Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
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2. Metho<strong>de</strong>n und Materialen 42<br />
µg/ml Streptomyzin zur Infektionsprophylaxe <strong>de</strong>r Zellkul<strong>tu</strong>ren zugesetzt wur<strong>de</strong>. Anschließend<br />
wur<strong>de</strong>n die Gehirne durch mehrfaches Aufziehen in einer Pasteurpipette homogenisiert.<br />
Diese Zellsuspension wur<strong>de</strong> in einer 75 cm 3<br />
unbeschichteten NUNC (Naperville, IL)<br />
Kul<strong>tu</strong>rflasche mit Kul<strong>tu</strong>rmedium (DMEM, 15-% FCS, 100 IU/ml Penizillin und 100 µg/ml<br />
Streptomyzin) bei 37 0 C in einem Gasgemisch aus Raumluft und 5-% C0 2 für 14 Tage in<br />
einem Inkubator kultiviert. Alle 2 Tage erfolgte ein Medienwechsel.<br />
Nach 14 Tagen hatten die Astrozyten einen konfluenten Zellrasen gebil<strong>de</strong>t. Die noch<br />
vereinzelt auf <strong>de</strong>m Zellrasen vorhan<strong>de</strong>nen Mikrogliazellen, Oligo<strong>de</strong>ndrozyten und Neurone<br />
wur<strong>de</strong>n durch mehrfaches Waschen in DMEM und kräftiges Schütteln entfernt. Die so<br />
gereinigten Astrozyten wur<strong>de</strong>n mit Trypsin (0,25-prozentig in PBS) abgelöst, in einer<br />
Neubauer-Kammer gezählt und auf eine Vier-Kammer-Platte (NUNC) mit einer<br />
Einzelkammergröße von 2,2 x 1,1 cm in einer Dichte von 85,000 Astrozyten/Kammer<br />
ausgesät. Die Zellen wur<strong>de</strong>n in Kul<strong>tu</strong>rmedium bei 5-% C0 2 gehalten und alle 2 Tage erfolgte<br />
ein Mediumwechsel. Nach 4 Tagen waren die Astrozyten zu einem konfluenten Zellrasen<br />
zusammengewachsen und stan<strong>de</strong>n für Kokul<strong>tu</strong>ren mit Mikrogliazellen bereit. Die Reinheit<br />
<strong>de</strong>r Astrozytenkul<strong>tu</strong>ren wur<strong>de</strong> immunzytochemisch bestimmt, in<strong>de</strong>m möglicherweise<br />
kontaminieren<strong>de</strong> Oligo<strong>de</strong>ndrozyten und Mikroglia aus <strong>de</strong>r Ratte sichtbar gemacht wur<strong>de</strong>n.<br />
Zum Nachweis von Ratten-Mikroglia wur<strong>de</strong> <strong>de</strong>r 0X42-Antikörper (Serotec, Wiesba<strong>de</strong>n) aus<br />
<strong>de</strong>r Maus in einer Verdünnung von 1: 1000 benutzt. Zur Darstellung <strong>de</strong>r Oligo<strong>de</strong>ndrozyten<br />
wur<strong>de</strong> ein Antikörper gegen Galaktozerebrosi<strong>de</strong> (GalC, 1:100) (Sigma, Deisenhofen) aus<br />
<strong>de</strong>m Kaninchen verwen<strong>de</strong>t. Es fan<strong>de</strong>n sich in <strong>de</strong>n Astrozytenkul<strong>tu</strong>ren aus <strong>de</strong>r Ratte<br />
regelmäßig weniger als 3% Mikroglia und weniger als 1,5% Oligo<strong>de</strong>ndrozyten.<br />
2.2.1.2 Primäre Mikrogliakul<strong>tu</strong>r aus <strong>de</strong>r Maus<br />
Für die Kultivierung <strong>de</strong>r Mikroglia wur<strong>de</strong> die Metho<strong>de</strong> von Giulian und Baker (Giulian und<br />
Baker, 1986) in leicht modifizierter Form verwen<strong>de</strong>t. Neugeborene FVB-Mäuse wur<strong>de</strong>n<br />
<strong>de</strong>kaptiert, das gesamte Gehirn entnommen, in Kul<strong>tu</strong>rmedium (DMEM, 15-% FCS, 100 IU/ml