Etablierung von ES-Zelllinien zur vorhersagbaren autoregulierten ...
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<strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> <strong>zur</strong> <strong>vorhersagbaren</strong><br />
<strong>autoregulierten</strong> Expression <strong>von</strong> Transgenen in Mäusen<br />
Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät<br />
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina<br />
zu Braunschweig<br />
<strong>zur</strong> Erlangung des Grades eines<br />
Doktors der Naturwissenschaften<br />
(Dr. rer. nat.)<br />
genehmigte<br />
D i s s e r t a t i o n<br />
<strong>von</strong> Claas Wodarczyk<br />
aus Eisleben
1. Referent: Prof. Dr. Jürgen Bode<br />
2. Referent: Prof. Dr. Leopold Flohé<br />
eingereicht am: 18.09.2003<br />
mündliche Prüfung (Disputation) am: 23.01.2004
I<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
Zusammenfassung<br />
IV<br />
1 Einleitung ..................................................................................................................................................... 1<br />
1.1 Regulierte Expressionssysteme ............................................................................................................ 1<br />
1.1.1 Das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem................................................................................ 2<br />
1.1.1.1 Das TetOff-System ................................................................................................................. 2<br />
1.1.1.2 Das TetOn-System.................................................................................................................. 3<br />
1.1.1.3 Modifizierung der Tetracyclin-abhängigen Transaktivatoren................................................. 3<br />
1.1.1.4 Anwendungen des Tetracyclin-regulierten Expressionssystems............................................. 5<br />
1.1.2 Das Streptogramin-regulierte Expressionssystem PIPOff............................................................... 6<br />
1.1.3 Das Makrolid-regulierte Epxressionssystem E.REXOff ................................................................. 6<br />
1.1.4 Autoregulierte Expressionssysteme ................................................................................................ 7<br />
1.2 Rekombination ..................................................................................................................................... 8<br />
1.2.1 Homologe Rekombination .............................................................................................................. 8<br />
1.2.2 Sequenzspezifische Rekombination .............................................................................................. 10<br />
1.2.2.1 Das Cre/loxP-System............................................................................................................ 12<br />
1.2.2.2 Das Flp/FRT-System ............................................................................................................ 13<br />
1.2.2.3 Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch..................................................................... 14<br />
1.3 Embryonale Stammzellen und in vitro Differenzierung ..................................................................... 16<br />
1.4 Aufgabenstellung................................................................................................................................ 17<br />
2 Ergebnisse .................................................................................................................................................. 19<br />
2.1 Strategie zum Auffinden und Wiederverwenden regulierbarer Genorte............................................ 19<br />
2.1.1 Die autoregulierte Expressionskassette LUCTP <strong>zur</strong> Identifizierung <strong>von</strong> regulierbaren Genorten 19<br />
2.1.2 Strategie zum Austausch der Reportergen-Kassette gegen beliebige biologisch aktive Gene ...... 19<br />
2.2 <strong>Etablierung</strong> eines TetOff-Expressionssystems in <strong>ES</strong>-Zellen............................................................... 21<br />
2.2.1 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität <strong>von</strong> LUCTP in NIH3T3-Zellen........... 21<br />
2.2.2 Optimierung der Tkneo-Expression durch aktivere IR<strong>ES</strong>-Elemente ............................................ 23<br />
2.2.3 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität <strong>von</strong> LUCTN7 in NIH3T3-Zellen ........ 24<br />
2.2.4 Stabile Expression <strong>von</strong> LUCTN7 in <strong>ES</strong>-Zellen............................................................................. 26<br />
2.2.4.1 Die Expression <strong>von</strong> LUCTN7 ist in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig......................................................... 26<br />
2.2.4.2 Weniger toxische Transaktivatoren verbessern nicht die Expression des <strong>autoregulierten</strong><br />
TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen................................................................................................ 27<br />
2.2.5 <strong>Etablierung</strong> eines TetOff-Expressionssystems im ROSA26-Locus <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen ...................... 31<br />
2.2.5.1 Integration der <strong>autoregulierten</strong> Expressionskassette LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus... 31<br />
2.2.5.2 In vitro Differenzierung ........................................................................................................ 34<br />
2.2.5.3 Aktivierung der Luciferase-Expression durch konstitutiv exprimierte Transaktivatoren ..... 38<br />
2.3 <strong>Etablierung</strong> eines TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Expressionssystems in <strong>ES</strong>-Zellen ....................... 39<br />
2.3.1 Optimierung der Expressionsanalyse durch Einsatz einer aktiveren Luciferase........................... 39<br />
2.3.2 Untersuchung der transienten Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-<br />
Kassetten ....................................................................................................................................... 40<br />
2.3.3 Untersuchung der stabilen Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-<br />
Kassetten in <strong>ES</strong>-Zellen.................................................................................................................. 41<br />
2.3.4 Squelching-Effekt <strong>von</strong> LUC3rTA2E............................................................................................. 44<br />
2.4 Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie .................................................................................. 47<br />
2.4.1 Kassettenaustausch in NIH3T3-Zellen.......................................................................................... 47<br />
3 Diskussion................................................................................................................................................... 51<br />
3.1 Autoregulierte Expressionssysteme in NIH3T3- und <strong>ES</strong>-Zellen......................................................... 51<br />
3.1.1 Optimierung der Tkneo-Expression durch Austausch des IR<strong>ES</strong>-Elements................................... 51<br />
3.1.2 Das autoregulierte TetOff-System ist in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig exprimierend ................................... 52<br />
3.1.2.1 Das TetOff-System in <strong>ES</strong>-Zellen (publizierte Daten) ........................................................... 53<br />
3.1.2.2 TetOff-Transaktivatoren können in <strong>ES</strong>-Zellen Squelching hervorrufen............................... 53
II<br />
3.1.2.3 Durch weniger toxische TetOff-Transaktivatoren kann die Expression des TetOff-Systems in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen nicht erhöht werden ............................................................................................. 54<br />
3.1.2.4 Die niedrige Expression des TetOff-Systems ist begründet durch eine niedrige Aktivität des<br />
TetOff-Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen, nicht aber durch Squelching...................................... 55<br />
3.1.2.5 Die Expression des TetOff-Systems ist nach in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen deutlich<br />
erhöht .................................................................................................................................... 55<br />
3.1.3 Das TetOn-System ist in <strong>ES</strong>-Zellen hoch exprimierend................................................................ 56<br />
3.1.3.1 Das TetOn-System führt zu hohen Expressionen in <strong>ES</strong>-Zellen ............................................ 56<br />
3.1.3.2 Der TetOn-Transaktivator induziert Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen.............................................. 57<br />
3.1.4 Das E.REXOff- und das PIPOff-System führen zu geringeren Expressionen, aber auch<br />
geringerem Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen als das TetOn-System........................................................ 57<br />
3.1.5 Vergleich der <strong>autoregulierten</strong> Expressionssysteme in <strong>ES</strong>-Zellen.................................................. 58<br />
3.2 Flp-vermittelter Kassettenaustausch.................................................................................................. 59<br />
3.2.1 Die Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion ist funktional, jedoch wenig effizient.... 60<br />
3.2.2 Der Kassettenaustausch führt zu einem hohen Anteil an Austauschklonen mit zusätzlich<br />
integrierten Austauschkonstrukten ................................................................................................ 61<br />
3.2.3 Die Expression des integrierten Austauschkonstruktes ist vorhersagbar ...................................... 62<br />
3.2.4 Anwendung der Kassettenaustauschstrategie in <strong>ES</strong>-Zellen.......................................................... 63<br />
3.2.5 Ein Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion ist effizienter als mit Negativ-Selektion .............. 63<br />
3.2.6 Das neo-Gen kann die Expression benachbarter Gene negativ beeinflussen ................................ 63<br />
3.3 Perspektiven....................................................................................................................................... 64<br />
3.3.1 Optimierung der <strong>autoregulierten</strong> Expression in <strong>ES</strong>-Zellen ........................................................... 64<br />
3.3.1.1 Reduktion der <strong>autoregulierten</strong> Expression durch Modifikation des Promotors .................... 64<br />
3.3.1.2 Verwendung weniger toxischer Transaktivatoren................................................................. 65<br />
3.3.2 Optimierung der Kassettenaustauschstrategie............................................................................... 67<br />
3.3.2.1 Positiv-Selektion statt Negativ-Selektion beim Kassettenaustausch..................................... 67<br />
3.3.2.2 Alternative Negativ-Selektion des Kassettenaustausches ..................................................... 69<br />
3.3.2.3 Thymidinkinase-Expression in männlichen Mäusen führt <strong>zur</strong> Infertilität............................. 70<br />
3.4 Ausblick.............................................................................................................................................. 70<br />
4 Material und Methoden ............................................................................................................................ 72<br />
4.1 Geräte ................................................................................................................................................ 72<br />
4.2 Material ............................................................................................................................................. 73<br />
4.3 Allgemeine Grundtechniken............................................................................................................... 74<br />
4.3.1 Sterilisieren durch Hitze................................................................................................................ 74<br />
4.3.2 Sterilisieren durch Filtration.......................................................................................................... 74<br />
4.3.3 Phenolisieren <strong>von</strong> DNA ................................................................................................................ 74<br />
4.3.4 Fällung <strong>von</strong> DNA.......................................................................................................................... 74<br />
4.4 DNA-Modifizierung............................................................................................................................ 75<br />
4.4.1 Spaltung <strong>von</strong> DNA mit Restriktionsenzymen ............................................................................... 75<br />
4.4.2 Auffüllen <strong>von</strong> 5’-überstehenden Enden......................................................................................... 75<br />
4.4.3 Dephosphorylierung <strong>von</strong> DNA-Fragmenten ................................................................................. 75<br />
4.4.4 Oligohybridisierung ...................................................................................................................... 75<br />
4.4.5 Ligation <strong>von</strong> DNA-Fragmenten .................................................................................................... 76<br />
4.4.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ................................................................................................ 76<br />
4.4.7 Agarose-Gelelektrophorese........................................................................................................... 77<br />
4.4.8 Isolierung <strong>von</strong> DNA aus Agarosegelen (QIAquick-Kit, Quiagen)................................................ 77<br />
4.5 Radioaktive Detektionsmethoden....................................................................................................... 77<br />
4.5.1 Random priming mit „Rediprime DNA Labelling System” (Amersham Life Science)................ 77<br />
4.5.2 Klenow-Markierung...................................................................................................................... 78<br />
4.5.3 Southern-Blot Analyse .................................................................................................................. 78<br />
4.5.3.1 Isolierung <strong>von</strong> hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen .............................. 78<br />
4.5.3.2 Enzymatischer Verdau der hochmolekularen DNA (HMW-DNA) ...................................... 78<br />
4.5.3.3 DNA-Transfer....................................................................................................................... 79<br />
4.5.3.4 Hybridisierung der restriktierten HMW-DNA...................................................................... 79<br />
4.5.3.5 Rehybridisierung der restriktierten HMW-DNA .................................................................. 79
III<br />
4.6 Arbeiten mit E.coli ............................................................................................................................. 80<br />
4.6.1 Verwendete Bakterienstämme....................................................................................................... 80<br />
4.6.2 Medien .......................................................................................................................................... 80<br />
4.6.3 Herstellung <strong>von</strong> Agarplatten ......................................................................................................... 80<br />
4.6.4 Herstellung elektrokompetenter Bakterien.................................................................................... 80<br />
4.6.5 Elektrotransformation kompetenter Bakterien .............................................................................. 81<br />
4.6.6 Konservierung <strong>von</strong> Bakterien........................................................................................................ 81<br />
4.6.7 Isolierung <strong>von</strong> Plasmid-DNA aus Bakterien im analytischen Maßstab ........................................ 81<br />
4.6.8 Isolierung <strong>von</strong> Plasmid-DNA aus Bakterien im präparativen Maßstab (QUIAGEN)................... 82<br />
4.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen.................................................................................................. 83<br />
4.7.1 Verwendete <strong>Zelllinien</strong>................................................................................................................... 83<br />
4.7.2 Grundmedien................................................................................................................................. 83<br />
4.7.3 Kulturmedien................................................................................................................................. 84<br />
4.7.4 Gelatinierung <strong>von</strong> Zellkulturgefäßen ............................................................................................ 84<br />
4.7.5 Präparation <strong>von</strong> Zellkulturgefäßen mit Feeder-Zellen .................................................................. 84<br />
4.7.6 Zählung <strong>von</strong> Zellen ....................................................................................................................... 84<br />
4.7.7 Kultivierung <strong>von</strong> Zellen ................................................................................................................ 84<br />
4.7.8 Passagieren <strong>von</strong> Zellen.................................................................................................................. 85<br />
4.7.9 Langzeitlagerung <strong>von</strong> Zellen......................................................................................................... 85<br />
4.7.10 Gentransfer-Methoden.............................................................................................................. 85<br />
4.7.10.1 Transfektion mittels Calciumphosphat/DNA-Präzipitation .................................................. 85<br />
4.7.10.2 Transfektion mittels Elektroporation .................................................................................... 86<br />
4.7.10.3 Stabile Expression – Selektion <strong>von</strong> G418-resistenten Zellklonen ........................................ 86<br />
4.7.10.4 Transiente Expression...........................................................................................................87<br />
4.7.11 In vitro Differenzierung............................................................................................................ 87<br />
4.8 Proteinanalytik................................................................................................................................... 87<br />
4.8.1 Aufschluss <strong>von</strong> Zellen................................................................................................................... 87<br />
4.8.2 Nachweis <strong>von</strong> β-Galactosidase ..................................................................................................... 88<br />
4.8.2.1 Färbung <strong>von</strong> Zellen............................................................................................................... 88<br />
4.8.2.2 Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivtät ........................................................................... 88<br />
4.8.3 Bestimmung der Luciferase-Aktivität ........................................................................................... 89<br />
4.8.4 Proteinbestimmung nach Bradford................................................................................................ 89<br />
5 Vektoren und Oligonukleotide ................................................................................................................. 90<br />
5.1 Vektoren............................................................................................................................................. 90<br />
5.1.1 Verwendete Vektoren.................................................................................................................... 90<br />
5.1.2 Hergestellte Vektoren.................................................................................................................... 91<br />
5.2 Primer/Oligomere .............................................................................................................................. 95<br />
6 Abkürzungen ............................................................................................................................................. 97<br />
7 Literatur................................................................................................................................................... 100
IV<br />
Zusammenfassung<br />
Eine etablierte Methode <strong>zur</strong> Generierung transgener Mauslinien ist die Injektion genetisch<br />
veränderter <strong>ES</strong>-Zellen in Mausblastozysten. Die Expression im Tier ist jedoch vom<br />
Integrationsort des Transgens in der <strong>ES</strong>-Zelle abhängig und variiert daher stark. Diese ist<br />
nicht vorhersagbar und erfordert daher ein aufwendiges Screening transgener Tiere. Eine<br />
Strategie <strong>zur</strong> Wiederverwendung <strong>von</strong> chromosomalen Genorten in <strong>ES</strong>-Zellen erscheint daher<br />
sinnvoll.<br />
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> hoch exprimierenden, regulierbaren<br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mittels einer <strong>autoregulierten</strong> Reportergen-Kassette, die <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong><br />
Mäusen mit regulierbarer Expression eingesetzt werden können. Die Markierung der Genorte<br />
mit heterospezifischen FRT-Sites sollte außerdem die Integration <strong>von</strong> Expressionskassetten<br />
<strong>zur</strong> <strong>autoregulierten</strong> Expression eines beliebigen Transgens in diese charakterisierten Loci<br />
durch Flp-vermittelte sequenzspezifische Rekombination ermöglichen.<br />
Nach Integration einer <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Kassette in zufällige Genorte konnten wenige<br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> generiert werden. Diese wiesen jedoch keine signifikante Reportergen-<br />
Expression auf. Auch nach spezifischer Integration einer TetOff-Kassette in einen definierten<br />
Genort, dem ROSA26-Locus, wurden nur niedrige Expressionen festgestellt. Dagegen<br />
konnten nach in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen mit integrierter TetOff-Kassette<br />
deutliche Expressionssteigerungen festgestellt werden. Auch in NIH3T3-Zellen zeigten<br />
TetOff-Kassetten hohe, regulierbare Expressionen. Daraus wurde geschlussfolgert, dass in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen das TetOff-System unabhängig vom Integrationsort niedrig, in differenzierten<br />
Zellen jedoch hoch exprimierend ist. In transienten Expressionsstudien konnte die im<br />
Vergleich zu NIH3T3-Zellen niedrige Expressionskapazität des TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
bestätigt werden. Daher wurden weitere autoregulierte Expressionssysteme auf ihre<br />
Verwendbarkeit in <strong>ES</strong>-Zellen untersucht. Das E.REXOff-System führte transient zu ähnlichen<br />
Expressionen wie das TetOff-System. Dagegen zeigte das PIPOff-System transient vielfach<br />
höhere Expressionskapazitäten. Mit dem TetOn-System wurden transient jedoch die höchsten<br />
Expressionen erzielt. Mit diesem System konnten schließlich <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> generiert werden,<br />
die eine hohe, regulierbare Expression aufwiesen. Jedoch war die Zahl der selektierten Klone<br />
gering. Es konnte gezeigt werden, dass durch den hoch exprimierten TetOn-Transaktivator<br />
hohes Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen auftritt, was die <strong>Etablierung</strong> transgener <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong><br />
beeinträchtigt.<br />
Die in dieser Arbeit aufgestellte Kassettenaustauschstrategie wurde in NIH3T3-Zellen mit<br />
integrierter TetOff-Kassette überprüft. Der mit Integration einer <strong>autoregulierten</strong><br />
Austauschkassette in den markierten Genort verbundene Verlust des Negativ-<br />
Selektionsmarkers Thymidinkinase ließ die Selektion <strong>von</strong> Austauschklonen mit korrekter<br />
Integration des Austauschkonstruktes zu. Diese wiesen eine homogene, vorhersagbare<br />
Reportergen-Expression auf.<br />
In der vorliegenden Arbeit konnte die <strong>Etablierung</strong> regulierbarer <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> gezeigt werden.<br />
Aufgrund der hohen Expressionskapazität ist das TetOn-System das einzige System, das für<br />
die Identifizierung hoch exprimierender, gut regulierbarer Genorte in <strong>ES</strong>-Zellen geeignet ist.<br />
Durch Anwendung der Kassettenaustauschstrategie sollte es möglich sein, markierte Genorte<br />
in den <strong>ES</strong>-Zellen wiederverwenden zu können. Dadurch können <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> generiert<br />
werden, die eine definierte Expression eines beliebigen Transgens erlauben. Aus diesen <strong>ES</strong>-<br />
Zellen können Mäuse mit vorhersagbarer Transgenexpression etabliert werden, wodurch<br />
aufwendige Screenings vermieden werden.
