Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de

2. Methoden und Materialen 38
Glutaraldehyd (in Mg-PBS) transkardial perfundiert und entsprechend der oben
beschriebenen Schritte weiterverarbeitet.
2.5.1.2 Immunhistochemie für die Elektronenmikroskopie
Die immunhistochemischen Färbungen erfolgten ähnlich wie in der Lichtmikroskopie (siehe
2.1.4.2), jedoch mit einigen Unterschieden. Die Vorbehandlung mit Azeton entfiel. Die
Schnitte wurden dann für 4 Stunden bei Raumtemperatur in 5-% Ziegenserum (in PB)
vorinkubiert, um unspezifische Bindungsstellen im Schnitt abzusättigen, und anschließend
mit einem primären, monoklonalen Antikörper gegen ICAM1 aus der Ratte (Verdünnung
1:1.000 in PB/BSA) über Nacht bei 4 0 C inkubiert. Die Schnitte wurden nicht an einen
Objektträger fixiert, sondern schwammen frei in den Lösungen. Die Lagerung erfolgte auf
einem Schütteltisch bei minimaler Umdrehungszahl. Der primäre Antikörper wurde dann in
PB/BSA, PB, PB und PB/BSA ausgewaschen und das sekundäre, biotinilierte Ziegenserum
gegen Ratten-IgG (Vector) für 8 Stunden bei 4 0 C zugesetzt. Nach erneutem Waschen der
Schnitte in PB/BSA, PB/BSA, PB und PB wurden die Schnitte über Nacht mit ABC-Reagenz
bei 4 0 C inkubiert. Bei Verwendung des Peroxidasesystems mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB),
H 2 0 2 , CoCl 2 und NiS0 4 als Substrate wurde zunächst mit DAB für 20 Minuten bei
Raumtemperatur ohne H 2 0 2 präinkubiert, anschließend wurde die Peroxidasereaktion in DAB
mit 0,25 g/l CoC1 2 , 0,2 g/l NiS0 4 und H 2 0 2 (1:3000 verdünnt) gestartet und schließlich nach
15 Minuten in Aqua dest. wieder gestoppt. Für weitere 7 Tage wurde das Gewebe bei 4 0 C in
2-% Paraformaldehyd und 3.0% Glutaraldehyd (in Mg-PBS) nachfixiert, dann in
Dalton-Lösung 1 (1.1 g K 2 Cr 2 0 4 , 0.9 g NaCI und 1 g O s 0 4 in 100 ml Aqua dest., mit 1N KOH
auf pH 7 eingestellt) osmiert, in einer Alkoholreihe dehydriert und in Araldit (Fluka)
eingebettet. Semidünnschnitte (80 µm) wurden zur lichtmikroskopischen Orientierung mit
Toluidin-Blau-Lösung für 4 Minuten gegengefärbt. Des weiteren wurden der axotomierte
sowie der kontralaterale Ncl. facialis aus dem umliegenden Gewebe herausgeschnitten, in
Agarose eingebettet und mit einem Vibratom in ultradünne 100 nm dicke Präparate