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2. Methoden und Materialen 43
Penizillin, 100 ug/ml Streptomyzin) gebracht und durch mehrfaches Aufziehen mit einer
Pasteurpipette homogenisiert. Die Zellsuspension wurde in einer 25 cm 3 unbeschichteten
NUNC Kulturflasche in Kulturmedium (DMEM, 15-% FCS, 100 IU/ml Penizillin, 100 µg/ml
Streptomyzin) bei 37 0 C in einem Gasgemisch aus Raumluft und 5-% C0 2 für 14 Tage
inkubiert. Ein Mediumwechsel fand an den Tagen 7 und 12 statt.
Anschließend konnte die Mikroglia nach zweistündigem Schütteln auf dem Rotator bei 200
rpm als Überstand abgeerntet werden. Die Zahl der Mikroglia wurde in einer
Neubauer-Zählkammer bestimmt. Schließlich wurden die Mikrogliazellen auf den konfluenten
Astrozytenrasen ausgesät und für weitere 10 bis14 Tage kultiviert.
2.2.1.3 Ramifizierte Mikroglia in Kokultur
Ein konfluenter Astrozytenrasen wurde, wie unter 2.2.1.1 beschrieben angelegt, und hierauf
wurde ramifizierte Mikroglia nach einer leicht modifizierten Methode von Sievers kultiviert
(Sievers et al., 1994). Hierfür wurden Mikrogliazellen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro
Zellkammer ausgesät. Die Kokulturen wurden 10 Tage lang in Kulturmedium (DMEM, 15%
FCS, 100 IU/ml Penizillin, 100 µg/ml Streptomyzin) bei 37 0 C in einem Gasgemisch aus
Raumluft und 5-%-C0 2 inkubiert und für 14 Tage kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle 2
Tage gewechselt.
2.2.1.4 Präparation der Zellmembranen
Für die Zellmembranpräparation von Gehirn, Niere, Leber, Milz und Skelettmuskel aus der
Maus wurden die entsprechenden Organe von insgesamt zehn erwachsenen FVB Mäusen
mit Hilfe eines Mörsers im Reagenzglas mit dem 10-fachen Volumen eines hypotonischen
Phosphatpuffers (10mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) homogenisiert. Anschließend konnte das
Zelldebris nach zweimaligem Abzentrifugieren für jeweils 10 Minuten bei 600 x g verworfen
werden, und der Überstand erneut für zwei Stunden bei 50,000 x g zentrifugiert und dann in
4 ml PBS resuspendiert werden. Schließlich wurde die Proteinkonzentration der jeweiligen