Methan-Analysen werden mit dem Flammenionisationsdetektor (FID)
durchgeführt (Betriebstemperatur 200 0 C, (0.5 kg H 2
/ cm 2 und 0.5 kg Luft /
cm 2)). Als Säulenmaterial dient MS-5A 80/100 mesh (Supelco Inc., USA).
Messbedingungen: Trägergas Stickstoff 52 (Carba Gas), Gasfluss 50 ml / Min.,
Injektortemperatur 200 0 C, Temperaturprogramm isotherm bei 200 0 C. Die
Methan-Messung zeigt einen linearen Messbereich von 0 - 100 % Methan. Die
Messgenauigkeit beträgt ca. ± 0.5 %. Mittels der sensitiven FID-Detektion
- 26-

kann eIne Methan-Konzentration von wenIgen ppm nachgewiesen werden
(Kaiser 1988).
Die Kohlendioxid-Messungen werden mit dem Wärmeleitfähigkeitsdetektor
(TCD) vorgenommen (Betriebstemperatur 220 0 C, Stromstärke 100 mA). Als
Trägermaterial wird eine Carbosieve-S 120 I 140 mesh Säule (Supelco Inc.,
USA) eingesetzt. Messbedingungen: Trägergas Helium (Carba Gas), Gasfluss
70 ml IMin., Injektortemperatur 180 0 C, Temperaturprogramm 4 Min.
isotherm bei 70 0 C, Temperaturgradient von 70 - 200 0 C (Heizleistung 25 0 C I
Min.), 3 Min. isotherm bei 200 0 C. Aus Gründen einer ungenügenden
Auf trennung von Kohlendioxid und Wasserdampf können CO 2
-Konzentrationen
unterhalb eines Volumenprozentes nicht mehr quantitativ nachgewiesen
werden.
2.4.8. Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffs
Die Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffs erfolgt nach
vollständiger Oxidation der organischen Kohlenstoffverbindungen (Verbrennung
bei 950 0 C) zu Kohlendioxid und Wasser durch infrarotspektroskopische
Messung des entstandenen Kohlendioxids (Procon
DOC/TOC - Analysator). Vor der Analyse werden die Versuchsansätze filtriert
(Millipore, 0.45 Jlm). Durch Ansäuerung der Probe (1 ml) mit konzentrierter
Salzsäure (20 JlI) und anschliessender Begasung mit Helium wird der gesamte
anorganische Kohlenstoffanteil als CO 2
ausgeblasen. Die Injektion eines
definierten Probevolumens erfolgt durch eine automatische Einspritzvorrichtung.
Die Eichkurve ist im Messbereich von 0 - 100 mg I I linear. Bei
einer Genauigkeit von ca. ± 5 % kann eine Menge von 2 mg I I gelösten
organischen Kohlenstoffs noch nachgewiesen werden.
2.4.9 Dosimetrie
Die Quantifizierung der Gesamtdosis, welche bei Bestrahlungsversuchen (Kap.
3.2.2.4.3) einer Kultur appliziert wird, erfolgt mittels eines Alanin-Dosimeters.
Das Dosimeter ist in einem Kunststoffbehälter wasserdicht eingeschlossen und
auf der Rührwelle des Bioreaktors befestigt. Das Messprinzip beruht auf der
Aenderung der Elektronenspinresonanz freier Radikale. Die Auswertung der
Dosimeter erfolgt am Paul ScheITer Institut.
- 27 -

2.5. Berechnungen
2.5.1. Berechnung der Oberfläche suspendierter Bitumen-Partikel
Verschiedene Umgebungs bedingungen und mehrmonatige Kultivationsdauer
verändern die Partikel-Grössenverteilung einer Bitumen-Suspension unwesentlich
(Kap. 3.1.2). Dies erlaubt, den Berechnungen eine zeit- und parameterunabhängige
Partikel-Grössenverteilung zugrunde zu legen.
Die Bentonit-Partikel-Fraktion (10 Gewichtsprozente bezüglich der eingewogenen
Menge Bitumen) kann messtechnisch relativ gut von den Bitumen­
Partikeln unterschieden werden (Kap. 3.1.2). Eine durch Fremdpartikel
verursachte Verfälschung der errechneten Bitumenoberfläche kann somit in
engen Grenzen gehalten werden.
Die Berechnung wird unter der Annahme vorgenommen, dass die Bitumen­
Partikel kugelförmige Gestalt und keine innere Oberfläche haben. Der für die
Dichte eingesetzte Wert (pH 2
0 / pBitumen == 1) ist der Elektrowatt-Studie
(1985) entnommen.
Die Oberfläche einer definierten Menge suspendierten Bitumens wird nach
folgender Gleichung ermittelt:
0=
/ '\
(xyt)(l-a) 2
41tr 1
+
4 3
- 1tr l
3
/
/
\.
(xy2)(l-a)
4 3
3 1t (r 1+

Legende:
0: errechnete Gesamtoberfläche aller suspendierten Bitumen-Partikel [J.1m 2 ]
x: eingewogene Menge Bitumen [J.1m 3 (pH 2
0 I pBitumen = 1.04)]
: willkürlich gewählte Grösse zur Unterteilung der suspendierten Bitumen­
Partikel in einzelne Fraktionen: 50 J..1m (Kap. 3.1.3)
n: Anzahl Bitumen-Partikel-Fraktionen
r 1: angenommener mittlerer Partikeldurchmesser der ersten (kleinsten)
Bitumen-Partikel-Fraktion zwischen 50 J..1m und (50 J..1m +

Legende:
A a
: mikrobielle Aktivität unter aeroben Bedingungen
[g abge~autes Bitumen· 0- 1 . (1 ]
x: Kohlendioxid-Konzentration (kontinuierlich erfasstes Signal der mikrobiellen
Aktivität) [ppm]
f: Gasflussrate [l. Min. -1 ]
[u]: Term zur Umrechnung von ppm CO 2
in g Kohlenstoff
[(10 6 ppmr 1 · 22.4 r 1 · 12 g]
k 1
: Korrekturfaktor zur Umrechnung metabolisierten Substratkohlenstoffs in
Menge abgebautes Bitumen unter Berücksichtigung eines Kohlenstoffanteils
von 85.2% am Gesa~tbitumen (Elektrowatt 1985) [100 . 85.2- 1 ]
k 2
: Korrekturfaktor zur Umrechnung inetabolisierten Substratkohlenstoffs in
Menge abgebautes Bitumen unter Berücksichtigung eines ca. 40 - 70 %­
igen Anteils an assimiliertem Substratkohlenstoff (Kap. 3.2.3) [ca. 2]
0: Bitumen-Oberfläche (Kap. 3.1.3)
2.5.3. Quantifizierung des anaeroben Bitumenabbaus
Bei der Quantifizierung des anaeroben Bitumenabbaus sind folgende
Sachverhalte in Rechnung zu stellen (Kap. 3.3): Unter anaeroben Bedingungen
entstehen im Gegensatz zur aeroben Atmung energieenthaltende Stoffwechselendprodukte.
Die in den Endprodukten enthaltene Energie variiert je
nach Art der Abbaureaktion und entspricht 5 - 95 % des Energiegehaltes des
Substrates. Im Vergleich mit aeroben Lebensbedingungen muss daher für
Synthese und Grundstoffwechsel einer bestimmten Menge Biomasse ein
grässerer Anteil des Substratkohlenstoffs dem Energiestoffwechsel zugeführt
werden. Der Korrekturfaktor k 2
kann somit verschiedene Werte annehmen
(Kap. 3.3.2). Im weiteren ist zu beachten, dass gewisse anaerobe Abbauwege
zur Ausscheidung organischer Stoffwechselendprodukte (organische Säuren,
Alkohole, etc.) ins Medium führen (Kap. 3.3.2). Die mikrobielle Aktivität wird
wiederum in Beziehung zur Substratoberfläche gesetzt.
- 30-

Die Berechnung erfolgt nach folgender Gleichung:
Legende:
A : mikrobielle Aktivität unter anaeroben Bedingungen
aa . 0-1 -1]
[g abgebautes B ttumen . · t
x: in Form von Kohlendioxid vorliegender Substrat-Kohlenstoff-Anteil
[mg C]. Das Kohlendioxid-Volumen (x C02
) wird wie fo.lgt ermittelt:
(pH 2 -pK)
xC02 = [x2 (v a 2 + v b 2 + v c 2 + vd2)] [10 + 1]
(pHI -pK)
- [Xl (val + Vbl + v cl )] [10 + 1]
x 1: 2 ,
gaschromatographisch ermittelter Volumenanteil CO 2
in der Gasphase
va: Volumen über der wässrigen Phase des Versuchsansatzes [mI]
Vb: in Form von Ueberdruck vorhandenes Gasvolumen [mI]. Die Ermittlung
des Volumens erfolgt anhand von p/V-Eichkurven.
v c: Volumen des gelösten Kohlendioxids [mI]. Die Werte werden einer
CO 2
-Löslichkeitskurve (Umbreit et al. 1964) entnommen.
v d: Volumen des durch Permeation entwichenen Gases [mi]. Die Werte
werden mittels entsprechender p/V -Eichkurven aus der Druckdifferenz
zwischen zwei Messungen ermittelt.
[lO(pH-pK)+l]: Korrekturfaktor zur Berücksichtigung des in Form von
Hydrogencarbonat vorliegenden Kohlendioxid-Anteils. Für die Ermittlung
ist das pH jedes Versuchsansatzes zu messen. Die Umrechnung
erfolgt anhand der Henderson-Hasselbalch-Beziehung. Die
pH-Werte aller Versuchsansätze liegen unterhalb 7.5. Für die
Berechnungen wird dementsprechend folgender pK -Wert eingesetzt:
pK H _ CO /HCO-= 6.46.
~"'2 3 3
- 31 -

Index 2: Versuchsansatz mit Bitumen
Index 1: Versuchsansatz ohne Bitumen (Referenz)
Umrechnung des ermittelten Kohlendioxid-Volumens (x co ) in Menge
2
Kohlenstoff (x): x = x CO
. [u ]. l
[u ]: Term zur Umrechrt:ung von ml Kohlendioxid in m~ Kohlenstoff
l
[22.4 ml -1 . 12 mg].
y: in Form von Methan vorliegender Substrat-Kohlenstoff-Anteil [mg C].
Das Methan-Volumen (Y CH ) wird wie folgt ermittelt:
4
YCH4 = [Y2 (va2 + vb2 + vc2 + vd2)] - [YI (Val + Vbl + v cl)]
Y 2 1:
,
gaschromatographisch ermittelter Volumenanteil CH 4 in der Gasphase
v b d' Index 1,2: Angaben wie für die Ermittlung des Kohlendioxida,
,
Volumens. Ebenso für die Errechnung der Menge Kohlenstoff (y)
aus dem gemessenen Methan-Volumen (YCH ).
4
v: Volumen des gelösten Methans [mI]. Die Werte können
c
vernachlässigt werden (Kap. 3.3.1).
z: in Form von gelöstem organischem Kohlenstoff vorliegender Kohlenstoff-Anteil
[mg C]
k 1
: Korrekturfaktor zur Umrechnung metabolisierten Substratkohlenstoffs in
Menge abgebautes Bitumen. Angabe wie für die Ermittlung des aeroben
Bitumenabbaus.
k 2
: Korrekturfaktor zur Umrechnung metabolisierten Substratkohlenstoffs in
Menge abgebautes Bitumen unter Berücksichtigung des dem Energiestoffwechsel
zugeführten Substrat-Kohlenstoff-Anteils (Kap. 3.3.2).
0: Bitumen-Oberfläche
t: Zeit
- 32-

3. RESULTATE UND DISKUSSION
3.1. Bitumen als Substrat für mikrobielle ~ktivität
3.1.1. Elementarzusammensetzung von Bitumen
Bitumen dient als Energie- und Kohlenstoffquelle für mikrobielles Wachstum.
Die Analyse seiner elementaren Zusammensetzung (Tab. 4 und Tab. 5) gibt
Hinweise, in welchem Ausmass es darüber hinaus essentiellen anorganischen
Nährstoftbedürfnissen des mikrobiellen Stoffwechsels (Kap. 2.3.1) zu genügen
vermöchte.
Element
Gehalt
%
C 85.2
H 10.2
0
N 1.8
S 2.8
P, Metalle, usw. Rest
Tab. 4: Elementarzusammensetzung von Bitumen (Ebano B 15, Esso). Die
Angaben sind der Elektrowatt-Studie (1985) entnommen.
Für Sauerstoff wird keine Angabe gemacht. Der prozentualen Zusammensetzung
der Elemente entsprechend ist der Anteil vemachlässigbar
klein.
- 33-

Der mit dem Begriff "Rest" umschriebene Teil wird atomspektroskopisch
analysiert (Tab.5).
Element
Gehalt
mg / g Bit.
Al 0.27
Ca 0.93
Cu 0.05
Fe 0.9
Mg 0.14
Na 0.67
Ni 0.78
p' 0.64
Pb 0.26
Zn 0.53
Tab. 5: Elementaranalyse von Bitumen (Ebano B 15, Esso).
Die Elemente B und Si können in HN0 3
nicht gemessen werden.
Kalium und Mangan können in Spuren nachgewiesen werden, jedoch
unterhalb der quantitativerfassbaren Grenze. Die konzentrierte
Salpetersäure, in welcher die Elemente gelöst sind, beeinträchtigt
generell die Messgenauigkeit der atomspektroskopischen Analyse.
Viele essentielle Nährstoffe, wie beispielsweise Calcium, Eisen, Kalium,
Magnesium und Phosphor, sind im Bitumen nur in Spuren vorhanden. Damit
Mikroorganismen Bitumen als Substrat verwerten können, müssen diese
Nährstoffe als gelöste Species in der Umgebung vorhanden sein.
- 34-