1 Einleitung 1<br />
1 Einleitung<br />
1.1 Regulierte Expressionssysteme<br />
Zur Beantwortung vieler Fragestellungen in Biologie und Medizin, <strong>zur</strong> Aufklärung <strong>von</strong><br />
Signalkaskaden, Genregulationen und Genfunktionen, <strong>zur</strong> Untersuchung des Einflusses<br />
bestimmter Gene oder Toxine auf Entwicklung und Metabolismus eines Organismus, aber<br />
auch für gentherapeutische Anwendungen sind Expressionssysteme, die eine gezielte<br />
Regulation der Expression eines bestimmten Transgens zulassen, ein wichtiges Hilfsmittel.<br />
Ein regulierbares System sollte folgende Eigenschaften aufweisen (Fussenegger, 2001):<br />
(1) Spezifität: Das System darf nicht mit endogenen Regulationssystemen interferieren und<br />
nur durch exogene, nicht-toxische Faktoren aktiviert werden. (2) Induzierbarkeit: Es sollte<br />
eine niedrige Basalexpression im reprimierten Zustand und eine hohe Expression im<br />
induzierten Zustand aufweisen. (3) Verfügbarkeit der Regulationsfaktoren: Exogene<br />
Regulationsfaktoren sollten in alle Gewebe und Zellen gelangen und die Planzenta und die<br />
Blut-Hirn-Schranke durchdringen können. (4) Reversibilität: Das System sollte jederzeit in<br />
allen Geweben durch Regulation den Ausgangszustand erreichen können. (5) Immunogenität:<br />
Komponenten des Systems und Regulationsfaktoren sollten keine Immunantwort hervorrufen.<br />
(6) Dosis-Abhängigkeit: Die Expression des Systems sollte durch exogene Faktoren<br />
modulierbar sein.<br />
Eine Vielzahl verschiedener Regulationssysteme wurde bis heute etabliert (Übersicht:<br />
Fussenegger, 2001). Die ersten Systeme basierten auf endogene Komponenten (Promotoren<br />
und Enhancer). Die Regulation erfolgte durch exogene Signale oder Stress (Hitze, Hormone,<br />
Sauerstoff, Cytokine, Metallionen). Die Installation dieser Systeme in Zellen führte jedoch zu<br />
pleiotropen Interferenzen mit bestehenden, endogenen Regulationssystemen. Aus diesem<br />
Grund wurden Systeme entwickelt, die nicht auf endogene sondern auf heterologe, mutierte<br />
endogene oder synthetische Komponenten beruhen. In diesen Systemen regulieren exogene<br />
Faktoren wie IPTG, Ecdyson, Östrogen oder RU486 die Aktivität bzw. das DNA-<br />
Bindungspotenzial eines Transaktivators, der wiederum die, <strong>von</strong> einem Transaktivatorabhängigen<br />
heterologen Promotor induzierte Expression kontrolliert. Im Östrogen-induzierten<br />
System bindet im reprimierten Zustand Hsp90 (Heat shock protein 90 complex) an einen<br />
Transaktivator, der aus DNA-Bindungsdomäne wie Gal4, Östrogen-Bindungsdomäne und<br />
Transaktivierungsdomäne wie VP16 aufgebaut ist. Durch Östrogen wird die Hsp90-<br />
Transaktivator-Interaktion aufgehoben, so dass der Transaktivator an regulatorische DNA-<br />
Sequenzen binden und die Expression induzieren kann. Im RU486/Mifipriston-induzierten<br />
System enthält der Transaktivator statt der Bindungsdomäne des Östrogen-Rezeptors die des<br />
Progesteron-Rezeptors. Einige Regulationssysteme werden durch chemisch-induzierte<br />
Dimerisierung kontrolliert. Dazu zählen das FK506/Rapamycin- und das Cyclosporininduzierbare<br />
System. Diese Immunsupressiva binden an FKBP (FK506 binding protein 12)<br />
bzw. Cyp (Cyclophilin), die entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne wie Gal4 oder einer<br />
transkriptionsaktivierenden Domäne wie VP16 fusioniert sind. Es kommt <strong>zur</strong><br />
Heterodimerisierung der Fusionsproteine und damit <strong>zur</strong> Bildung eines funktionalen<br />
Transaktivators, der an definierte DNA-Sequenzen binden und die Expression initiieren kann.<br />
In anderen Systemen regulieren exogene Faktoren die Dimerisierung <strong>von</strong> vorhandenen<br />
Transaktivatoren bzw. die Konformation dieser Dimere. Dadurch kann die Interaktion der<br />
Transaktivatoren mit regulatorischen DNA-Bereichen und somit die Expression kontrolliert<br />
werden. Dazu zählen das Tetracyclin-regulierte (Gossen und Bujard, 1992), das
1 Einleitung 2<br />
Streptogramin-regulierte (Fussenegger et al., 2000) und das Makrolid-regulierte<br />
Expressionssystem (Weber et al., 2002a).<br />
1.1.1 Das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem<br />
Das Antibiotikum Tetracyclin und dessen Derivate wie Doxycyclin können in Bakterien<br />
durch Bindung an die 30S-Untereinheit der 70S-Ribosomen die Bindung <strong>von</strong> AminoacetyltRNAs<br />
an die Ribosomen blockieren und dadurch die Proteinbiosynthese inhibieren. Eine<br />
Vielzahl <strong>von</strong> Bakterien besitzt jedoch eine natürliche bzw. erworbene Resistenz gegenüber<br />
Tetracyclinen. Das Tetracyclin-Resistenzsystem (Abb.1) besteht aus dem membranassoziierten<br />
Protein TetA, welches den aktiven Transport <strong>von</strong> Tetracyclin aus den Bakterien<br />
durch einen H + /[Tetracyclin+Mg] + -Antiport-Mechanismus ermöglicht und dadurch die<br />
Akkumulation <strong>von</strong> Tetracyclin im Bakterium verhindert, und dem Repressor TetR (Postle et<br />
al., 1984), der die Expression <strong>von</strong> TetA in Abhängigkeit <strong>von</strong> Tetracyclin kontrolliert. Gelangt<br />
Tetracyclin in die Bakterien, wird dieses <strong>von</strong> TetR-Dimeren gebunden, was zu einer<br />
Konformationsänderung der TetR-Dimere führt (Müller et al., 1995). Dadurch dissoziieren<br />
diese <strong>von</strong> den Operator-Sequenzen tetO ab, und die Transkription <strong>von</strong> TetA und TetR wird<br />
ermöglicht (Hillen et al., 1983; Hillen und Berens, 1994; Postle et al., 1984).<br />
Tetracyclin<br />
F<br />
1<br />
3<br />
TetA-Protein<br />
TetR-Protein<br />
TetR<br />
TetA<br />
TetR<br />
2<br />
TetA<br />
Operatoren<br />
Abb. 1 Schematische Darstellung des Tetracyclin-Resistenz Operons<br />
(1) Tetracyclin-Moleküle gelangen in das Bakterium und interagieren mit TetR-Proteinen, die an Operatoren des Operons gebunden sind.<br />
(2) Die Interaktion <strong>von</strong> Tetracyclin mit TetR induziert eine Konformationsänderung in TetR, worauf dieses <strong>von</strong> der DNA dissoziiert und die<br />
Operatoren demaskiert. (3) Es kommt <strong>zur</strong> Expression <strong>von</strong> TetR- und TetA-Proteinen. TetA ist ein membranständiges Porenprotein, das<br />
Tetracyclin-Moleküle aus dem Bakterium entfernt.<br />
1.1.1.1 Das TetOff-System<br />
In Pflanzen wurde gezeigt, dass Teile des Tetracyclin-Resistenz Operons aus E.coli, welches<br />
auf dem Transposon Tn10 lokalisiert ist, die Expression eukaryontischer Gene regulieren<br />
können (Frohberg et al., 1991; Gatz und Quail, 1988; Gatz et al., 1991). Von Gossen und<br />
Bujard (1992) wurde aus Komponenten dieses Operons ein Tetracyclin-regulierbares<br />
Expressionssystem in Säugerzellen entwickelt (Abb.2). Dieses besteht aus dem Transaktivator<br />
tTA, eine Fusion aus TetR und transkriptionsaktivierender Domäne VP16 des Herpes Simplex<br />
Virus (Triezenberg et al., 1988, Sadowski et al., 1988), und dem Transaktivator-abhängigen<br />
Promotor P hCMV*-1 , eine Fusion aus sieben tetO-Sequenzwiederholungen und dem humanen<br />
CMV-Minimalpromotor P hCMVmin (Boshart et al., 1985). Mittels der TetR-Domäne kann der<br />
Transaktivator an die Operator-Sequenzen des Promotors binden. Die VP16-Domäne<br />
interagiert direkt mit Transkriptionsfaktoren wie TFIIB (Lin et al., 1991), TBP (TATA
1 Einleitung 3<br />
binding protein; Ingles et al., 1991) und TAFII 40 (TBP associated factor; Goodrich et al.,<br />
1993), was <strong>zur</strong> Bildung eines Transkriptionsinitiationskomplexes und damit <strong>zur</strong> Aktivierung<br />
der Transkription eines beliebigen, 3’-gelegenen Gens führt (Abb.2A). Tetracyclin bzw.<br />
Derivate können durch Bindung an die TetR-Domäne eine Konformationsumwandlung der<br />
Transaktivatoren induzieren und somit deren hochaffine Bindung an die Operatoren im<br />
P hCMV*-1 -Promotor unterbrechen. Die Transkription wird dadurch deaktiviert (Abb.2B).<br />
A Induktion<br />
B Repression<br />
tTA<br />
P<br />
Pmin<br />
Pmin<br />
Repressor-<br />
Domäne<br />
Transaktivierungsdomäne<br />
VP16<br />
7x tetO<br />
Minimaler Transgen<br />
Promotor P hCMVmin<br />
Tetracyclin<br />
Abb. 2 Schematische Darstellung des TetOff-Systems<br />
(A) Induktion der Expression: Der exprimierte Transaktivator bindet mit seiner tet-Repressor-Domäne TetR an Operator-Sequenzen tetO im<br />
Transaktivator-abhängigen Promotor P hCMV*-1 . Die Transaktivierungsdomäne VP16 bewirkt eine Transkriptionsaktivierung. Der minimale<br />
Promotor P hCMVmin kontrolliert die Expression eines Transgens. (B) Repression: Tetracyclin-Moleküle oder Derivate binden an die TetR-<br />
Domäne des Transaktivators und induzieren dadurch eine Konformationsänderung, die <strong>zur</strong> Dissoziation des Transaktivators vom Operator<br />
führt. Die Expression wird deaktiviert.<br />
1.1.1.2 Das TetOn-System<br />
Von Gossen et al. (1995) wurde die Repressor-Domäne TetR des ursprünglichen<br />
Transaktivators tTA (Kap.1.1.1.1) in vier Aminosäuren verändert, was den Phenotyp des<br />
Transaktivators invertierte. Ohne Tetracyclin oder eines Derivates nimmt dieser reverse<br />
Transaktivator, rtTA genannt, eine Konformation ein, die eine Interaktion mit Operator-<br />
Sequenzen des Transaktivator-abhängigen Promotors P hCMV*-1 verhindert. Erst nach Bindung<br />
<strong>von</strong> Tetracyclinen, insbesondere Doxycyclin, an die TetR-Domäne kann rtTA mit den<br />
Operatoren interagieren und dadurch die Transkription induzieren.<br />
1.1.1.3 Modifizierung der Tetracyclin-abhängigen Transaktivatoren<br />
Die transkriptionsaktivierende Domäne <strong>von</strong> VP16 kann mit einer Vielzahl <strong>von</strong><br />
Transkriptionsfaktoren interagieren (Lin et al., 1991; Ingles et al., 1991; Goodrich et al., 1993;<br />
Flint und Shenk, 1997), was jedoch bei hohen Konzentrationen <strong>von</strong> VP16 zu einer Reduktion<br />
freier Transkriptionsfaktoren in den Zellen führt. Dadurch wird die RNA-Transkription<br />
eingeschränkt, was letzlich den Tod der Zellen bewirken kann. Dieser Prozess wird auch<br />
transkriptionelles Squelching genannt und wurde erstmals bei der Überexpression <strong>von</strong> Gal4 in<br />
Hefe beobachtet (Gill und Ptashne, 1988). Da die Transaktivatoren tTA und rtTA<br />
(Kap.1.1.1.1 und 1.1.1.2) eine VP16-Domäne besitzen, können hohe Konzentrationen dieser<br />
Transaktivatoren in Zellen Squelching-Effekte induzieren (Gossen und Bujard, 1992; Damke<br />
et al., 1995; Saez et al., 1997; Gallia und Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Von Baron et<br />
al. (1997) wurden durch Fusion verschiedener, durch Aminosäureaustausch modifizierter<br />
minimaler Transaktivierungsdomänen <strong>von</strong> VP16 mit der TetR-Domäne Transaktivatoren mit<br />
reduzierter Toxizität generiert (Abb.3). Diese werden <strong>von</strong> Zellen in höheren Konzentrationen
1 Einleitung 4<br />
toleriert, da Bindungsstellen für bestimmte Transkriptionsfaktoren wie für Oct1 (Hayes und<br />
O’Hare, 1993), TAFII 40 (Goodrich et al., 1993) und ADA2 (Silverman et al., 1994) fehlen. In<br />
Abhängigkeit <strong>von</strong> Anzahl und Typ der fusionierten minimalen VP16-Domänen können die<br />
Transaktivatoren allerdings eine reduzierte Aktivität aufweisen (Abb.3).<br />
Aktivität Toxizität<br />
tTA tetR<br />
C-term. VP16 100% 100%<br />
tTA2<br />
tetR F F F<br />
98% 33%<br />
tTA3<br />
tTA4<br />
tetR<br />
tetR<br />
F F<br />
G F Y<br />
39%<br />
14%<br />
20%<br />
11%<br />
Modifizierte minimale VP16-Domänen<br />
(Aminosäure-Sequenz)<br />
F<br />
G<br />
Y<br />
PADALDDFDLDML<br />
PADALDDGDLDML<br />
PADALDDYDLDML<br />
Abb. 3 TetOff-Transaktivatoren mit modifizierter Transaktivierungsdomäne<br />
Die modifizierten minimalen VP16-Domänen des Typs F, G und Y wurden an die TetR-Domäne fusioniert, was zu den Transaktivatoren<br />
tTA2, tTA3 und tTA4 führte. Diese zeigen bei gleicher bzw. abnehmender Aktivität reduziertes Squelching (Baron et al., 1997).<br />
Neben Transaktivatoren des TetOff-Systems gibt es ebenfalls TetOn-Transaktivatoren mit<br />
modifizierten minimalen VP16-Domänen. Von Kämper et al. (2002) wurden bis zu 8<br />
Domänen des F-Typs (Baron et al., 1997) und bis zu 20 Domänen des L-Typs, eine<br />
Modifikation des F-Typ, die durch Entfernung <strong>von</strong> zwei Aminosäuren generiert wurde, an<br />
reverse TetR-Domänen fusioniert. Die Aktivität der meisten dieser Transaktivatoren lag<br />
unterhalb der Aktivität der VP16-Varianten. Weiterhin existieren reverse Transaktivatoren<br />
mit synthetischen minimalen VP16-Domänen, in denen u.a. potentielle Splice-Donor- und<br />
Splice-Akzeptor-Stellen, potentielle Schnittstellen für Endonukleasen und Sequenzen, die für<br />
die Ausbildung <strong>von</strong> Haarnadelstrukturen verantwortlich sind, entfernt wurden (Urlinger et al.,<br />
2000b). Diese besitzen ein höheres Induktionspotenzial als die ursprünglichen reversen<br />
Transaktivatoren.<br />
Eine andere Möglichkeit, das durch die VP16-Domäne der Transaktivatoren vermittelte<br />
Squelching zu reduzieren, bieten nicht-virale Transaktivierungsdomänen wie p65 (Schmitz<br />
und Bäuerle, 1991) und E2F4 (Ginsberg et al., 1994). Diese wurden an verschiedene TetR-<br />
Domänen fusioniert (Urlinger et al., 2000a; Akagi et al., 2001). Die Transaktivatoren mit p65-<br />
Domäne sind ähnlich aktiv wie die Transaktivatoren mit VP16-Domäne. Transaktivatoren mit<br />
E2F4-Domän haben dagegen ein niedrigeres transkriptionsinduzierendes Potenzial als die<br />
VP16-Varianten. Die Fusion der Tet-Repressor Domäne mit der KRAB (Krüppel-associated<br />
box)-Repressor Domäne des humanen Zinkfinger-Proteins Kox1 (Margolin et al., 1994) zeigt<br />
dagegen kein Induktions- sondern ein Repressionsverhalten (Deuschle et al., 1995). Die<br />
Bindung dieses Transrepressors (tTS: Transcriptional Silencer) an die Operatoren verhindert<br />
die Transkription eines Gens. Durch Tetracyclin kann diese Bindung jedoch aufgehoben<br />
werden, was die Transkription wieder ermöglicht.<br />
Das Induktionspotenzial <strong>von</strong> Transaktivatoren wird nicht allein durch die<br />
Transaktivierungsdomäne, sonderen auch durch das Bindungsverhalten der Repressor-<br />
Domäne an die Operator-Sequenzen des Promotors (Hinrichs et al., 1994; Orth et al., 1998;<br />
Baron et al., 1999) und durch Sequenzen, die den Eintritt des Transaktivator-Proteins in den<br />
Zellkern bzw. die Translation der Transaktivator-mRNA (Shockett et al., 1995; Kozak, 1984)<br />
beeinflussen, bestimmt. Durch Mutagenese und daraus resultierenden, zufälligen<br />
Aminosäureaustauschen im TetR wurden reverse Transaktivatoren generiert, die aufgrund<br />
eines höheren DNA-Bindungspotenzials höhere Expression ermöglichten (Urlinger et al.,<br />
2000b). Die Fusion einer nls-Sequenz (nuclear localization signal) an tTA (Yoshida und<br />
Hamada, 1997) bzw. an rtTA (Gossen et al., 1995) erhöhte die Transferrate der<br />
Transaktivatoren in den Kern, was ebenfalls zu höheren Induktionen führte.
