Abschlussbericht Projekt: „Verminderung der ... - BLE

2.8 Ermittlung der Zellgröße
Die Größe der Rindenzellen aus dem Nabel- und Kronengewebe der Knollen wurde unter dem Mikroskop
gemessen. Dafür wurden die Gewebeproben mit einer Rasierklinge, entnommen, abwechselnd in
Ethanol und Wasser getaucht (um die Stärke zu entfernen) und anschließend auf einen Objektträger
gelegt und mit einem Deckglas versehen. Durch eine bei vierzigfacher Vergrößerung geeichte Messskala
im Okular konnte die Zellgröße bestimmt werden. Hierbei entsprach ein Abstand auf der Messskala
einem Wert von 25 µm. Die durchschnittliche Zellgröße jeder Gewebeprobe entspricht der Größe
von drei gemessenen Zellen, die im Gewebeverband nicht unmittelbar nebeneinander lagen.
2.9 Ermittlung der antioxidativen Kapazität
Die antioxidative Kapazität der Knollen spiegelt die Summe antioxidativ wirkender Substanzen wider.
Diese besitzen u. a. Eisen-reduzierende Fähigkeiten, die durch die FRAP-Methode ermittelt werden
können. Ebenso wurde durch die Nutzung der H-ORAC-Methode die Möglichkeit die Bildung von
Hydroxylradikalen zu verringern gemessen.
Die Anwendung der FRAP-Methode setzte eine manuelle Zerkleinerung des gefrorenen Knollenmaterials
bei 4°C voraus. Anschließend wurden 3 g des Knollenmaterials genutzt um daraus freie, zellwandassoziierte
(Leo et al. 2008, Civello et al. 1995, Keutgen und Pawelzik 2007) und wasserunlösliche
(George et al. 2004) antioxidativ wirkende Substanzen zu extrahieren. Die freien antioxidativ wirkende
Substanzen wurden durch einen 0,1 M KH 2 PO 4 -Puffer (pH 6.0) gewonnen. Die zellwandassoziierten
antioxidativ wirkenden Substanzen wurden durch zweifache Anwendung einer 1M NaCl-
Lösung entzogen. Wasserunlösliche antioxidativ wirkende Substanzen wurden durch Zugabe des Lösungsmittels
n-Hexane extrahiert. Die Bestimmung der Konzentration antioxidativ wirkender Substanzen
erfolgte mit einem UV-Vis spectral system (HP 8453, Germany) bei 595 nm im Vergleich zu 1
mM FeSO 4 *7H 2 O-Standartlösungen (Benzie und Strain 1996), die im jeweiligen Extraktionsmedium
hergestellt wurden. Die Ergebnisse stellen die gesamte FRAP-Aktivität (mmol kg -1 FM) in frischem
Knollenmaterial dar.
Die H-ORAC-Methode nach Boxin et al. (2002) wurde modifiziert und bei gefriergetrocknetem Knollenmaterial
von Mark und Schale angewendet. Dabei wurden 100 mg Knollenmaterial in 2 ml einer
Lösung bestehend aus Aceton:destilliertes Wasser:Essigsäure im Verhältnis 70:29,5:0,5 (pH 5.0) für 1
h inkubiert. Das Stoffgemisch wurde 10 min bei 5000 rpm zentrifugiert (Janetzki T-30, Germany) und
der verbleibende Überstand zur spektrophotometrischen Analyse der H-ORAC-Aktivität verwendet.
Die Ergebnisse beschreiben die relative H-ORAC Aktivität auf der Grundlage von Gallussäureequivalenten
(GAE) in frischem Knollenmaterial.
2.10 Ermittlung von Enzymaktivitäten
Die Enzyme Superoxiddismutase (EC 1.15.1.1, EC 1.15.1.2), Ascorbatperoxidase (EC 1.11.1.11) und
Polyphenoloxidase (EC 1.14.18.1) liegen in Kartoffelzellen entweder frei im Zytoplasma vor oder sind
membranassoziiert. Heinecke (2007) stellte fest, dass die Aktivität membranassoziierter Enzyme in
Kartoffeln höher ist, als die Aktivität freier Enzyme. Die in ihrer Arbeit beschriebenen Methoden für
die Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden modifiziert und an gefrorenem Knollenmaterial durchgeführt,
wobei ausschließlich die Aktivitäten membranassoziierter Superoxiddismutase, Ascorbatperoxidase
und Polyphenoloxidase gemessen wurden.
2.10.1 Ermittlung der Aktivität der Superoxiddismutase
Superoxiddismutase katalysiert die Reaktion 2 O 2
-
+ 2 H + → H 2 O 2 + O 2 . In pflanzlichen Zellen bildet
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