3.1.2. Charakterisierung der Bitumen-Suspension
Bei Kohlenwasserstoffen steht die mikrobielle Aktivität in der Regel in direkter
Beziehung zur Oberfläche der Substrat-Wasser-Grenzschicht (ZoBell 1946,
Wyatt 1984). Eine Quantifizierung mikrobieller Aktivität ist daher nur in
Bezug zur Substratoberfläche sinnvoll.
Um abzuklären, ob sich die Substratoberfläche als Funktion der Zeit verändert,
wird die Partikel-Grässenverteilung einer Bitumen-Suspension nach verschieden
langer Kultivationsdauer oder Aufbewahrungszeit untersucht (Abb. 5).
Vol.-%
15
10
5
o ______ ~ ____ ~ ____ ~ ____ ~ ____ ~ ____ L_ __ ~~~
o 100 200 300 400 500 600
~lm
Abb. 5: Partikel-Grössenverteilung der Bitumen-Suspension als Funktion der
Zeit. Die Mittelwerte jeder Grässenklasse (Kap. 3.1.3) sind
verbunden.
Jeder Versuchsansatz enthält 30 g Bitumen in 1 I Mineralsalzmedium.
Das pR ist auf 7.0 eingestellt, die Kultivation oder Aufbewahrung
erfolgt bei Zimmertemperatur.
1: Partikel-Grössenverteilung ein Tag nach Zubereitung der Suspension.
Vom Zeitpunkt der Zubereitung bis zur Analyse wird die
Suspension in einer Schottflasche aufbewahrt.
2: Partikel-Grössenverteilung nach zweiwöchiger Kultivation in einem
Bioreaktor bei einer Rührdrehzahl von 500 U IMin.
3: Partikel-Grössenverteilung nach ca. 18-monatiger Aufbewahrung in
einer Schottflasche.
- 35 -

o
o 100 200 300 400 500 600 ~LIn
Die Zusammensetzung der Partikel-Population verändert sich mit der Zeit nur
unwesentlich und die mechanischen Scherkräfte, verursacht durch Rühren im
Bioreaktor, üben nur einen geringfügigen Einfluss auf die Partikel-Grössenverteilung
der Suspension aus.
Abb. 6 zeigt die Partikel-Grössenverteilung verschiedener Mengen suspendierten
Bitumens in gleichen Volumina Mineralsalzmedium.
Vol.-%
15
10
5
Abb. 6: Partikel-Grässenverteilung als Funktion des Verhältnisses von Volumen
Mineralsalzmedium zu Menge Bitumen (Darstellung wie Abb. 5).
1: 10 g Bitumen suspendiert in 50 ml Mineralsalzmedium; Standardansatz
für anaerobe Kultivationsversuche.
2: 10 g Bitumen suspendiert in 330 ml Mineralsalzmedium. Standardansatz
für aerobe Kultivationsversuche.
Die im geringeren Volumen Mineralsalzmedium suspendierte Menge Bitumen
zeigt anfanglich einen etwas grässeren Anteil kleiner Partikel. Im Verlaufe der
Zeit nimmt der prozentuale Volumenanteil der kleinen Partikel jedoch wieder
ab (siehe Abb. 7). Es zeigt sich somit, dass die Oberfläche suspendierter
Bitumen-Partikel durch das Verhältnis von Mediumvolumen zu darin suspendierter
Menge Bitumen nicht signifikant beeinflusst wird.
- 36-

Im weiteren stellen wir fest, dass Temperaturen im Bereich von 5 - 35° C und
pH-Werte zwischen 3 und 10.5 die Zusammensetzung der Partikel-Population
nicht verändern (Daten nicht aufgeführt).
Vergleicht man die Partikel-Grössenverteilung anaero ber Versuchsansätze
untereinander (Abb. 7), zeigt sich eine im Vergleich zu Partikel-Grössenverteilungen
aerober Versuchsansätze grössere Heterogenität. Unter mehr als 200
anaeroben Versuchsansätzen zeigen ca. 95% aller Kulturen eine
durchschnittliche, den Ansätzen 1 - 4 von Abb. 7 entsprechende Partikel­
GrÖssenverteilung. Unter den restlichen Ansätzen finden sich mehrheitlich
Kulturen mit grösseren prozentualen Volumenanteilen grösserer Partikel.
Beispiele sind die Ansätze 6 und 7 von Abb. 7. Zwei Versuchs ansätze zeigen
eine prozentuale Zunahme von Partikeln mit kleinerem Durchmesser (nicht
abgebildet). Alle Kulturen, in welchen sich eine Aenderung der Partikel-.
Grössenverteilung einstellt, sind mit Inokuli angeimpft worden, welche bereits
beträchtliche Anteile organischer Komponenten enthielten. Die Aenderung der
Partikel-Grössenverteilung könnte auf oberflächenaktive Substanzen zurückzuführen
sein, welche mit dem Impfmaterial in die Versuchsansätze eingeschleppt
werden. Das Phänomen der Ausscheidung oberflächenaktiver
Substanzen durch Mikroorganismen zur besseren Verwertbarkeit hydrophober
Substrate (z.B. Kohlenwasserstoffe) wird u.a. beschrieben von Cooper und
Zajic (1980), Co oper et al. (1980), Grula et al. (1982) und Cooper (1983).
Welche organischen Komponenten zu einer Partikel-V ergrösserung respektive
-Verkleinerung führen, ist unklar. Die wtUrrend der vorgegebenen Kultivationsdauer
durch mikrobielles Wachstum mit Bitumen als Substrat eventuell
ausgeschiedenen organischen Komponenten scheinen mengenmässig nicht
auszureichen, um signifikante Veränderungen der Grössenverteilung der
Partikel zu bewirken.
Die Stabilität der B iturnen-Suspension nahezu aller untersuchten Versuchsansätze
unter verschiedensten Umgebungsbedingungen erlaubt, der Oberflächenberechnung
eine bezüglich des Zeitfaktors unabhängige Partikel­
Grössenverteilung zugrundezulegen (Kap. 2.5.1).
- 37 -

Vol.-%
20
15
10
5
o
o 100 200 300 400 500 600 ~lm
Abb. 7: Partikel-Grässenverteilung anaerober Versuchs ansätze nach dreimonatiger
Kultivationsdauer. Alle Kulturen enthalten 20 g Bitumen in
100 ml Medium; pH 7.2, Kultivationstemperatur 35° C, Rührdrehzahl
des Laborschüttlers 160 U/Min. (Darstellung wie Abb. 5).
1: Partikel-Grässenverteilung ein Tag nach Zubereitung der Suspension
(Anfangsbedi11:gung)
2/3/4: Versuchs ansätze ohne Inokulum, unsteril. Die Ansätze unterscheiden
sich ledigleich bezüglich des zugegebenen Elektronenakzeptors.
5: Versuchsansatz mit Rübenschwemmwasser-Faulschlamm-Inokulum
(10 Vol.%)
6: Versuchsansatz inokuliert mit einer an Bitumen adaptierten Kultur
(10 Vol.%). Die Anreicherung Bitumen abbauender Organismen
erfolgt durch Beimpfung einer unsterilen Bitumen-Suspension mit
einem Inokulum der Rüberschwemmwasser-Faulschlamm-Mischung
und anschliessender Kultivation während ca. 3 Monaten.
7: Versuchsansatz inokuliert mit dem Impfmaterial der Ansätze 5 und
6 und Seesediment (total 30 Vol. %).
- 38 -

3.1.3. Oberfläche der suspendierten Bitumen-Partikel
Der feste Anteil einer Bitumen-in-Wasser-Suspension setzt sich aus 90 Gewichtsanteilen
Bitumen und 10 Gewichtsanteilen Bentonit zusammen (Kap.
2.1.1). Mehr als 95 % dieser 10Gewichtsanteile Bentonit sind Partikel im
Messbereich von 0 - 50 Jlm (Durchschnitt aus 5 Messungen, Beispiel Tab. 6).
Partikel- unter Partikel- unter
grässe (%) grässe (%)
(J.UIl)
(JlIll)
188.0 100.0 17.7 71.1
162.0 100.0 15.3 64.5
140.0 99.9 13.2 57.5
121.0 99.8 11.4 52.7
104.0 99.6 9.8 48.9
89.9 99.5 8.5 48.9
77.5 99.4 7.3 38.6
66.9 98.9 6.3 32.7
57.7 98.0 5.4 26.9
49.8 96.4 4.7 21.5
42.9 93.8 4.1 16.6
37.1 90.1 3.5 12.8
32.0 85.4 3.0 10.3
27.6 81.2 2.6 8.3
23.8 78.4 2.2 6.4
20.5 75.4 1.9 4.6
Tab. 6: Partikel-Grössenverteilung einer Bentonit-Suspension ein Tag nach
deren Zubereitung.
2 g Bentonit sind in 100 ml Mineralsalzmedium suspendiert, entsprechend
dem Bentonit-Anteil eines anaeroben Versuchsansatzes.
Aus der Partikel-Grössenverteilung wird ersichtlich, dass ca. 97 % aller
suspendierten Bentonit-Partikel kleiner als 50 Jlm sind. Die Rälte der Partikel
ist sogar kleiner als 10 JlIIl.
- 39-

Bei der Ermittlung der Oberfläche der suspendierten B itumen-Partikel werden
daher Teilchen im Messbereich von 0 - 50 Jlm nicht berücksichtigt, da es sich
grösstenteils um Bentonit-Partikel handelt.
Tab. 7 zeigt, dass der Durchmesser aller suspendierten Bitumen-Partikel unterhalb
von 750 Jlm liegt. Bildet man einen Durchschnitt aus 10 Messungen,
ergibt sich ein Volumenanteil von ca. 98 % suspendierter B itumen-Teilchen,
deren Partikelgrösse kleiner ist als 750 Jlm.
Partikel- unter Partikel- unter
grösse (%) grösse (%)
(JlID)
(JlID)
1128.0 100.0 106.0 29.3
973.0 100.0 91.7 25.0
840.0 100.0 79.1 21.6
724.0 99.9 68.2 18.7
625.0 99.1 58.9 16.0
539.0 97.3 50.8 13.2
465.0 94.4 43.8 10.8
401.0 90.1 37.8 9.0
346.0 84.2 32.6 7.8
299.0 76.6 28.1 6.7
258.0 67.7 24.3 6.0
222.0 59.1 20.9 5.6
192.0 52.2 18.1 5.3
165.0 46.0 15.6 5.0
143.0 40.4 13.4 4.2
123.0 34.6 11.6 3.2
Tab.7: Partikel-Grössenverteilung einer Bitumen-Suspension ein Tag nach
deren Zubereitung.
20 g Bitumen sind in 100 ml Mineralsalzmedium suspendiert. Dies
entspricht in etwa der Menge suspendierten Bitumens eines anaeroben
Versuchsansatzes. Das pH ist auf 7.2 eingestellt.
- 40-

Für die Berechnung der Oberfläche suspendierter Bitumen-Partikel werden
Teilchen im Grössenbereich von 50 - 750 Jlm berücksichtigt. Die Partikel
dieses Messbereichs werden willkürlich in 14 Fraktionen eingeteilt. Eine
Fraktion umfasst einen Messbereich von 50 Jlm. Für jede Fraktion wird der
durchschnittliche prozentuale Volumenanteil Bitumen-Partikel ermittelt
(Durchschnitt aus 10 Messungen) und daraus die Gesamtoberfläche der
Partikel einer Fraktion errechnet. Die Gesamtoberfläche aller suspendierten
B itumen-Partikel erhält man somit aus der Summe der Oberflächen der Partikel
aller Fraktionen (siehe Kap. 2.5.1).
Entsprechend diesem Berechnungsmodus ergibt sich, dass durch mechanische
Zerkleinerung 1 g Bitumen mit einer Oberfläche von ca. 0.035 m 2 suspendiert
werden kann.
Die Berechnung erfolgt unter der Annahme, dass die Bitumen-Partikel
kugelförmige Gestalt und keine innere Oberfläche haben. Da beide Annahmen
in der Realität nicht zutreffen, was beispielsweise aus den Abbildungen 8 - 12
ersichtlich wird, dürfte die reale Oberfläche suspendierter B itumen-Partikel die
rechnerisch ermittelte übertreffen. Im weiteren ist zu bedenken, dass Bentonit­
Partikel mit gewissen -Bitumen-Komponenten (Kap. 3.2.2.2) beschichtet
werden könnten, was eine zusätzliche Vergrösserung der Substratoberfläche
zur Folge hätte. Erwähnt werden sollten im übrigen die Bitumen-Teilchen im
Messbereich von 0 - 50 Jlm, welche aus messtechnischen Gründen nicht erfasst
werden können. Aus all den erwähnten Gründen ist anzunehmen, dass die für
Mikroorganismen verfügbare Substratoberfläche etwas grösser ist, als die
rechnerisch ermittelte Oberfläche suspendierter B itumen-Partikel.
- 41 -

3.2. Mikrobielle Aktivität unter aeroben Bedingungen
3.2.1. Kontakt der Mikroorganismen mit dem Substrat
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Mikroorganismen
direkt mit dem Substrat Bitumen in Kontakt treten (Abb. 8 - 10). Alle
Aufnahmen zeigen Bitumen-Partikel nach einwöchiger Kultivation in einem
Bioreaktor.
Abb. 8: Bitumen-Partikel mit mikrobiellem Bewuchs (Balken = 20 )lm).
Pfeile markieren die von Mikroorganismen bewachsenen Stellen. In
der Mitte des Partikels ist eine nicht bewachsene Region erkennbar.
Die Risse im Bitumen sind Artefakte, die sich bei der Aufnahme,
während des Aufenthalts im Hochvakuum, bilden.
- 42-

Abb.9:
Biofilm auf einem Bitumen­
Partikel (Balken = 2 J.lm).
Der Biofilm setzt sich hauptsächlich
aus stäbchenfönnigen
Bakterien zusammen. Oben
links ist eine nicht bewachsene
Stelle sichtbar.
Abb.10:
Oberfläche eines Bitumen-Partikels,
besiedelt mit fadenbildenden
Species
(B alken = 2 J.lm).
- 43-

Mittels des Vitalfarbstoffes Carboxy-Fluoreszein-Diacetat lässt sich die Stoffwechselaktivität
der Mikroorganismen nachweisen (Abb.11 und Abb.12).
Abb. 11:
Fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme einer Bitumen-Suspension
(Balken = 2 Jlm).
Die Suspension ist einem B ioreaktor
nach einwöchiger Kultivation
entnommen. Die Färbung
erfolgt mit dem Farbstoff
CFDA. Erkennbar sind
stäbchenförmige und fädige
Mikroorganismen.
Abb.12:
Fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme von der Oberfläche
eines B itumen-Partikels
(Balken = 2 Jlm).
Das Teilchen stammt aus einer
Suspension, die während ca. 6
Monaten auf einem Laborschüttler
kultiviert wurde. Die
Färbung erfolgt mit dem
Farbstoff CFDA. Erkennbar
sind Bakterien, welche sich in
einer Vertiefung der B itumen­
Oberfläche ansiedeln.
- 44-