1 Einleitung 5<br />
1.1.1.4 Anwendungen des Tetracyclin-regulierten Expressionssystems<br />
Tetracyclin-regulierte Expressionssysteme wurden in verschiedenen Säugerzelllinien wie<br />
HeLa, 293T, CHO, PC12 etabliert, wobei festgestellt wurde, dass das Regulations- und<br />
Expressionspotenzial der Systeme zwischen den <strong>Zelllinien</strong> variiert (Howe et al., 1995;<br />
Leuchtenberger et al., 2001). Es wurden auch embryonale Stammzellen mit regulierbarer<br />
Transgen-Expression generiert. So integrierten Wutz und Jänisch (2000) das Gen des reversen<br />
Transaktivators (Gossen et al., 1995) in den ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991)<br />
unter Kontrolle des endogenen Promotors, um das in zufälligen Genorten integrierte Transgen<br />
Xist reguliert exprimieren zu können (TetOn-System). Von Kyba et al. (2002) wurde<br />
ebenfalls ein TetOn-Expressionssystem in <strong>ES</strong>-Zellen etabliert. Im ROSA26-Locus befand<br />
sich das Transaktivator-Gen und im HPRT-Locus eine Expressionseinheit aus Transaktivatorabhängigem<br />
Promotor und dem Transgen HoxB4. Era und Witte (2000) generierten <strong>ES</strong>-<br />
<strong>Zelllinien</strong>, die eine regulierte Expression des Oncogens P210 Bcr-Abl zuließen, kontrolliert<br />
durch den konstitutiv exprimierten Transaktivator tTA2 des TetOff-Systems (Baron et al.,<br />
1997). In anderen Arbeiten wurden <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit ausschließlich Transaktivator- oder<br />
Transgen-Expressionskassetten etabliert (Böger und Gruss, 1999; Shin et al., 1999; Fedorov<br />
et al., 20001a, b). Aus diesen <strong>ES</strong>-Zellen bzw. durch pronukleäre Injektion <strong>von</strong> Transaktivatorexprimierenden<br />
Konstrukten wurden transgene Mäuse generiert. In Abhängigkeit vom<br />
Integrationsort bzw. Promotor exprimieren diese ubiquitär oder gewebespezifisch den<br />
Transaktivator (Tab.1). Auf gleiche Weise wurden Mäuse generiert, die eine<br />
Expressionseinheit aus Transaktivator-abhängigen Promotor und Transgen in ihrem Genom<br />
besitzen. Die Kreuzung dieser Mäuse mit Transaktivator-exprimierenden Mäusen führte zu<br />
Mauslinien, die in Abhängigkeit vom Expressionsprofil der Transaktivator-Maus eine<br />
regulierbarer Expression eines Transgens aufwiesen (Tab.1).<br />
Promotor Transaktivator Transgen<br />
P hCMV tTA Luciferase,<br />
Furth et al. (1994)<br />
β-Galactosidase<br />
P hCMV tTA Cre-Rekombinase St-Onge et al. (1996)<br />
P hCMV tTA/rtTA Luciferase Kistner et al. (1996)<br />
Promotor-Trap tTA Alkalische Phosphatase Böger und Gruss (1999)<br />
P hCMV*-1 tTA Luciferase (autoreguliert) Shockett et al. (1995)<br />
Gewebespezif. Transaktivator Transgen Expressionsort<br />
Promotor<br />
LAP tTA Luciferase Leber Kistner et al. (1996)<br />
MMTV-LTR tTA Bcr-Abl1 hämatopoetische Hüttner et al. (2000)<br />
Zellen<br />
NSE tTA Luciferase, tTA, ∆FosB Gehirn Chen et al. (1998)<br />
PrP tTA PrP Gehirn Tremblay et al. (1998)<br />
CaMKIIa tTA/rtTA Calcineurin-Mutante<br />
Calcineurin-Inhibitor<br />
Hdh<br />
Luciferase,<br />
Gehirn Mayford et al. (1996)<br />
Mansuy et al. (1998)<br />
Yamamoto et al. (2000)<br />
Krestel et al. (2001)<br />
β-Galactosidase<br />
Ednrb tTA/rtTA Ednrb Melanocyten Shin et al. (1999)<br />
Neuronen<br />
Tyr rtTA H-ras Melanocyten Chin et al. (1999)<br />
Wap rtTA Cre-Rekombinase Brustepithelzellen Utomo et al. (1999)<br />
RB rtTA Cre-Rekombinase Retina, Monocyten,<br />
Cerebellum<br />
Utomo et al. (1999)<br />
Tab. 1 Transaktivator-exprimierende Mauslinien<br />
Ausgewählte Mauslinien mit allgemeiner oder gewebespezifischer tTA/rtTA-Expression und Transaktivator-abhängiger Expression eines<br />
Transgens.
1 Einleitung 6<br />
1.1.2 Das Streptogramin-regulierte Expressionssystem PIPOff<br />
Um selbst produzierte Antibiotika tolerieren zu können, besitzen Streptomyces-Arten<br />
verschiedene Schutzmechanismen, die zusammen mit der Antibiotika-Produktion reguliert<br />
werden (Cundliffe, 1989). Eine wichtige Schutzkomponente stellt das Pristinamycin-<br />
Resistenzgen ptr dar (Blanc et al., 1995; Salah-Bey et al., 1995; Salah-Bey und Thompson,<br />
1995). Dessen Expression wird durch Streptogramine wie Pristinamycin, welche an das 28<br />
kDa Repressor-Protein Pip (Pristinamycin induced protein, Folcher et al. 2001) binden und<br />
dadurch die Interaktion <strong>von</strong> Pip mit dem Promotor P PTR aufheben kann, induziert.<br />
Von Fussenegger et al. (2000) wurde auf Basis des Pristinamycin-Resistenz Operons aus<br />
S.pristinaespiralis ein in Eukaryonten regulierbares Expressionssystem entwickelt (PIP-<br />
System). Dieses besteht aus einem Pristinamycin-abhängigen Transaktivator PIT und einem<br />
PIT-kontrollierten Promotor P PIR . Der Transaktivator PIT ist eine Fusion aus Pip und der<br />
Transaktivierungsdomäne VP16 (Triezenberg et al., 1988, Sadowski et al., 1988), der<br />
Promotor P PIR eine Fusion aus Pip-Bindungstellen des ptr-Promotors und der minimalen<br />
Variante des hsp70-Promotors (Corces und Pellicer, 1984). Durch Interaktion des<br />
Transaktivators PIT mit dem Promotor P PIR kann die Transkription eines beliebigen Gens<br />
induziert werden. Die Bindung <strong>von</strong> Pristinamycin an die Repressor-Domäne Pip <strong>von</strong> PIT<br />
führt zu einer Aufhebung der Interaktion PIT-P PIR und somit zu einer Reprimierung der vom<br />
Promotor P PIR kontrollierten Transkription (PIPOff-System). Durch zusätzliche Pip-<br />
Bindungsstellen im PIT-abhängigen Promotor (Fussenegger et al., 2000) und durch<br />
Baseninsertionen zwischen Pip-Bindungsstelle und minimalem Promotor (Weber et al.,<br />
2002b; Fux und Fussenegger, 2003a) kann die Transkriptionsinduktion verstärkt werden.<br />
Weiterhin wurden alternative PIT-Transaktivatoren mit verschiedenen, nicht-viralen (p65-,<br />
E2F4-Domäne) bzw. minimalen VP16-Transaktivierungsdomänen konstruiert (Weber et al.,<br />
2002b). Das Induktionspotenzial dieser Transaktivatoren weicht jedoch <strong>von</strong> dem des<br />
Transaktivators mit VP16-Domäne ab.<br />
1.1.3 Das Makrolid-regulierte Epxressionssystem E.REXOff<br />
Makrolid-Antibiotika können durch Bindung an die 50S-Untereinheit der bakteriellen 70S-<br />
Ribosomen die Proteinbiosynthese in Bakterien wie Heliobacter, Bordetella und Legionella<br />
ssp blockieren (Williams und Sefton, 1993; Guay, 1996). Von Noguchi et al. (1995) wurde<br />
aus dem E.coli-Stamm Tf481A das Gen mph(A) (macrolide-inactivating 2’-<br />
phosphotransferase I) isoliert, welches Resistenz gegenüber Makrolid-Antibiotika vermittelt.<br />
Die Expression dieses Resistenzgens wird durch den Repressor MphR(A) reguliert. Dieser<br />
kann an die 35 bp lange Operator-Sequenz ETR des mph(A)-Promotors binden und dadurch<br />
die Expression <strong>von</strong> mph(A) inhibieren (Noguchi et al., 2000). Durch Makrolid-Antibiotika<br />
wird die Interaktion MphR(A)-ETR aufgehoben, was <strong>zur</strong> Expression des Resistenzgens<br />
mph(A) führt.<br />
Von Weber et al. (2002a) wurden die Komponenten dieses Resistenz-vermittelnden Systems<br />
in ein eukaryontisches Expressionssystem adaptiert (E.REX-System). Dieses besteht aus dem<br />
Transaktivator ET und dem Transaktivator-abhängigen Promotor P ETR . Im Transaktivator ET<br />
ist der Repressor MphR(A) mit der Transaktivierungsdomäne VP16 (Triezenberg et al., 1988,<br />
Sadowski et al., 1988) fusioniert. Der ET-abhängige Promotor besteht aus einer ETR<br />
Operator-Sequenz und einem minimalen Promotor wie dem humanen CMV-Promotor<br />
P hCMVmin (Boshart et al., 1985; Gossen und Bujard, 1992) oder dem hsp70-Promotor P hsp70min<br />
(Corces und Pellicer, 1984). Durch Bindung <strong>von</strong> ET an die Operator-Sequenzen <strong>von</strong> P ETR<br />
kann die Expression eines beliebigen Gens induziert werden. Die Interaktion <strong>von</strong> Makrolid-<br />
Antibiotika wie Erythromycin mit der Repressor-Domäne des Transaktivators führt zu einer
1 Einleitung 7<br />
Aufhebung der Bindung ET-P ETR , so dass die P ETR -vermittelte Expression zum Erliegen<br />
kommt (E.REXOff-System). Es existieren auch Transaktivatoren mit nicht-viralen (p65-,<br />
E2F4-Domäne) bzw. verschiedenen minimalen VP16-Transaktivierungsdomänen<br />
(Kap.1.1.1.3), die jedoch weniger aktiv als der ursprüngliche Transaktivator ET mit VP16-<br />
Domäne sind (Weber et al., 2002b).<br />
1.1.4 Autoregulierte Expressionssysteme<br />
In einem <strong>autoregulierten</strong> System kontrolliert der Transaktivator-abhängige Promotor die<br />
Expression des Transaktivators (Abb.4). Wenige Transaktivator-Proteine initiieren durch<br />
Aktivierung des Transaktivator-abhängigen Promotors die Transkription <strong>von</strong> weiteren<br />
Transaktivatoren, was in einer positiven Rückkopplung letztlich zu einer hohen,<br />
intrazellulären Transaktivator-Konzentration und einer maximalen Transaktivator-abhängigen<br />
Expression eines beliebigen Gens führt (Shockett et al., 1995).<br />
A<br />
Transaktivator<br />
2 1 3<br />
Transgen<br />
Pmin<br />
Pmin<br />
Transaktivatorabhängiger<br />
Promotor<br />
B<br />
2<br />
1<br />
3<br />
Pmin<br />
IR<strong>ES</strong><br />
C<br />
3<br />
2<br />
1<br />
Pmin<br />
Pmin<br />
Abb. 4 Schematische Darstellung autoregulierter Expressionssysteme<br />
(1) Der Transaktivator-abhängige Promotor kontrolliert die Expression des Transaktivators. (2) Dieser bindet an die Operator-Sequenzen<br />
des Promotors und induziert wiederum die Transaktivator-Expression. (3) Gleichzeitig kommt es <strong>zur</strong> Induktion der Expression eines<br />
Transgens. (A) Dual-Promotor System: Transaktivator- und Transgen-Expressionseinheit befinden sich auf zwei getrennten oder einem<br />
Plasmid. (B) Der Promotor kontrolliert autoreguliert die Transkription einer bicistronischen mRNA, welche die Translation des<br />
Transaktivators und des Transgens erlaubt. (C) Ein bidirektionaler Promotor steuert die Transkription des Transaktivators und parallel die<br />
des Transgens.<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Shockett et al. (1995) wurde ein autoreguliertes TetOff-Expressionssystem<br />
in Zellen etabliert, das auf zwei getrennten Expressionseinheiten, die auf zwei unabhängigen<br />
Plasmiden positioniert sind, basierte (Abb.4A). Dies hat jedoch den Nachteil, dass zwei<br />
Transfektionsschritte für die Generierung regulierbarer Zelllininen erforderlich sind. Eine<br />
Alternative stellt die Positionierung der Expressionseinheiten in einem Plasmid dar (O’Brien<br />
et al., 1997). Jedoch können dabei durch mögliche Interferenzen zwischen den Promotoren<br />
(Cullen et al., 1984) die Expression und die Regulation des Systems beeinflusst werden.<br />
Durch bicistronische Anordnung der Gene kann dies verhindert werden (Abb. 4B). Auf diese
1 Einleitung 8<br />
Weise wurden autoregulierte TetOff- (Hofmann et al., 1996; Fussenegger et al., 1997; Moser<br />
et al., 2001), E.REXOff- (Weber et al., 2002c) und PIPOff-Expressionssysteme (Moser et al.,<br />
2000, 2001; Fux und Fussenegger, 2003b) generiert. Eine weitere Möglichkeit, mittels eines<br />
Plasmides ein autoreguliertes Expressionssystem in Zellen zu etablieren, bietet ein<br />
bidrektionaler Promotor. In einem <strong>autoregulierten</strong> Tet-System (Abb.4C) besteht dieser aus<br />
sieben tetO-Sequenzen, die <strong>von</strong> zwei minimalen Promotoren flankiert werden (Baron et al.,<br />
1995), die einerseits die Expression eines beliebigen Gens, anderseits die Expression eines<br />
Transaktivators wie tTA oder rtTA kontrollieren (Strathdee et al., 1999; Block et al., 2003;<br />
Chtarto et al., 2003).<br />
1.2 Rekombination<br />
Der Austausch <strong>von</strong> DNA-Sequenzen zwischen zwei Chromosomen oder DNA-Molekülen<br />
wird allgemein als Rekombination bezeichnet. Mittels Rekombination ist es möglich,<br />
genomische Bereiche in einer Zelle gezielt zu verändern. So können DNA-Sequenzen in das<br />
Genom <strong>von</strong> Zielzellen eingebracht (Targeting) bzw. entfernt (Exzision) oder invertiert<br />
(Inversion) werden. Man unterscheidet die homologe und die sequenzspezifische<br />
Rekombination. Integriert die DNA-Sequenz unspezifisch in einen zufälligen Genort, wird<br />
dies als illegitime oder nicht-homologe Rekombination bezeichnet (Übersicht: Roth und<br />
Wilson, 1986).<br />
1.2.1 Homologe Rekombination<br />
Homologe Rekombination ist ein in allen Organismen vorkommender, natürlicher Prozess,<br />
der <strong>zur</strong> Entstehung <strong>von</strong> genetischer Diversität und der Reparatur geschädigter DNA dient. Das<br />
erste Modell der homologen Rekombination wurde <strong>von</strong> Holliday (1968) aufgestellt und <strong>von</strong><br />
Meselson und Radding (1975) erweitert. Letztlich wurde <strong>von</strong> Szostak et al. (1983) das<br />
Doppelstrangbruch-Modell entwickelt. Der Initiationsschritt der homologen Rekombination<br />
in diesem Modell ist ein Doppelstrang-Bruch in einer der DNA-Sequenzen (Shinohara und<br />
Ogawa, 1995; Haber, 1997), dem sich ein DNA-Processing durch eine 5’-Exonuklease<br />
anschließt, wodurch lange 3’-terminale, einzelsträngige DNA-Überhänge entstehen (Abb.5A<br />
und B). Diese interagieren mit homologen Bereichen einer doppelsträngigen DNA<br />
(Heteroduplex, Abb.5C). Anschließend werden die Sequenzlücken aufgefüllt, und die Hybrid-<br />
DNA nimmt eine sogenannte Holliday-Struktur ein (Holliday, 1968; Abb.5D). Die Struktur<br />
kann sich vergrößern oder verkleinern bzw. „wandern“ bis eine DNA-Resolvase diese auf<br />
zwei gleichwertigen Wegen auflöst (Abb.5E).<br />
Homologe Rekombination ist ein häufig auftretender Prozess in Bakterien und Hefen. In<br />
Säugerzellen findet dieser Prozess jedoch nur selten statt. In Hefen kommt homologe<br />
Rekombination mit einer 10fach höheren Häufigkeit vor als die nicht-homologe<br />
Rekombination (Hinnen et al., 1978; Scherer und Davis, 1979; Rothstein, 1983). Dagegen ist<br />
die Wahrscheinlichkeit für homologe Rekombination in Säugerzellen mit ca. 1/1000 sehr<br />
gering (Folger et al., 1984; Lin et al., 1984, 1985; Smith und Berg, 1984; Smithies et al.,<br />
1984, 1985; Jasin et al., 1985; Thomas et al., 1986; Thomas und Capecchi, 1986, 1987;<br />
Doetschman et al., 1987; Zhang et al., 1994). Es wurde vermutet, dass dies möglicherweise<br />
mit der Größe des Säugergenoms zusammenhängt (bp Mensch : bp Hefe ≈ 340:1). Untersuchungen<br />
der Rekombination in anderen Organismen wie Dictyostelium discoideum (De Lozanne und<br />
Spudich, 1987), Schizosaccharomyces pombe (Wright et al., 1986) und Neurospora crassa<br />
(Case, 1986) zeigten jedoch keine eindeutige Korrelation zwischen Genomgröße und
1 Einleitung 9<br />
Frequenz der homologen bzw. nicht-homologen Rekombination. Auch die Anzahl homologer<br />
Zielsequenzen scheint die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination nicht zu<br />
beeinflussen (Thomas et al., 1986; Steele et al., 1984; Wallenburg et al., 1987). Allerdings<br />
konnte Kucherlapati et al. (1984) zeigen, dass homologe Rekombination mit hoher<br />
Wahrscheinlichkeit zwischen zwei transfizierten, nicht integrierten Plasmiden in Säugerzellen<br />
stattfindet. Dies kann einerseits mit einer hohen Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens<br />
der Plasmide, anderseits mit einer freien Zugänglichkeit der homologen Sequenzen in den<br />
Plasmiden, die im Gegensatz <strong>zur</strong> chromosomalen DNA nicht mit Proteinen assoziiert sind,<br />
erklärt werden.<br />
A<br />
Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA<br />
B<br />
DNA-Processing (5‘-Exonuklease)<br />
C<br />
Homologe Paarung der DNA<br />
D<br />
Auffüllen der Sequenzlücken<br />
E<br />
Modifikation und Auflösung der Holliday-Struktur<br />
DNA-Resolvase<br />
Abb. 5 Schematische Darstellung der homologen Rekombination<br />
(A) Nach einem Doppelstrangbruch in einer der DNA-Sequenzen kommt es zu (B) einem DNA-Processing durch eine 5’-Exonuklease. (C)<br />
Die entstandenen 3’-terminalen, einzelsträngigen DNA-Überhänge interagieren mit homologen Sequenzen des anderen DNA-Stranges<br />
(Heteroduplex-Struktur). (D) Die Sequenzlücken werden aufgefüllt (Holliday-Struktur). (E) Die Holliday-Struktur kann sich in ihrer Größe<br />
