Abschlussbericht Projekt: „Verminderung der ... - BLE

µkat kg
−1
FM
⎛⎛
* / min
⎞
⎜
⎛
⎞
⎜
V ΔE
⎞
=
* ⎟ / ⎟*16,67
⎜
⎜
* *
⎟ a
Einwaage
⎟
⎝⎝⎝
ε mol
VP
d ⎠ ⎠ ⎠
(7)
V: Gesamtvolumen (ml), ∆E/ min: Absorptionsänderung pro Minute, ε mol : Extinktionskoeffizient
(6,3*10 3 mol -1 *cm -1 ), V P : Probevolumen, d: Schichtdicke der Küvette (cm), a: Verdünnungsfaktor (hier
1000), Einwaage: 3 g ± 0,3g Knollenmaterial
2.10.3 Ermittlung der Aktivität der Polyphenoloxidase
Die Bestimmung der Polyphenoloxidaseaktivität erfolgte nach der Methode der Messung der Catecholaseaktivität
(Ashida 1971), u. a. modifiziert nach Partington et al. (1999). Polyphenoloxidase katalysiert
in Kartoffeln die Hydroxylierung von Monophenolen zu L-Dopa und anschließend zu Dopaquninone
aus dem u. a. Melanin gebildet werden kann. Dopa (3-3,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin) (Fluka,
Germany) wurde als Reaktionslösung zur Messung der Polyphenoloxidaseaktivität verwendet. Von
dieser Lösung wurden 600 µl mit 40 µl Probe (NaCl-Extrakt des Knollenmaterials) und 860 µl 0,05 M
KH 2 PO 4 -Pufferlösung (KMF optichem, Germany) gemischt und bei einer Wellenlänge von 490 nm in
einem UV-Vis spectral system (HP 8453, Germany) wiederholt gemessen. Die erste Messung erfolgte
direkt nach dem Mischen. Die zweite Messung wurde nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten im
Wasserbad bei 30°C durchgeführt. Die Enzymaktivität (Units) beschreibt die Menge, die eine Absorptionsänderung
von 0,01 bewirkt. Die berechneten Ergebnisse (8) beschreiben die Enzymaktivität in
Katal (kat):
−1 ⎛⎛ ΔE
⎞ ⎞
µkat kg FM =
⎜⎜
⎟ / Einwaage
⎟
(8)
⎝⎝
0,01⎠
⎠
∆E/ min: Absorptionsänderung pro Minute, Einwaage: 3 g ± 0,3g Knollenmaterial
2.11 Ermittlung der Proteinkonzentration
Die Konzentration membranassoziierter Proteine wurde im Knollenmaterial nach Extraktion mit NaCl
nach der Methode von Bradford (1976) gemessen. Die Quantifizierung erfolgte im Vergleich zu einer
Proteinstandardlösung aus Rinder-Serum-Albumin (BSA, Sigma-Aldrich, Germany) aus den Proteinstammlösungen
von 0 bis 1500 µg ml -1 hergestellt wurden. Proteinstammlösung bzw. Probe, Extraktionslösung
und Bio-Rad Farbreagenz (Bio-Rad, USA) im Verhältnis 1:1:5 wurden bei einer Wellenlänge
von 595 nm a einem UV-Vis spectral system (HP 8453, Germany) gemessen. Die Proteinkonzentration
im frischen Knollenmaterial wurde berechnet (9):
( * C) / 1000
−1
Protein ( g kg FM ) = ( a / Einwaage)
a: Verdünnungsfaktor, Einwaage: 3 g ± 0,3g Knollenmaterial, C: Proteinkonzentration (µg ml -1 )
2.12 Ermittlung der Polyphenolkonzentration
Die Polyphenolkonzentration wurde in 100 mg gefriergetrocknetem Knollenmaterial nach Extraktion
mit 2 ml einer Lösung bestehend aus Aceton:destilliertes Wasser:Essigsäure im Verhältnis 70:29,5:0,5
(pH 5,0) ermittelt. Grundlage der Analyse war die Methode von Singleton und Rossi (1965).
2.13 Ermittlung der Konzentration organischer Säuren
2.13.1 Konzentration von L-Ascorbinsäure
Der Konzentration von L-Ascorbinsäure in frischem Knollenmaterial wurde mittels Farbumschlag
durch Titration (Beutler und Beinstingl 1980) ermittelt.
2.13.2 Konzentration von Chlorogensäure
12
(9)