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2. Methoden und Materialen 26
getötet. Unmittelbar nach Eintritt des Todes wurde der Herzbeutel eröffnet, die linke
Herzkammer kanüliert und das rechte Herzohr für den Austritt der Perfusionslösung
aufgeschnitten. Die Tiere wurden zunächst mit 200 ml isotoner Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung (PBS) transkardial mit einer peristaltischen Pumpe perfundiert (40ml/min).
Daraufhin wurden die Tiere zur weiteren Fixierung mit 200 ml 4-% Paraformaldehyd (in PBS)
perfundiert, das Gewebe herauspräpariert (Hirnstamm, Milz, Abdominalorgane) und in 1 %
Paraformaldehyd bei 4°C auf einem Rotator für zwei Stunden nachfixiert. Zur Fixierung des
N. facialis wurden die Versuchstiere im Anschluss an die Spülung mit 200 ml 4%
Paraformaldeyhd für weitere 60 min mit 1 % Paraformaldehyd perfundiert, der periphere
Nerv auf einer Länge von 15 bis 20 mm vorsichtig freipräpariert und mit dem Eindeckmedium
OCT überdeckt. Zum Gefrierschutz wurden Hirnstamm, Milz und Abdominalorgane bei 4°C
über Nacht in 30% Saccharose auf dem Drehrad eingelegt und schließlich auf Trockeneis
eingefroren und im Gefrierschrank bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Weiterhin wurden in einem Kryostaten (Reichert-Jung, Med. 2700, Frigocut) bei einer
Kammertemperatur von -20°C und einer Objekttemperatur von -10°C der gefrorene
Hirnstamm auf der Höhe des Ncl. facialis in 20 µm dicke Schnitte verarbeitet. Der N. facialis
wurde in Längsrichtung mit einer Schnittdicke von 10 µm geschnitten. Die Schnittpräparate
wurden auf einem warmen, mit 0.5%-Gelatine beschichteten Objektträger aufgenommen,
sofort auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C bis zum weiteren Gebrauch gelagert.
2.1.3.2 Immunhistochemie mit Diaminobenzidin (DAB)
Die Gewebsschnitte mit einer Dicke von 20 µm wurden mit bidestilliertem Wasser rehydriert
und auf dem Objektträger ausgebreitet. Alle Präparate wurden für 5 Minuten an der Luft
getrocknet und dann für 5 Minuten mit 4-% Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt,
Deutschland) auf dem Objektträger mittels kovalenter Bindungen fixiert. Je nach
verwendetem Antikörper wurden die Schnitte für jeweils 2 Minuten in 50-%, 100-%, 50-%