Gentechnologie: Klonierung und Transformation von DNA

Grundpraktikum Genetik 8. Kurstag 16.06.2005
Gentechnologie:
Klonierung und Transformation von DNA
Lerninhalte: Transformation, natürliche Kompetenz, Transformationseffizienz, Vektor, Plasmid,
Resistenzgen, Replikationsursprung, Polylinker („multiple cloning site“), Ligation,
Markergen, Blau-Weiß-Test, Klonierung
Genübertragung durch Transformation
Die direkte Aufnahme von DNA-Molekülen und die stabile Weitergabe dieser Information wird
Transformation genannt. Einige Bakterienstämme (insbesondere grampositive, wie z.B. Streptococcus
pneumoniae) besitzen die Eigenschaft, DNA ohne besondere Vorbehandlung aufzunehmen. Diese
Eigenschaft nennt man natürliche Kompetenz. In der molekularen Genetik findet allerdings
hauptsächlich das gramnegative Bakterium Escherichia coli Verwendung. E. coli besitzt keine
natürliche Kompetenz, kann aber durch verschiedene Methoden kompetent gemacht werden: Die
Behandlung mit zweiwertigen Ionen (meist Ca 2+ ) macht Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase
fähig zur Aufnahme von DNA. Werden so behandelte Zellen mit zirkulärer, superhelikaler Plasmid-
DNA inkubiert, können ca. 10 6 - 10 8 Transformanden je µg DNA erzielt werden.
Plasmide und Vektoren
Plasmide sind zirkuläre, extrachromosomale DNA-Moleküle, die sich in der Zelle unabhängig vom
Wirtsgenom vermehren können. Viele dieser natürlich vorkommenden Plasmide tragen Resistenzgene,
welche die Bakterien gegen die Wirkung bestimmter Antibiotika schützen. Die schnelle Ausbreitung
solcher (Multi-)Resistenzplasmide stellt im Krankenhausalltag eine beträchtliche Gefahr dar, denn
viele pathogene Organismen sind inzwischen gegen eine Vielzahl therapeutisch wichtiger Antibiotika
resistent.
Ausgehend von den natürlich vorkommenden Plasmiden sind sogenannte Plasmidvektoren entwickelt
worden, die sich durch folgende Eigenschaften auszeichnen: Sie sind klein, haben eine hohe
Kopienzahl und besitzen im Allgemeinen nur noch das für die Selektion notwendige Resistenzgen
sowie einen Replikationsursprung für ihre Vermehrung. Zur Erleichterung von Klonierungsexperimenten
tragen Vektoren meist eine künstlich eingefügte Region (Polylinker oder „multiple
cloning site“), die eine Reihe sogenannter singulärer Restriktionsschnittstellen enthält. Dies bedeutet,
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dass das Plasmid von den Restriktionsenzymen, die im Polylinker eine Erkennungssequenz besitzen,
ausschließlich an dieser Stelle geschnitten werden.
Abb. 1: Aufbau des Klonierungsvektors pUC18 mit
vergrößerter Darstellung des Polylinkers
Ligation und Blau-Weiß-Test
DNA-Fragmente mit einer Größe bis ca. 20 kb lassen sich mit Hilfe von Plasmidvektoren in
Bakterienzellen einbringen. Dazu wird das zu klonierende DNA-Fragment mit einem
Restriktionsenzym behandelt. Restriktionsenzyme sind aus Bakterien isolierte Enzyme, die DNA an
spezifischen Erkennungssequenzen schneiden. Auch der Vektor, in den ein DNA-Fragment eingebracht
werden soll, muss mit einem Restriktionsenzym behandelt werden, welches passende Enden erzeugt.
Das DNA-Fragment kann dann mit Hilfe der T4 DNA-Ligase in Gegenwart von Mg 2+ und ATP in den
Vektor eingefügt werden (Ligation). Dabei katalysiert die Ligase die Bildung von
Phosphodiesterbindungen zwischen den offenen Enden des DNA-Fragments und dem Vektor.
