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2. Methoden und Materialen 45
zeitgleich Gehirnmembrane in aufsteigender Dosis zugesetzt, um eine mögliche
gegenseitige Hemmung zu untersuchen.
2.2.1.6 Stimulation der Kokulturen mit pharmakologisch wirksamen Substanzen
An den Tagen 10 bis 12 wurden die Kokulturen für 48 Stunden mit Calcium-Ionophore
Calcimycine (A-23187/Sigma), Dibutyryl-cAMP (Sigma), Dibutyryl-cGMP (Sigma), Okadaic
Acid (Sigma), Pertussis toxin (Sigma), Prostaglandin D2 (Sigma), Forskolin (Sigma),
Fibronectin (Sigma), Thrombin (Sigma), Keratansufat (Sigma), Kistrin (Sigma), Echistatin
(Sigma), Flavoridin (Sigma), UTP (Sigma) oder den zyklischen Peptiden CRGDSPASSC/FR-
1,cyclic RG-DdFV, GRGDSP, GRADSP oder GRGDTP (alle von Calbiochem) mit einem
Volumen von 0.5 ml pro Zellkammer inkubiert. Diese Moleküle wurden auf ihre Fähigkeit
untersucht, als mögliche Vermittler in der Umwandlung von Mikroglia in Makrophagen zu
fungieren.
2.2.2 Immunzytochemie
2.2.2.1 Immunzytochemie mit Diaminobenzidin (DAB)
Zur immunhistochemischen Darstellung der spezifischen Antigene auf der Zelloberfläche der
Mikroglia wurde das Kulturmedium durch -20 0 C kaltes 50%-Methanol (in H 2 0 bidest.) ersetzt
und die Kulturen wurden für 30 Minuten bei 4 0 C fixiert und in Phosphat-Puffer (PB)
gewaschen. Währenddessen wurden die Kammeraufbauten von den Objektträgern der
verwendeten Vier-Kammer-Platten entfernt. Dann wurden die Zellen 5 Minuten durch
Fixation in 4% Paraformaldehyd (in PB gelöst) kovalent an den Objektträger gebunden und
für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur in 5% Ziegenserum inkubiert, um unspezifische
Bindungsstellen abzusättigen. Anschließend wurde das Serum abgenommen und den
Kulturen zur Detektion der αMß2-Integrine der primäre Antikörper 5C6 (Serotec, Wiesbaden,
Deutschland) aus der Ratte verdünnt in PB/BSA (PB mit 1 g/L BSA) zugesetzt. Die Kulturen
wurden über Nacht bei 4 0 C inkubiert, dann in PB/BSA, PB und PB gewaschen und