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2. Methoden und Materialen 29 (SD) als Maß für die Färbung. Die Differenz von MEAN-SD wird von dem maximalen OLW- Wert (255) subtrahiert und als Farbintensität (Fi) bezeichnet. Folgende Formel beschreibt diesen Zusammenhang: Farbintensität (Fi) = 255 – (Mittelwert (MEAN) – Standardabweichung (SD)) 2.1.3.4 Messung der Regenerationsrate im Nervus facialis Die lichtmikroskopische Analyse der peripheren Regenerationsrate im N. facialis erfolgte an den osteopetrotischen Mäusen 96 Stunden nach Fazialisaxotomie. Nachdem die fixierten Nerven herauspräpariert (siehe Kap. 2.1.4.1) und mit einem Durchmesser von 10 µm geschnitten worden waren, wurde jeder fünfte Schnitt mit einem entsprechenden Abstand von 50 µm gegen die Neuropeptide Galanin und CGRP gefärbt, welche axonal in den Wachstumskegeln transportiert werden. Die Distanz zwischen dem am weitesten distal von der Läsionsseite gelegenen Wachstumskegel und der morphologisch bestimmten Läsionsstelle wurde im Lichtmikroskop (Zeiss Axiophot) bestimmt. Schließlich wurde für jedes Tier der Mittelwert der axonalen Regenerationsgeschwindigkeit aus 4 bis 5 Nervenschnitten festgestellt. 2.1.3.5 Anfärbung von Granulozyten und Makrophagen im N. facialis Zur Beurteilung der Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten bei Verletzungen des peripheren Nervensystems wurden neutrophile Granulozyten und Makrophagen im Bereich der Läsionsstelle nach Fazialisaxotomie untersucht. Zum Nachweis der infiltrierenden Granulozyten diente der Nachweis der Aktivität der endogenen Peroxidase (EP) in den Granulozyten. Die mit 4% Paraformaldehyd fixierten Schnitte wurden hierfür mit biotiniliertem Tyramin (3% in PB) und 0,01% H 2 0 2 für 10 Minuten inkubiert. Das durch die Peroxidase oxidierte Tyramin bindet kovalent an das Schnittgewebe und wird durch das
2. Methoden und Materialen 30 daran konjugierte Biotin im anschließenden ABC/DAB-Verfahren detektiert und gefärbt (Adams et al., 1992). Der Nachweis von Makrophagen erfolgte mit dem gegen das αMβ2- Antigen gerichteten Antikörper. Die Anzahl beider Zelltypen wurde für jeweils fünf Schnittpräparate des jeweiligen Nervs sowohl an der Läsionsstelle als auch zwei und vier mm distal hiervon bestimmt. 2.1.4 Fluoreszenzimmunhistochemie Die Untersuchung der zellulären Lokalisation von zellspezifischen Antigenen auf Neurone, Astrozyten, Oligidendroglia, Mikroglia, Endothelien oder Leukozyten durch fluoreszierende Antikörper bietet gegenüber der konventionellen DAB-Immunhistochemie eine Reihe wichtiger Vorteile. Die simultane Markierung mehrerer Antigene durch verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe ermöglicht die zweifelsfreie Zuordnung von verschiedenen Zellen, selbst wenn sich Ihre Morphologie entsprechend des Aktivierungszustandes lichtmikroskopisch ähnelt. Als zelltypspezifische Marker dienten in dieser Arbeit GFAP zur Markierung der Astrozyten, ionisiertes Ca-bindendes Adapterprotein 1 (IBA 1) und intrinsisches Maus-Immunglobulin (IgG) als Mikrogliamarker, und Galanin oder CGRP als Marker für axotomierte Motoneurone (Raivich et al., 1995; Klein et al., 1997). Des weiteren ermöglichen Doppelmarkierungen eine besonders hohe Aufnahmeempfindlichkeit im konfokalen Lasermikroskop. Darüber hinaus lässt sich die Menge eines Antigens selektiv mit Hilfe der bestimmten Zelltypmasken semiquantitativ abschätzen. 2.1.4.1 lmmunfluoreszenz-Doppelmarkierungen Für immunhistochemische Doppelmarkierungen wurden die fixierten, 20 µm-dicken Schnitte zunächst wie unter 2.1.3.2 beschrieben behandelt, jedoch erfolgte die Präinkubation mit 5% Esel-Normalserum in PB. Die Schnitte wurden simultan mit primären monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die aus unterschiedlichen Tieren stammten, über Nacht bei 4 0 C
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