Zur Erkennung, ob ein Vektor ein DNA-Fragment aufgenommen hat, dient das β-Galaktosidase-Gen
lacZ als Markergen, dessen Ausprägung durch Insertion eines DNA-Fragmentes gestört wird. Die
Aktivität der β-Galaktosidase ist auf Platten durch den Indikator X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-Galaktosid)
direkt nachweisbar, denn dieses Enzym spaltet den farblosen Indikator unter
Freisetzung eines blauen Farbstoffes. Bakterien, die ein Plasmid ohne kloniertes DNA-Fragment
aufgenommen haben, bilden daher auf X-Gal-Platten blaue Kolonien. Nach Insertion eines DNA-
Stückes in das Plasmid kann keine funktionelle β-Galaktosidase gebildet werden. Deshalb bleiben
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diejenigen Kolonien, die ein rekombinantes Plasmid tragen, in der Regel auf X-Gal-Platten weiß
(Blau-Weiß-Test).
Klonierung
Unter einer Klonierung versteht man die Vermehrung eines bestimmten DNA-Moleküls in Wirtszellen.
Da alle Nachkommen einer Ausgangszelle genetisch identisch sind, spricht man von einem Klon
(griech.: klõn, der abgebrochene Zweig, der für die vegetative Vermehrung von Rebstöcken oder
Obstbäumen verwendet wird).
Gleichzeitig findet durch das schnelle Wachstum der Bakterien (Teilungsrate: 20-30 min unter
geeigneten Wachstumsbedingungen) eine enorme Vermehrung dieses DNA-Moleküls in der
Bakterienpopulation statt, so dass bereits in einer Übernachtkultur eines transformierten
Bakterienstammes genügend Vektor-DNA vorhanden ist, um die klonierte DNA in vitro zu
untersuchen. Die Plasmid-DNA lässt sich durch einfache Methoden (Plasmid-Präparation) aus den
Zellen isolieren. Dabei können aus 3 ml einer Kultur bis zu 50 µg Plasmid-DNA gewonnen werden.
Experimentalteil
Wir wollen in einem Transformationsexperiment mit nachfolgender Restriktionsanalyse die Klonierung
eines DNA-Fragmentes durchführen und überprüfen. Ein 2140 bp großes Fragment ist durch
Behandlung der DNA des Bakteriophagen λ mit der Restriktionsendonuklease PstI entstanden (s. Abb.
2). Dieses Fragment wurde in das Plasmid pUC18 kloniert. Hierfür wurde der Vektor pUC18 mit dem
Restriktionsenzym PstI im Polylinker linearisiert und anschließend das PstI-Fragment des
Bakteriophagen λ mit Hilfe der DNA-Ligase mit dem Vektor kovalent verknüpft. Da beide Enden des
PstI-Fragmentes die gleichen Überhänge von 4 Nukleotiden aufweisen (vergl. S. 10 des Skriptes), kann
das Fragment in beiden „Richtungen“ - in der Molekulargenetik spricht man von beiden Orientierungen
eines Fragmentes– in pUC18 ligiert werden. Weiterhin können natürlich auch pUC18-Moleküle
auftreten, die kein fremdes DNA-Fragment (Insertion) besitzen, sondern bei denen die eigenen Enden
verknüpft wurden (s. Abb. 2). Diese drei Molekültypen müssen nach einer Klonierung voneinander
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unterschieden werden. Das insertionsfreie Plasmid lässt sich von den Plasmiden, welche eine Insertion
tragen, mittels des Blau-Weiß-Tests unterscheiden (s. S. 2/3 des Skriptes). Bei den Plasmiden, die eine
Insertion besitzen, lässt sich die Größe und die Orientierung des klonierten Fragmentes durch
Restriktionsanalyse bestimmen (s. S. 3 des Skriptes). Zur Bestimmung der Größe des inserierten DNA-
Fragments wird das Plasmid mit PstI geschnitten. Die Orientierung lässt sich durch Behandlung mit der
Restriktionsendonuklease EcoRI feststellen. EcoRI schneidet das PstI-Fragment 945 bp vom Rand
entfernt. Da EcoRI außerdem genau einmal im Polylinker schneidet, erhält man je nach Orientierung
Fragmente mit einer Länge von 985 bp und 3880 bp (Orientierung A in Abb. 2) bzw. 1235 bp sowie
3631 bp (Orientierung B).
