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2. Methoden und Materialen 44
Membranpräparation mittels BioRad-Proteinassay (Burlingame, CA) auf 2.5 mg/ ml
eingestellt. Zur Identifizierung der Zellen, welche die präparierten Zellmembrane
phagozytieren, wurden die jeweiligen Organpräparationen noch für weitere zwei Stunden mit
Rhodamine B Isothiocyanate (100 µg/ml) bei 4 0 C inkubiert und dann für mindestens 4x im
Wechsel eine Stunde bei 50,000 x g zentrifugiert und dann in PBS resuspendiert, bis der
Überstand keine rötliche Tönung mehr zeigte. Dieser Verarbeitungsprozess führt zur
Ausbildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und den
Zellmembranen. Schließlich wurden die mit Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Zellmembrane
mit den unkonjugierten Membranpräparationen in ein 1:1 Mischungsverhältnis gebracht und
über einen 5-µm Miliporefilter filtriert.
2.2.1.5 Stimulation der Kokulturen mit Zellmembranen
An den Tagen 10 bis 12 wurden die Kokulturen mit filtrierten Zellmembranen (siehe Kapitel
2.2.3) aus dem Gehirn in einer Konzentration von 0.7-300 µg /ml für eine Dauer zwischen 1
bis 72 Stunden inkubiert. Dies erfolgte zur Bestimmung der Dosis-Wirkungsbeziehung
hinsichtlich der deramifizierenden Wirkung der Gehirnmembrane auf die Mikroglia. Zur
Kontrolle erhielten parallele Kulturen nur Kulturmedium.
In den Versuchen zur Reramifikation der Mikroglia wurde diese zunächst mit 20 µg/ml
Gehirnmembrane für 48 Stunden inkubiert, dann erfolgte ein zweimaliger Mediumwechsel
(DMEM/FCS) für jeweils 5 Minuten und eine nochmalige Inkubatiosdauer der Kokulturen
zwischen 1 bis 96 Stunden in diesem Medium.
In einem weiteren Versuch wurde die deramifizierende Wirkung von nicht-biologischen
Stimuli untersucht. Hierfür wurden die Kulturen mit Fluorobeads (FluoroB), bei welchen es
sich um 1 µm große Latexkügelchen handelt, bis hin zu einer maximalen Dosis von 10 6 x 10 6
pro Zellkulturkammer inkubiert. Einen Teil der mit FluoroB inkubierten Kokulturen wurde