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2. Metho<strong>de</strong>n und Materialen 26<br />
getötet. Unmittelbar nach Eintritt <strong>de</strong>s To<strong>de</strong>s wur<strong>de</strong> <strong>de</strong>r Herzbeutel eröffnet, die linke<br />
Herzkammer kanüliert und das rechte Herzohr für <strong>de</strong>n Austritt <strong>de</strong>r Perfusionslösung<br />
aufgeschnitten. Die Tiere wur<strong>de</strong>n zunächst mit 200 ml isotoner Phosphat-gepufferter<br />
Kochsalzlösung (PBS) transkardial mit einer peristaltischen Pumpe perfundiert (40ml/min).<br />
Daraufhin wur<strong>de</strong>n die Tiere zur weiteren Fixierung mit 200 ml 4-% Paraformal<strong>de</strong>hyd (in PBS)<br />
perfundiert, das Gewebe herauspräpariert (Hirnstamm, Milz, Abdominalorgane) und in 1 %<br />
Paraformal<strong>de</strong>hyd bei 4°C auf einem Rotator für zwei S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong>n nachfixiert. Zur Fixierung <strong>de</strong>s<br />
N. facialis wur<strong>de</strong>n die Versuchstiere im Anschluss an die Spülung mit 200 ml 4%<br />
Paraformal<strong>de</strong>yhd für weitere 60 min mit 1 % Paraformal<strong>de</strong>hyd perfundiert, <strong>de</strong>r periphere<br />
Nerv auf einer Länge von 15 bis 20 mm vorsichtig freipräpariert und mit <strong>de</strong>m Ein<strong>de</strong>ckmedium<br />
OCT über<strong>de</strong>ckt. Zum Gefrierschutz wur<strong>de</strong>n Hirnstamm, Milz und Abdominalorgane bei 4°C<br />
über Nacht in 30% Saccharose auf <strong>de</strong>m Drehrad eingelegt und schließlich auf Trockeneis<br />
eingefroren und im Gefrierschrank bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.<br />
Weiterhin wur<strong>de</strong>n in einem Kryostaten (Reichert-Jung, Med. 2700, Frigocut) bei einer<br />
Kammertempera<strong>tu</strong>r von -20°C und einer Objekttempera<strong>tu</strong>r von -10°C <strong>de</strong>r gefrorene<br />
Hirnstamm auf <strong>de</strong>r Höhe <strong>de</strong>s Ncl. facialis in 20 µm dicke Schnitte verarbeitet. Der N. facialis<br />
wur<strong>de</strong> in Längsrich<strong>tu</strong>ng mit einer Schnittdicke von 10 µm geschnitten. Die Schnittpräparate<br />
wur<strong>de</strong>n auf einem warmen, mit 0.5%-Gelatine beschichteten Objektträger aufgenommen,<br />
sofort auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C bis zum weiteren Gebrauch gelagert.<br />
2.1.3.2 Immunhistochemie mit Diaminobenzidin (DAB)<br />
Die Gewebsschnitte mit einer Dicke von 20 µm wur<strong>de</strong>n mit bi<strong>de</strong>stilliertem Wasser rehydriert<br />
und auf <strong>de</strong>m Objektträger ausgebreitet. Alle Präparate wur<strong>de</strong>n für 5 Minuten an <strong>de</strong>r Luft<br />
getrocknet und dann für 5 Minuten mit 4-% Paraformal<strong>de</strong>hyd (Merck, Darmstadt,<br />
Deutschland) auf <strong>de</strong>m Objektträger mittels kovalenter Bindungen fixiert. Je nach<br />
verwen<strong>de</strong>tem Antikörper wur<strong>de</strong>n die Schnitte für jeweils 2 Minuten in 50-%, 100-%, 50-%