Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
2. Metho<strong>de</strong>n und Materialen 33<br />
wur<strong>de</strong>n die Schnitte erneut mit 5-% Eselserum zur Absättigung unspezifischer<br />
Bindungsstellen für 30 Minuten bei Raumtempera<strong>tu</strong>r (RT) präinkubiert und mit <strong>de</strong>m<br />
entsprechen<strong>de</strong>n primären Antikörper über Nacht bei 4 0 C inkubiert. Anschließend wur<strong>de</strong>n die<br />
Schnitte mit einem sekundären FITC-konjugierten Antikörper gegen Ratten-IgG (1:100 in<br />
PB/BSA) aus <strong>de</strong>r Ziege (siehe Tabelle 7, Seite 50) für eine S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong> bei RT inkubiert und<br />
dann in PB/BSA, PB, PB und PB gewaschen. Schließlich wur<strong>de</strong>n die Schnitte mit einem<br />
tertiären FITC-konjugierten Antiserum gegen Ziegen-IgG (1:100 in PB/BSA) aus <strong>de</strong>m Esel in<br />
Kombination mit Cy3-Avidin (1:1000 in PB/BSA) für 2 S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong>n bei RT inkubiert. Nach <strong>de</strong>m<br />
Waschen in PB/BSA, PB, PB und PB wur<strong>de</strong>n die Schnitte mit Vectashield einge<strong>de</strong>ckelt und<br />
bei 4 0 C in <strong>de</strong>r Dunkelheit bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt.<br />
2.1.4.3 Digitalisierung <strong>de</strong>r Fluoreszenz im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop<br />
Die weitere Darstellung und Verarbei<strong>tu</strong>ng <strong>de</strong>r Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen<br />
erfolgte mit einem konfokalen Laser-Mikroskop (TCS 4D, Leica). Zur I<strong>de</strong>ntifikation <strong>de</strong>r sich<br />
grünlich darstellen<strong>de</strong>n FITC-Fluoreszenz wur<strong>de</strong> eine Anregungswellenlängen von 488 nm<br />
verwen<strong>de</strong>t. Die Cy3-Fluoreszenz stellte sich bei einer Anregungswellenlänge von 568 nm rot<br />
dar. Die verschie<strong>de</strong>nen Emissionsspektren <strong>de</strong>r FITC- und Cy3-Fluoreszenz wur<strong>de</strong>n durch<br />
entsprechen<strong>de</strong> Filter aufgetrennt und ihre Intensität von getrennten Foto<strong>de</strong>tektoren simultan<br />
gemessen (Lichtwerte 0-255). Die resultieren<strong>de</strong>n Mikrographien hatten eine Größe von 1024<br />
x 1024 Pixel pro Bild. Für quantitative Untersuchungen wur<strong>de</strong> ein 10x-Objektiv bei konstanter<br />
Laserspannung benutzt, wobei hier eine Fläche von 1 mm x 1 mm erfasst wur<strong>de</strong>. Für höher<br />
auflösen<strong>de</strong> Darstellungen wur<strong>de</strong> ein 20x-, 40x- o<strong>de</strong>r 100x-Objektiv gewählt. Es wur<strong>de</strong>n<br />
gleichmäßig 11 aufeinan<strong>de</strong>rfolgen<strong>de</strong> Bil<strong>de</strong>r über eine Gesamtdicke von 30 µm aufgenommen<br />
und mit <strong>de</strong>m Max-Intens-Algorithmus zu einem Bild kon<strong>de</strong>nsiert. Dieser Algorithmus wählt<br />
aus je<strong>de</strong>m <strong>de</strong>r 11 korrespondieren<strong>de</strong>n Pixel, mit <strong>de</strong>n jeweils gleichen x-y Koordinaten<br />
(insgesamt 1024x1024 Pixel per Bite), <strong>de</strong>n hellsten (mit <strong>de</strong>m höchsten OLVV) aller 11<br />
Schnittebenen aus und setzt sie zu einem neuen kon<strong>de</strong>nsierten Bild wie<strong>de</strong>r zusammen. Ein