verändern bzw. verschieben. Eine DNA-Resolvase löst die Struktur letztlich auf.<br />
Mittels homologer Rekombination können Transgene in bekannte Genorte <strong>von</strong> murinen<br />
embryonalen Stammzellen integriert bzw. Mutationen bzw. Modifikationen in endogene Gene<br />
dieser Zellen eingefügt werden. Aus den <strong>ES</strong>-Zellen können anschließend durch<br />
Mikroinjektion in Mausblastozysten transgene Mauslinien generiert werden (Kap.1.3), die das<br />
Transgen (knock-in Mauslinie) bzw. ein verändertes endogenes Gen exprimieren oder<br />
aufgrund einer Mutation (Verlust <strong>von</strong> Exon-Bereichen, Verschiebung des Leserasters u.s.w.)<br />
ein endogenes Gen nicht exprimieren (knock-out Mauslinie). Die Häufigkeit der homologen<br />
Rekombination in <strong>ES</strong>-Zellen beträgt 10 -6 bis 10 -5 (Reid et al., 1991). Templeton et al. (1997)<br />
konnte durch veränderte Zellkultivierung und Selektion die Frequenz der homologen<br />
Rekombination auf 10 -1 erhöhen. Die Effizienz der Rekombination wird durch die Länge der<br />
homologen Bereiche bestimmt. Zwischen 2 bis 10 kbp nimmt die Frequenz der homologen<br />
Rekombination proportional zu (bis 100fach) und erreicht das Maximum bei 14 kbp. Längere<br />
homologe Bereiche führen zu keiner Verbesserung der Rekombinationseffizienz (Thomas et<br />
al., 1992). Auch das Ausmaß der Homologie zwischen Donor- und Akzeptor-DNA<br />
beeinflusst entscheidend die Rekombination. Sequenzen aus isogener DNA erhöhen die<br />
Effizienz der Rekombination um das 4- bis 5-fache im Vergleich zu Sequenzen aus nichtisogener<br />
DNA (Thomas et al., 1992). Die Rekombination zwischen nicht-isogenen DNA-<br />
Sequenzen führt zu einer Vielzahl <strong>von</strong> falschen Basenpaarungen in der Heteroduplex-Region.<br />
Durch Exonucleasen des Reparatur-Systems der Zelle werden beide DNA-Stränge dieser<br />
Hybrid-DNA abgebaut, was zu einer Degradation der gesamten DNA und damit zum Tod der
1 Einleitung 10<br />
Zelle führt (Rayssiguier et al., 1989; Selva et al., 1995; de Wind et al., 1995; Waldman und<br />
Liskay, 1988).<br />
1.2.2 Sequenzspezifische Rekombination<br />
Für die Manipulation eukaryontischer Genome kann neben der homologen Rekombination<br />
auch die sequenzspezifische Rekombination eingesetzt werden. Die am häufigsten<br />
verwendeten sequenzspezifischen Rekombinationssysteme sind das Cre/loxP- (Kap.1.2.2.1)<br />
und das Flp/FRT-System (Kap.1.2.2.2). Diese sind unabhängig <strong>von</strong> endogenen Faktoren, die<br />
für homologe Rekombination benötigt werden, und bestehen aus zwei Komponenten, der<br />
Rekombinase Cre bzw. Flp und den Rekombinase-Erkennungsstellen loxP bzw. FRT. Diese<br />
sogenannten „Sites“ enthalten eine Spacer-Region, die <strong>von</strong> entgegengesetzt orientierten<br />
Sequenzen flankiert wird. Die Rekombinase erkennt diese Sequenzen und katalysiert letztlich<br />
die reversible Rekombination zwischen den Erkennungsstellen. Aufgrund der Asymetrie des<br />
Spacers besitzen die Erkennungsstellen eine definierte Ausrichtung. Je nach Lage und<br />
Orientierung der Rekombinase-Erkennungsstellen zueinander ergeben sich unterschiedliche<br />
Rekombinationsereignisse. Befinden sich auf einem DNA-Abschnitt Erkennungsstellen mit<br />
inverser Orientierung (‚head-to-head’), führt die Rekombinase-vermittelte Rekombination zu<br />
einer Inversion der dazwischenliegenden DNA-Sequenz (Abb.6A). Bei gleicher Orientierung<br />
der Erkennungsstellen (‚head-to-tail’) findet eine Exzision der DNA statt (Abb.6B). Sind die<br />
Erkennungsstellen auf unterschiedlichen DNA-Molekülen lokalisiert, kommt es zu einer<br />
Integration, der Rückreaktion der Exzision (Abb.6B), oder zu einer Translokation (Abb.6C).<br />
Inversion und Exzision sind als monomolekulare Rekationen thermodynamisch begünstigt.<br />
Dagegen ist die Integration ein intermolekularer Prozess und deshalb vielfach ineffizienter als<br />
die Exzision.<br />
A<br />
Inversion<br />
B<br />
Exzision/Integration<br />
C<br />
Translokation<br />
Exzision<br />
Integration<br />
Rekombinase-Erkennungsstellen<br />
Abb. 6 Schematische Darstellung verschiedener, sequenzspezifischer Rekombinationsvorgänge<br />
(A) Die intramolekulare Rekombination zwischen invers orientierten Rekombinase-Erkennungsstellen führt zu einer Inversion der<br />
dazwischenliegenden DNA-Sequenz. (B) Bei gleicher Orientierung der Erkennungsstellen kommt es <strong>zur</strong> Exzision der dazwischenliegenden<br />
DNA-Sequenz und <strong>zur</strong> Bildung eines zirkulären DNA-Produktes. Der umgekehrte Weg, die Integration, verläuft weniger effizient als die<br />
Exzision. (C) Bei Lokalisierung der Erkennungsstellen auf unterschiedlichen DNA-Sequenzen kommt es <strong>zur</strong> Translokation. (Metzger und<br />
Feil, 1999)<br />
Die Rekombinasen Cre und Flp dieser Systeme gehören <strong>zur</strong> Integrase-Familie, die nach der<br />
Integrase des Bakteriophagen λ benannt ist, die die Integration des λ-Phagengenoms in das<br />
Genom <strong>von</strong> E.coli als auch dessen Exzision katalysiert. Bisher sind mehr als 30 verschiedene<br />
Integrasen aus unterschiedlichen Organismen isoliert und charakterisiert worden (Übersicht:<br />
Craig, 1988; Sadowski, 1993). Obwohl keine gemeinsamen DNA-Bindungsmotive existieren,
1 Einleitung 11<br />
scheint die Arbeitsweise der Integrasen konserviert zu sein. Im katalytischen Zentrum<br />
befinden sich die Aminosäuren Tyrosin, Histidin und Arginin (Argos et al., 1986). Tyrosin ist<br />
am Strangbruch, Histidin und Arginin an der Verknüpfung der rekombinierten DNA-Stränge<br />
beteiligt.<br />
Der Reaktionsmechanismus der Rekombinasen Cre und Flp ist ähnlich jedoch nicht identisch<br />
(Ringrose et al., 1998; Tribble et al., 2000; Übersicht: Van Duyne, 2001). Die<br />
sequenzspezifische Rekombination läuft in vier Stufen ab (Abb.7). Im ersten Schritt lagern<br />
sich Rekombinasen als Monomere an die Bindungsstellen der Erkennungssequenzen an<br />
(Andrews et al., 1987; Hoess und Abremski, 1984; Mack et al., 1992). Durch Protein-Protein-<br />
Interaktion kommt es <strong>zur</strong> Paarung der Rekombinasen (Beatty et al., 1986; Abremski und<br />
Hoess, 1985; Adams et al., 1992; Guo et al., 1997). Anschließend findet die Rekombination<br />
zwischen den Erkennungsstellen, eine Neuverknüpfung <strong>von</strong> DNA-Strängen statt (Stark et al.,<br />
1992), und im letzten Schritt dissoziieren die Rekombinasen <strong>von</strong> den Erkennungsstellen ab<br />
(Gates und Cox, 1988; Waite und Cox, 1995). Der Mechanismus der DNA-Neuverknüpfung<br />
wird allgemein als „konservative“ sequenzspezifische Rekombination bezeichnet. Während<br />
des Rekombinationsverlaufes werden zwei DNA-Stränge an definierten Stellen geschnitten<br />
und diese Stränge unverändert, d.h. ohne Abbau und Neusynthese <strong>von</strong> DNA, wieder<br />
verknüpft. Das bedeutet, dass keine genetischen Informationen zufällig, unspezifisch<br />
verändert oder verloren gehen. Für die sequenzspezifische Rekombination sind keine weiteren<br />
Faktoren notwendig (Stark et al., 1992).<br />
Da die Rekombinasen des Cre/loxP- und Flp/FRT-Systems sowohl Hin- als auch<br />
Rückreaktion der Rekombination katalysieren können (bidirektionale Reaktion), die<br />
Reaktionsrichtung bzw. das Reaktionsgleichgewicht jedoch nach thermodynamischen<br />
Stabilitätsbedingungen definiert wird, ist die Effizienz der Integrationsreaktion gering,<br />
während die Exzision bevorzugt wird. Sequenzspezifisch integrierte DNA-Bereiche im<br />
Genom sind deshalb in Gegenwart der Rekombinasen instabil. Aus diesem Grund sind<br />
stringente Selektionssysteme (O’Gorman et al., 1991; Schübeler et al., 1998; Francastel et al.,<br />
1999) oder Strategien, die nur ein temporäres Vorhandensein der Rekombinase ermöglichen<br />
(O’Gorman et al., 1991; Logie und Stewart, 1995; Metzger et al., 1995; Kellendonk et al.<br />
1996; Kühn et al., 1995), erforderlich.<br />
A Anlagerung der Rekombinasen<br />
an Erkennungsstellen<br />
B<br />
Paarung der Rekombinasen und Neuverknüpfung der DNA-Stränge<br />
Spacer<br />
C Dissoziation<br />
Abb. 7 Mechanismus der Rekombinase-vermittelten Exzision<br />
(A) Rekombinase-Monomere lagern sich an die Erkennungsstellen an. (B) Es kommt <strong>zur</strong> Paarung der Rekombinasen und <strong>zur</strong><br />
Neuverknüpfung der DNA-Stränge. (C) Die Rekombinasen dissoziieren <strong>von</strong> den Erkennungsstellen ab.
1 Einleitung 12<br />
Es existieren weitere Rekombinationssysteme wie das λ-Integrase- (Landy, 1989; Christ und<br />
Dröge, 2002; Christ et al., 2002) und das ΦC31-Integrase-System (Kuhstoss und Rao, 1991;<br />
Rausch und Lehmann, 1991; Thorpe und Smith, 1998). In beiden Systemen katalysiert die<br />
Integrase die Rekombination zwischen zwei unterschiedlichen Erkennungsstellen, attP und<br />
attB. Dies führt <strong>zur</strong> Bildung neuer Erkennungsstellen, attL und attR. Im ΦC31-Integrase-<br />
System können diese nicht mehr miteinander rekombinieren, so dass die Integration einer<br />
Sequenz irreversibel ist (Thorpe et al., 2000). Im λ-Integrase-System ist dagegen eine<br />
Rekombination zwischen diesen Erkennungsstellen möglich. Jedoch werden dafür andere<br />
exogene Kofaktoren benötigt als für die Rekombination zwischen attB und attP.<br />
1.2.2.1 Das Cre/loxP-System<br />
Um die bei der Replikation entstandenen Phagendimere in Monomere zerlegen zu können,<br />
besitzt der Bakterienphage P1 ein sequenzspezifisches Rekombinationssystem. Dieses besteht<br />
aus einer loxP-Site (locus of X-over), die sich singulär auf jedem zirkulären Phagenplasmid<br />
befindet, und einer 38 kDa großen Rekombinase Cre (Cyclization recombination), die loxP-<br />
Sites erkennt und die Rekombination zwischen zwei loxP-Sites katalysiert (Übersicht: Nagy,<br />
2000). Die Wildtyp loxP-Site besteht aus einem 8 bp langem Spacer, der <strong>von</strong> zwei 13 bp<br />
langen invertierten Sequenzen flankiert wird (Abb.8). An diese binden Cre-Rekombinasen<br />
(Hoess und Abremski, 1985) und katalysieren die Rekombination.<br />
Da das Cre/loxP-Rekombinationssystem keine Kofaktoren benötigt, konnte es in anderen<br />
Organismen wie E.coli, Hefe (Sauer und Henderson, 1990) und Maus (Lakso et al., 1992) und<br />
in Säugerzellen (Übersicht: Kilby et al., 1993; Sauer, 1994), so auch in <strong>ES</strong>-Zellen (Gu et al.,<br />
1993), etabliert werden.<br />
Insbesondere <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong> knock-out Mauslinien findet das Cre/loxP-System<br />
weitreichende Anwendung. Mittels homologer Rekombination können Gene konstitutiv<br />
abgeschaltet werden (Kap.1.2.1), was jedoch letal sein kann, da bestimmte Gene für die<br />
Embryogenese essentiell sind. Dieses Problem kann durch Kreuzung einer Mauslinie, in<br />
denen das Gen bzw. ein Exon durch loxP-Sites flankiert ist, mit einer Mauslinie, die gewebeoder<br />
entwicklungsspezifisch bzw. induzierbar die Rekombinase Cre exprimiert, umgangen<br />
werden. Durch Cre-vermittelte Exzision bestimmter Genabschnitte kann die Expression des<br />
Gens konditional statt konstitutiv reprimiert werden, was auch die Untersuchung der Funktion<br />
<strong>von</strong> Genen in bestimmten Entwicklungsstadien oder Zelltypen erlaubt (Übersicht: Orban et<br />
al., 1992; Kühn et al., 1995; Sauer, 1998; Metzger und Feil, 1999; Nagy, 2000).<br />
Mit dem Cre/loxP-Rekombinationssystem können jedoch nicht nur kurze DNA-Abschnitte<br />
aus dem Genom exzisiert werden (Gu et al., 1993). Die Cre-Rekombinase kann auch<br />
Rekombinationen zwischen loxP-Sites katalysieren, die mehrere Centimorgan auseinander,<br />
auf unterschiedlichen Chromosomen-Armen liegen (Ramirez-Solis et al., 1995; Li et al.,<br />
1996; Herault et al., 1998; Zheng et al., 2000). Neben Exzision genetischer Elemente können<br />
mittels des Cre/loxP-Systems auch DNA-Sequenzen in mit loxP-Sites markierte Genorte<br />
inseriert werden (Fukushige und Sauer, 1992; Baubonis und Sauer, 1993; Schübeler, 1998).<br />
Durch sogenannte „Pseudo-loxP“-Sites, die eine ähnliche Nukleotidsequenz wie das loxP-<br />
Element des Bakteriophagen P1 aufweisen und im Mammaliagenom vorkommen<br />
(Thyagarajan et al., 2000), kann es zu illegitimen Cre-vermittelten Rekombinationen<br />
kommen. Von Schmidt et al. (2000) wurde gezeigt, dass die Expression <strong>von</strong> Cre in Maus-<br />
Spermatiden zu Chromosomen-Rearrangements führt. Dieser, bei Cre-vermittelter<br />
Rekombination auftretende negative Effekt kann jedoch durch eine temporäre Expression <strong>von</strong><br />
Cre minimiert werden (Choulika et al., 1996; Silver und Livingston, 2001). „Pseudo-loxP“-<br />
Sites können auch gezielt <strong>zur</strong> Integration <strong>von</strong> endogenen DNA-Sequenzen benutzt werden
1 Einleitung 13<br />
(Sauer, 1996). Dafür bedarf es jedoch Cre-Rekombinasen, die spezifisch „Pseudo-loxP“-Sites<br />
erkennen (Buchholz und Stewart, 2001).<br />
loxP<br />
Spacer<br />
ATAACTTCGTATA<br />
GCATACAT<br />
TATACGAAGTTAT<br />
Abb. 8 Sequenz und Aufbau der Wildtyp loxP-Site<br />
1.2.2.2 Das Flp/FRT-System<br />
Viele Stämme der Hefe Saccaromyces cerevisia besitzen das sogenannte 2µ-Plasmid (Hartley<br />
und Donelson, 1980). Dieses enthält zwei komplementäre DNA-Sequenzen, die das Plasmid<br />
in zwei Bereiche abgrenzen. Diese Sequenzen sind Erkennungsstellen für die Rekombinase<br />
Flp, die ebenfalls auf dem Plamid kodiert vorliegt und die Rekombination zwischen diesen<br />
sogenannten FRT-Sites (Flp-recombinase Recognition Target) katalysiert. Da die im 2µ-<br />
Plasmid vorkommenden FRT-Sites invers orientiert sind, führt die Flp-vermittelte<br />
Rekombination zwischen den Sites zu einer Inversion eines Teils des Plasmides.<br />
Die FRT-Site besteht ähnlich wie die loxP-Site aus einer asymetrischen, 8 bp langen Spacer-<br />
Region (Abb.9), die für die Orientierung verantwortlich ist (Jayaram, 1985; Senecoff und<br />
Cox, 1986; Senecoff et al., 1985; McLeod et al., 1986). Flankiert wird diese Region <strong>von</strong><br />
invers angeordenten, 13 bp langen Sequenzwiederholungen und einer zusätzlichen<br />
Sequenzwiederholung, die jedoch für Rekombinationen entbehrlich ist (Senecoff und Cox,<br />
1986; Lyznik et al., 1993; Sadowski, 1995). Die den Spacer flankierenden Sequenzen stellen<br />
die Bindungsstellen für die 43 kDa große Flp-Rekombinase dar (Senecoff et al., 1988).<br />
Da das Flp/FRT-System wie das Cre/loxP-System nicht <strong>von</strong> weiteren Faktoren abhängig ist,<br />
konnte es auf Organismen wie E.coli (Huang et al., 1991), Drosophila (Golic und Lindquist,<br />
1989; Golic, 1991) und Maus (Dymecki, 1996; Dymecki und Tomasiewicz, 1998; Vooijs et<br />
al., 1998; Farley et al., 2000) und auf Planzen- und Säugerzellen (O’Gorman et al., 1991,<br />
Lyznik et al., 1993, Übersicht: Kilby et al., 1993) adaptiert werden. Das<br />
Rekombinationssystem dient der Exzision FRT-Sites flankierter Genbereiche und damit der<br />
Abschaltung bestimmter Gene z.B. Selektionsmarker (Fiering et al., 1993; Farley et al., 2000;<br />
Rodriguez et al., 2000; Schaft et al., 2001). Auch die Integration <strong>von</strong> DNA-Sequenzen über<br />
singuläre FRT-Sites ist mittels des FRT/Flp-Systems möglich (O’Gorman et al., 1991; Koch<br />
et al., 2000), es bedarf jedoch Selektionsfallen, da die Integration gegenüber der Exzision<br />
thermodynamisch benachteiligt ist (Schübeler et al., 1998; Verhoeyen et al., 1998). Im<br />
Gegensatz <strong>zur</strong> Cre-Rekombinase mit einem Temperatur-Optimum bei 37-39°C hat die<br />
Wildtyp Flp-Rekombinase ihre höchste Aktivität bei 25-30°C. Bei 37°C ist die Aktivität<br />
signifikant reduziert (Buchholz et al., 1996). Aufgrund der geringen Rekombinationseffizienz<br />
ist die Wildtyp Flp-Rekombinase daher für gezielte sequenzspezifische Rekombinationen in<br />
Zellkultur und transgenen Mäusen (Dymecki, 1996; Vooijs et al., 1998) weniger geeignet.<br />
Von Buchholz et al. (1998) wurde jedoch die thermostabilere Flp-Rekombinase Flpe (Flp-<br />
Recombinase enhanced) generiert. Mit dieser Rekombinase stellt das Flp/FRT-System eine<br />
Alternative zum etablierten Cre/loxP-Rekombinationssystem dar (Farley et al., 2000;<br />
Rodriguez et al., 2000).