3.2.2. Charakterisierung der mikrobiellen Aktivität mit Bitumen als Substrat
3.2.2.1. Kohlendioxid-Freisetzung als Mass für die mikrobielle Aktivität
Für die Quantifizierung der mikrobiellen Aktivität eignet sich unter den
gegebenen Kultivationsbedingungen das Stoffwechselendprodukt Kohlendioxid
am besten. Da unter aeroben Verhältnissen der nicht als Biomasse
assimilierte Substrat-Kohlenstoffanteil des metabolisierten Substrates in Fonn
von Kohlendioxid freigesetzt wird, steht diese Messgrösse in direkter
Beziehung zur mikrobiellen Aktivität. In der Infrarotspektroskopie steht eine
sehr sensitive Methode zur Verfügung, mit der geringste Mengen des
produzierten Gases nachgewiesen werden können (Kap. 2.4.6).
3.2.2.2. Abhängigkeit der mikrobiellen Aktivität von der Substratoberfläche
Aus dem Verlauf der mikrobiellen Aktivität als Funktion der Zeit wird ersichtlich,
dass nach kurzer Zeit ein das Wachstum der Organismen limitierender
Faktor bedeutend wird (Abb. 13).
mikrobielle
Aktivität
Ippm C0 2
J
II
HI
Abb. 13: Schematische Darstellung des Verlaufs mikrobieller Aktivität als
Funktion der Zeit.
I: Adaptationsphase
11: Wachstumsphase
111: Phase konstanter mikrobieller Aktivität.
Zeit
- 45-

Nach einer Adaptationsphase, welche je nach Herkunft des Inokulums und den
vorherrschenden Umgebungsbedingungen unterschiedlich lange sein kann,
folgt eine Phase mikrobiellen Wachstums. Die Dauer der Wachstumsphase
wird von den Kultivationsbedingungen, der Mächtigkeit und dem Adaptationszustand
des Inokulums bestimmt. Eine an das Substrat Bitumen
adaptierte Kultur besiedelt eine Bitumenoberfläche von 1 m 2 in ungefähr 2 - 3
Tagen (siehe Abb. 17). Nach Besiedlung der Oberfläche geht die Wachstumsphase
über in eine Phase konstanter mikrobieller Aktivität. Das Ausmass
dieser Aktivität bestimmt langfristig, wie schnell Bitumen mikrobiell abgebaut
wird. Der leichte Rückgang der Aktivität nach Beendigung der Wachstumsphase
dürfte auf das Verschwinden leicht zugänglicher oder gut abbaubarer
Komponenten zurückzuführen sein. Unmittelbar· nach Zubereitung einer
Bitumen-Suspension treten auf .der Mediumoberfläche ölige Filme auf. Es
handelt sich dabei um Komponenten, welche durch das Aufbereitungsverfahren
aus dem Bitumen freigesetzt und von den Mikroorganismen vermutlich als
erstes metabolisiert werden (Abb. 17). Ein Indiz für die Richtigkeit dieser
Annahme kann darin gesehen werden, dass die Wachstumsgeschwindigkeit der
Bitumen abbauenden Mikroflora mit Erdöl als Substrat um ein Vielfaches
ansteigt (Abb. 14). Nach Verwertung dieser Komponenten stellt sich die
mikrobielle Aktivität entsprechend der Oberfläche des suspendierten Bitumens
ein. Mit der Zeit ist ein geringfügiger Rückgang der mikrobiellen Aktivität
festzustellen, der auf eine Abnahme der Substratoberfläche zurückzuführen ist.
Die Oberflächenverminderung wird zum einen durch Partikelverlust an der
Wasser-Luft-Grenzschicht verursacht, zum andem durch Partikel, die sich am
Rührwerk des Bioreaktors festsetzen.
Das unmittelbare Einsetzen mikrobiellen Wachstums der auf Bitumen
adaptierten Mischkultur nach Zugabe eines Aliquots Erdöl weist darauf hin,
dass die enzymatische Ausstattung der angereicherten Mikroflora auch die
Metabolisierung kürzerkettiger Erdölkomponenten erlaubt. Die mikrobielle
Aktivität nach Zugabe von Erdöl kann allerdings nur während ca. einem Tag
verfolgt werden, da durch das DeI die Integrität der Suspension zerstört wird.
Die nach mechanischer Aufbereitung des Bitumens ins Medium freigegebenen
öligen Komponenten werden langsamer umgesetzt als Erdölverbindungen.
Dies könnte in deren erschwerter enzymatischer Zugänglichkeit begründet sein.
- 46-

Eventuell handelt es sich dabei auch um schwerer abbaubare Stoffe,
beispielsweise um solche mit höheren Molekulargewichten oder komplexeren
Strukturen.
ppmC0 2
ppm CO 2
200 200
100 100
B
0....:::~_----iL....-_-----'-----_----i~0 ..... ~-_...a.-_-_.....&-~
o 5 10 Tage 0 5 Tage
Abb. 14: Mikrobielle Aktivität nach der Zugabe von frisch zubereiteter Bitumen-Suspension
oder Erdöl als Substrat.
Die Zugabe von neuem Substrat erfolgt im Stadium konstanter
mikrobieller Aktivität. Die Kultivation erfolgt unter optimalen
Bedingungen bei einer Temperatur von 30° C und einem pH von 7.0.
Die Kultur wird mit 0.5 I Luft pro Minute begast. Die Drehzahl des
Rührwerks beträgt 500 Umdrehungen pro Minute.
A: Zugabe von 25 g frisch zubereiteter Bitumen-Suspension
B: Zugabe von 20 ml Erdöl (Shell)
Die Kultivation der Organismen erfolgt unter optimalen Bedingungen (Kap.
2.3.1). Da im Medium alle essentiellen Nährstoffe in ausreichender Konzentration
vorliegen, ist die Limitierung des mikrobiellen Wachstums nach
wenigen Tagen auf eine beschränkte Verfügbarkeit des Substrates Bitumen
zurückzuführen. Abb. 15 zeigt die Abhängigkeit der mikrobiellen Aktivität von
der Substratoberfläche.
- 47-

ppmC0 2
300 c
250
200
150
100
B
50 A
0
0 2 4 6 8 Tage
Abb. 15: Mikrobielle Aktivität in Abhängigkeit steigender Suspensions dichten.
Der Versuch wird mit einer Mischkultur gestartet, die sich aus
unsterilen Anfangsbedingungen etabliert (Kap. 3.2.2.3). Kultivationsbedingungen:
Temperatur 30° C, pR 7.0, Rührdrehzahl500 U 1 Min.,
Belüftungsrate 0.5 11 Min.
A: Wachstumsverlauf in Gegenwart von 5 g Bitumen (ca. 0.175 m 2 )
pro Ansatz
B: Wachstumsverlauf in Gegenwart von 25 g Bitumen (ca. 0.875 m 2 )
pro Ansatz
C: Wachstumsverlauf in Gegenwart von 50 g Bitumen (ca. 1.75 m 2)
pro Ansatz
Der Versuch zeigt deutlich, dass sich die mikrobielle Aktivität entsprechend
der angebotenen Substratoberfläche einstellt. Bei doppelter Menge suspendierter
Bitumen-Partikel ergibt sich in etwa doppelte mikrobielle Aktivität.
Daraus lässt sich schliessen, dass unter optimalen Bedingungen die mikrobielle
Aktivität durch die Oberfläche des Substrates Bitumen limitiert wird .
. - 48-

Da Bitumen ein Gemisch einer Vielzahl unterschiedlichster Komponenten
darstellt (Kap. 2.1), ist eine selektive und sequentielle Metabolisierung der
Komponenten wahrscheinlich (Kap 4.1). Adaptation des mikrobiellen Stoffwechsels
auf ein neues Substrat hätte eine Aenderung der mikrobiellen
Aktivität zur Folge.
Um abzuklären, ob sich die mikrobielle Aktivität im Verlaufe der Zeit ändert,
beispielsweise durch Anpassung der Organismen auf eine oder mehrere andere
Bitumenkomponenten, kultivieren wir einen Versuchs ansatz während möglichst
langer Zeit. Unter optimalen Kultivationsbedingungen (Kap. 2.3.1) kann
im Zeitraum von nahezu vier Monaten keine Aenderung der mikrobiellen
Aktivität, gemessen als abgegebene Menge Kohlendioxid pro Zeit, festgestellt
werden. Die sich entsprechend der vorhandenen Bitumenoberfläche etablierte
Aktivität wird damit über die ganze Zeit unverändert beibehalten. Ausgehend
von dieser Beobachtung nehmen wir an, dass sich die mikrobielle Aktivität
während langer Zeit nicht verändert.
Obwohl der mikrobielle Abbau von Bitumen massgeblich von seiner
Beschaffenheit und der Grösse der gemeinsamen Oberfläche mit der wässrigen
Phase bestimmt wird, darf der Einfluss der Mikroflora selbst und der
herrschenden Umgebungsbedingungen auf die mikrobielle Aktivität nicht
ausser Acht gelassen werden.
3.2.2.3. Einfluss der Mikroflora auf den mikrobiellen Bitumenabbau
Die Kultivation von Bitumen mit Mikrofloren verschiedener Herkunft und
somit unterschiedlicher Anfangszusammensetzung zeigt, in welchem Ausmass
das mikrobielle Oekosystem den Abbau von Bitumen zu beeinflussen vermag
(Abb. 16).
- 49 -

ppm CO 2
30
A
20
10
o
o 5 10 15 20 Tage
Abb. 16: Mikrobielle Aktivität unterschiedlicher mikrobieller Oekosysteme
mit Bitumen als Substrat.
Alle Versuchsansätze werden unter optimalen Bedingungen kultiviert:
Temperatur 30° C, pR 7.0, Belüftungsrate 0.5 I Luft / Min.,
Rührdrehzahl 500 U / Min. Die suspendierte Bitumenoberfläche beträgt
ca. 0.2 m 2 . Da mit dem Inokulum organisches Material in den
Versuchsansatz eingebracht werden kann, wird jeder Ansatz verglichen
mit einer Kultur ohne Bitumen.
Die nachfolgenden Impfmaterialien werden nach 2.2. vorbereitet:
A: asphalthaltige Erde
B: Gartenerde vermischt mit Bitumen, angereichert in einer Perkolationsapparatur
C: asphalthaltige Erde vermischt mit Bitumen, angereichert in einer
Perkolationsapparatur
D: Mischkultur, die sich aus unsterilen Anfangsbedingungen etabliert,
angereichert in einer Perkolationsapparatur
E: Mischkultur, die sich aus unsterilen Anfangsbedingungen etabliert,
angereichert als Schüttelkultur.
- 50-

In keinem Versuchsansatz kann im Referenz-Bioreaktor mikrobielle Aktivität
festgestellt werden. Die mit dem Impfmaterial in die Kultur eingebrachte
Menge organischen Materials ist zu gering, um eventuell freigesetztes
Kohlendioxid aus dem mikrobiellen Stoffwechsel noch erfassen zu können.
Die unterschiedlich langen Adaptationszeiten sind auf die Anpassung der
Organismen an die veränderten Umgebungsbedingungen gegenüber dem
Standort des Inokulums zurückzuführen. Grosse Unterschiede betreffen das
pR, das in den Perkolationssystemen nicht reguliert wird. Bei der Entnahme
des Impfmaterials werden Werte zwischen 5 und 8 gemessen. Im weiteren
dürften die im Bioreaktor vorherrschenden mechanischen Scherkräfte eine
Anpassung der Mikrorganismen erschweren. Die Unterschiede der konstanten
mikrobiellen Aktivität, die sich in den verschiedenen Versuchsansätzen
etabliert, dürfen nicht allein auf die unterschiedlichen mikrobiellen Oekosysteme
zurückgeführt werden. Einzelne Inokuli enthalten Komponenten, welche
die Partikel-Grössenverteilung einer Suspension geringfügig verändern.
Die Ansätze unterscheiden sich somit bezüglich der suspendierten Substratoberfläche.
Da die Substratoberfläche der Faktor ist, welcher unter optimalen
Bedingungen die mikrobielle Aktivität limitiert, wirken sich Aenderungen der
Oberfläche direkt auf die mikrobielle Aktivität aus. Bemerkenswert ist, dass in
allen Versuchsansätzen Mikroorganismen mit Bitumen als Substrat zu wachsen
vermögen. Auch nicht angeimpfte, unsterile Versuchsansätze etablieren eine
den inokulierten Kulturen vergleichbare mikrobielle Aktivität.
Aus den durchgeführten Untersuchungen schliessen wir, dass Bitumen
abbauende Mikroorganismen ubiquitär sind. Mischkulturen unterschiedlicher
Herkunft und somit unterschiedlicher Zusammensetzung metabolisieren
Bitumen ungefähr mit der gleichen mikrobiellen Aktivität.
Alle nachfolgenden Untersuchungen werden mit Mischkulturen durchgeführt,
die sich aus unsterilen Anfangsbedingungen etablieren. Dieses Vorgehen bringt
den Vorteil mit sich, dass kein organisches Material, das im Impfmaterial
enthalten sein könnte, in einen Versuchsansatz eingebracht werden muss.
Bitumen ist somit in allen Versuchsansätzen die alleinige Kohlenstoff- und
Energiequelle.
- 51 -

Eine taxonomische Analyse zeigt, dass sich eine solche Mischkultur zur
Hauptsache aus den Species Pseudomonas aeruginosa und nicht näher
spezifizierten Arten der Gattungen Alcaligenes und Streptomyces zusammensetzt.
Im Hinblick auf die Untersuchung des mikrobiellen Abbaus von
Bitumen darf diese Mischkultur als repräsentativ angesehen werden. Die U. S.
Nuclear Regulatory Commission schreibt in zwei Test-Serien vor, in
Gegenwart welcher Species bestimmte Materialien, u.a. auch Bitumen, auf ihre
Resistenz gegenüber mikrobieller Aktivität untersucht werden müssen (Barletta
et al. 1986). Eine Versuchs-Serie beinhaltet die Kultivation des zu untersuchenden
Materials mit den Pilzen Aspergillus niger, Chaetomium globosum,
Aureobasidium pullulans und Gliocladium virens. Westsiek et al. (1984)
weisen nach, dass alle 4 Species mit Bitumen als Substrat kein signifikantes
Wachstum zeigen. Als Testorganismus für bakterielle Aktivität dient
Pseudomonas aeruginosa. Sowohl Westsiek et al. (1984) als auch Barletta et al.
(1986) finden in Gegenwart von Bitumen als Substrat mikrobielle Aktivität des
Testorganismus Pseudomonas aeruginosa.
Da die Bitumenoberfläche von mehreren Species gleichzeitig besiedelt wird,
muss abgeklärt werden, ob Aenderungen der Zusammensetzung der Mischkultur
zu einer Aenderung der mikrobiellen Aktivität führen. Selektion einer
Species, die Bitumen besser metabolisiert, könnte beispielsweise zu einer
Beschleunigung des mikrobiellen Bitumenabbaus führen. Durch mehrmaliges
aufeinanderfolgendes Ueberimpfen eines Teils einer Kultur, die sich im
Stadium konstanter mikrobieller Aktivität befindet, auf eine frische Bitumen­
Suspension, untersuchen wir, ob eine Species heraus selektioniert wird, die das
Bitumen schneller metabolisiert (Abb. 17).
- 52-

