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2. Methoden und Materialen 30
daran konjugierte Biotin im anschließenden ABC/DAB-Verfahren detektiert und gefärbt
(Adams et al., 1992). Der Nachweis von Makrophagen erfolgte mit dem gegen das αMβ2-
Antigen gerichteten Antikörper. Die Anzahl beider Zelltypen wurde für jeweils fünf
Schnittpräparate des jeweiligen Nervs sowohl an der Läsionsstelle als auch zwei und vier
mm distal hiervon bestimmt.
2.1.4 Fluoreszenzimmunhistochemie
Die Untersuchung der zellulären Lokalisation von zellspezifischen Antigenen auf Neurone,
Astrozyten, Oligidendroglia, Mikroglia, Endothelien oder Leukozyten durch fluoreszierende
Antikörper bietet gegenüber der konventionellen DAB-Immunhistochemie eine Reihe
wichtiger Vorteile. Die simultane Markierung mehrerer Antigene durch verschiedene
Fluoreszenzfarbstoffe ermöglicht die zweifelsfreie Zuordnung von verschiedenen Zellen,
selbst wenn sich Ihre Morphologie entsprechend des Aktivierungszustandes
lichtmikroskopisch ähnelt. Als zelltypspezifische Marker dienten in dieser Arbeit GFAP zur
Markierung der Astrozyten, ionisiertes Ca-bindendes Adapterprotein 1 (IBA 1) und
intrinsisches Maus-Immunglobulin (IgG) als Mikrogliamarker, und Galanin oder CGRP als
Marker für axotomierte Motoneurone (Raivich et al., 1995; Klein et al., 1997). Des weiteren
ermöglichen Doppelmarkierungen eine besonders hohe Aufnahmeempfindlichkeit im
konfokalen Lasermikroskop. Darüber hinaus lässt sich die Menge eines Antigens selektiv mit
Hilfe der bestimmten Zelltypmasken semiquantitativ abschätzen.
2.1.4.1 lmmunfluoreszenz-Doppelmarkierungen
Für immunhistochemische Doppelmarkierungen wurden die fixierten, 20 µm-dicken Schnitte
zunächst wie unter 2.1.3.2 beschrieben behandelt, jedoch erfolgte die Präinkubation mit 5%
Esel-Normalserum in PB. Die Schnitte wurden simultan mit primären monoklonalen und
polyklonalen Antikörpern, die aus unterschiedlichen Tieren stammten, über Nacht bei 4 0 C