1 Einleitung 14<br />
FRT<br />
Spacer<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
Abb. 9 Sequenz und Aufbau der Wildtyp FRT-Site<br />
1.2.2.3 Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch<br />
Die Cre- bzw. Flp-vermittelte Integration <strong>von</strong> DNA-Sequenzen in mit loxP- bzw. FRT-Sites<br />
markierte Genorte <strong>von</strong> Zellen ist thermodynamisch benachteiligt, da dieser Vorgang im<br />
Gegensatz <strong>zur</strong> Exzision ein monomolekularer Prozess ist. Eine weitaus effizientere Methode,<br />
eine beliebige DNA-Sequenz in einen Genort zu inserieren, stellt der Rekombinasevermittelte<br />
Kassettenaustausch, RMCE genannt (Recombinase-mediated Cassette Exchange),<br />
dar, der auf die Verwendung heterospezifischer Rekombinase-Erkennungsstellen beruht. Das<br />
Flp-basierte RMCE-Verfahren wurde erstmals <strong>von</strong> Schlake und Bode (1994), das Cre-basierte<br />
Verfahren <strong>von</strong> Bouhassira er al. (1997) vorgestellt.<br />
Durch verschiedene Mutationen, in erster Linie in der Spacer-Region, wurden FRT-Sites<br />
generiert (Tab.2), die ebenfalls <strong>von</strong> der Flp-Rekombinase erkannt werden, jedoch nicht mit<br />
der Wildtyp FRT-Site bzw. anderen mutierten FRT-Sites rekombinieren können (Senecoff<br />
und Cox, 1986; Umlauf und Cox, 1988; McLeod et al., 1986; Schlake und Bode, 1994).<br />
Zwischen homospezifischen FRT-Mutanten ist die Rekombination allerdings weiterhin<br />
möglich, ähnlich effizient wie zwischen Wildtyp FRT-Sites (Schlake und Bode, 1994).<br />
Spacer<br />
Wildtyp FRT<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
min. FRT<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M1 1<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAA_<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M2 1<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TTCTAGAAAA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M3 2<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAT<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M4 2<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGATA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M5 2<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAAC<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M6 3<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TTCTAGAA_<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M7 4<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTACTTA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M8 4<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TTCAAATA<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M9 4<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TCTAGAAG<br />
GTATAGGAACTTC<br />
M10 (F5) 4<br />
GAAGTTCCTATTCC<br />
GAAGTTCCTATTC<br />
TTCAAAAG<br />
GTATAGGAACTTC<br />
Tab. 2 Wildtyp FRT-Sites und verschiedene FRT-Mutanten<br />
Sequenz der Wildtyp FRT-Site im Vergleich zu diversen FRT-Mutanten (Veränderungen in der Sequenz der Spacer-Region sind<br />
unterstrichen): 1 veränderte Spacer-Länge, 2 Punktmutationen, 3 symetrischer Spacer, 4 mehrere Mutationen<br />
Der Kassettenaustausch beruht auf zwei sequenzspezifischen Rekombinationen zwischen<br />
homospezifischen FRT-Sites, die einerseits genomisch verankert, anderseits im sogenannten<br />
Austauschplasmid vorliegen. Da die FRT-Sites im Genom bzw. im Austauschplasmid<br />
heterospezifisch sind, kann die im Genom <strong>von</strong> den unterschiedlichen FRT-Sites<br />
eingeschlossenene DNA-Sequenz durch die, mit den selben FRT-Sites flankierte Sequenz im
1 Einleitung 15<br />
Austauschplasmid ersetzt werden (Abb.10). Eine Flp-vermittelte Integration des<br />
Austauschplasmids in eine der FRT-Sites oder eine Exzision der mit FRT-Sites flankierten<br />
DNA-Sequenzen findet nicht statt. Um unspezifische Integrationsereignisse zu vermeiden und<br />
Zellen mit ausgetauschter DNA-Sequenz zu selektieren, muss das Austauschereignis<br />
angereichert werden, entweder durch Wegfall eines Selektionsmarkers (Negativ-Selektion)<br />
oder Integration bzw. Aktivierung eines Selektionsmarkers (Positiv-Selektion). Zur Negativ-<br />
Selektion eignet sich Thymidinkinase aus HSV (Herpes Simplex Virus). Durch den Verlust<br />
dieses Gens können Zellen eine Gancyclovir-Selektion überleben. Dagegen kann<br />
Thymidinkinase in Zellen, in denen kein Austausch stattgefunden hat, Gancyclovir in ein<br />
toxisches Triphosphat umwandeln, was zum Tod der Zellen führt (Seibler und Bode, 1997).<br />
Bei Positiv-Selektion wird mit dem Austausch ein vollständiger Positiv-Selektionsmarker<br />
integriert (Schübeler et al., 1998) oder ein ATG-defizienter, bereits genomisch verankerter<br />
Positiv-Selektionsmarker wie Neomycinphosphotransferase durch Integration eines<br />
Startcodons aktiviert (Verhoeyen et al., 1998, 2001).<br />
Durch Mutationen der Wildtyp loxP-Site in der Spacer-Region konnten auch loxP-Mutanten<br />
generiert werden, die nicht mit anderen loxP-Sites rekombinieren (Hoess et al., 1986;<br />
Bouhassira et al., 1997; Bethke und Sauer, 1997; Lee und Saito, 1998; Lee et al., 2000;<br />
Langer et al., 2002) und somit für RMCE-Verfahren einsetzbar sind (Bethke und Sauer, 1997;<br />
Soukharev et al., 1999; Langer et al., 2002). Eine weitere Möglichkeit <strong>zur</strong> effizienten<br />
Integration <strong>von</strong> DNA-Sequenzen bieten die loxP-Sites lox66 und lox71, die Mutationen in<br />
ihren flankierenden Sequenzen, nicht jedoch in der Spacer-Region aufweisen (Albert et al.,<br />
1995; Araki et al., 1997). Die Rekombination zwischen diesen loxP-Sites führt <strong>zur</strong><br />
Ausbildung einer Wildtyp loxP-Site und einer loxP-Mutante, welche die flankierenden<br />
Sequenzen der lox66- und lox71-Site aufweisen.<br />
chromosomal integrierte<br />
DNA-Sequenz<br />
F1<br />
F2<br />
F1<br />
F2<br />
Rekombinase<br />
+<br />
F1<br />
Austauschplasmid<br />
F2<br />
F1<br />
F2<br />
Abb. 10 Schematische Darstellung des Kassettenaustausches (RMCE) am Beispiel des Flp/FRT-Systems<br />
Die heterospezifischen Rekombinase-Erkennungsstellen F1 und F2 (FRT-Sites) rekombinieren nicht miteinander sondern nur untereinander.<br />
Dadurch kann eine DNA-Sequenz, die auf dem Austauschplasmid mit den Erkennungsstellen F1 und F2 flankiert ist, in einen Genort, der die<br />
gleichen Erkennungsstellen aufweist, sequenzspezifisch integriert werden.<br />
Ein Problem beim Kassettenaustausch besteht darin, dass das Austauschkonstrukt nicht nur<br />
sequenzspezifisch in den markierten Genort sondern zusätzlich in zufällige Loci durch<br />
illegitime Rekombination integrieren kann. Dies reduziert die Austauscheffizienz, da nicht<br />
nur Klone selektiert werden, die einzig im markierten Genort die Austauschkassette inseriert<br />
haben (Seibler, 1999). Da die Integration zirkulärer Plasmide in das Genom <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen<br />
sehr ineffizient ist, kann erwartet werden, dass ein Kassettenaustausch in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
vorwiegend zu Austauschklonen mit ausschließlich im markierten Genort integrierter<br />
Austauschkassette führt. In anderen Zellen wie NIH3T3 können dagegen zirkuläre Plasmide<br />
effizient in zufällige Genorte integrieren. Ein Kassettenaustausch in diesen Zellen ist deshalb<br />
häufig verbunden mit zusätzlichen Integrationen des Austauschplasmides. Dadurch erhöht<br />
sich der Screening-Aufwand nach Klonen, bei denen allein im markierten Genort das<br />
Austauschkonstrukt inseriert vorliegt.
1 Einleitung 16<br />
1.3 Embryonale Stammzellen und in vitro Differenzierung<br />
Von Evans und Kaufman (1981) als auch <strong>von</strong> Martin (1981) wurden undifferenzierte <strong>ES</strong>-<br />
Zellen (embryonic stem cells) aus der inneren Zellmasse (ICM: inner cell mass) <strong>von</strong> 3.5 Tage<br />
alten Blastozysten isoliert, die nach Reimplantation in Mausblastozysten wieder <strong>zur</strong><br />
Generierung <strong>von</strong> Mäusen beitrugen (Gossler et al., 1986; Robertson et al., 1986; Mansour et<br />
al., 1988; Thomas und Capecchi, 1987). Dies eröffnete die Möglichkeit, <strong>ES</strong>-Zellen in vitro zu<br />
manipulieren und mit diesen Zellen transgene Mauslinien zu etablieren. Für die<br />
Gewährleistung der Pluripotenz der <strong>ES</strong>-Zellen müssen diese in LIF (Leukemia inhibitory<br />
factor)-haltigem Medium kultiviert werden, da dieser Faktor die Differenzierung der Zellen<br />
verhindert (Smith und Hooper, 1987; Williams et al., 1988; Niwa et al., 1998; Matsuda et al.,<br />
1999). Ähnliche Wirkung zeigen auch andere Faktoren wie CNF (Ciliary neurotrphic factor)<br />
und OSM (Oncostatin M) (Conover et al., 1993; Piquet-Pellorce et al., 1994; Rose et al.,<br />
1994). Durch verschiedene Techniken wie homologe oder sequenzspezifische Rekombination<br />
(Kap.1.2) können in <strong>ES</strong>-Zellen Transgene integriert oder endogene Gene manipuliert oder<br />
deletiert werden (Smithies et al., 1985; Thomas und Capecchi, 1987; Doetschman et al.,<br />
1988). Diese transgenen <strong>ES</strong>-Zellen kann man anschließend <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong> knock-in<br />
bzw. knock-out Mauslinien einsetzen.<br />
Embryonale Stammzellen besitzen die Fähigkeit, in vitro spontan zu differenzieren. In<br />
Suspension schließen sich diese zu Embryo-ähnlichen Aggregaten, sogenannten Embryonic<br />
Bodies (EB) zusammen (Doetschman et al., 1985). Innerhalb <strong>von</strong> 5 Tagen bilden diese eine<br />
äußere endodermale Zellschicht, die <strong>von</strong> einer Basallamina umgeben ist, und eine innere<br />
Schicht aus Zellen ektodermalen und mesodermalen Ursprungs aus, strukturell vergleichbar<br />
mit einem 5-Tage alten Mausembryo. Diese Aggregate entwickeln sich dann weiter zu<br />
cystischen Emryonic Bodies, die durch typische Strukturen wie Microvilli und typische<br />
Genexpressionen wie alpha-Foetoprotein und Transferrin-Expression charakterisiert sind, und<br />
einem 8- bis 10-Tage alten visceralen Dottersack ähneln. Auf Zellkulturplatten ausplattiert<br />
wachsen aus den Aggregaten differenzierte Zellen endodermaler, ektodermaler und<br />
mesenchymaler Abstammung. Diese komplexen, multizellulären Zellrasen werden auch als<br />
Outgrowths bezeichnet und bestehen aus Skelettmuskelzellen und glatten Muskelzellen<br />
(Miller-Hance et al., 1993, Rohwedel et al., 1994), vaskulären glatten Muskelzellen (Risau et<br />
al., 1988, Drab et al., 1997), Kardiomyocyten (Miller-Hance et al., 1993), neuronalen Zellen<br />
mit synaptischen Verbindungen (Bain et al., 1995, Rohwedel et al., 1998b, Strübing et al.,<br />
1995), Glial-Zellen (Fraichard et al., 1995, Brüstle et al., 1999, Liu et al., 2000), Adipocyten<br />
(Dani et al., 1997), Chondrocyten (Wobus et al., 2000), Epithelzellen (Bagutti et al., 1996),<br />
Endothelzellen (Risau et al., 1988, Wang et al., 1992) und hematopoetischen Zellen (Schmitt<br />
et al., 1991, Keller et al., 1993, Choi et al., 1998).<br />
Durch Zugabe bestimmter Faktoren zu definierten Zeitpunkten der Kultivierung können<br />
bestimmte Differenzierungen forciert werden. So wird zum Beispiel durch BMP-2/-4<br />
Chondrogenese induziert (Kramer et al., 2000) und Neurogenese inhibiert (Finley et al.,<br />
1999, Wiles und Johansson, 1999). Die Differenzierung zu mesodermalen Zellen kann durch<br />
die Faktoren Activin A, EGF (Epidermal Growth Factor) und bFGF/FGF-2 (basic Fibroblast<br />
Growth Factor/Fibroblast Growth Factor 2) stimuliert werden, wobei letztere auch eine<br />
ektodermale Differenzierung induzieren (Brüstle et al., 1999, Schuldiner, M. et al., 2000). Der<br />
wichtigste Faktor für eine zielgerichtete Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen zu mesodermalen und<br />
ektodermalen Zellen ist jedoch all-trans-Retinsäure. Dabei beeinflussen die eingesetzte<br />
Konzentration und der Zeitpunkt der Induktion entscheidend die Differenzierungsrichtung.<br />
So induziert 10 -7 M Retinsäure zwischen Tag 0 und 2 (Strübing et al., 1995, Fraichard et al.,<br />
1995) bzw. 5⋅10 -7 M Retinsäure zwischen Tag 4 und 8 der Differenzierung (Bain et al., 1995,<br />
Liu et al., 2000) die Neurogenese. Dagegen verhindert eine Retinsäure-Induktion in der<br />
Konzentration <strong>von</strong> 10 -7 M zwischen Tag 0 und 2 (Rohwedel et al., 1998a) bzw. <strong>von</strong> 10 -8 M bis
1 Einleitung 17<br />
10 -6 M zwischen Tag 2 und 5 (Dani et al., 1997) die Bildung <strong>von</strong> Kardiomyocyten. Mit 10 -8 M<br />
Retinsäure ab Tag 5 kann die Kardiogenese jedoch stimuliert werden (Wobus et al., 1997).<br />
Gleichzeitig kommt es dabei <strong>zur</strong> Induktion der Vaskulogenese (Drab et al., 1997) und<br />
Inhibierung <strong>von</strong> Myogenese und Adipogenese (Wobus et al., 1997). Eine 10 -8 M Retinsäure-<br />
Induktion zwischen Tag 2 und 5 kann eine Differenzierung zu Skelettmuskelzellen (Wobus et<br />
al., 1994) und Adipocyten (Dani et al., 1997) bewirken. In Tabelle 3 sind terminale<br />
Retinsäure-Induktionen und resultierende Differenzierungsrichtungen zusammengefasst.<br />
Retinsäure-Induktion an Tag:<br />
Retinsäure induziert: 0-2 2-5 >5<br />
Neurogenese ++ (1⋅10-7M RA) + * (5⋅10 -7 M RA) ±<br />
Kardiogenese −− (1⋅10 -7 M RA) −− (1⋅10 -8 M RA) +<br />
(1⋅10 -8 M RA)<br />
Myogenese ± ++ (1⋅10 -8 M RA) −<br />
(1⋅10 -8 M RA)<br />
Adipogenese − ++ (1⋅10 -8 M RA) −<br />
(1⋅10 -8 M RA)<br />
Vaskulogenese ± +<br />
(1⋅10 -8 M RA)<br />
Tab. 3 Terminale Retinsäure-Induktion und Folgen auf die in vitro Differenzierung<br />
Neurogenese, Kardiogenese, Myogenese, Adipogenese, Vaskulogenese werden in Abhängigkeit <strong>von</strong> einer zeitlich begrenzter Induktion mit<br />
Retinsäure (RA) am Tag 0-2, Tag 2-5 oder ab dem 5. Tag der in vitro Differenzierung unterschiedlich beeinflusst: ++ starke Induktion,<br />
+ Induktion, ± keine Induktion/Inhibition, − Inhibition, −− starke Inhibition (*: 4 Tage ohne, 4 Tage mit Retinsäure)<br />
Durch die in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen ist es möglich, die in vivo Differenzierung<br />
im Embryo nachzuahmen. Während der <strong>ES</strong>-Zelldifferenzierung werden in ähnlicher Weise<br />
wie bei der Embryogenese der Maus gewebespezifische Gene, Proteine, Ionenkanäle und<br />
Rezeptoren in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium exprimiert (Übersicht: Rohwedel et<br />
al., 1999, Guan et al., 1999). Somit eignet sich dieses Modell, um in der Zellkultur die<br />
Embryogenese und den Einfluss verschiedener Faktoren wie Wachstumsfaktoren (Übersicht:<br />
Schuldiner et al., 2000), aber auch den Effekt <strong>von</strong> Genabschaltung, Überexpression<br />
bestimmter Gene und Expression <strong>von</strong> Transgenen auf und während der Differenzierung<br />
untersuchen zu können.<br />
1.4 Aufgabenstellung<br />
Die meisten derzeit angewandten Verfahren <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong> transgener Mäuse erfordern ein<br />
weitläufiges Screening <strong>von</strong> Tieren, da die zufällige Integration eines Transgens zu einer, vom<br />
Integrationsort abhängigen und daher nicht <strong>vorhersagbaren</strong> Expression des Transgens führt.<br />
Da die Möglichkeit besteht, aus <strong>ES</strong>-Zellen transgene Mäuse zu generieren, sollten im Rahmen<br />
dieser Arbeit transgene <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> etabliert werden, in denen chromosomale Loci mit<br />
unterschiedlichen FRT-Sites markiert sind, so dass durch Flp-vermittelte Rekombination ein<br />
beliebiges Transgens in diese Loci über Kassettenaustausch integriert werden kann. Da bei<br />
diesem Verfahren bereits charakterisierte Genorte wiederverwendet werden, sollte es möglich<br />
sein, die Expression des Transgens vorherzusagen. Um die Expression eines Transgens<br />
exogen beeinflussen zu können, sollte eine Tetracyclin-abhängige, autoregulierbare<br />
Expressionskassette für die Markierung und Charakterisierung der Genorte in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Verwendung finden.<br />
Im ersten Teil der Arbeit sollte überprüft werden, ob durch Integration einer <strong>autoregulierten</strong><br />
TetOff-Expressionskassette in unbekannte chromosomale Genorte durch illegitime<br />
Rekombination und in bekannte Genorte mittels homologer Rekombination <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong><br />
generiert werden können, die eine hohe, strikt regulierbare Reportergen-Expression<br />
aufweisen. Zu Vergleichszwecken sollte das autoregulierte Expressionssystem außerdem in<br />
NIH3T3-Zellen etabliert werden, da in mehreren Publikationen bereits erfolgreich gezeigt
1 Einleitung 18<br />
werden konnte, dass in differenzierten Zellen das TetOff-System funktional ist. Im zweiten<br />
Teil der Arbeit sollte ein Kassettenaustausch durchgeführt werden. Dazu sollte eine<br />
genomisch integrierte, autoregulierte Kassette Flp-vermittelt durch eine ähnlich aufgebaute,<br />
autoregulierte Austauschkassette ersetzt und deren Expression mit der der parentalen Kassette<br />
im selben Genort verglichen werden.<br />
Weiterhin sollten die Expressionseigenschaften eines <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes in in vitro<br />
differenzierten Zellen im Vergleich zu undifferenzierten <strong>ES</strong>-Zellen beurteilt werden, um<br />
mögliche Rückschlüsse auf die Expression der Kassette in transgenen Mäusen ziehen zu<br />
können.
