Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
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2. Metho<strong>de</strong>n und Materialen 43<br />
Penizillin, 100 ug/ml Streptomyzin) gebracht und durch mehrfaches Aufziehen mit einer<br />
Pasteurpipette homogenisiert. Die Zellsuspension wur<strong>de</strong> in einer 25 cm 3 unbeschichteten<br />
NUNC Kul<strong>tu</strong>rflasche in Kul<strong>tu</strong>rmedium (DMEM, 15-% FCS, 100 IU/ml Penizillin, 100 µg/ml<br />
Streptomyzin) bei 37 0 C in einem Gasgemisch aus Raumluft und 5-% C0 2 für 14 Tage<br />
inkubiert. Ein Mediumwechsel fand an <strong>de</strong>n Tagen 7 und 12 statt.<br />
Anschließend konnte die Mikroglia nach zweistündigem Schütteln auf <strong>de</strong>m Rotator bei 200<br />
rpm als Überstand abgeerntet wer<strong>de</strong>n. Die Zahl <strong>de</strong>r Mikroglia wur<strong>de</strong> in einer<br />
Neubauer-Zählkammer bestimmt. Schließlich wur<strong>de</strong>n die Mikrogliazellen auf <strong>de</strong>n konfluenten<br />
Astrozytenrasen ausgesät und für weitere 10 bis14 Tage kultiviert.<br />
2.2.1.3 Ramifizierte Mikroglia in Kokul<strong>tu</strong>r<br />
Ein konfluenter Astrozytenrasen wur<strong>de</strong>, wie unter 2.2.1.1 beschrieben angelegt, und hierauf<br />
wur<strong>de</strong> ramifizierte Mikroglia nach einer leicht modifizierten Metho<strong>de</strong> von Sievers kultiviert<br />
(Sievers et al., 1994). Hierfür wur<strong>de</strong>n Mikrogliazellen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro<br />
Zellkammer ausgesät. Die Kokul<strong>tu</strong>ren wur<strong>de</strong>n 10 Tage lang in Kul<strong>tu</strong>rmedium (DMEM, 15%<br />
FCS, 100 IU/ml Penizillin, 100 µg/ml Streptomyzin) bei 37 0 C in einem Gasgemisch aus<br />
Raumluft und 5-%-C0 2 inkubiert und für 14 Tage kultiviert. Das Kul<strong>tu</strong>rmedium wur<strong>de</strong> alle 2<br />
Tage gewechselt.<br />
2.2.1.4 Präparation <strong>de</strong>r Zellmembranen<br />
Für die Zellmembranpräparation von Gehirn, Niere, Leber, Milz und Skelettmuskel aus <strong>de</strong>r<br />
Maus wur<strong>de</strong>n die entsprechen<strong>de</strong>n Organe von insgesamt zehn erwachsenen FVB Mäusen<br />
mit Hilfe eines Mörsers im Reagenzglas mit <strong>de</strong>m 10-fachen Volumen eines hypotonischen<br />
Phosphatpuffers (10mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) homogenisiert. Anschließend konnte das<br />
Zell<strong>de</strong>bris nach zweimaligem Abzentrifugieren für jeweils 10 Minuten bei 600 x g verworfen<br />
wer<strong>de</strong>n, und <strong>de</strong>r Überstand erneut für zwei S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong>n bei 50,000 x g zentrifugiert und dann in<br />
4 ml PBS resuspendiert wer<strong>de</strong>n. Schließlich wur<strong>de</strong> die Proteinkonzentration <strong>de</strong>r jeweiligen