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2. Methoden und Materialen 47 behandelt, jedoch erfolgte die Präinkubation mit 5% Esel-Normalserum in PB. Die Schnitte wurden simultan mit den primären monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 4 0 C inkubiert (siehe Tabelle 6) und dann in PB/BSA, PB, PB und PB/BSA gewaschen. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit dem entsprechenden Fluoreszein-5-Isothiocyanat (FITC)- konjugierten Antiserum gegen Ratten- oder Hasen-IgG (1:100 in PB/BSA) aus der Ziege für eine Stunde bei RT (siehe Tabelle 7). Nach erneutem Waschen in PB/BSA, PB, PB und PB wurden die Schnitte mit einem tertiären FITC-konjugierten Antiserum gegen Ziegen-IgG (1:100 in PB/BSA) aus dem Esel für 2 Stunden bei RT inkubiert und nochmals in PB/BSA, PB, PB und PB gewaschen. Schließlich wurden die Schnitte mit Vectashield eingedeckelt und bei 4 0 C in der Dunkelheit bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt. Die resultierenden digitalen Mikrographien mit einer Größe von 1024 x 1024 Pixel pro Bild wurden mit einem konfokalen Laser-Mikroskop (TCS 4D, Leica) unter Verwendung eines 40x, 63x oder 100x Objektives gemacht. Die Identifikation der sich grünlich darstellenden FITC-Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlängen von 488 nm. Die Rhodamin-Fluoreszenz stellte sich bei einer Anregungswellenlänge von 568 nm rot dar. Die Emissionsspektren der FITCund Rhodamin-Fluoreszenz wurden durch entsprechende Filter aufgetrennt und ihre Intensität von getrennten Fotodetektoren simultan gemessen (Lichtwerte 0-255). 2.2.3 Quantifizierung der Deramifikation der Mikroglia Die Mikroglia konnte anhand der αMβ2-Immunzytochemie identifiziert werden. Als ramifizierte Mikroglia wurden Zellen mit wenigstens zwei Fortsätzen gewertet, die wenigstens einen halben Zellkörper lang sein mussten, wobei mindestens ein Fortsatz länger war verglichen mit dem Durchmesser des Zellkörpers (Tanaka und Maeda, 1996; Kloss et al., 1997). Als nicht-ramifizierte Zellen wurden die Zellen gewertet, welche diese Kriterien nicht erfüllten. Für jede Kammer eines Objektträgers wurde die Zahl der nicht-ramifizierten Zellen in wenigstens vier zufällig gewählten Gesichtsfeldern mit insgesamt wenigstens 120 5C6- positven Zellen und einer Objektivvergrößerung von 20x ausgewertet. Das Verhältnis der
2. Methoden und Materialen 48 Zahl aller ramifizierten Mikrogliazellen zu den nicht-ramifizierten Mikrogliazellen wurde mit Mittelwert und Standardabweichung von jeweils drei identisch behandelten Zellkulturkammern bestimmt und graphisch aufgetragen.
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