2 Ergebnisse 19<br />
2 Ergebnisse<br />
Ziel dieser Arbeit war die <strong>Etablierung</strong> eines autoregulierbaren Expressionssystems <strong>zur</strong><br />
Markierung hoch exprimierender und regulierbarer Genorte in murinen embryonalen<br />
Stammzellen. Dabei sollte gewährleistet werden, dass nachträglich in diese Genorte durch<br />
sequenzspezifische, Flp-Rekombinase vermittelte Rekombination andere Expressionskassetten<br />
inseriert werden können.<br />
2.1 Strategie zum Auffinden und Wiederverwenden regulierbarer Genorte<br />
2.1.1 Die autoregulierte Expressionskassette LUCTP <strong>zur</strong> Identifizierung <strong>von</strong><br />
regulierbaren Genorten<br />
Zur Identifizierung <strong>von</strong> wiederverwendbaren, chromosomalen Loci in Zellen wurde der auf<br />
dem TetOff-System basierende, autoregulierte Expressionsvektor LUCTP konstruiert<br />
(Abb.11A). Dieser enthält einen bidirektionalen, Transaktivator-abhängigen Promotor P bi<br />
(Baron et al., 1995), der die Transkription einer bicistronischen mRNA erlaubt, die einerseits<br />
zu einer cap-abhängigen Expression des für eine Autoregulation notwendigen Transaktivators<br />
tTA (1. Cistron) und zu einer Polio-IR<strong>ES</strong> vermittelten, cap-unabhängigen Expression des<br />
Positiv-Negativ-Selektionsmarkers Tkneo (2. Cistron) führt (Abb.11A). Außerdem wird durch<br />
den Promotor die Expression der Firefly-Luciferase aus Photinus pyralis (Leuchtkäfer)<br />
gewährleistet, welche die Oxidation <strong>von</strong> Luciferin in Oxyluciferin katalysiert. Bei dieser<br />
Reaktion werden Photonen freigesetzt, die durch photodetektorische Messung Auskunft über<br />
die Höhe der Expression des Enzyms in untersuchten Zellen geben. Im Tkneo-Gen ist das<br />
Neomycinphosphotransferase-Gen (neo) aus dem bakteriellen Transposon Tn5 im Leseraster<br />
mit dem Thymidinkinase-Gen (Tk) aus dem Herpes Simplex Virus fusioniert. Durch die<br />
Neomycinphosphotransferase-Aktivität des exprimierten Fusionsproteins Tkneo wird<br />
Resistenz gegen das Gentamycin-Derivat G418 (Aminoglycosid-Antibiotikum), welches die<br />
Translation hemmt, vermittelt. Dadurch können die Zellen, die nach chromosomaler<br />
Integration der Expressionskassette Tkneo exprimieren, selektiert werden (Positiv-Selektion).<br />
Durch die Thymidinkinase-Aktivität <strong>von</strong> Tkneo werden die Zellen gegen Gancyclovir, ein<br />
Guanosin-Antimetabolit, sensitiv. Zur Wiederverwendung markierter Genorte ist die Kassette<br />
am 5’-Ende durch eine Wildtyp FRT-Site F und im 3’-Bereich im Fusionsgen zwischen<br />
Thymidinkinase- und Neomycinphosphotransferase-Gen durch die FRT-Mutante F5 (Tab.2)<br />
flankiert.<br />
2.1.2 Strategie zum Austausch der Reportergen-Kassette gegen beliebige biologisch<br />
aktive Gene<br />
Über die heterospezifischen FRT-Sites F und F5 der im Genort verankerten Kassette LUCTP<br />
kann ein Austauschplasmid, das ebenfalls <strong>von</strong> den FRT-Sites F und F5 flankiert wird, mittels<br />
sequenzspezifischer, Flp-vermittelter Rekombination in den markierten Locus integriert<br />
werden (Kap.1.2.2.3). In Abbildung 11B ist schematisch der Kassettenaustausch dargestellt.<br />
Eine Exzision der integierten Kassette kann nicht stattfinden, da die FRT-Sites F und F5 nicht<br />
miteinander rekombinieren können. Die Zellen, bei denen ein Kassettenaustausch<br />
stattgefunden hat, können anhand des Verlustes des Thymidinkinase-Gens selektiert werden<br />
(Negativ-Selektion). Durch die fehlende Thymidinkinase-Aktivität wird Gancyclovir nicht in
2 Ergebnisse 20<br />
ein, für die Zellen toxisches Triphosphat umgewandelt. Dagegen sollten die Zellen, bei denen<br />
die DNA-Kassette nicht ausgetauscht wurde, absterben. Nach Kassettenaustausch befindet<br />
sich an der Stelle des Thymidinkinase-Gens ein Startcodon im Leseraster zum verbliebenen<br />
neo-Gen. Dadurch können die Zellen aufgrund ihrer Neomycinphosphotransferase-Aktivität<br />
weiterhin mit G418 selektiert werden (G418-Resistenz).<br />
A<br />
Markierung <strong>von</strong> Genorten in Zellen mit dem Vektor LUCTP<br />
Autoregulierter Vektor LUCTP<br />
F<br />
P bi<br />
F5 loxP loxP<br />
5‘ pA Luciferase tTA Polio TK- neo pA 3‘<br />
Transkription<br />
(mRNA):<br />
Luciferase<br />
tTA<br />
TK<br />
neo<br />
Translation<br />
(Protein):<br />
Luciferin<br />
Firefly-Luciferase<br />
Oxyluciferin<br />
+ Lichtenergie<br />
Transaktivator<br />
tTA<br />
Fusionsprotein Tkneo:<br />
Thymidinkinase-/Neomycinphosphotransferase-Aktivität<br />
B<br />
Kassettenaustauschstrategie<br />
Markierter Genort<br />
P bi<br />
F5 loxP loxP<br />
5‘ pA Luciferase tTA Polio TK- neo pA 3‘<br />
Austauschkonstrukt<br />
F<br />
P bi<br />
F5<br />
Flp-Rekombinase<br />
(Flipase)<br />
pA<br />
Gen X<br />
tTA<br />
IR<strong>ES</strong><br />
pA<br />
ATG<br />
RMCE<br />
Genort nach Kassettenaustausch<br />
F<br />
P bi<br />
F5 loxP loxP<br />
5‘ pA Gen X<br />
tTA IR<strong>ES</strong> neo pA 3‘<br />
ATG<br />
Genort nach Exzision <strong>von</strong><br />
Neomycinphosphotransferase<br />
Cre-Rekombinase<br />
F<br />
P bi<br />
F5 loxP<br />
5‘<br />
pA<br />
Gen X<br />
tTA<br />
IR<strong>ES</strong><br />
pA 3‘<br />
ATG<br />
Abb. 11 Schematische Darstellung der Markierungs- und Kassettenaustauschstrategie<br />
(A) Schematische Darstellung des Aufbaus der <strong>autoregulierten</strong> Expressionskassette LUCTP: Der bidirektionale Promotor Pbi vermittelt die<br />
Transaktivator-abhängige Bildung zweier mRNAs, die einerseits der Expression des Reporters Luciferase, anderseits der Expression des<br />
Transaktivators tTA (TA) und der Polio-IR<strong>ES</strong> vermittelten Expression des Selektionsmarkers Tkneo, ein Fusionsprotein aus Thymidinkinase<br />
(Tk) und Neomycinphosphotransferase (neo), dienen. (B) Schematische Darstellung des Kassettenaustausches: Nach Integration der<br />
<strong>autoregulierten</strong> Kassette in das Genom <strong>von</strong> Zellen kann diese über die heterospezifischen FRT-Sites F und F5 durch sequenzspezifische, Flp-<br />
Rekombinase vermittelte Rekombination gegen eine Austauschkassette, die mit gleichen FRT-Sites versehen ist, ausgetauscht werden<br />
(RMCE: Recombinase mediated cassette exchange). Dabei kommt es zum selektierbaren Verlust des Thymidinkinase-Gens. Durch ein<br />
inseriertes Startcodon ATG im 5’-Bereich des neo-Gens wird die Neomycinphosphotransferase-Aktivität der Zellen aufrechterhalten. Das<br />
neo-Gen kann anschließend über die flankierenden loxP-Sites mittels Cre-Rekombinase vermittelter Rekombination exzisiert werden.
2 Ergebnisse 21<br />
Das neo-Gen kann einen negativen Einfluss auf die Expression benachbarter Gene ausüben<br />
(Artelt et al., 1991). Daher ist es <strong>von</strong> zwei loxP-Sites flankiert, wodurch es Cre-vermittelt<br />
exzisiert werden kann (Kap.1.2.2.1). Insbesondere nach <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> parentalen <strong>ES</strong>-<br />
<strong>Zelllinien</strong> bzw. <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen mit Austauschkonstrukt und folgender Generierung transgener<br />
Mauslinien ist angedacht, diese Mäuse mit Cre-exprimierenden Mäusen zu kreuzen, was zum<br />
Verlust des Gens in den Nachkommen führt.<br />
2.2 <strong>Etablierung</strong> eines TetOff-Expressionssystems in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
2.2.1 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität <strong>von</strong> LUCTP in<br />
NIH3T3-Zellen<br />
Das Expressionsverhalten und die Regulationskapazität des Vektors LUCTP wurden zunächst<br />
in Zellen der Mausfibroblasten-Zelllinie NIH3T3 überprüft. Dazu wurde der linearisierte<br />
Vektor in die Zellen elektroporiert und die Zellen anschließend mit G418-haltigem Medium<br />
selektiert. Zehn G418-resistente Klone wurden hinsichtlich Kopienzahl im Southern-Blot<br />
analysiert. Dazu wurden die genomischen DNAs der Klone mit dem Restriktionsenzym PvuII<br />
geschnitten und mit der Tkneo-Sonde, welche gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet<br />
ist, hybridisiert (Abb.12A). Dadurch konnten Randfragmente nachgewiesen werden, deren<br />
Größe <strong>von</strong> der Entfernung zwischen der PvuII-Schnittstelle im 3’-Bereich der inserierten<br />
Kassette und der nächstgelegenen PvuII-Schnittstelle im Genom abhängig und für jeden<br />
genomischen Integrationsort spezifisch ist (Randfragment-Detektion).<br />
Die Southern-Blot Analyse zeigte, dass die Klone 4 und 8 eine singuläre Kopie der<br />
Expressionskassette besitzen (Abb.12B). Die ähnliche Größe des detektierten DNA-<br />
Fragmentes lässt jedoch nicht ausschließen, dass diese beiden Klone Subklone eines<br />
gemeinsamen parentalen Klons sind. In den restlichen Klonen wurden mehrfache genomische<br />
Integrationen der LUCTP-Kassette nachgewiesen.<br />
A LUCTP<br />
F<br />
F5<br />
5‘ pA Luciferase tTA POLIO TKneo<br />
PvuII<br />
PvuII<br />
pA 3‘<br />
B<br />
1 kb<br />
> 0.8 kb<br />
Tkneo-Sonde<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
7<br />
8 9 10<br />
K<br />
21.2 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
1.4 kb<br />
Abb. 12 Southern-Blot Analyse der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTP-Kassette<br />
(A) Schematische Darstellung des Konstruktes LUCTP nach Integration in das Genom <strong>von</strong> NIH3T3-Zellen. Tkneo-Sonde: DNA-Sonde<br />
gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens, Fragment des HindIII/PvuII geschnittenen Vektors pSBC2TKneoLML (B) Nach Elektroporation <strong>von</strong><br />
10 µg des mit den Restriktionsenzymen Bst1107I/XmnI linearisierten Vektors LUCTP in 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen wurden 10 Klone selektiert.<br />
Die HMW-DNAs der NIH3T3-Klone wurden mit PvuII geschnitten. Zum Nachweis der Kopienzahl wurde die DNA mit der Tkneo-Sonde<br />
hybridisiert: Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf mehrfache Integrationen der jeweiligen Kassette<br />
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert, Spur K: parentale NIH3T3-Zellen
2 Ergebnisse 22<br />
Zur Bestimmung des Expressions- und Regulationspotenzials der Klone wurde die relative<br />
Luciferase-Expression der Klone im induzierten als auch reprimierten Zustand untersucht und<br />
daraus der Regulationsfaktor RF berechnet (Abb.13). Die Klone zeigten teilweise hohe<br />
Luciferase-Expressionen im induzierten Zustand, insbesondere die Klone 4 und 8 mit<br />
singulärer Integration der Kassette LUCTP (∼40000 bzw. ∼44000 rlu), und niedrige<br />
Basalexpressionen im reprimierten Zustand (∼12 bis ∼290 rlu), was sich in hohen<br />
Regulationsfaktoren widerspiegelt. Die Unterschiede zwischen den Expressionshöhen der<br />
verschiedenen Klone (∼2500 bis ∼44000 rlu) lassen sich damit erklären, dass die den<br />
Integrationsort der Kassette im Genom umgebenen Sequenzen die Expression <strong>von</strong> LUCTP<br />
sowohl negativ als auch positiv beeinflussen können (Positionseffekt).<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
100000<br />
10000<br />
1000<br />
100<br />
10<br />
10492<br />
19709 21173<br />
39758<br />
7186<br />
10958<br />
24575<br />
43647<br />
9261<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
2522<br />
1<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
RF 130 130 116 160 117 296 85 222 281 215<br />
Abb. 13 Luciferase-Expression der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTP-Kassette<br />
Zellen der isolierten LUCTP-Klone wurden unter induzierenden (-Doxycyclin) und –reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen kultiviert<br />
und abschließend hinsichtlich der Luciferase-Aktivität untersucht. Die relative Luciferase-Expression [rlu] wird durch den Quotienten aus<br />
der gemessenen Luciferase-Aktivität und der Proteinmenge des bei der Messung eingesetzten Zelllysats dargestellt. Der Regulationsfaktor<br />
RF wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten (•) und reprimierten () Zustand gebildet.<br />
Um die Kassettenaustauschstrategie (Abb.11B) zu überprüfen, wurde beabsichtigt, in<br />
NIH3T3-Zellklonen das singulär integrierte Expressionskonstrukt gegen eine andere<br />
autoregulierte Kassette auszutauschen. Entsprechend dem Konzept findet die Anreicherung<br />
<strong>von</strong> Zellen, in denen ein Austausch stattgefunden hat, über den Verlust der Thymidinkinase-<br />
Expression statt (Kap.2.1.2). Dies setzt jedoch eine ausreichende Thymidinkinase-Aktivität in<br />
den parentalen Zellklonen voraus, die durch die Höhe der Expression <strong>von</strong> Tkneo bestimmt<br />
wird. Bei der Kultivierung der Zellen der Klone mit Gancyclovir-haltigem bzw. -freiem<br />
Selektionsmedium konnten jedoch keine Unterschiede im Wachstum der Zellen festgestellt<br />
werden. Die Zellen waren gegen Gancyclovir resistent und starben nicht ab.<br />
Es wurde vermutet, dass das Tkneo-Fusionsprotein in den Zellen zu gering exprimiert wird.<br />
Es ist bekannt, dass für die Vermittlung <strong>von</strong> G418-Resistenz eine niedrige<br />
Neomycinphosphotransferase-Aktivität in den Zellen ausreicht. Die Thymidinkinase-<br />
Aktivitäten sind jedoch möglicherweise zu niedrig, damit die Zellen sensitiv auf Gancyclovir<br />
reagieren. Es wurde vermutet, dass die Ursache für die niedrige Expression <strong>von</strong> Tkneo in der<br />
geringen Aktivität des Polio-IR<strong>ES</strong> Elements begründet ist, welches die cap-unabhängige<br />
Translation <strong>von</strong> Tkneo im Cytoplasma vermittelt. Daher wurde versucht, durch aktivere<br />
IR<strong>ES</strong>-Elemente die Expression und damit die Konzentration des Fusionsproteins Tkneo zu<br />
erhöhen. Dies wird im Folgenden erläutert.
