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2. Methoden und Materialen 27 Aceton/H 2 0 entfettet und jeweils für zwei Minuten in PB, in PB/0.1-%-Rinder-Serum-Albumin (PB/BSA) und nochmals in PB gewaschen. Zur Absättigung von unspezifischen Bindungsstellen im Gewebe wurden die Präparate für 30 Minuten mit 5% Ziegenserum/PB (Vector, Wiesbaden, Deutschland) inkubiert und mit dem in PB/BSA optimal verdünnten primären Antikörper (Kapitel 2.3, Seite 47) über Nacht bei 4°C inkubiert und im Anschluss daran einmal in PB/BSA, zweimal in PB und wieder in PB/BSA gewaschen. Um unspezifische Bindungsstellen der Antikörper gegen Maus-Immunglobuline zu blockieren, wurden die entsprechenden sekundären Antikörper (Kapitel 2.3, Seite 48) zunächst unverdünnt mit der doppelten Menge Maus-Normalserum für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die präinkubierten sekundären Antikörper in PB/BSA mit Ziegenserum 1:100 verdünnt und für eine Stunde auf den Schnitten bei RT inkubiert, dann zweimal in PB/BSA und zweimal in PB gewaschen, um anschließend das gesuchte Antigen mit dem Avidin-Biotin-Peroxidasesystem sichtbar zu machen. Hierbei wird an den biotinilierten sekundären Antikörper über eine Avidin-Biotin-Avidin Brücke eine biotinilierte Peroxidase gebunden, welche das zugefügtes 3.3´-Diaminobenzidin (DAB) unter Reduktion von H 2 O 2 oxidiert. Das oxidierte DAB polymerisiert und bildet einen unlöslichen bräunlichen Niederschlag (Graham und Karnovsky, 1965; Sternberger, 1986). Für die ABC-DAB- Reaktion wurden die Schnitte für eine Stunde mit ABC-Reagenz (Vector, Lösung A 1:125 und Lösung B 1:125 in PB, 30 Minuten vor Gebrauch angesetzt) bei RT inkubiert, wieder in PB und PBS gewaschen, und schließlich wurde die enzymatische Reaktion durch Zusatz von Diaminobenzidin (0.5 mg/ml; filtriert) mit H 2 O 2 (1:3000) gestartet und nach 5 Minuten in Aqua dest. abgestoppt. Zur Intensivierung der Färbung von CD3 wurden dem Reaktionsgemisch 0,25 g/l CoCl 2 und 0,2 g/l NiS0 4 zugesetzt. Dabei kommt es zu einem Einbau dieser Cobalt und Nickel-Ionen in die Chromophoren des polymerisierten DAB mit blau-schwarzer Tönung der Niederschlagsfarbe des entsprechenden Produkts (Hsu und Soban, 1982). Anschließend wurden die Schnitte in einer Alkoholreihe (jeweils 1 Minute in
2. Methoden und Materialen 28 Ethanol 70%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100%; Isopropanol 100%, 100%; Xylol 100%, 100%) dehydriert und in DEPEX (BDH, Poole, England) eingebettet. Zur weiteren Darstellung wurden die gefärbten Schnitte an einem Zeiss Axiophot Mikroskop mit einem Leica SilverFast 4.1 Scanner (Leica, Stuttgart, Deutschland) digital aufgenommen und in dem Bildanalyse-Programm OPTIMAS 6.2 (Bothell, WA) weiter verarbeitet. 2.1.3.3 Quantifizierung lichtmikroskopischer Immunhistochemie Zur Quantifizierung der Gesamtimmunreaktivität wurden die DAB-Färbungen in einem Zeiss Axiophot Mikroskop (2.5x-Objektiv) bei konstanter Beleuchtungsspannung mit einer Sony 89B CCD Kamera (Model CX-77CC) aufgenommen. Diese Kamera liefert eine Auflösung von 640 x 400 Bildpunkten, wobei jeder Bildpunkt (Pixel) einen optischen Lichtwerte (OLW) von 0-255 erhielt. Das digitalisierte Bild wurde in das Bildverarbeitungsprogramm OPTIMAS 6.2 importiert und der Ncl. facialis für jeden Schnitt als Auswertungsgebiet (region of interest, ROI) markiert, in dem für die Gesamtheit der Pixel des ROI der Mittelwert (MEAN) und die Standardabweichung (SD) der OLW ermittelt wurde. Als Maß für die Stärke der Färbung wurde die Färbeintensität (Fi) mit dem MEAN-SD-Algorithmus berechnet. Dieser Algorithmus bildet eine Differenz aus Absorption (MEAN) und Standardabweichung (SD) der OLW im ROI und zudem von leerem Objektträgerglas. Dieser Algorithmus liefert besonders zuverlässige Ergebnisse für die Quantifizierung von Immunhistochemien (Möller et al., 1996). Eine OLW von 0 bedeutet minimale Lichtintensität mit maximaler Färbung und eine OLW von 255 maximale Lichtintensität mit minimaler Färbung des Schnittpräparates. Ein gleichmäßiger Anstieg der Stärke der Färbung macht sich in einem gleichmäßigen Abfall der mittleren OLW bemerkbar. Wenn nur wenige Pixel einen deutlichen Färbeanstieg zeigen, so sinkt zwar der Mittelwert aufgrund der geringen Anzahl der beteiligten Pixel nur minimal ab, aber der starke Färbeanstieg bewirkt einen deutlichen Anstieg der Standardabweichung der OLW. Da sich also Mittelwert und Standardabweichung bei ansteigender Färbung gegenläufig verhalten, dient der Mittelwert (MEAN) der OLW minus Standardabweichung
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