600
500
400
300
200
100
o~~~--~--·~--~----~--~--~--~----~'-+·
o 2 3 4 5 6 7 8 Tage
Abb. 17: Vergleich der mikrobiellen Aktivität einer Mischkultur nach mehrmaliger
Ueberimpfung auf frische Bitumen- Suspension.
Die Kultivation erfolgt unter optimalen Bedingungen: Temperatur
30° C, pR 7.0, Belüftungsrate 0.5 I Luft / Min., Rührdrehzahl500 U /
Min. Die Oberfläche des suspendierten Bitumens beträgt ca. 1 m 2 .
Das Volumen des Inokulums beträgt 10 Vol.% eines Versuchsansatzes.
A: Mikrobielle Aktivität, die sich aus unsterilen Anfangsbedingungen
etabliert
B: Mikrobielle Aktivität nach der 1. U eberimpfung
C: Mikrobielle Aktivität nach der 2. ,Ueberimpfung
D: Mikrobielle Aktivität nach der 3. Ueberimpfung
Nach allen Ueberimpfungen ist ein schnell einsetzendes und starkes
mikrobielles Wachstum feststellbar. Innerhalb von wenigen Tagen reduziert
sich die mikrobielle Aktivität jedoch wieder auf das Niveau der Anfangskultur.
Das rasche Wachstum dürfte auf den Bitumenkomponenten beruhen, die als
Folge des Aufbereitungsverfahrens ins Medium gelangen (Kap. 3.2.2.2). Da
nach einer Ueberimpfung eine verglichen mit der Ausgangskultur zahlreichere
Mikroflora im Versuchsansatz vorhanden ist, setzt ein entsprechend schnelleres
Wachstum ein. Nach der Metabolisierung dieser Komponenten erreicht die
mikrobielle Aktivität wiederum das der suspendierten Bitumenoberfläche
entsprechende Niveau. Wir schliessen daraus, dass sich die mikrobielle
Aktivität einer Mischkultur im Verlaufe der Zeit nicht verändert.
- 53 -

3.2.2.4. Einfluss von Umgebungsfaktoren auf die mikrobielle Aktivität
Die nachfolgenden Untersuchungen dienen vor allem dazu, abzuschätzen, in
welchem Ausmass die wichtigen Umgebungsparameter Temperatur, pH und
radioaktive Strahlung die mikrobielle Aktivität Bitumen abbauender Mikroorganismen
beeinflussen. Die Messungen haben nur Gültigkeit für Organismen,
die unter mehr oder weniger optimalen Bedingungen angereichert
werden. Mikroorganismen, die an extreme Umgebungsbedingungen angepasst
sind, zeigen andereVerhaltensweisen.
3.2.2.4.1. Einfluss der Temperatur auf die mikrobielle Aktivität
ppm cO 2
A
1
500 1----..
400 B
ppmC0 2
500
400
300
100
300 1 200
200
0 0 10 20 30 40 oe
100
o ----------~------------~----------~------__ ~ ______ __+
o 5 10 15 20 Stunden
Abb. 18: Einfluss der Temperatur auf die mikrobielle Aktivität.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 30° C, pH 7.0, Belüftungsrate
0.5 I Luft / Min., Rührdrehzahl 500 U / Min. Die Temperaturänderungen
werden an einer Kultur untersucht, die sich in der Phase
konstanter mikrobieller Aktivität befindet.
A: Temperaturänderung von 30° C auf 20° C
B: Temperaturänderung von 20° C auf 10° C
- 54-

Eine Bitumen-Suspension kann nur bis zu einer Temperatur von ca. 40° C
kultiviert werden. Oberhalb dieser Temperatur setzt ein Zusammenfliessen
suspendierter Teilchen ein. Dies führt zu einer Reduktion der Substratoberfläche
und somit der mikrobiellen Aktivität.
Das Experiment zeigt, dass eine Erhöhung der Temperatur um 10° C ungefähr
eine Verdoppelung der mikrobiellen Aktivität bewirkt. Das Resultat steht in
guter Uebereinstimmung mit der Tatsache, dass Enzyme bei einer Temperaturerhöhung
von 10° C ihre Umsatzrate verdoppeln (Atlas und Bartha 1981).
3.2.2.4.2. Einfluss des pR auf die mikrobielle Aktivität
Die nachfolgenden Experimente geben Auskunft, wie empfindlich die unter
neutralen Ausgangsbedingungen angereicherten Bitumen abbauenden Mikroorganismen
aufpR-Aenderungen reagieren (Abb. 19 und Abb. 20).
ppm cO 2 ppmC0 2
100
A
1
B
!
100
50
'-1/-......._ ......._ ....... pR
3 5 7
o ~--____ ~ ______-L______ ~ ________ ~ ______ ~
o 5 10 15 20 Tage
Abb. 19: Auswirkung von pR-Aenderungen in den sauren Bereich auf die mikrobielle
Aktivität.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 30° C, pR 7.0, Belüftungsrate
0.5 1 Luft / Min., Rührdrehzahl 500 U / Min. Die Mischkultur befindet
sich im Stadium konstanter mikrobieller Aktivität. Die pR­
Aenderungen erfolgen durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure.
A: Aenderung des pR von 7 auf 5
B: Aenderung des pR von 5 auf 3
- 55 -

______
________
______
______
ppmC0 2 ppmC0 2
100
A
1
B 100
1
c
1 50
50
7 9 11
o ~
-L ______ ~
~
~~
--+
o 5 10 15 20 Tage
Abb. 20: Auswirkung von pR-Aenderungen in den alkalischen Bereich auf die
mikrobielle Aktivität.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 30° C, pR 7.0, Belüftungsrate
0.5 1 Luft / Min., Rührdrehzahl 500 U / Min. Die Mischkultur befindet
sich im Stadium konstanter mikrobieller Aktivität. Die pR­
Aenderungen erfolgen durch Zugabe von konzentrierter Ammoniumhydroxid-Lösung.
A: Aenderung des pR von 7 auf 8
B: Aenderung des pR von 7.8 auf 9
C: Aenderung des pR von 8.8 auf 10.5
Die meisten Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen zeigen optimale
Stoffwechselaktivität um pR 7 (Atlas 1981). Im weiteren zeichnen sie
sich aus durch eine relative Unempfindlichkeit gegenüber pR-Aenderungen im
Bereich von ca. 6 - 10 (ZoBell 1946). Die Bitumen abbauende Mischkultur
zeichnet sich gegenüber Aenderungen des pR in diesem Bereich durch eine
ähnliche Verhaltensweise aus: pR-Aenderungen zwischen 5 und 9 haben nur
eine geringfügige Auswirkung auf die mikrobielle Aktivität.
- 56-

Mikrobieller Kohlenwasserstoffabbau wird jedoch auch unter extremen pH­
Bedingungen gefunden. Roffey et al. (1987) erwähnen den Abbau von Kohlenwasserstoffen
bei pH-Werten von 12. Bei pH-Werten über 11 messen sie
auch mikrobiellen Abbau von Bitumen (Kap. 4.3).
3.2.2.4.3. Auswirkung radioaktiver Strahlung auf die mikrobielle Aktivität
Mikroorganismen, welche in einem Endlager bituminisierte Abfallgebinde besie'deln,
sind einer permanenten radioaktiven Strahlung ausgesetzt. Das nachfolgende
Experiment soll abklären, ob hohe Strahlendosen die Mikroorganismen
in ihrer Stoffwechselaktivität beeinträchtigen (Abb. 21).
100
1
50 A B
o----------------~------~------~--------.
o 5 10 15 20 Tage
Abb.21: Auswirkung radioaktiver Strahlung auf die mikrobielle Aktivität.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 30° C, pH 7.0, Belüftungsrate
0.5 I Luft / Min., Rührdrehzahl 500 U / Min. Die Mischkultur
befindet sich im Stadium konstanter mikrobieller Aktivität. Die
Bestrahlung des Versuchsansatzes erfolgt mit einem 30 kV
Elektronenstrahl während drei Stunden. In dieser Zeit wird der
Kultur eine Dosis von 50'000 rad verabreicht. Die Bestrahlung wird
nach einer Woche wiederholt.
A: 1. Bestrahlung der Kultur
B: 2. Bestrahlung der Kultur

Unmittelbar nach Einsetzen der Strahlung wird kurzfristig Kohlendioxid aus
dem Kultivationssystem ausgetrieben. Nach Beendigung der Strahlung ist eine
Abnahme der mikrobiellen Aktivität während ca. zwei Tagen zu beobachten.
Anschliessend findet eine Erholung statt. Nach ungefähr einer Woche erreicht
die mikrobielle Aktivität wiederum ihr ursprüngliches Niveau. Eine zweite
Bestrahlung der Kultur zeigt ein vergleichbares Ergebnis. Ein Teil der
Mikroflora scheint durch die Strahlung geschädigt zu werden. Die verabreichte
Dosis reicht jedoch nicht aus, um die gesamte Mikroflora abzutöten.
Ueberlebende Organismen besiedeln erneut das suspendierte Bitumen.
Die radioaktive Strahlenbelastung, welcher die Organismen in einem Endlager
schwach- und mittel aktiver Abfälle ausgesetzt sein werden, liegt um ein Vielfaches
unter derjenigen der bestrahlten Mischkultur. Da die Ortsdosisleistung
schwach- und mittelradioaktiver Abfallgebinde (borhaltige Betriebsabfälle
(BA-KKG-2) des Kernkraftwerkes Gösgen) durchschnittlich bei ca. 1.31 rem
pro Stunde liegt (Elektrowatt 1985), ergibt sich als Konsequenz, dass die in
einem Endlager vorherrschende Strahlung die meisten Mikroorganismen in
ihrer Aktivität kaum beeinträchtigen wird. Geringe Strahlendosen führen im
Gegenteil zur Selektion strahlenresistenter Organismen (Bachofen und Lüscher
1984). Da radioaktive Strahlung zudem die Mutationsrate der Mikroorganismen
erhöht, muss mit einer stoffwechselphysiologisch flexiblen
Mikroflora gerechnet werden.
3.2.3. Quantifizierung des aeroben Abbaus von Bitumen
Der Quantifizierung des Bitumenabbaus setzen wir optimale Bedingungen
zugrunde. Die Grunde werden mehrfach dargelegt (Kap. 1.3 und 4.1). In
welchem Ausmass die Abbaurate durch extreme Umweltbedingungen reduziert
würde, ist schwierig vorherzusagen. Abschätzungen für die Parameter Temperatur,
pH und Strahlung könnten anband der durchgeführten Untersuchungen
vorgenommen werden (Kap. 3.2.2.4). Es ist jedoch zu bedenken, dass unter
extremen Bedingungen eine Mikroflora selektioniert wird, deren Verhalten
nicht unbedingt aus demjenigen "normaler" Mikroorganismen hergeleitet
werden kann.
Unter den gewählten optimalen Kultivationsbedingungen (Temperatur 30° C,
pH 7.0, ausreichende Versorgung der Organismen mit Sauerstoff und essentiellen
Elementen) produziert eine Mischkultur mit Bitumen als Energie- und
Kohlenstoffquelle pro m 2 suspendierter Substratoberfläche ungefähr 50 Jll CO 2
- 58 -

pro Minute. Dies entspricht umgerechnet einer Menge von ca. 30 - 35 g
Bitumen, welches pro m 2 und Jahr mikrobiell abgebaut wird. Da unter aeroben
Bedingungen in der Regel ausschliesslich Kohlendioxid und Wasser als
Stoffwechselendprodukte anfallen, werden bei dieser Abbaurate pro m 2 Bitumenoberfläche
in einem Jahr ca. 25 - 30 I CO 2
produziert.
Die ermittelte Abbaurate basiert auf der Messung des freigesetzten Stoffwechselendproduktes
Kohlendioxid. Um ihre Genauigkeit abschätzen zu
können, stellt sich die Frage nach der Reproduzierbarkeit der beobachteten
mikrobiellen Aktivität sowie der Messgenauigkeit der eingesetzten analytischen
Methode. Es muss auch diskutiert werden, welcher Anteil des im
Bitumen enthaltenen Kohlenstoffs überhaupt in Form von Kohlendioxid
freigesetzt wird.
Eine exakte Messung des mikrobiell produzierten Kohlendioxids basiert auf
der Messgenauigkeit des Analysegerätes, der Konstanthaltung der Belüftungsrate
und des pH' s der Suspension. Die Messgenauigkeit des Infrarot­
Spektrometers wird mit ± 1 % angegeben (Kap. 2.4.6). Die Gasflussrate kann
während der ganzen Versuchsdauer konstant gehalten werden (Kap. 2.3.1).
Durch Schwankungen versursachte Fehler dürften nicht mehr als ca. + 1 %
ausmachen. Das Medium ist ausreichend gepuffert, was eine Konstanthaltung
des pH' s während der ganzen Kultivationsdauer erlaubt.
Die mikrobielle Aktivität wird vor allem bestimmt durch die vorgegebenen
Kultivationsbedingungen und die Oberfläche des suspendierten Bitumens. Da
die Kultivationsparameter während der ganzen Versuchs dauer konstant
gehalten werden, dürften beobachtete Unterschiede der Aktivität äquivalenter
Versuchsansätze bis ca. 20 % zur Hauptsache auf Unterschiede der Oberfläche
des suspendierten Bitumens zUlÜckzuführen sein. Ein Grund dafür mag in der
beschränkten Reproduzierbarkeit identischer Bitumen-Suspensionen durch das
Verfahren der mechanischen Zerkleinerung des Bitumens im Mörser liegen.
Ausgehend von der Menge Kohlendioxid, die von den Mikroorganismen
produziert wird, ermitteln wir den Anteil des Substrat-Kohlenstoffs, den die
Mikroflora metabolisiert hat. Da bisher weder die Biomasse (Brunner et al.
1987) noch eventuell ins Medium abgegebene organische Komponenten (Kap.
3.3.1) quantifiziert werden können, muss abgeschätzt werden, wie gross der
Anteil des Substrat-Kohlenstoffs ist, der in Form von Kohlendioxid freigesetzt
wird.
- 59-