2 Ergebnisse 23<br />
2.2.2 Optimierung der Tkneo-Expression durch aktivere IR<strong>ES</strong>-Elemente<br />
Neben dem Polio-IR<strong>ES</strong> Element existieren weitere Strukturelemente, die ebenfalls eine capunabhängige<br />
mRNA-Translation vermitteln, wie das EMCV-IR<strong>ES</strong> Element aus dem<br />
Encephalomyocarditis Virus (Jang et al., 1988) und der 5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NFκB<br />
repressing factor), der im Folgenden auch als NRF-IR<strong>ES</strong> bezeichnet wird. Es wurde<br />
gezeigt, dass das vollständige humane und murine NRF-IR<strong>ES</strong> sowie im 5’-Bereich verkürzte<br />
Varianten höhere cap-unabhängige Translationen als das Polio-IR<strong>ES</strong> vermitteln können<br />
(Oumard et al., 2000, Oumard, 2001).<br />
Daher wurde das Polio-IR<strong>ES</strong> Element im Vektor LUCTP durch das EMCV-IR<strong>ES</strong>, durch das<br />
murine NRF-IR<strong>ES</strong> Element (1-857bp) sowie durch die verkürzten Varianten des murinen<br />
NRF-IR<strong>ES</strong> (608-857 bp, 708-857 bp) ersetzt, was zu den Konstrukten LUCTE, LUCTN,<br />
LUCTN6 und LUCTN7 führte. Die Funktionalität und die Tkneo-Expression dieser Vektoren<br />
wurden im Vergleich zum Konstrukt LUCTP in NIH3T3-Zellen untersucht. Nach<br />
Transfektion der Konstrukte in die Zellen wurden diese bis <strong>zur</strong> Klonbildung in<br />
Selektionsmedium kultiviert. Zur Abschätzung der Höhe der Tkneo-Expression und somit der<br />
translationsvermittelnden Aktivität der IR<strong>ES</strong>-Elemente wurde die Anzahl resistenter<br />
Zellklone bestimmt und diese auf die Zahl der nach Transfektion mit LUCTP erhaltenen<br />
Klone normiert (Abb.14). Das Expressions- und Regulationspotenzial der Konstrukte wurde<br />
anhand der Luciferase-Expression der selektierten Zellen im Gemisch im induzierten und<br />
reprimierten Zustand überprüft, wobei die Luciferase-Expressionen der einzelnen<br />
Zellgemische auf die der LUCTP-transfizierten Zellen abgeglichen wurde (Abb.14). Der<br />
Regulationsfaktor RF beschreibt das Regulationspotenzial der Konstrukte (Abb.14).<br />
Vektor<br />
IR<strong>ES</strong>-Element<br />
relative Klonzahl<br />
relative Luciferase-<br />
0 1 2 3 4 5 6 0<br />
Expression<br />
1<br />
RF<br />
LUCTP<br />
Polio<br />
1,0<br />
115<br />
LUCTE<br />
EMCV<br />
1,7<br />
121<br />
LUCTN<br />
NRF (murin)<br />
1-857 bp<br />
4,9<br />
81<br />
LUCTN6<br />
NRF608 (murin)<br />
608-857 bp<br />
5,2<br />
85<br />
LUCTN7<br />
NRF708 (murin)<br />
708-857 bp<br />
5,4<br />
95<br />
Abb. 14 Anzahl G418-resistenter Klone und Luciferase-Expression in Abhängigkeit vom IR<strong>ES</strong>-Element<br />
Es wurden 5 µg der mit unterschiedlichen IR<strong>ES</strong>-Elementen ausgestatteten <strong>autoregulierten</strong> Koanstrukte in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen transfiziert<br />
und nach G418-Selektion die reltative Klonzahl bestimmt. Die Luciferase-Expression unter induzierenden (-Doxycyclin) und<br />
reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen wurde in Zellgemischen aus selektierten Zellen gemessen. Der Regulationsfaktor RF wurde<br />
durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten und reprimierten Zustand berechnet.<br />
Die Daten zeigen, dass die verschiedenen IR<strong>ES</strong>-Elemente die cap-unabhängige Translation<br />
<strong>von</strong> Tkneo unterschiedlich stark vermitteln. Im Vergleich zum Ausgangskonstrukt LUCTP<br />
konnte die Anzahl resistenter Klone mit dem Konstrukt LUCTE annähernd verdoppelt<br />
werden. Mit den Konstrukten LUCTN, LUCTN6 und LUCTN7 wurde die Zahl resistenter<br />
Klone sogar verfünffacht. Die Luciferase-Expression und Regulierbarkeit der Konstrukte<br />
waren ähnlich. Das bedeutet, dass die Expression des ersten Cistrons, des Transaktivators<br />
tTA, vom inserierten IR<strong>ES</strong>-Element wie erwartet weitestgehend unabhängig ist. Betrachtet<br />
man demzufolge die Klonzahlen als Maßstab für die Höhe der Expression <strong>von</strong> Tkneo, kann<br />
geschlussfolgert werden, dass die murinen NRF-IR<strong>ES</strong> Elemente die höchste<br />
translationsvermittelnde Aktivität besitzen, gefolgt vom EMCV-IR<strong>ES</strong> und letztlich vom<br />
Polio-IR<strong>ES</strong> Element.<br />
Zur Beantwortung der Frage, ob die Tkneo-Expression der Konstrukte auch zu ausreichender<br />
Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen führt, so dass diese bei Gancyclovir-Selektion
2 Ergebnisse 24<br />
absterben, wurden die Konstrukte LUCTE, LUCTN, LUCTN6 und LUCTN7 in NIH3T3-<br />
Zellen transfiziert und in Gegegnwart <strong>von</strong> G418 bzw. G418 und Gancyclovir kultiviert. Nach<br />
Abschluss der Selektion zeigte sich, dass erwartungsgemäß bei Kultivierung in Gancyclovirfreiem<br />
Medium mit allen Konstrukten eine Vielzahl G418-resistenter Zellklone selektiert<br />
werden konnten. Dagegen führte die Kultivierung der mit LUCTN, LUCTN6 bzw. LUCTN7<br />
transfizierten Zellen in Gancyclovir-haltigem Selektionsmedium zu keinem<br />
Gancyclovir/G418-resistenten Klon. Die Selektion der mit LUCTE transfizierten Zellen ergab<br />
einen Gancyclovir-/G418-resistenten Klon auf 50 G418-resistente Klone. Dies bedeutet, dass<br />
insbesondere durch die NRF-IR<strong>ES</strong> vermittelte Tkneo-Expression die Konzentration des<br />
Tkneo-Fusionsproteins und damit die Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen soweit erhöht<br />
werden kann, dass die Zellen Gancyclovir-sensitiv sind.<br />
2.2.3 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität <strong>von</strong> LUCTN7 in<br />
NIH3T3-Zellen<br />
Um einerseits das Expressions- und Regulationspotenzial des Konstruktes LUCTN7 in<br />
Zellklonen untersuchen zu können, anderseits um Zellklone mit singulärer Intergration zu<br />
erhalten, die <strong>zur</strong> Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie einsetzbar sind, wurde der<br />
linearisierte Vektor LUCTN7 in NIH3T3-Zellen elektroporiert. Nach Kultivierung in<br />
Selektionsmedium wurde eine Vielzahl G418-resistenter Klonen selektiert. Bei 17 Klonen<br />
wurde die Kopienzahl des Konstruktes im Genom der Zellen bestimmt. Dazu wurde die<br />
genomische DNA der Klone mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und im Southern-<br />
Blot mit einer Luc-Sonde, welche zum Luciferase-Gen homolog ist, hybridisiert<br />
(Randfragment-Detektion, Abb.15).<br />
A<br />
LUCTN7<br />
EcoRI<br />
EcoRI EcoRI EcoRI<br />
F<br />
F5<br />
5‘ pA Luciferase TA N TKneo<br />
pA 3‘<br />
B<br />
21.2 kb<br />
> 1.4 kb<br />
1 kb<br />
Luc-Sonde<br />
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 K<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
Abb. 15 Southern Blot Analyse der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTN7-Kassette<br />
(A) Schematische Darstellung des Konstruktes LUCTN7 nach Integration in das Genom <strong>von</strong> NIH3T3-Zellen. Luc-Sonde: DNA-Sonde<br />
gegen das Luciferase-Gen, Fragment des BglII/XcmI geschnittenen Vektors LUCTP (B) Nach Elektroporation <strong>von</strong> 10 µg des mit den<br />
Restriktionsenzymen Bst1107I/XmnI linearisierten Vektors LUCTN7 in 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen wurden 17 G418-resistente Klone isoliert.<br />
Die HMW-DNAs dieser Klone wurden mit EcoRI geschnitten. Zum Nachweis der Kopienzahl wurde die DNA mit der Luc-Sonde<br />
hybridisiert. Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf mehrfache Integrationen der LUCTN7-Kassette<br />
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert, Spur K: parentale NIH3T3-Zellen.
2 Ergebnisse 25<br />
In den Klonen 1, 6, 7, 10, 12, 14 und 18 konnte eine singuläre Integration <strong>von</strong> LUCTN7<br />
nachgewiesen werden (Abb.15B). In den restlichen Klonen lag die Kassette mehrfach<br />
integriert vor (Abb.15B). Durch die Hybridisierung der EcoRI geschnittenen DNA mit einer<br />
neo-Sonde, welche gegen 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet ist, konnte die Vollständigkeit<br />
der inserierten Kassette in den Klonen mit singulärer Integration festgestellt werden (Daten<br />
nicht gezeigt).<br />
Für die Bestimmung des Expressions- und Regulationspotenzials wurden die Zellen der Klone<br />
in Doxycyclin-freiem bzw. -haltigem Medium kultiviert. Anschließend wurde die Luciferase-<br />
Aktivität bestimmt und der Regulationsfaktor RF berechnet (Abb.16).<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
1000000<br />
100000<br />
10000<br />
1000<br />
100<br />
10<br />
10102<br />
74582<br />
366467<br />
134516 102825 139800<br />
75732 69753 103454 45952<br />
33781<br />
46749<br />
57496<br />
31252<br />
19223<br />
2154<br />
66<br />
1<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18<br />
RF 31 75 89 209 207 375 5 66 97 131 448 73 160 59 482 434 397<br />
Kopienzahl<br />
1<br />
5<br />
2<br />
2<br />
4<br />
Abb. 16 Luciferase-Expression der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTN7-Kassette<br />
1<br />
1<br />
Zellen der LUCTN7-Klone wurden unter induzierenden (-Doxycyclin) und reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen kultiviert und<br />
abschließend hinsichtlich der Luciferase-Aktivität untersucht. Die relative Luciferase-Expression [rlu] wird durch den Quotienten aus der<br />
gemessenen Luciferase-Aktivität und der Proteinmenge des bei der Messung eingesetzten Zelllysats dargestellt. Der Regulationsfaktor RF<br />
wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten (•) und reprimierten () Zustand gebildet. Weiterhin ist die Anzahl der<br />
integrierten Kopien des Konstruktes LUCTN7 im Genom der einzelnen Klone aufgelistet.<br />
In den meisten Klonen war eine hohe bis sehr hohe Luciferase-Expression festzustellen<br />
(Abb.16, ∼10000 bis ∼366000 rlu). Durch Doxycyclin-Zugabe konnte diese stark reprimiert<br />
werden (Abb.16, ∼100 bis ∼1000 rlu), was sich in teilweise sehr hohen Regulationsfaktoren<br />
RF widerspiegelte (Abb.16). Ein Zusammenhang zwischen Anzahl der Kopien der<br />
Expressionskassette im Genom und der Höhe der Expression der Klone (Abb.16) war jedoch<br />
nicht zu erkennen. Vielmehr bedingen offensichtlich Positionseffekte des Integrationsortes<br />
der Kassette(n) die unterschiedlichen Expressionshöhen und Regulationsfaktoren.<br />
Zur Untersuchung der Gancyclovir-Sensitivität wurden die Zellen der Klone mit Gancyclovirfreiem<br />
bzw. -haltigem Medium kultiviert. Es zeigte sich, dass alle Klone bis auf die Klone 7<br />
und 8, die nur eine geringe Expression zeigten (Abb.16), unter Gancyclovir-Druck abstarben.<br />
Das bestätigt, dass das Konstrukt LUCTN7 aufgrund einer hohen translationsinitiierenden<br />
Aktivität des NRF708-IR<strong>ES</strong> zu hohen Tkneo-Expressionen und damit für eine Negativ-<br />
Selektion ausreichenden Thymidinkinase-Aktivitäten in diesen Zellen führt.<br />
Klone mit singulärer Integration der Reportergen-Kassette stellen Kandidaten für einen<br />
Kassettenaustausch dar. Da die Klone 1, 6, 10, 12, 14 und 18 eine singulär integrierte Kassette<br />
aufweisen (Abb.15B) und außerdem Gancyclovir-sensitiv sind, können diese Klone für einen<br />
Kassettenaustausch eingesetzt werden.<br />
3<br />
1<br />
2<br />
1<br />
4<br />
1<br />
3<br />
3<br />
1
2 Ergebnisse 26<br />
2.2.4 Stabile Expression <strong>von</strong> LUCTN7 in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Da mit dem Vektor LUCTN7 viele stabile, hoch exprimierende NIH3T3-Zellklone etabliert<br />
werden konnten, die aufgrund der hohen Aktivität des NRF708-IR<strong>ES</strong> Elementes auch eine<br />
hohe, für Gancyclovir-Selektion ausreichende Tkneo-Expression zeigten (Kap.2.2.3), wurde<br />
dieses Konstrukt auch <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong> stabil autoreguliert exprimierenden <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong><br />
eingesetzt.<br />
In mehreren Ansätzen wurde der linearisierte Vektor LUCTN7 bzw. als Kontrolle das<br />
linearisierte Konstrukt pSBC2Tkneo, welches eine konstitutive Expression des Selektionsgens<br />
Tkneo ermöglicht, in <strong>ES</strong>-Zellen der Zelllinie D3 elektroporiert. Die Zellen wurden<br />
anschließend bis <strong>zur</strong> Klonbildung in Selektionsmedium kultiviert. Mit dem Kontroll-Vektor<br />
pSBC2Tkneo konnten sehr viele (>100 Klone), mit dem Konstrukt LUCTN7 dagegen nur<br />
wenige G418-resistente <strong>Zelllinien</strong> generiert werden (
2 Ergebnisse 27<br />
A<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
1000000<br />
100000<br />
10000<br />
1000<br />
100<br />
10<br />
136080<br />
67476<br />
526<br />
3003<br />
LUCTN7<br />
pSBC1Luc<br />
11705<br />
8674<br />
1882 1781<br />
B<br />
relative Luciferase-Expression<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
2,0<br />
0,2 0,2 0,2<br />
1<br />
0,0<br />
NIH3T3<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
NIH3T3<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
Abb. 17 Vergleich der <strong>autoregulierten</strong> und konstitutiven Luciferase-Expression in NIH3T3- und <strong>ES</strong>-<br />
Zellen<br />
Es wurden jeweils 5 µg des Vektors LUCTN7 bzw. pSBC1Luc in je 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen bzw. 5 bis 7.5⋅10 5 <strong>ES</strong>-Zellen der Linien D3, IB10<br />
und CCE transfiziert. Nach 2 Tagen Kultivierung wurde die Luciferase-Expression bestimmt und auf die Proteinmenge normiert [rlu].<br />
(A) Luciferase-Expression <strong>von</strong> LUCTN7 und pSBC1Luc in NIH3T3-, <strong>ES</strong>- und CCE-Zellen. (B) Die Luciferase-Expression <strong>von</strong> LUCTN7<br />
wurde gegen die konstitutive Luciferase-Expression <strong>von</strong> pSBC1Luc der jeweiligen Zelllinie abgeglichen.<br />
Die Daten verdeutlichen, dass die Expression der <strong>autoregulierten</strong> Kassette LUCTN7 in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen niedrig ist. Möglicherweise führt eine geringe Aktivität des Transaktivator-abhängigen<br />
Promotors oder/und des Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen zu diesen niedrigen Expressionen. Da<br />
die VP16-Domäne des Transaktivators tTA des Konstruktes LUCTN7 als transkriptioneller<br />
Aktivator eine Vielzahl <strong>von</strong> Proteinen, die für die Regulation der Transkription verantwortlich<br />
sind, binden kann (Lin et al., 1991; Ingles et al., 1991; Goodrich et al., 1993; Flint und Shenk,<br />
1997), wäre es auch denkbar, dass es durch den exprimierten Transaktivator zu einer<br />
Reduktion des zellulären Pools solcher Faktoren und damit zu einer Inhibition der<br />
Transkription in den Zellen, zum sogenannten transkriptionelles Squelching kommt (Gill und<br />
Ptashne, 1988; Gossen und Bujard, 1992; Damke et al., 1995; Saez et al., 1997; Gallia und<br />
Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Einerseits könnte dies die Expression des<br />
<strong>autoregulierten</strong> Konstruktes negativ beeinflussen, was die niedrigen transienten Luciferase-<br />
Aktiväten in <strong>ES</strong>-Zellen erklären würde. Anderseits könnten die Zellen absterben, die eine zu<br />
hohe Expression des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes aufweisen. Es sollten demzufolge nur die<br />
Zellen überleben, die eine niedrige und damit weniger toxische Transaktivator-Expression<br />
aufweisen. Dies würde die niedrige Zahl resistenter Klone nach Elektroporation des<br />
<strong>autoregulierten</strong> Konstruktes in <strong>ES</strong>-Zellen und die nicht signifikante Luciferase-Expression<br />
dieser Klone erklären.<br />
Im Folgenden wurde untersucht, ob durch Einsatz weniger toxischer Transaktivator-Mutanten<br />
anstelle des Wildtyp-Transaktivators im Konstrukt LUCTN7 die Expression des<br />
<strong>autoregulierten</strong> Konstruktes in <strong>ES</strong>-Zellen gesteigert werden kann, so dass die <strong>Etablierung</strong><br />
höher exprimierender <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> ermöglicht wird.<br />
2.2.4.2 Weniger toxische Transaktivatoren verbessern nicht die Expression des<br />
<strong>autoregulierten</strong> TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Da möglicherweise die Expressionshöhe der <strong>autoregulierten</strong> Kassette LUCTN7 in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
durch Squelching des exprimierten Wildtyp-Transaktivators limitiert wird, wurde dieser<br />
gegen die weniger toxischen Varianten tTA2, tTA3 und tTA4 (Baron et al., 1997)<br />
ausgetauscht, was zu den Vektoren LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 führte.