Abb. 2: Klonierung des 2140 bp PstI-Fragmentes
des Bakteriophagen λ in das Plasmid pUC18.
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Vor Beginn des Praktikums durchgeführte Experimente:
Restriktion der λ-DNA mit PstI und Isolierung des 2140 bp Fragmentes
Restriktion von pUC18 mit PstI
Ligation beider DNA-Moleküle -> Plasmidgemisch
1. Versuchstag (16.06.05): Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Transformation des Plasmidgemisches
Weiterführung am 20.06.05 oder 21.06.05:
Auswertung der Transformation
Animpfen von zwei E. coli-Kulturen (von je einer blauen und einer
weißen Kolonie)
2. Versuchstag (23.06.05): Isolierung der Plasmid-DNA und
Restriktionsanalyse
Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente
1. Versuchstag
Der Versuch umfasst folgende Teile:
• Herstellung CaCl 2 -kompetenter E. coli-Zellen und
• Überprüfung der kompetenten Zellen und Transformation des Plasmidgemisches in die
kompetenten Zellen
Zur Vorbereitung des Experimentes gießen Sie 3 LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 µg/ml) und X-
Gal (40 µg/ml) sowie eine LB-Agarplatte ohne Zusätze.
Herstellung CaCl 2 -kompetenter E. coli-Zellen
Die Behandlung von E. coli-Zellen mit Ca 2+ -Ionen bewirkt aufgrund eines bisher nicht verstandenen
Mechanismus, dass die Zellen mit hoher Effizienz Plasmid-DNA aufnehmen können.
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Folgender Ansatz wurde vorbereitet:
Ein Vollmedium (dYT-Medium) wurde mit einer frischen Übernachtkultur des Stammes E. coli DH5α
(lacZ ∆M15) 1:50 angeimpft und schüttelnd bei 37 °C ca. 2 Stunden inkubiert.
Bei Erreichen einer Konzentration von ca. 1 x 10 9 Zellen pro ml (optische Dichte bei 600 nm (OD 600 )
≈ 0,5 - 0,8) wurde die Kultur bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.
Der Versuch wird im Praktikum folgendermaßen fortgesetzt:
In vier Reaktionsgefäßen werden jeweils 1,5 ml Kultur 2 min bei 5000 Upm zentrifugiert. Der
Überstand wird in den Flüssigabfall verworfen, die Zellpellets werden in jeweils 200 µl eiskalter
50 mM CaCl 2 -Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis gestellt. Danach werden die Zellsuspensionen
2 min bei 5000 Upm zentrifugiert, der Überstand wird wiederum verworfen, und die Zellen werden in
jeweils 20 µl eiskaltem 50 mM CaCl 2 aufgenommen und auf Eis aufbewahrt. Diese kompetenten
Zellen können bei Lagerung auf Eis innerhalb von ca. 12 Stunden für die Transformation verwendet
werden.
Transformation
Es werden vier verschiedene Transformationsexperimente durchgeführt:
1. Kompetente Zellen werden ohne Zugabe von DNA gemäß dem Transformationsprotokoll (s.
unten) behandelt und anschließend auf einer antibiotikumfreien Agarplatte ausplattiert. Dieses
Experiment zeigt Ihnen, ob die kompetenten Zellen nach Kompetenzinduktion und
Transformation weiterhin lebensfähig sind.
2. Kompetente Zellen werden wie im Experiment 1 ohne Zugabe von DNA behandelt, jedoch auf
einer Agarplatte ausplattiert, die Ampicillin und X-Gal enthält. Dieses Experiment dient der
Überprüfung der Antibiotikumsensitivität der Zellen.