Die meisten Mikroorganismen oxidieren organische Nährstoffe unter aeroben
Bedingungen vollständig zu Kohlendioxid und Wasser (Schlegel 1985).
Ausscheidung grösserer Mengen nicht vollständig oxidierter organischer
Komponenten ins Medium ist eher selten. Ein Indiz dafür, dass in unseren
Versuchsansätzen nur sehr geringe Mengen organischer Komponenten ins
Medium abgeben werden, sehen wir in einer unveränderten Partikel­
Grössenverteilung suspendierter Bitumen-Teilchen während einer Kultivationsdauer
von mehreren Monaten. Der Befund ergibt sich vor allem aus
dem Vergleich der Partikel-Grössenverteilung aerober und anaerober
Versuchsansätze (Kap. 3.1.2). Zu bedenken ist allerdings, dass Spaltprodukte
aus dem Abbau von Bitumen ins Medium gelangen können, welche die
Integrität der Suspension nicht beeinträchtigen (Brunner et al. 1987). In
unserem Kultivationssystem ist eine genaue Quantifizierung gelöster
organischer Komponenten im Medium nicht möglich, da ein Grossteil der
Verbindungen an der Oberfläche suspendierter Bitumen- und Bentonit-Partikel
adsorbiert wird (Kap. 3.3.1). Für die Ermittlung der Abbaurate nehmen wir an,
dass ins Medium abgegebene organische Vebindungen einen vemachlässigbar
kleinen prozentualen Anteil des Substrat-Kohlenstoffs ausmachen.
Zu welchem Anteil ein Substrat in Biomasse umgewandelt wird, hängt im
wesentlichen von der Stoffwechselkapazität eines Organismus, den Umgebungsbedingungen,
vor allem aber vom Substrat selber ab. Diesbezügliche
Angaben zeigen dementsprechend eine grosse Streubreite. Allgemein kann
man sagen, dass der Anteil des assimilierten Substrates unter aeroben
Bedingungen, sowohl bei vollständiger als auch unvollständiger Oxidation, ca.
40 - 70 % beträgt (Schlegel 1985). Bei einem Kohlenstoffanteil von 85 % im
Bitumen entspricht dies einer ungefähr 30 - 60 %-igen Assimilierung von
Substratkohlenstoff. Unter aeroben Bedingungen produziertes Kohlendioxid repräsentiert
somit einen ca. 40 - 70 %-igen Substratkohlenstoff-Anteil. Die Zuverlässigkeit
der Annahme, dass B itumen-Kohlenstoff zu ungefähr 45 - 50 %
zu Zellsubstanz assimiliert wird (Kap. 2.5.2) beträgt somit ca. ± 15 %.
Unter Berücksichtigung der Genauigkeit der analytischen Methode und der
Messung der mikrobiellen Aktivität und der Zuverlässigkeit der getroffenen
Annahme ist die mikrobielle Abbaurate von Bitumen anzugeben mit 30 - 35 g
(± 35 - 40 %) oder ca. 20 - 50 g abgebautes Bitumen pro m 2 und Jahr. Damit
verbunden ist eine Kohlendioxid-Produktion von ca. 15 - 40 Litern.
- 60-

3.3. Mikrobielle Aktivität unter anaeroben Bedingungen
3.3.1. Einfluss von Mikroflora und Umgebungsbedingungen auf die mikrobielle
Aktivität
Organische Verbindungen können bei Abwesenheit von molekularem Sauerstoff
durch Gärungen, oder beim V orliegen oxidierter anorganischer oder
seltener organischer Verbindungen durch anaerobe Atmung abgebaut werden.
Einen Ueberblick über mögliche Elektronenakzeptoren für anaerobe Atmungsprozesse
gibt Abb. 22.
02 H 0 AEROBE ATMUNG
• 2
.... \ ';"--...
... - - ~ C02
...--.. .... _
NITRAT - REDUKTION
MANGAN - REDUKTION
-:----.... --... C02
EISEN - REDUKTION
Fe(+II)
~-""--"'C02
VsoS- .
so 4 -
SULFAT - REDUKTION
..........__
...._-...
~ C02
(CHOHf)
L, METHAN - BILDUNG
...........----...
~CHL.
AUTOTROPHE METHANBILDUNG
l-i;1 ':::: ~ CHI.
C02
Abb. 22
Abbau von Substraten (CHOH) durch anaerobe Atmung (Brandl
1987).
Dargestellt sind in Frage kommende Akzeptoren für die aus dem
Stoffwechsel anfallenden Reduktionsäquivalente.
- 61 -

Mit Nitraten und Sulfaten ist im Endlager zu rechnen (Zürrer 1985). Wir klären
daher ab, ob Bitumen in Anwesenheit dieser Elektronenakzeptoren metabolisiert
werden kann. Durch Vorgabe von Fe 3+ untersuchen wir, ob anaerobe
Atmungsprozesse auch mit anderen Akzeptoren ablaufen können.
V oraussetzung für die Vergärbarkeit eines Substrates ist dessen intramolekulare
Aufspaltung in organische Komponenten, welche teilweise als Akzeptoren
für Reduktionsäquivalente fungieren können. Ob Bitumen auf diese Art
und Weise abgebaut werden kann, klären wir ebenfalls ab.
Die Untersuchungen werden mit mikrobiellen Oekosystemen verschiedener
Herkunft und somit unterschiedlicher Zusammensetzung durchgeführt (Kap.
2.2), um deren Einfluss auf den Abbau zu analysieren. Zum einen beimpfen wir
die Versuchsansätze mit Organismen aus Komposterde, einer an kein spezielles
Substrat adaptierten Mikroflora." Die Aktivität dieser Population vergleichen
wir mit Kulturen, die auf Kohlehydraten oder Bitumen angereichert wurden.
Ob sich aus unsterilen Anfangsbedingungen eine Mikroflora etabliert, die
Bitumen abzubauen vermag, ist ebenfalls von Interesse.
Aus der nachfolgenden Zusammenstellung geht hervor, unter welchen
Bedingungen die unterschiedlichen Mischkulturen mikrobielle Aktivität mit
Bitumen als Substrat zu entwickeln vermögen (Tab. 8).
Alle beimpften Versuchsansätze zeigen mikrobielle Aktivität. Es kann daraus
geschlossen werden, dass Mikroorganismen, welche Bitumen auch unter
anaeroben Bedingungen abzubauen vermögen, überall vorkommen. Im
Gegensatz zum mikrobiellen Abbau von Bitumen unter aeroben Bedingungen
kann in unbeimpften anaeroben Kulturen innerhalb der vorgegebenen Kultivationsdauer
keine Aktivität nachgewiesen werden. Dies dürfte auf ein
langsames Wachstum der Organismen unter anaeroben Bedingungen
zurückzuführen sein. Die verglichen mit beimpften Versuchsansätzen geringe
Organismenzahl zu Beginn des Experiments kann innerhalb der vorgegebenen
Zeit nicht zu einer Population anwachsen, deren mikrobielle Aktivität
analytisch erfasst werden kann.
In Anwesenheit der Elektronenakzeptoren Nitrat, Sulfat oder Eisen 3+ kann in
allen beimpften Versuchsansätzen mikrobielle Aktivität nachgewiesen werden.
Es zeigt sich damit, dass bei Vorhandensein geeigneter Elektronenakzeptoren
Bitumen unter anaeroben Bedingungen abgebaut werden kann.
- 62-

~
akzeptor - N0 - SO 2- Fe 3 +
3
Inokulum
- - - - a)
--
b)
- - - -
nicht adaptierte - + + + a)
Mischkultur (I) + - - + b)
an Kohlehydrate - + + + a)
adaptierte Kultur (11) - - - - b)
an Bitumen (+) + + + a)
adaptierte Kultur (111) + - + + b)
Mischung von (+) + + + a)
I + 11 + 111 - + + + b)
4
Tab. 8: Anaerober Abbau von Bitumen in Abwesenheit und Gegenwart von
Elektronenakzeptoren.
Die Versuchsansätze werden unter optimalen Bedingungen kultiviert.
Temperatur 35° C, pR 7.2, Rührdrehzahl 160 U / Min., Gasphase:
Helium (Kap. 2.3.2). Jeder Ansatz enthält 24 g Bitumen, was einer
suspendierten Bitumenoberfläche von ca. 0.8 m 2 entspricht. Als
Indikatoren für mikrobielle Aktivität dienen die Stoffwechselendprodukte
Kohlendioxid (a) und Methan (b).
- : keine Gasproduktion feststellbar
(+): Spuren von Gasproduktion feststellbar, nicht quantifizierbar
+ : Gasproduktion feststellbar, quantifizierbar
Fehlen Elektronenakzeptoren, ist die biologische Aktivität, gemessen als
produzierte Menge Kohlendioxid, äusserst gering. Es ist jedoch zu bedenken,
dass nicht alle Gärungsprozesse Kohlendioxid freisetzen, sondern unter
Umständen alle Reduktionsäquivalente in Form von gelösten organischen
Komponenten ins Medium ausscheiden (Kap. 3.3.2). Gelöste organische
- 63 -

Kohlenstoffverbindungen können in unserem Kultivationssystem jedoch nicht
quantifiziert werden (Kap. 3.3.1). Trotzdem nehmen wir an, dass der
mikrobielle Abbau von Bitumen durch Gärungsprozesse relativ klein ist.
Im Vergleich zur Produktion von Kohlendioxid ist die Methanbildung sehr
gering. In keinem Versuchsansatz wird während der vorgegebenen Kultivationsdauer
mehr als 1 ml Methan gebildet. Ein möglicher Grund könnte darin
liegen, dass unter den vorgegebenen Bedingungen äusserst geringe Mengen
von Stoffwechsel produkten anfallen, welche von einer methanogenen Mikroflora
als Substrate verwertet werden können.
Die produzierten Mengen Kohlendioxid in den unterschiedlichen Versuchsansätzen
werden in Abb. 23 aufgezeigt. Die grässte mikrobielle Aktivität
entwickelt die Kultur, welche mit Mikroorganismen beimpft wird, die auf
Kohlehydraten angereichert wurden. Die Versuchsansätze, die mit einer auf
Bitumen angereicherten Mischkultur oder mit Mikroorganismen aus Komposterde
inokuliert werden, produzieren bedeutend weniger Kohlendioxid.
Dieser Befund dürfte weniger auf eine unterschiedliche Fähigkeit der
verschiedenen Mischkulturen Bitumen abzubauen, zurückzuführen sein,
sondern vielmehr auf die Anzahl Mikroorganismen, die mit dem Inokulum in
den Versuchsansatz eingebracht werden. Die mit Kohlehydraten angereicherte
Kultur entstammt einer Versuchsanlage, in der die Organismen kontinuierlich
mit Substrat versorgt werden (Da Pra 1987). Da Mikroorganismen mit
Kohlehydraten als Substrat schnell zu wachsen vermögen, enthält das dieser
Versuchsanlage entnommene Inokulum eine beträchtliche Anzahl
Mikroorganismen. Im Gegensatz dazu erfolgt mikrobielles Wachstum mit
Bitumen als Substrat nur sehr langsam. Ein gleiches Volumen Impfmaterial aus
einer Bitumen-Anreicherungskultur dürfte somit eine viel geringere Zahl
anaerober Organismen enthalten. Im Vergleich zu den aeroben Kulturen
weisen die Mikroorganismen unter anaeroben Bedingungen eine sehr geringe
Wachstumsrate auf. Ausgehend von einer kleinen Zellzahl dürfte die vorgegebene
Kultivationsdauer nicht ausgereicht haben, um die suspendierte
Bitumenoberfläche vollständig zu besiedeln. Ob nach genügend langer Zeit die
unterschiedliche Zellzahlen enthaltenden Kulturen eine in etwa gleiche mikrobielle
Aktivität zeigen würden, kann unter den gegebenen Bedingungen nicht
abgeklärt werden.
- 64-

60
50
40
30
20
NO,-
10
o
A B c D
Abb. 23: Kohlendioxid-Produktion in anaeroben Versuchsansätzen mit Bitumen
als Substrat.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 35° C, pR 7.2, Rührdrehzahl
160 U / Min., Gasphase: Helium. Jeder Ansatz enthält 24 g Bitumen,
was einer suspendierten Bitumenoberfläche von ca. 0.8 m 2 entspricht.
Die Kultivation dauert zwei Monate ..
Angegeben ist die Gesamtproduktion von Kohlendioxid in Anwesenheit
unterschiedlicher Elektronenakzeptoren. Die nicht punktierte
Fläche entspricht der Kohlendioxid-Produktion der Kontrollen ohne
Bitumen, die punktierte Fläche derjenigen aus der Umwandlung von
Bitumen. Die Mischkulturen 11 und III wurden unter anaeroben
Bedingungen auf den entsprechenden Substraten angereichert (Kap.
2.2).
A: nicht adaptierte Mischkultur, isoliert aus Komposterde (I)
B: an Kohlehydrate adaptierte, anaerobe Mischkultur (11)
C: an Bitumen adaptierte, anaerobe Mischkultur (111)
D: Mischung von I + II + III
- 65 -

Nach ca. viermonatiger Kultivationsdauer sind in den Versuchsansätzen oft
Aenderungen der Grössenverteilung der suspendierten Bitumen-Partikel zu
beobachten. In der Mehrzahl der Ansätze tritt durch Zusammenfliessen von
Partikeln eine Oberflächenreduktion ein. Die mikrobielle Aktivität der
Mikrofloren kann dann nur noch schlecht miteinander verglichen werden.
Diese Aenderungen der Partikel-Grössenverteilung könnten auf organische
Komponenten zurückzuführen sein, die von den Organismen ins Medium
ausgeschieden werden. Nach mehrmonatiger Kultivation scheint deren Konzentration
auszureichen, um signifikante Verschiebungen in der Grössenverteilung
zu bewirken. Vergleicht man die CO 2
- Produktion unserer Versuchsansätze
mit Werten aus der Literatur (Kap. 4.3), darf angenommen werden,
dass die mikrobielle Aktivität im Verlaufe der Zeit noch etwas ansteigt.
Kulturen, welche eine Mischung der drei Impfmaterialien enthalten, zeigen im
Vergleich mit Ansätzen, denen auf Kohlehydraten angereichertes Impfmaterial
zugegeben wird, eine deutlich geringere mikrobielle Aktivität. Dies dürfte
ebenfalls auf eine geringere aktive Biomasse zurückzuführen sein. Da allen
Ansätzen ein gleiches Volumen Inokulum zugegeben wird, setzt sich das
Misch-Inokulum aus je ca. 33 % der Biomasse der einzelnen Inokuli
zusammen. Diese Kulturen werden somit mit einer gesamthaft geringeren
Anfangszellzahl gestartet.
In Gegenwart der Elektronenakzeptoren Nitrat und Sulfat findet sich in allen
Versuchsansätzen eine vergleichbare Menge Kohlendioxid. Eine Ausnahme
bildet die Kultur, welcher auf Bitumen angereichertes Impfmaterial zugegeben
wird. Sie zeigt mit Sulfat als Elektronenakzeptor die grösste mikrobielle
Aktivität. Der Grund liegt darin, dass in der Anreicherungskultur
Ammoniumsulfat (5 mM) als Stickstoff- und Schwefelquelle diente. Unter
diesen Bedingungen scheinen vorwiegend Sulfatreduzenten angereichert
worden zu sein. Eisenhydroxid als Elektronenakzeptor stimuliert in allen Versuchsansätzen
mikrobielles Wachstum. Die Bildung von Kohlendioxid liegt
jedoch unter derjenigen der Sulfat- und Nitratatmung.
Für die Erstellung der Kohlenstoff-Bilanz des anaeroben Abbaus von Bitumen
wäre es von V orteil, wenn auch die von Mikroorganismen ins Medium
ausgeschiedenen organischen Verbindungen erfasst werden könnten. Unter den
vorgegebenen Kultivationsbedingungen werden jedoch beträchtliche Mengen
gelöster organischer Komponenten an der gesamthaft grossen Oberfläche
suspendierter Partikel adsorbiert (Tab. 9).
- 66-

