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2. Methoden und Materialen 47
behandelt, jedoch erfolgte die Präinkubation mit 5% Esel-Normalserum in PB. Die Schnitte
wurden simultan mit den primären monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 4 0 C inkubiert
(siehe Tabelle 6) und dann in PB/BSA, PB, PB und PB/BSA gewaschen. Anschließend
erfolgte eine Inkubation mit dem entsprechenden Fluoreszein-5-Isothiocyanat (FITC)-
konjugierten Antiserum gegen Ratten- oder Hasen-IgG (1:100 in PB/BSA) aus der Ziege für
eine Stunde bei RT (siehe Tabelle 7). Nach erneutem Waschen in PB/BSA, PB, PB und PB
wurden die Schnitte mit einem tertiären FITC-konjugierten Antiserum gegen Ziegen-IgG
(1:100 in PB/BSA) aus dem Esel für 2 Stunden bei RT inkubiert und nochmals in PB/BSA,
PB, PB und PB gewaschen. Schließlich wurden die Schnitte mit Vectashield eingedeckelt
und bei 4 0 C in der Dunkelheit bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt. Die resultierenden
digitalen Mikrographien mit einer Größe von 1024 x 1024 Pixel pro Bild wurden mit einem
konfokalen Laser-Mikroskop (TCS 4D, Leica) unter Verwendung eines 40x, 63x oder 100x
Objektives gemacht. Die Identifikation der sich grünlich darstellenden FITC-Fluoreszenz
erfolgte bei einer Anregungswellenlängen von 488 nm. Die Rhodamin-Fluoreszenz stellte
sich bei einer Anregungswellenlänge von 568 nm rot dar. Die Emissionsspektren der FITCund
Rhodamin-Fluoreszenz wurden durch entsprechende Filter aufgetrennt und ihre
Intensität von getrennten Fotodetektoren simultan gemessen (Lichtwerte 0-255).
2.2.3 Quantifizierung der Deramifikation der Mikroglia
Die Mikroglia konnte anhand der αMβ2-Immunzytochemie identifiziert werden. Als
ramifizierte Mikroglia wurden Zellen mit wenigstens zwei Fortsätzen gewertet, die wenigstens
einen halben Zellkörper lang sein mussten, wobei mindestens ein Fortsatz länger war
verglichen mit dem Durchmesser des Zellkörpers (Tanaka und Maeda, 1996; Kloss et al.,
1997). Als nicht-ramifizierte Zellen wurden die Zellen gewertet, welche diese Kriterien nicht
erfüllten. Für jede Kammer eines Objektträgers wurde die Zahl der nicht-ramifizierten Zellen
in wenigstens vier zufällig gewählten Gesichtsfeldern mit insgesamt wenigstens 120 5C6-
positven Zellen und einer Objektivvergrößerung von 20x ausgewertet. Das Verhältnis der