3. Kompetente Zellen werden mit einer definierten Menge Plasmid (2 µl pUC18; 50 µg/µl)
transformiert und auf einer Agarplatte ausplattiert, die sowohl Ampicillin als auch X-Gal
enthält. Mit diesem Experiment wird die Transformationseffizienz der kompetenten Zellen
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bestimmt. Die Transformationseffizienz ist ein Maß für die Kompetenz der Zellen und gibt an,
wie viele Transformanden bei einem Transformationsexperiment mit 1 µg eines superhelikalen,
ringförmigen Plasmids erzielt werden können.
Transformationseffizienz =
Anzahl der Transformanden
__________________________________
µg eingesetzte DNA
Da die Transformationseffinienz im Bereich von 10 5 bis 10 6 Transformanden/µg DNA liegt,
werden in der Regel werden aber nur einige ng des Plasmids transformiert, damit die Zahl der
Kolonien auf den Transformationsplatten nicht zu groß wird.
4. Die kompetenten Zellen werden mit 2 µl des Plasmidgemisches behandelt und auf einer
Agarplatte ausplattiert, die sowohl Ampicillin als auch X-Gal enthält. Dieses Experiment gibt
Ihnen das Verhältnis rekombinanter zu nicht rekombinanten Klonen an. Von dieser Platte
werden Sie am zweiten Versuchstag von je einer blauen (ohne Insertion) und einer weißen
Kolonie (mit Insertion) eine Kultur ansetzen, aus der am 3. Versuchstag die Plasmid-DNA
isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert wird.
Durchführung der Transformation:
Die Gefäße mit den CaCl 2 -kompetenten Zellen (je 20 µl) werden beschriftet (Nr. 1 – 4;
Gruppennummer) und bei den Ansätzen 3 und 4 wird die oben angegebene DNA-Menge zugegeben.
Die Ansätze werden 15 min auf Eis inkubiert, anschließend genau 2 min in einen auf 42 °C warmen
Heizblock gestellt. Danach werden jeweils 500 µl dYT-Medium ohne Ampicillin zugegeben und
30 min bei 37 °C inkubiert (Wasserbad). In dieser Zeit regenerieren sich die Zellen und es wird das
Enzym gebildet, das für den Abbau von Ampicillin notwendig ist (Ausprägung der Ampicillinresistenz).
100 µl dieser Transformationsansätze werden jeweils auf einer dYT-Platte ausplattiert, welche die oben
für die einzelnen Versuchsteile jeweils angegebenen Zusätze enthält (Ampicillin, X-Gal).
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Weiterführung des Versuchs am 20.06.05 oder 21.06.05
Versuchsauswertung und Vorbereitung des Experiments „Isolierung und
Charakterisierung von DNA“
Werten Sie die Platten des ersten Versuchstages aus. Zählen Sie hierfür die Kolonien auf Ihren Platten
und unterscheiden Sie dabei zwischen weißen und blauen Kolonien.
1. Geben Sie für die Transformationsansätze 1 und 2 den Grund an, warum sie durchgeführt
wurden und werten Sie ihre Ergebnisse aus.
2. Erklären Sie auch für den 3. Transformationsansatz, warum er durchgeführt wurde, zählen
Sie die Kolonien und bestimmen Sie die Transformationseffizienz ihrer kompetenten Zellen.
Falls Sie sehr viele Kolonien auf Ihrer Platte haben (> ca. 200), zählen Sie nur einen
Teilbereich („Tortenstück“) der Platte aus und berücksichtigen dies bei Ihren Berechnungen.
3. Beim 4. Transformationsansatz (Plasmidgemisch) zählen Sie die blauen und weißen
Kolonien (evtl. nur bei einem Teilbereich der Platte) und bestimmen das Verhältnis
rekombinanter zu nicht rekombinanten Klonen.
Jede Gruppe überführt dann jeweils eine weiße und eine blaue Kolonie von der Platte mit dem
Plasmidgemisch mit einem sterilen Zahnstocher in 3 ml dYT-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml).
Diese Kulturen werden über Nacht bei 37 °C schüttelnd inkubiert und am nächsten Versuchstag für die
Isolierung der Plasmid-DNA eingesetzt.
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