~ - N0 - SO 2-
zeptor 3 4
Inokulum KA KE D KA KE D KA KE D
oB 15 15 0 10 11 1 15 20 5
°
mB 20 15 -5 20 11 -9 21 12 -9
D 5 0 -5 10 1 -9 1 -13 -14
oB 10 70 60 11 61 51 11 68 57
I mB 36 32 -4 26 47 21 46 25 -21
D 26 -38 -64 15 -14 -29 35 -43 -78
oB 115 28 -87 89 41 -48 78 36 -42
11 mB 82 19 -63 34 42 8 155 25 -130
D -33 -9 24 -55 1 56 77 11 -88
oB 8 28 20 8 36 28 20 23 3
m mB 22 10 -12 23 37 14 35 14 -21
D 14 -18 -32 15 1 -14 15 -9 -24
oB nb nb - 27 73 46 32 62 30
1+11+111 mB nb nb - 36 51 14 75 25 -50
D - - - 9 -22 -32 43 -37 -80
Tab. 9: Freisetzung von gelösten organischen Kohlenstoffverbindungen verschiedener
anaerober Mischkulturen in Anwesenheit unterschiedlicher
Elektronenakzeptoren.
Kultivationsbedingungen: Temperatur 35° C, pR 7.2, Rührdrehzahl
160 U / Min., Gasphase: Helium. Ein Versuchsansatz enthält 24 g
Bitumen, was einer suspendierten Bitumenoberfläche von ca. 0.8 m 2
entspricht. Die Kultivation dauert zwei Monate. Die Mischkulturen 11
und 111 wurden unter anaeroben Bedingungen auf den entsprechenden
Substraten angereichert. Die Menge gelöster organischer Kohlenstoffverbindungen
ist angegeben in mg / 1.
0: Kontrolle ohne Beimpfung
I: nicht adaptierte Mischkultur, isoliert aus Komposterde
II: an Kohlehydrate adaptierte Kultur
III: an Bitumen adaptierte Kultur
KA: Kultivationsanfang / KE: Kultivationsende
oB: Versuchsansatz ohne Bitumen / mB: Versuchsansatz mit Bitumen
nb: nicht bestimmt
D: Differenz, KE - KA resp. mB - oB
- 67-

Mit dem auf Kohlehydraten angereicherten Impfmaterial werden beträchtliche
Mengen organisches Material in einen Versuchsansatz eingebracht. Nach
Zugabe von Bitumen vermindert sich die Gesamtmenge gelöster organischer
Kohlenstoffverbindungen sofort deutlich. Im Gegensatz dazu zeigt die Kultur,
welche Sulfat als Elektronenakzeptor enthält, nach Zugabe von Bitumen einen
grösseren Anteil gelöster organischer Stoffe im Medium. Ein möglicher Grund
könnte in unterschiedlichen Oberflächenladungsverhältnissen in Gegenwart
von Sulfat liegen, was Aenderungen der Adsorptionseigenschaften der Partikel
zur Folge hätte. Kulturen, denen als Impfmaterial Komposterde zugegeben
wird, zeigen nach zweimonatiger Kultivationsdauer in Abwesenheit von
Bitumen einen deutlichen Anstieg gelöster organischer Verbindungen im
Medium. Da die mikrobielle Aktivität dieser Kulturen anderseits sehr gering ist
(siehe Abb. 21), ist die Zunahme kaum auf mikrobielle Stoffwechselprodukte
zurückzuführen. Es dürfte sich vielmehr um Stoffe handeln, die in dieser Zeit
aus den mit dem Impfmaterial eingebrachten Bodenpartikeln ausgewaschen
werden (z. B. Huminsäuren). In Gegenwart von Bitumen zeigen solche
Versuchsansätze am Ende der Kultivation einen signifikant geringeren Anteil
gelöster organischer Stoffe als zu Beginn. Generell ist zu beobachten, dass mit
der Zeit gelöste organische Komponenten aus dem Medium verschwinden.
Alle diskutierten Befunde sind erklärbar unter der Annahme, dass an den
Oberflächen der suspendierten Bitumen- und Bentonitpartikel beträchtliche
Mengen organischer Stoffe adsorbiert werden. In den verschiedenen
Versuchsansätzen werden jeweils Mengen von 2 - 20 mg gelöster organischer
Verbindungen durch Adsorptionsphänomene aus dem Medium entfernt. Eine
quantitative Erfassung von Kohlenstoffverbindungen, die durch Mikroorganismen
ins Medium abgegeben werden, ist unter diesen Bedingungen nicht
möglich.
- 68 -

3.3.2. Quantifizierung des anaeroben Abbaus von Bitumen
Unter anaeroben Bedingungen kann Substrat-Kohlenstoff letztlich umgesetzt
werden zu Biomasse, Kohlendioxid und Methan, dazu kommen allenfalls
organische Komponenten, welche von den Organismen ins Medium abgegeben
werden (Abb. 24).
BIOMASSE J
SUBSTRAT-
KOHLENSTOFF
biologische ~ KOHLENDIOXID
Aktivität ~ METHAN
GELOESTE ORGANISCHE
KOHLENSTOFFVERBINDUNGEN
Abb. 24: Schematische Darstellung der mikrobiellen Umsetzungen von Substrat-Kohlenstoff
unter anaeroben Bedingungen.
Da unter den gegebenen Kultivationsbedingungen nur die gasförmig anfallenden
Stoffwechselendprodukte Kohlendioxid und Methan quantitativ erfasst
werden, stellt sich analog zum Abbau unter aeroben Bedingungen die Frage,
welchem prozentualen Anteil des metabolisierten Substrat-Kohlenstoffs die
beiden Gase entsprechen.
Aus den Stoffwechselendprodukten der vollständigen aeroben Atmung kann
durch weitere Oxidation keine Energie mehr freigesetzt werden. Im Gegensatz
dazu entstehen bei allen anaeroben Abbauprozessen immer energiehaltige
Endprodukte (Tab. 10). Durch Nitratatmung bei Denitrifikation kann sich ein
Mikroorganismus ungefähr gleich viel der im Substrat gespeicherten Energie
für Lebensvorgänge nutzbar machen, wie dies bei Oxidation des Substrates in
Anwesenheit von Luftsauerstoff möglich wäre. Dies erlaubt uns, die für den
aeroben Abbau angegebenen Verhältnisse mehr oder weniger auf diesen Fall
zu übertragen: Durch Oxidation von 30 - 60 % des Substrates Bitumen kann
soviel Energie nutzbar gemacht werden, dass 40 - 70 % des Substrates in
Biomasse umgewandelt werden können. Im Falle der Nitratatmung bei
Ammonifikation wird nur ca. 65 % der Energie des metabolisierten Substrates
von Organismen genutzt.
- 69-

Energie in Hauptsächliche
Mikrobieller Prozess Produkten energiehaltige
[%] Endprodukte
Aerobe Atmung 0
Nitrat-Atmung bei Denitrifikation 5
Nitrat-Atmung bei Ammonifikation 35 NH 4
Sulfat -Atmung (vollständig) 80 H 2
S
Sulfat-Atmung (unvollständig) 82 H 2
S, niedere Fettsäuren
Eisen-Atmung 83 Fe 2 +
Methanfermentation 83 CH 4
Gemischte Fermentation 87 v. a. niedere Fettsäuren
und Alkohole
Tab. 10: Energiegehalt von Stoffwechselendprodukten aus anaeroben Abbauprozessen.
Der Energiewert, der durch vollständige Oxidation eines Substrates
in Anwesenheit von Luftsauerstoff freigesetzt werden kann, wird als
100 % gesetzt. Dementsprechend enthalten die Stoffwechselendprodukte
CO 2
und H 2
0 aus der aeroben Atmung keine nutzbare Energie
mehr (0 %). Die Energiegehalte von Produkten unterschiedlicher
anaerober Abbauwege sind berechnet nach Hanselmann (1986).
Um eine gleiche Menge an Biomasse zu synthetisieren, wie dies unter aeroben
oder denitrifizierenden Bedingungen stattfinden würde, müsste ca. 35 % mehr
Substrat umgesetzt werden. Bei anaerober Atmung mit Sulfat oder Eisen als
Elektronenakzeptor wird so gar 5 - 6 mal so viel Substrat für den Energiestoffwechsel
benötigt. Bezogen auf eine bestimmte Menge Substrat liefert
der Gärungsstoffwechsel am wenigsten Energie. Durch Oxidation intramolekularer
Substrat-Spaltprodukte kann nur ca. 10 - 15 % des Substrat-Energiegehaltes
für biologische Aktivität gewonnen werden. Allgemein kann man
-70 -

sagen, dass unter anaeroben Bedingungen pro Menge metabolisierten
Substrates weniger Energie freigesetzt wird, als dies bei aerobem Abbau der
Fall wäre. Daher muss für den Aufbau und die Erhaltung einer gleichen Menge
Biomasse mehr Substrat oxidiert werden.
Bitumenabbau ist sowohl mit Nitrat als auch Sulfat und Eisen als
Elektronenakzeptor möglich (Kap. 3.3.1). Um den anaeroben Abbau von
Bitumen mit der mikrobiellen Aktivität unter aeroben Verhältnissen vergleichen
zu können, werden den Berechnungen ebenfalls Werte zugrunde gelegt,
die unter optimalen Bedingungen ermittelt werden. Da im Falle der Nitrat­
Atmung bei Denitrifikation die aus dem Katabolismus resultierende Energieausbeute
für den Organismus am günstigsten ausfällt (siehe Tab. 10), wird
der mikrobielle Bitumenabbau für diesen Abbauweg bestimmt. Die Ermittlung
der Abbaurate für diesen Stoffwechselweg bringt zudem den Vorteil mit sich,
dass der prozentuale Anteil der gasförmigen Stoffwechselendprodukte am
Substrat-Kohlenstoff mit dem für aerobe Verhältnisse bestimmten Wert von ca.
30 - 60 % verglichen werden kann (Kap. 3.2.3). Ein weiterer Vorteil ist darin
zu sehen, dass bei Nitrat-Atmung zur Hauptsache Kohlendioxid als kohlenstoffhaltiges
Endprodukt des Energiestoffwechsels in Erscheinung tritt. Durch
Messung dieses Gases hat man somit den grössten Teil kohlenstoffhaltiger
Stoffwechselendprodukte erfasst. (Als Gegensatz dazu sei die Homoacetatfermentation
elW ähnt , wo oder gesamte, dem Energiestoffwechsel zugeführte
Substrat-Kohlenstoff in Form von Acetat ins Medium ausgeschieden wird.)
Diese Tatsache ist für eine Quantifizierung mikrobieller Aktivität in unseren
Kultivationssystemen von grosser Wichtigkeit, da wir im Medium gelöste
organische Kohlenstoffverbindungen nicht quantitativ erfassen können (Kap.
3.3.1 ).
Ob alternative anaerobe Abbauwege (Sulfat-Atmung, Eisen-Atmung, etc.)
einen geringeren oder erhöhten Abbau von Bitumen zur Folge hätten, ist
schwierig abzuschätzen. Es wird zwar pro Menge metabolisierten Substrates
weniger Biomasse synthetisiert. Eine an Zahl geringere Mikroflora kann jedoch
vergleichbare Mengen Substrat verbrauchen um ihren Energiebedarf zu
decken. Es darf auch nicht ausser Acht gelassen werden, dass aus einer
Vielzahl anaerober Abbauprozesse organische Kohlenstoffverbindungen ins
Medium ausgeschieden werden, welche die Intergrität der Bitumenmatrix auf
indirektem Weg beeinträchtigen können.
-71 -

Für die Quantifizierung können die im Vergleich mit der Kohlendioxidproduktion
äusserst geringen Mengen gebildeten Methans vernachlässigt
werden (Kap. 3.3.1). Das Vorhandensein von Methan in den Versuchsansätzen
ist aber insofern von Bedeutung, als durch dessen Anwesenheit strikte
anaerobe Bedingungen in den Versuchsansätzen als erwiesen gelten dürfen.
Da während der vorgegebenen Kultivationsdauer das mikrobielle Wachstum
nicht ausgereicht haben dürfte, um die suspendierte Bitumenoberfläche
vollständig zu besiedeln (Kap. 3.3.1), ist anzunehmen, dass die mikrobielle
Aktivität mit der Zeit noch ansteigt. Vergleiche mit Werten aus der Literatur
bestätigen diese Vermutung (Kap. 4.3). Wir ennitteln daher den anaeroben
Abbau mit Bitumen als Substrat ausgehend von den Versuchsansätzen mit der
grössten mikrobiellen Aktivität.
Zusammenfassend schliessen wir, dass unter anaeroben Bedingungen bei einer
vorgegebenen Substratoberfläche von ca. 1 m 2 in einem Jahr ungefahr 0.4 g
Bitumen abgebaut werden. Dies entspricht einer Kohlendioxidproduktion von
ca. 0.25 1 pro Jahr. Dagegen ist die produzierte Menge Methan vemachlässigbar
gering. Unter anaeroben Bedingungen können neben Kohlendioxid
und Methan allerdings noch andere Gase gebildet werden. Je nach den
ablaufenden Abbauprozessen können Mikroorganismen zusätzlich Wasserstoff,
Stickstoff, oder Schwefelwasserstoff produzieren. Wasserstoff kann in keinem
unserer Versuchsansätze nachgewiesen werden. Stickstoff und Schwefelwasserstoff
finden sich in denjenigen Kulturen, welchen Nitrat oder Sulfat als
Elektronenakzeptor zugegeben wird.
Die Zuverlässigkeit der Angabe des anaeroben Bitumenabbaus hängt von
verschiedenen Faktoren ab. Einerseits von der Genauigkeit, mit welcher das
mikrobiell produzierte Kohlendioxid gemessen werden kann, andererseits von
der Abschätzung, welchem prozentualen Substrat-Kohlenstoffanteil das
freigesetzte Kohlendioxid entspricht.
Die Abschätzung des Kohlenstoffanteils erfolgt für den Fall der Nitrat-Atmung
bei Denitrifikation. Somit kann der für den aeroben Abbau diskutierte Wert für
die Genauigkeit dieser Annahme von ca. ± 15 % übernommen werden (Kap.
3.2.3).
-72 -

