Abschlussbericht Projekt: „Verminderung der ... - BLE

-
sich das Sauerstoffradikal O 2 bei ungünstigen Umweltbedingungen, wobei dessen Konzentration
durch die Aktivität der Superoxiddismutase begrenzt werden kann. In wässrigen Lösungen kann die
-
Bildung von O 2 durch das Enzym Xanthin-Oxidase (Katalysator der Reaktion Xanthin + O 2 + H 2 O →
-
Harnsäure + O 2 + 2H + -
) zur Bildung von O 2 genutzt werden, welches umgehend Nitro-
Blautetrazolium (NBT) reduziert. Dabei entsteht ein blauer Farbstoff, dessen Bildung entsprechend der
Aktivität der Superoxiddismutase gehemmt wird. Zur Bestimmung der Aktivität der Superoxiddismutase
modifiziert nach Keutgen und Pawelzik (2007), Lester et al. (2004), McCord und Fridovich
(1969) und Fridovich (1995) wurde eine Reaktionslösung mit 1,33 mM DETEPAC-Lösung (entspricht
Idranal, Riedl de Heän, Germany), 1,8mM Xanthin-Lösung (Sigma-Aldrich, Germany), Katalase (40U
ml -1 ) (Sigma-Aldrich, Germany), 2,24 mM NBT-Lösung (Merck, Germany) und 0,05 M KH 2 PO 4 -
Pufferlösung (KMF optichem, Germany) genutzt. Die Absorption des blauen Farbstoffs wurde
spektrophotometrisch mit einem UV-Vis spectral system (HP 8453, Germany) bei 560 nm ermittelt.
Dazu wurde zunächst ein Kontrollwert bestimmt, der die Absorptionsänderung der 1 M NaCl-
Extraktionslösung im 20-Sekundenintervall bei einem 3-Minuten Messintervall beschreibt. Die Reduktionsrate
betrug 0,015 bis 0,025 je Minute und kennzeichnete die optimal gewählte Konzentration des
Enzym Xanthin-Oxidase. Zur Bestimmung der Superoxiddismutaseaktivität im Knollenmaterial wurden
800 µl Reaktionslösung mit 100 µl Probe (NaCl-Extrakt des Knollenmaterials) gemischt und deren
Absorption bei 560 nm gemessen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 100 µl Xanthin-Oxidase
und die wiederholte Messung der Absorption bei 560 nm nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten.
Die Hemmung der Enzymaktivität wurde nach Formel (5) berechnet:
ΔBlank
− Δ Pr obe
Inhibition (%) =
(5)
ΔBlank
Anschließend wurde die Aktivität der Superoxiddismutase in Einheiten (Units) berechnet, wobei eine
Unit definiert ist als die Enzymaktivität die benötigt wird, um die Reduktionsrate des NBT um 50 % zu
hemmen. Die Units wurden mit dem Faktor 16,67 multipliziert und die Darstellung der Ergebnisse in
Katal (kat) dem internationalen Einheitensystem angepasst (6):
−1
⎛⎛
Inhibition ⎞ ⎞
µkat kg FM = ⎜⎜
⎟ / Einwaage⎟
*16,67
(6)
⎝⎝
50 ⎠ ⎠
Einwaage: 3 g ± 0,3g Knollenmaterial
2.10.2 Ermittlung der Aktivität der Ascorbatperoxidase
Ascorbatperoxidase katalysiert die Reduktion von H 2 O 2 zu H 2 O, wobei Ascorbat als Elektronendonator
dient, dessen Oxidation bei einer Wellenlänge von 265 nm mit einem UV-Vis spectral system (HP
8453, Germany) gemessen wurde. Die Bestimmung der Ascorbatperoxidaseaktivität im Knollenmaterial
erfolgte in Anlehnung an die beschriebene Methode von Nakano und Asada (1981) und Lester et
al. (2004). Als Reaktionslösung diente 0,3 mM L(+)-Ascorbinsäure (Roth, Germany) und 0,06 mM
Triplex III (EDTA, Merck, Germany) gelöst in einer 0,05 M KH 2 PO 4 -Pufferlösung (KMF optichem,
Germany). Von dieser Lösung wurden 2200 µl mit 600µl Probe (NaCl-Extrakt des Knollenmaterials)
gemischt und 200 µl H 2 O 2 unmittelbar vor der Messung hinzugefügt. Gemessen wurde der Absorptionsrückgang
im 20-Sekundenintervall. Als Kontrollwert diente NaCl, das Extraktionsmittel der Probe.
Die Berechnung der Ascorbatperoxidaseaktivität erfolgte nach dem Lambert-Beer´schen Gesetz
(∆E=ε mol *c*d), bei linearem Verhältnis zwischen Konzentration der Probe und gemessener Absorption
(7):
11