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2. Methoden und Materialen 35 (OLV) der Pixel, die den Ncl. facialis repräsentieren, berechnet. Die zu markierenden zellulären Cy3-Profile wurden anhand eines Schwellenwertes von MEAN + SD bestimmt. Diese Profil-Maske wurde auf das korrigierte und ebenfalls geglättete FITC-Bild übertragen und hier der Mittelwert der OLV aller Pixel im Ncl. facialis (MEAN-Ncl. facialis) und der Mittelwert von den Pixeln innerhalb der Maske (MEAN-zelluläre Maske) berechnet. Daraus ergab sich der relative Färbekoeffizienten (RISC), der sich wie folgt berechnet: RISC = log (MEAN-zelluläre Maske : MEAN-Nucleus facialis) Anschließend wurde die Differenz der relativen Färbekoeffizienten zwischen der jeweils operierten Seite (RISC-Operiert) und der kontralateralen, gesunden Seite als endogene Kontrolle (RISC-Kontrolle) bestimmt. Diese ist ein Maß für die Veränderung der Immunreaktivität des jeweilig getesteten spezifischen Aktivierungsmarkers nach Fazialisaxotomie. DIFF-RISC = (RISC-Operiert) – (RISC-Kontrolle) Die statistische Auswertung der zellulären Immunreaktivität der spezifischen Aktivierungsmarker erfolgte an vier definierten Zeitpunkten nach Fazialisaxotomie (Tage 1, 3, 4, 14). Die relativen Färbekoeffizienten (RISC) der operierten und der kontralateralen Ncl. faciales wurden bei 5 Schnitten von jeweils 3 bis 8 Tieren pro Gruppe nach dem RISC Algorithmus bestimmt, wobei die jeweiligen Berechnungsschritte der Koeffizienten teilautomatisiert durch Programmierung in OPTIMAS und EXCEL erfolgten. Dann wurden die Mittelwerte der Färbeintensitäten getrennt für die operierten und die kontralateralen Seiten errechnet, graphisch aufgetragen und mit einem gepaarten t-Test bei einem Signifikanzniveau von 5% auf statistisch signifikante Unterschiede getestet.
2. Methoden und Materialen 36 2.1.4.5 Autofluoreszenzextraktion im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Die Anregung der Fluoreszenz im konfokalen Laser-Mikroskop führt in fixiertem Gewebe und hier besonders in phagozytischen Mikrogliazellen und Lipofuszinkörpern der Neurone (Raivich et al., 1998a) auch zur Emission von unspezifischer Fluoreszenz oder Autofluoreszenz. Diese hat ein sehr breitbandiges Spektrum, so das sie sich zu der spezifischen FITC- und Cy3-Fluoreszenz hinzuaddiert. Die Korrektur der Autofluoreszenz erfolgte entsprechend der Anwendung der linearen Extraktion (Raivich et al., 1998a). Hierbei wurde zur Detektion der autofluoreszenten Strukturen das Präparat mit einer Wellenlänge von 647 nm (Cy5) angeregt, einem Bereich, in welchem die hier verwendeten Farbstoffe FITC und Cy3 nicht mehr emittieren und in dem autofluoreszierende Strukturen gut angeregt werden. Diese Strukturen wurden mit den korrespondierenden Stellen im FITC- und Cy3-Bild in Bezug gesetzt, woraus sich lineare Extraktionskoeffizienten berechneten. Zur Korrektur der Autofluoreszenz wurden unter Berücksichtigung der jeweiligen Extraktionskoeffizienten die optischen Lichtwerte (OLV) der jeweils korrespondierenden Pixel im FITC- und Cy3-Bild abgezogen. Die einzelnen Rechenschritte sollen im folgenden dargestellt werden. Zunächst wurden die TIFF-Bilder mit der FITC-, Cy3- und der Autofluoreszenz (AF) in Optimas importiert und der Mittelwert (MEAN AF ) und die Standardabweichung (SD AF ) aller Pixel eines AF-Bildes (OM AF ) bestimmt. Nun wurden hochautofluoreszente Strukturen (HAFS) im OPTIMAS-Programm durch einen OLV-Schwellenwert aus MEAN AF + (SD AF x 2) markiert. Der Mittelwert der OLV innerhalb dieser markierten Strukturen wurde als MEAN AF- HAFS berechnet. Die markierten Profile der fluoreszenten Strukturen wurden als Maske in das FITC- und Cy3-Bild (OM FITC , OM Cy3 ) übertragen, wobei ihre Position dort den hochautofluoreszenten Strukturen im AF-Bild entsprach. Innerhalb dieser Profile wurde nun der OLV-Mittelwert getrennt für das FITC-Bild (MEAN FITC-HAFS ) und das Cy3-Bild (MEAN Cy3- HAFS) berechnet. Anschließend wurde der Mittelwert aller OLV für FITC (MEAN FITC ) und Cy3 (MEAN Cy3 ) berechnet. Die linearen Extraktionskoeffizienten für FITC (LEK FITC ) und Cy3 (LEK Cy3) berechneten sich dann wie folgt:
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10. Veröffentlichungen 142 10. Ver
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