Die Quantifizierung des mikrobiell produzierten Kohlendioxids basiert auf der
Erfassung mehrerer Messgrössen. Ein relativ bedeutender Unsicherheitsfaktor
zeigt sich beim Vergleich der Gasmessung doppelt geführter Versuchsansätze.
Die Werte streuen durchschnittlich 1 - 20 % um den gebildeten Mittelwert. Da
die gaschromatographisch ermittelte Kohlendioxid-Konzentration in Bezug
zum Gesamtgasvolumen des Versuchsansatzes gesetzt werden muss (Kap.
2.5.3), hängt die Genauigkeit im weiteren von einer exakten Bestimmung des
totalen Gasvolumens ab. Unter Berücksichtigung aller möglichen
Fehlerquellen, die bei der Ermittlung der einzelnen Grössen in Betracht zu
ziehen sind, beispielsweise Gasverlust beim Einstechen des Manometers in die
Butyl-Kautschuk-Membran des Kultivationsgefässes, Ungenauigkeiten beim
Extrapolieren des gelösten Gasanteils aus Literaturwerten, ete., dürfte das
Gesamtgasvolumen mit einer Genauigkeit von ca. 5 - 10 % ermittelt werden
können. Der Fehler bei der Quantifizierung des in Form von Hydrogencarbonat
im Medium verbleibenden Kohlendioxids beträgt ca. + 5 - 10 %. Die
Ungenauigkeit ist vor allem auf eine beschränkte Messgenauigkeit bei der
Ermittlung des pR-Wertes des Mediums zurückzuführen. Zusammenfassend
kann der mikrobielle Abbau von Bitumen unter anaeroben Bedingungen mit
einer Genauigkeit von ca. ± 50 % angegeben werden.
Nicht abschätzbar ist der Fehler, mit dem die Kohlenstoff-Bilanz behaftet wird,
durch Vemachlässigung der gelösten organischen Kohlenstoff-Verbindungen.
Im Falle der Nitrat-Atmung, welche mit der aeroben Atmung verglichen
werden kann, dürfte es sich jedoch um einen äusserst geringen Anteil handeln.
Unter Berücksichtigung der abgeschätzten Genauigkeit von ca. ± 50 %, mit
welcher das ermittelte Resultat betrachtet werden kann, beträgt der mikrobielle
Abbau von Bitumen unter anaeroben Bedingungen bei einer Substratoberfläche
von 1 m 2 ca. 0.2 - 0.6 g Bitumen pro Jahr. Dies entspricht einer CO 2
-
Produktion von ungefähr 0.15 - 0.45 I pro Jahr. Verglichen mit dem aeroben
Abbau, bei welchem in einem Jahr bezogen auf 1 m 2 Oberfläche ca. 20 - 50 g
Bitumen metabolisiert werden, ergibt sich unter anaeroben Bedingungen damit
eine ca. 100 mal geringere Abbaurate.
-73 -

4. INTERPRETATION UND EXTRAPOLATION DER MIKROBIELLEN
ABBAURATEN VON BITUMEN
4.1. Interpretation der Resultate
In einem Endlager ist mit Sicherheit mit mikrobieller Aktivität zu rechnen. Das
V orhandensein autochthoner Species und die Einschleppung· von Mikroorganismen
in Kavernen und Bohrlöcher wurde vielfach nachgewiesen
(Christophi et al. 1983, Bachofen und Lüscher 1984, West et al. 1985, West
und Grogan 1986). Da Bitumen abbauende Mikroorganismen offensichtlich
ubiquitär sind (Kap. 3.2.2.3 und 3.3.1), darf die Anwesenheit einer Bitumen
abbauenden Mikroflora im Endlager als sicher gelten.
Der mikrobielle Abbau von Bitumen wird im wesentlichen bestimmt durch die
vorherrschenden Umgebungsbedingungen. Die Milieufaktoren in einem
Endlager sind jedoch nicht genau bekannt (Elektrowatt 1985). Es darf aber
angenommen werden, dass die dort vorherrschenden Verhältnisse bezüglich
Temperatur, Strahlungsintensität, etc. mikrobiologische Aktivität nicht
ausschliessen. Lediglich die hohen pR-Werte durch die Gegenwart von
Zement und Beton werden für mikrobielles Leben als ungünstig betrachtet
(Elektrowatt 1985). Sie sind jedoch kein Grund, mikrobielle Aktivität
auszuschliessen. Roffey et al. (1987) berichten über mikrobiellen
Kohlenwasserstoffabbau bis zu pR-Werten von 12. In ihren Untersuchungen
zum Abbau von Bitumen finden sie mikrobielle Aktivität bei pR-Werten über
10. Bath et al. (1987) beschreiben mikrobielle Aktivitäten in extrem
alkalischen Quellen, welche als natürliche Analoga der Zementporenwässer des
Endlager-Nahfeldes betrachtet werden können. Dass mikrobielles Leben unter
extremsten Bedingungen auch bezüglich Temperatur, Druck, Salinität, etc.,
möglich ist, wurde mehrfach daraufhingewiesen (West et al. 1982, Bachofen
1986, Stetter et al. 1986, Troper und Galinski 1986).
Auch wenn Umgebungsbedingungen für ein Endlager angegeben werden
könnten, wäre es schwierig, diese den experimentellen Untersuchungen
zugrunde zu legen, da die Bedingungen innerhalb des Endlagers von Ort zu Ort
verschieden sein können und sich überdies auch im Verlaufe der Zeit ändern.
-74 -

Trotz dieser Unsicherheit muss eine Risikoabschätzung vorgenommen werden
können. Es wird daher vorgeschlagen, das Verhalten einzelner Systemkomponenten
mit einfachen konservativen Modellen zu beschreiben (N ag ra
Projektbericht Gewähr 1985b). Durch die Annahme optimaler Umgebungsbedingungen
für mikrobielle Aktivität wird dieser Anforderung entsprochen
(Kap. 1.3). Die ermittelten Resultate können als konservative Eingangsdaten in
ein Modell eingebracht werden.
Von besonderer Bedeutung für die Beurteilung der Langzeitstabilität eines
Materials ist die An- oder Abwesenheit von molekularem Sauerstoff, da unter
aeroben Bedingungen erheblich grössere mikrobielle Aktivitäten zu elWarten
sind. Da auch in bezug zu diesem Parameter keine genauen Angaben gemacht
werden können, wird generell angenommen, dass in der ersten Zeit nach
Verschluss des Endlagers aerobe Bedingungen vorherrschen werden. Durch
mikrobielle Aktivität und Korrosionsprozesse wird der verfügbare Sauerstoff
langsam aufgebraucht, und es werden sich zunehmend anaerobe Verhältnisse
einstellen (Nagra Projektbericht Gewähr 1985a). Wiborgh et al. (1986)
postulieren aufgrund von Modellrechnungen eine Zeit von 1 - 5 Jahren, bis der
vorhandene Sauerstoff aufgebraucht ist. Unter der Annahme, dass der
Sauerstoff in dieser kurzen Zeit aufgebraucht ist und dass später kein neuer
Sauerstoff in das Endlager eindringen kann, ist für die Beurteilung der
Langzeitstabilität von Bitumen vor allem die unter anaeroben Bedingungen
ermittelte Abbaurate relevant. Da für diese Annahme jedoch keine absolute
Gewähr besteht, sollten auch die Abbauraten unter aeroben Bedingungen
bekannt sein.
In welchem Ausmass Bitumen als Substrat- und Energiequelle von
Mikroorganismen genutzt werden kann, wird von seinem physikalischen
Zustand und seiner Zusammensetzung bestimmt. Ait und Pedersen (1984)
zeigen einen bevorzugten Abbau von Maltenen (v.a. gesättigte, langkettige und
verzweigte Kohlenwasserstoffe). Dies deutet darauf hin, dass Bitumen vorerst
nur partiell metabolisiert wird. Der Befund stimmt überein mit Erkenntnissen
aus dem Abbau von Kohlenwasserstoffen. Niedermolekulare Verbindungen
werden bevorzugt abgebaut. Moleküle mit aromatischen Eigenschaften und
Kettenverzweigungen werden erschwert abgebaut. Diese selektive Metabolisierung
von Bitumenkomponenten dürfte eine erhöhte Beeinträchtigung der
Matrixintegrität zur Folge haben.
-75 -

Entscheidend für die Geschwindigkeit des Bitumenabbaus ist die für Mikroorganismen
zugängliche Oberfläche. Veränderungen, die eine Vergrösserung
der Oberfläche zur Folge haben, zum Beispiel Rissbildungen, hervorgerufen
durch Gasbildung oder Quellung von Ionentauscherharzen (Peltonen und
Niemi 1983), führen zu einem grösseren Substratangebot und dementsprechend
zu einer erhöhten mikrobiellen Aktivität. Oberflächenvergrössemde Effekte
könnten auch durch Detergenzien, welche von Mikroorganismen ausgeschieden
werden, oder durch organische Stoffe in der Umgebung oder im
Abfallgebinde, hervorgerufen werden.
Der radioaktive Abfall wird mit Bitumen vermischt und in einen Stahlbehälter
eingegossen. Die Mischverhältnisse variieren je nach der AbfaUart, welche mit
Bitumen immobilisiert wird von 30 : 70 bis 44 : 56 (Elektrowatt 1985). Wird
ein Bitumen-AbfaU-Gemisch mit einem durchschnittlichen Mischungsverhältnis
von 60 : 40 in einen Standard-Stahlbehälter mit einer Höhe von
0.893 m und einem Durchmesser von 0.606 m (Nagra Gebinde Katalog 1987)
eingegossen, ergibt sich unter Annahme eines homogenen Gemisches eine
Bitumenoberfläche des AbfaUgebindes von ca. 1.4 m 2. Wenn die Matrix intakt
ist, also keine innere Oberfläche aufweist, erfolgt unter aeroben Bedingungen
ein mikrobieller Abbau pro Abfallgebinde von ca. 30 - 70 g Bitumen in
einem Jahr, während unter anaeroben Verhältnissen in der selben Zeit mit
einem ungefähr 100 mal geringeren Abbau von ca. 0.3 - 0.8 g Bitumen zu
rechnen ist. Bei einer Gesamtmenge gelagerten Bitumens von 3' 400 Tonnen
ergibt dies in einem Jahr einen maximalen Bitumenabbau von ca. l' 000 -
2'400 kg unter aeroben und ca. 10 - 27 kg unter anaeroben Bedingungen. Bei
diesen Abbauraten errechnet sich bezogen auf die Gesamtmenge gelagerten
Bitumens unter aeroben Bedingungen eine Kohlendioxidfreisetzung von ca.
700 - 2'000 m 3 in einem Jahr. Unter anaeroben Bedingungen dürften in
derselben Zeit ungefähr 7 - 20 m 3 Kohlendioxid freigesetzt werden. Bei den im
Endlager herrschenden pH-Bedingungen von 10 - 13 (Nagra Projektbericht
Gewähr 1985a) würde ein Grossteil des produzierten Kohlendioxids in Form
von Hydrogencarbonat in der wässrigen Phase verbleiben. Damit verbunden
wäre eine Erniedrigung des lokalen pH-Wertes, was mikrobielle Aktivität
begünstigt.
-76 -

4.2. Extrapolation der mikrobiellen Abbauraten von Bitumen auf eine
lange Zeit
Die mikrobiellen Abbauraten von Bitumen wurden für die Dauer eines Jahres
angegeben. Im Hinblick auf die Sicherheitsanalyse muss jedoch die Frage nach
dem Verhalten des Materials während wesentlich längeren Zeiträumen beantwortet
werden. Als Richtwert für die erforderliche Langzeitbeständigkeit
von bituminierten Abfällen in einem Lager schwach- und mittelradioaktiver
Abfälle werden 1 '000 - 10'000 Jahre angegeben (Elektrowatt 1985). Während
einer Zeit von 1 '000 Jahren wird sich die Totalaktivität der Abfälle auf ca. 1 %
der Anfangsaktivität reduzieren (Abb. 25).
10"
10'
10' 10' 10"
Zeit (Jahre)
10" 10 7
Abb. 25: Verlauf der Totalaktivität in einem Endlager schwach- und mittelradioaktiver
Abfälle als Funktion der Zeit (Nagra Projektbericht
Gewähr 1985a).
Abfälle aus Medizin, Industrie und Forschung (MIF) , der Wiederaufarbeitung
(W A), der Stillegung (SA) und Betriebsabfälle (BA).
-77 -

Ausgehend von Laborexperimenten können Angaben zur Langzeitstabilität von
Bitumen nur unter der Annahme gemacht werden, dass sich die den
experimentellen Untersuchungen zugrunde gelegten Umgebungsbedingungen
im Verlaufe der Zeit nicht verändern. Eine solche Annahme ist jedoch mit
grosser Wahrscheinlichkeit nur beschränkt richtig. Zusammensetzung und
Eigenschaften des Bitumen können durch Strahlungs- und Wärmeeinwirkung,
innere und äussere Drucke, Auslaugung, Alterung, Einwirkung von
chemischen Agenzien aus dem Abfallgebinde oder der Umgebung und nicht
zuletzt durch mikrobielle Prozesse selbst, Aenderungen erfahren. Aenderungen
der Umgebungsbedingungen Temperatur, pH, Redoxpotential, etc. sind
ebenfalls wahrscheinlich. Selbst die Stoffwechseleigenschaften von Mikroorganismen
können in Folge von Mutationen, verursacht durch eine erhöhte
Strahlungsintensität im Endlager, andere Fonnen annehmen. Da die
mikrobielle Aktivität das Resultat des Zusammenwirkens einer Vielzahl
unterschiedlichster Faktoren darstellt, müssten zusätzlich antagonistische und
synergistische Effekte in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise ein
Abbau von Bitumen durch Co-Metabolismus in Anwesenheit anderer
organischer Kohlenstoffquellen oder Beeinträchtigung von dessen Integrität
durch Ausscheidung von Tensiden aus der Metabolisierung anderer Substrate.
Drucke könnten Risse in der Matrix verursachen, was in einem erhöhten
mikrobiellen Abbau von Bitumen resultieren könnte. Möglich wäre aber auch
eine Schädigung der Mikroflora durch Anhäufung toxischer Stoffe oder eine
Verminderung der mikrobiellen Aktivität durch Abnahme essentieller
Nährstoffe. In Anbetracht der genannten Gründe sind Extrapolationen von
Daten, welche aus Laborexperimenten gewonnen werden, mit äusserster
V orsicht zu interpretieren.
Unter Anwendung des Aktualitätsprinzips ergibt sich bei linearer Extrapolation
der ermittelten Abbauraten in 1 '000 Jahren ein anaerober Bitumenabbau von
ca. 10 - 27 Tonnen. Dies entspricht einem Abbau von ungefähr 0.3 - 0.8 % des
im Endlager vorhandenen Bitumens. Unter aeroben Bedingungen ergibt sich
eine Metabolisierung von ca. 25 - 70 % des gelagerten Bitumens in der selben
Zeit. Dieser Wert ist ebenfalls durch lineare Extrapolation der unter
Laborbedingungen ermittelten Abbaurate hergeleitet. Die der Extrapolation
zugrunde liegende Annahme eines unveränderten Bitumenabbaus dürfte jedoch
in Anbetracht einer selektiven und sequentiellen Metabolisierung unterschiedlicher
B itumenkom ponenten mit der Zeit nicht mehr stimmen. Dem extrapolierten
Wert ist somit keine besondere Bedeutung beizumessen.
-78 -

4.3. Vergleich der Resultate mit Daten anderer Arbeitsgruppen
Es liegt eine Vielzahl von Arbeiten vor, in welchen ein mikrobieller Abbau von
Bitumen nachgewiesen wird. Die meisten dieser Untersuchungen können
jedoch nur schwer miteinander verglichen werden, da wichtige Parameter, wie
beispielsweise das verwendete Bitumen oder bestimmte Umgebungsbedingungen,
nicht spezifiziert werden, oder die Versuche unter sehr unterschiedlichen
Bedingungen durchgeführt wurden (Kap. 1.3). Saubere Quantifizierungen
fehlen weitgehend (Bachofen et al. 1984). Erst seit wenigen Jahren
laufen in verschiedenen Laboratorien Untersuchungen mit dem Ziel, den
mikrobiellen Abbau von Bitumen quantitativ zu erfassen, um daraus Angaben
bezüglich der Eignung von Bitumen als Immobilisierungsmaterial für radioaktive
Abfälle machen zu können.
Ait und Pedersen (1984) untersuchen den mikrobiellen Abbau von Bitumen
unter aeroben Bedingungen. Ein Trägermaterial mit definierter Oberfläche wird
mit Bitumen beschichtet, in ein Mineralsalzmedium gegeben und mit einer
Mischkultur, welche aus Boden gewonnen wird, beimpft. Die Kultivation
erfolgt bei Zimmertemperatur in verschlossenen Gefässen, anfänglich
Luftatmosphäre enthaltend. Unter den gegebenen Bedingungen extrapolieren
sie einen Bitumenabbau von ca. 5 % in 1 '000 Jahren, bezogen auf ein
Abfallgebinde von 0.2 m 3 Volumen. Sie vermuten jedoch, dass diese Rate zu
gering veranschlagt ist, da durch Einwirkung unterschiedlichster Faktoren, wie
beispielsweise Rissbildungen, Radiolyse, etc. die Oberfläche der Bitumenmatrix
mit der Zeit ansteigen könnte.
Barletta et al. (1986) quantifizieren den aeroben Abbau eines geblasenen
Bitumen (Pioneer 221). Die Umgebungsbedingungen der Versuchsansätze
werden nicht exakt spezifiziert. Bitumenstücke mit einer definierten Oberfläche
werden in unterschiedliche Böden eingebracht. Als Mass für die mikrobielle
Aktivität wird das produzierte Kohlendioxid gemessen. Ausgehend von diesen
Bedingungen resultiert ein ca. 1 %-iger Bitumenabbau in 300 Jahren, bezogen
auf ein Fass Bitumen von 0.2 m 3 Inhalt.
In der Arbeit von Roffey et al. (1987) wird der Abbau von Bitumen unter
aeroben und anaeroben Bedingungen untersucht. Die Art des verwendeten
Bitumens wird nicht näher angegeben. Die Versuchsansätze werden mit einer
Mischkultur beimpft und bei Zimmertemperatur im Dunkeln kultiviert. Für
-79 -

aerobe Bedingungen wird ein Bitumenabbau von 7.2 - 18 mMol CO 2
pro Jahr
bei einer Bitumenoberfläche von 1 m 2 angegeben. Dieser Wert wird bei pH
11.5 ermittelt. Unter optimalen Bedingungen, bei Vorhandensein anorganischer
Nährstoffe im Medium und einem pH von 7.0, werden ca. 83 - 95 mMol CO 2
pro Jahr und Quadratmeter Bitumenoberfläche produziert. Dies entspricht unter
den angegebenen Bedingungen einer Kohlendioxid-Produktion von 140 - 400
ml unter alkalischen und einer solchen von ca. 2 1 unter optimalen
Bedingungen. Vergleicht man diese unter optimalen Bedingungen ermittelte
Kohlendioxid-Produktion von ca. 2 1 pro m 2 und Jahr mit der in unseren
Versuchsansätzen gemessenen Menge Kohlendioxid von ca. 20 1 pro m 2 und
Jahr, ergibt sich ein Unterschied von ungefähr einer GrÖssenordnung. Dieser
Unterschied dürfte vor allem auf einer unterschiedlichen Sauerstoffversorgung
der Kulturen beruhen. Bei den Versuchsansätzen von Roffey et al. (1987)
handelt es sich um verschlossene Kulturen mit einer Luftatmosphäre. Eine
kontinuierliche Gasversorgung ist somit nicht möglich. Da die Kulturen zudem
nicht geschüttelt werden, dürfte der Uebergang des Sauerstoffs von der Gas- in
die wässrige Phase gering sein. Verglichen mit kontinuierlich begasten
Kulturen in Bioreaktoren, in welchen durch Rühren ein erhöhter Massetransfer
von Sauerstoff in die wässrige Phase stattfindet, sind die bezüglich der
Gasversorgung geschlossenen Kulturen mit Sicherheit mangelhaft mit
Sauerstoff versorgt, was eine entsprechend geringere mikrobielle Aktivität zur
Folge hat. Ein weiteres Indiz dafür ist darin zu sehen, dass verschlossene
Versuchsansätze unter aeroben und anaeroben Bedingungen nur geringfügige
Unterschiede in der Menge produzierten Kohlendioxids aufweisen. Unter
anaeroben Bedingungen ermitteln Roffey et al. (1987) eine mikrobielle Kohlendioxidproduktion
von 13 - 18 mMol in einem Jahr, bezogen auf eine
Bitumenoberfläche von 1 m 2 für alkalische und maximal 25 mM für optimale
Bedingungen. Dies entspricht einer produzierten Menge CO 2
von 300 - 400 ml
unter alkalischen Verhältnissen und ca. 565 ml unter optimalen Bedingungen.
Diese Werte stimmen mit den von uns ermittelten Daten von ca. 150 - 450 ml
produzierten Kohlendioxids pro m 2 Bitumenoberfläche in einem Jahr recht gut
überein. Die etwas geringere Kohlendioxidproduktion in unseren Versuchsansätzen
könnte auf das bereits diskutierte Phänomen einer bezogen auf die
Substratoberfläche geringen Zellzahl zurückzuführen sein.
- 80-

Zusammengefasst zeigt sich, dass alle Arbeitsgruppen für den aeroben Abbau
von Bitumen eine verglichen mit unseren Resultaten erheblich geringere
mikrobielle Aktivität erhalten, was auf eine ungenügende Sauerstoffversorgung
der Kulturen zurückzuführen sein dürfte, da alle Arbeitsgruppen mit
geschlossenen Kultivationsansätzen arbeiten. Bezüglich des anaeroben
Bitumenabbaus ergibt sich eine relativ gute Uebereinstimmung.
4.4. Schlussfolgerungen
Die durchgeführten Untersuchungen haben gezeigt, dass Bitumen sowohl unter
aeroben als auch anaeroben Bedingungen mikrobiell abgebaut werden kann.
Von grässter Bedeutung für die Langzeitstabilität des Matrixmaterials Bitumen
wird sein, in welchem Ausmass Luftsauerstoff im Endlager vorhanden sein
wird. Bei dauerndem Eindringen von Sauerstoff ins Endlager müsste eine
rasche Zerstörung der Matrix in Betracht gezogen werden.
Abbau der Matrix bedeutet Zerstörung von deren Integrität und somit
Freisetzung von Radionukliden in die unmittelbare Umgebung der Abfallgebinde.
Ob aus den Gebinden freigesetzte Nuklide in die Biosphäre gelangen
können, hängt vor allem von der Tauglichkeit der nachgeschalteten Sicherheitsbarrieren
ab (Kap. 1.1).
- 81 -

5. ZUSAMMENFASSUNG
Bitumen dient als Immobilisierungsmaterial für einen Teil schwach- und
mittelradioaktiver Abfälle. Da in einem Endlager mit Sicherheit
Mikroorganismen vorhanden sind, klären wir ab, in welchem Ausrnass
mikrobielle Aktivität die Integrität und somit Langzeitstabilität von Bitumen zu
beeinträchtigen vermag. Der Bitumenabbau wird sowohl unter aeroben als
auch anaeroben Bedingungen quantifiziert.
Für die experimentellen Untersuchungen wird Bitumen mit vergrösserter
Oberfläche in wässriger Phase suspendiert und mit Mikrofloren unterschiedlicher
Zusammensetzung be impft. Die Versuchs ansätze werden unter
optimalen Bedingungen kultiviert. Durch Messung des Stoffwechselendproduktes
Kohlendioxid lässt sich die mikrobielle Aktivität eindeutig
quantifizieren.
Die Untersuchungen ergeben, dass Bitumen abbauende Mikroorganismen
ubiquitär sind. Der Abbau erfolgt hauptsächlich durch direkten Kontakt der
Mikroorganismen mit dem Substrat. Unter optimalen Bedingungen wird daher
die mikrobielle Aktivität durch die Bitumenoberfläche limitiert. Unter aeroben
Bedingungen werden im Zeitraum von einem Jahr bei einer Oberfläche
von 1 m 2 ca. 20 - 50 g Bitumen mikrobiell abgebaut. Aus dem Abbau resultiert
eine Kohlendioxid-Produktion von ungefähr 15 - 40 Litern. Verglichen mit
dem aeroben Abbau ergibt sich unter anaeroben Bedingungen eine ungefähr
100 mal geringere Abbaurate von ca. 0.2 - 0.6 g Bitumen pro Jahr bezogen auf
eine Oberfläche von 1 m 2 . Damit verbunden werden ca. 0.15 - 0.45 Liter
Kohlendioxid produziert. Methan kann in Spuren nachgewiesen werden. Je
nach vorhandenen Elektronenakzeptoren werden unter anaeroben Bedingungen
von den Mikroorganismen zusätzlich die Gase Stickstoff oder Schwefelwasserstoff
freigesetzt.
Bei linearer Extrapolation der für anaerobe Verhältnisse ermittelten Abbaurate
auf den sicherheitstechnisch relevanten Zeitraum von ungefähr l' 000 Jahren
muss mit einem ca. 0.3 - 0.8 %-igen Abbau der Bitumenmatrix gerechnet
werden. Bei dauerndem Eindringen von Luftsauerstoff ins Endlager müsste
eine erheblich raschere Zerstörung der Matrix in Betracht gezogen werden.
- 82-

6. LITERATURVERZEICHNIS
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VERDANKUNGEN
Unter der Leitung von Professor R. Bachofen habe ich die vorliegende Arbeit
ausgeführt. Ich möchte ihm herzlich danken für die durch Vertrauen und
Freiheit geprägte Arbeitsatmosphäre, die mir die Doktorandenzeit zu einem
wertvollen und lehrreichen Lebensabschnitt werden liess. Danken möchte ich
auch für die grosszügige Unterstützung bei der Bereitstellung und Beschaffung
teurer Labor-Infrastruktur.
Danken möchte ich im weiteren
den Herren Dres. K. Schneider, K. Hanselmann, Ch. Fuchs und B. Butsch für
wertvolle Anregungen und ihre B-eratung bei technischen Problemen
Herrn Ch. Brunner für seine Mitarbeit am Projekt im Rahmen seiner Diplomarbeit
und für die Ueberlassung fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen
den Herren D. B ollier, A. B irchmeier und H.P. Schmidhauser für die
unentbehrliche Hilfe bei Planung und Konstruktion von Versuchsanlagen und
bei der Instandhaltung der Labor-Infrastruktur
Herrn U. J auch für die Durchführung rasterelektronenmikroskopischer
Untersuchungen
Herrn J. Rehacek (N estec SA, Orbe) für die Ermöglichung laseroptische
Messungen durchführen zu können
Frau I. Cordt-Riehle (Strahlenbiologisches Institut der Universität Zürich) für
ihre unerlässliche Mithilfe und Beratung zu Fragen der Dosimetrie und bei der
Anwendung des Betatrons
Herrn Dr. J. Hertz (Anorganisch - chemisches Institut der Universität Zürich)
für seine Beratung und die Zurverfügungstellung von Labor-Infrastruktur
Frau Guecheva (Eidgenössische Anstalt für das forstliche Versuchswesen,
B irmensdort) für die Durchführung der Multielementanalysen
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dem Paul ScheITer Institut in Würenlingen für die Auswertung von Alanin­
Dosimetern
dem Institut für medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich für die
Durchführung einer taxonomischen Analyse
der Firma Kontron in Zürich für die Ueberlassung eines Infrarot-Spektrometers
der Firma SKAN AG in Basel für Untersuchungen mit einem Partikelzähl­
Messgerät
der EA W AG in Kastanienbaum für Messungen mit einem Sedigraphen
der Firma Bachofen AG in Basel für Versuche mit Kugelmühlen.
Die Arbeit wurde finanziert von der Nationalen Genossenschaft für die
Lagerung radioaktiver Abfälle (NAGRA).
Als Vertreter der NAGRA begleiteten die Herren Dres. A. Della Casa und K.
Kurtz den Fortgang der Untersuchungen. Für ihre Mithilfe und die Schaffung
wertvoller Kontakte möchte ich ihnen herzlich danken.
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