2 Ergebnisse 28<br />
Die Transaktivatoren besitzen anstelle der VP16-Domäne nur minimale Aktivierungsdomänen,<br />
die an die TetR-Domäne fusioniert sind. Durch das Fehlen <strong>von</strong> Bindungsstellen für<br />
bestimmte Transkriptionsfaktoren sind diese Transaktivatoren weniger toxisch als der<br />
Wildtyp-Transaktivator und können daher in höheren Konzentrationen <strong>von</strong> Zellen toleriert<br />
werden (Baron et al., 1997). Allerdings weisen die Transaktivatoren tTA3 und tTA4 eine<br />
niedrigere Aktivität als der Wildtyp-Transaktivator tTA auf.<br />
Die Funktionalität der verschiedenen <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte wurde zunächst transient und<br />
stabil in NIH3T3-Zellen untersucht.<br />
2.2.4.2.1 Transiente und stabile Expression autoregulierter TetOff- Konstrukte in<br />
NIH3T3-Zellen<br />
Die Konstrukte LUCTA2N7, LUCTA3N7, LUCTA4N7 sowie das ursprüngliche Konstrukt<br />
LUCTN7 wurden in NIH3T3-Zellen transfiziert. Anschließend wurden die transienten<br />
Luciferase-Expressionen gemessen und diese auf die Luciferase-Aktivität der mit LUCTN7<br />
transfizierten Zellen normiert (Abb.18). Die Expressionsfaktoren EF verdeutlichen die<br />
Aktivität der verschiedenen Transaktivatoren der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte in Bezug <strong>zur</strong><br />
Aktivität des Wildtyp-Transaktivators tTA des Konstruktes LUCTN7.<br />
1,2<br />
relative Luciferase-Expression<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0<br />
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7<br />
EF 1.0<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.3<br />
Abb. 18 Vergleich der transienten Luciferase-Expression der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7,<br />
LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in NIH3T3-Zellen<br />
Es wurden 5 µg der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen transfiziert und die transiente<br />
Expression nach 2 Tagen bestimmt. Die Luciferase-Aktivitäten wurden auf die mit LUCTN7 transfizierten Zellen normiert.<br />
EF: Expressionsfaktor.<br />
Die Daten zeigen, dass die Expression der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte durch die Aktivität des<br />
integrierten Transaktivators bestimmt wird (Abb.18). Erwartungsgemäß wird mit dem<br />
Konstrukt LUCTA2N7 (EF: 1.0) eine ähnliche Expression erreicht wie mit dem Konstrukt<br />
LUCTN7 (EF: 1.0), da entsprechend publizierter Daten (Baron et al., 1997) der Wildtyp-<br />
Transaktivator tTA und der Transaktivator tTA2 ähnlich aktiv sind (Abb.3). Dagegen fällt die<br />
Expression des Konstruktes LUCTA3N7 geringer aus (EF: 0.5). Die niedrigste Expression<br />
zeigen die mit LUCTA4N7 transfizierten Zellen (EF: 0.3). Dies entspricht ebenfalls den<br />
Erwartungen, da gezeigt wurde, dass die Aktivitäten <strong>von</strong> tTA3 bzw. tTA4 niedriger sind als<br />
die der Transaktivatoren tTA bzw. tTA2 (Baron et al., 1997).<br />
Weiterhin wurde die stabile Expression der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte in NIH3T3-Zellen<br />
untersucht. Nach Elektroporation der linearisierten Vektoren LUCTA2N7, LUCTA3N7 und<br />
LUCTA4N7 und Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium konnte eine Vielzahl
2 Ergebnisse 29<br />
resistenter Klone selektiert werden. Es wurden jeweils 8 Klone isoliert und hinsichtlich ihrer<br />
Luciferase-Expression und Regulation untersucht. Der Regulationsfaktor RF ergibt sich aus<br />
den gemessenen Luciferase-Expressionen im induzierten und reprimierten Zustand (Abb.19).<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
1000000<br />
∅ 217771<br />
∅ 87017<br />
∅ 174982<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
100000<br />
10000<br />
1000<br />
100<br />
10<br />
∅ 1834<br />
∅ 2112<br />
∅ 3286<br />
1<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
LUCTA2N7<br />
LUCTA3N7<br />
LUCTA4N7<br />
RF<br />
132 194<br />
124 91<br />
50<br />
86<br />
127<br />
193<br />
50<br />
42<br />
26<br />
27<br />
55<br />
39<br />
71<br />
31<br />
41<br />
45<br />
41<br />
55<br />
51<br />
53<br />
95<br />
87<br />
Abb. 19 Luciferase-Expression <strong>von</strong> NIH3T3-Klonen mit genomisch integrierter LUCTA2N7-, LUCTA3N7<br />
bzw. LUCTA4N7-Kassette<br />
Es wurden jeweils 2 µg der linearisierten Konstrukte LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in je 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen elektroporiert.<br />
Nach Selektion wurden jeweils 8 G418-resistente Klone hinsichtlich ihrer Luciferase-Expression und Regulation untersucht.<br />
RF: Regulationsfaktor<br />
Bei allen Klonen konnte sowohl eine deutliche Luciferase-Expression als auch Regulation<br />
festgestellt werden. Die Zellklone mit dem Konstrukt LUCTA2N7 zeigten erwartungsgemäß<br />
die höchste durchschnittliche Luciferase-Expression und die höchste Regulierbarkeit<br />
(Abb.19). Die Regulationsfaktoren dieser Zellklone waren zwei- bis dreimal höher als bei<br />
Zellklonen, die mit den Konstrukten LUCTA3N7 und LUCTA4N7 generiert wurden<br />
(Abb.19). Hierbei wird wiederum deutlich, dass die Expression des <strong>autoregulierten</strong><br />
Konstruktes <strong>von</strong> der Aktivität des Transaktivators bestimmt wird.<br />
Im Folgenden wurde die Expression der verschiedenen <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen untersucht.<br />
2.2.4.2.2 Transiente Expression der autoregulierter TetOff-Konstrukte in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Die Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 wurden in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
der Linie D3, IB10 und CCE transfiziert. Anschließend wurden die transienten Luciferase-<br />
Expressionen gemessen und auf die Luciferase-Aktivität der mit LUCTN7-transfizierten<br />
Zellen abgeglichen, was zu den Expressionsfaktoren EF führte (Abb.20).
2 Ergebnisse 30<br />
D3-Zellen<br />
1,4<br />
IB10-Zellen<br />
1,2<br />
relative Luciferase-Expression<br />
1,2<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
relative Luciferase-Expression<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0<br />
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7<br />
0<br />
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7<br />
EF 1.0 0.9<br />
0.2<br />
0.1<br />
EF 1.0<br />
0.8<br />
0.4<br />
0.3<br />
CCE-Zellen<br />
relative Luciferase-Expression<br />
1,4<br />
1,2<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0<br />
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7<br />
Abb. 20 Vergleich der transienten<br />
Luciferase-Expression der Konstrukte<br />
LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und<br />
LUCTA4N7 in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Es wurden 5 µg der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7,<br />
LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in 5 bis 7.5⋅10 5 <strong>ES</strong>-Zellen<br />
der Linien D3, IB10 und CCE transfiziert. Nach 2 Tagen<br />
wurde die transiente Luciferase-Expression bestimmt.<br />
Die Luciferase-Aktivitäten wurden auf die mit LUCTN7<br />
transfizierten Zellen normiert. EF: Expressionsfaktor.<br />
EF 1.0<br />
1.1<br />
0.5<br />
0.4<br />
Die <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte zeigen in <strong>ES</strong>-Zellen wie bereits in NIH3T3-Zellen beobachtet<br />
(Kap.2.2.4.2.1) eine entsprechend <strong>von</strong> der Aktivität der Transaktivatoren abhängige<br />
Expression (Abb.20). Die Expression der Konstrukte LUCTN7 und LUCTA2N7 ist<br />
annähernd identisch, während die Konstrukte LUCTA3N7 und LUCTA4N7 ca. ⅓ bzw. ¼<br />
der Expression des Konstruktes LUCTN7 aufweisen (Abb.20). Es wurde erwartet, dass<br />
insbesondere durch den Transaktivator tTA2 im Konstrukt LUCTA2N7, der die gleiche<br />
Aktivität wie der Wildtyp-Transaktivator, allerdings nach Baron et al. (1997) eine dreifach<br />
geringere Toxizität aufweist, die Expression des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
signifikant erhöht werden kann. Dies war jedoch nicht der Fall. Daraus ist zu schlussfolgern,<br />
dass die in <strong>ES</strong>-Zellen beobachtete niedrige Expression des <strong>autoregulierten</strong> Vektors LUCTN7<br />
sowohl transient (Abb.17) als auch in stabilen Zellklonen wahrscheinlich nicht auf Squelching<br />
beruht. Vielmehr scheint die niedrige Expression des TetOff-Systems durch eine geringe<br />
Aktivität der TetOff-Transaktivatoren begründet zu sein.<br />
Da mit den Konstrukten LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in <strong>ES</strong>-Zellen transient<br />
keine Verbesserung der Expression erzielt werden konnte, wurde auf eine <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong><br />
stabilen <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit diesen Konstrukten verzichtet.<br />
Allerdings wurde die Kassette LUCTA2N7 mit dem weniger toxischen Transaktivator tTA2<br />
in den ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991) mittels homologer Rekombination<br />
integriert (Kap.2.2.5). Da nach zufälliger Integration der LUCTN7-Expressionskassette in das<br />
Genom <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen nur Klone mit nicht signifikanter Expression selektiert werden konnten<br />
(Kap.2.2.4), sollte dies die Untersuchung der Expression und Regulation einer TetOff-<br />
Kassette in einem definierten Genort ermöglichen.
2 Ergebnisse 31<br />
2.2.5 <strong>Etablierung</strong> eines TetOff-Expressionssystems im ROSA26-Locus <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Ein Genort, der möglicherweise signifikante Expressionen autoregulierter Kassetten in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen erlaubt, ist der mittels Promoter-Trap-Methode identifizierte ROSA26-Locus<br />
(Friedrich und Soriano, 1991). Insertionen <strong>von</strong> Reportergenen in diesen Locus zeigten, dass<br />
diese sowohl während der Embryogenese als auch in der adulten Maus (Zambrowicz et al.,<br />
1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano, 1999, Srinivas et al., 2001) ubiquitär<br />
exprimiert werden, wodurch sich dieser Locus ideal für die Generierung transgener knock-in<br />
Mauslinien eignet (Rideout et al., 2000; Farley et al., 2000). Untersuchungen des für die<br />
Expression notwendigen ROSA26-Promotors verdeutlichten, dass dieser für die ubiquitäre<br />
Expression verantwortlich ist (Kisseberth et al.1999). Daher ist nicht vorhersagbar, ob in den<br />
Locus inserierte, mit eigenen Promotoren versehene Expressionssysteme wie die in dieser<br />
Arbeit konstruierten <strong>autoregulierten</strong> Kassetten ebenfalls signifikant oder gar ubiquitär<br />
exprimierend sind. Weiterhin stellt sich die Frage, ob dieser Integrationsort eine strikte<br />
Regulation der Expressionskassette ermöglicht. Da offenbar dieser Genort <strong>von</strong><br />
reprimierenden Einflüssen abgegrenzt zu sein scheint, was sich anhand der kontinuierlichen<br />
Reportergenexpression während der gesamten Mausentwicklung erkennen lässt (Zambrowicz<br />
et al., 1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano, 1999, Srinivas et al., 2001),<br />
könnte dies für inserierte, eigenständige Expressionskassetten vom Vorteil sein.<br />
Im Folgenden wurde die Expressions- und Regulationskapazität der Expressionskassette<br />
LUCTA2N7 im ROSA26-Locus untersucht.<br />
2.2.5.1 Integration der <strong>autoregulierten</strong> Expressionskassette LUCTA2N7 in den<br />
ROSA26-Locus<br />
Durch Insertion der <strong>autoregulierten</strong> Expressionseinheit des Plasmids LUCTA2N7 in den<br />
Vektor ROSA26-1 (Soriano, 1999), welcher die für die Rekombination erforderlichen<br />
homologen Genbereiche ROSA5’ und ROSA3’ besitzt, wurden die Vektoren RLUC und<br />
RLUC-R konstruiert, wobei im Vektor RLUC-R die inserierte Expressionseinheit in konträrer<br />
Orientierung vorliegt (Abb.21). Die Funktionalität der Konstrukte wurde in NIH3T3-Zellen<br />
überprüft. Dazu wurden die Konstrukte RLUC und RLUC-R sowie <strong>zur</strong> Kontrolle der<br />
Ausgangsvektor LUCTA2N7 mit dem Plasmid pEFLacZ, welches eine konstitutive β-<br />
Galactosidase-Expression ermöglicht, in die Zellen kotransfiziert. Anschließend wurden die<br />
transienten Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten der Zellen gemessen und daraus die<br />
relative Luciferase-Expression bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Expression der<br />
Konstrukte RLUC und RLUC-R vergleichbar mit der des Ausgangskonstruktes LUCTA2N7<br />
war (Daten nicht gezeigt).<br />
RLUC<br />
F<br />
ROSA5‘<br />
pA<br />
N<br />
Luciferase TA2 TKneo<br />
F5<br />
pA<br />
ROSA3‘<br />
RLUC-R<br />
ROSA5‘<br />
pA<br />
F5<br />
TKneo<br />
N<br />
TA2<br />
Luciferase<br />
F<br />
pA<br />
ROSA3‘<br />
1 kb<br />
Abb. 21 Schematische Darstellung der Konstrukte RLUC und RLUC-R<br />
Die Expressionseinheit des Konstruktes LUCTA2N7 wurde in den Vektor ROSA26-1 inseriert. Dadurch entstanden die Konstrukte RLUC<br />
und RLUC-R. Die homologen Sequenzen des ROSA26-Locus ROSA5’/ROSA3’ flankieren die autoregulierte Kassette.
2 Ergebnisse 32<br />
Zur Generierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit integrierter LUCTA2N7-Expressionskassette im<br />
ROSA26-Locus wurde zunächst der linearisierte Vektor RLUC in <strong>ES</strong>-Zellen der Linie D3<br />
elektroporiert. Die anschließende Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium führte zu 27<br />
G418-resistenten Zellklonen, <strong>von</strong> denen 6 Klone für weitere Untersuchungen isoliert wurden.<br />
Um die korrekte Integration der <strong>autoregulierten</strong> Kassette in den ROSA26-Locus<br />
nachzuweisen, wurden die genomischen DNAs der Klone mit dem Restriktionsenzym<br />
EcoRV, welches in Randbereichen vom Insertionsort im ROSA26-Locus und innerhalb der<br />
inserierten Kassette schneidet, verdaut (Abb.22A). Mit der RP-Sonde, die zum ROSA26-<br />
Promotor homolog ist, konnte in allen isolierten RLUC-Klonen die Integration <strong>von</strong><br />
LUCTA2N7 im ROSA26-Locus gezeigt werden (Abb.22B, 3.1kb Fragment). Die<br />
Untersuchung der Luciferase-Aktivität offenbarte jedoch, dass trotz Integration der<br />
Expressionskassette die Klone keine nachweisbare Luciferase-Expression besaßen.<br />
A<br />
ROSA26-Locus<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
Pro.<br />
ROSA5‘<br />
ROSA3‘<br />
E1 E2 E3<br />
11.5 kb<br />
1 kb<br />
RP-Sonde<br />
ROSA26-Locus nach Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 mittels des Vektors RLUC<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
F<br />
F5<br />
ROSA5‘<br />
Pro. Luciferase TA2 TKneo<br />
ROSA3‘<br />
3.1 kb<br />
B<br />
RP-Sonde<br />
1 2 3 4 5 6 K<br />
21.2 kb<br />
11.5kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
3.1kb<br />
2.0 kb<br />
RP-Sonde<br />
Abb. 22 Schematische Darstellung des ROSA26-Locus vor und nach homologer homologer Rekombination mit<br />
RLUC und Nachweis der Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus <strong>von</strong> D3 <strong>ES</strong>-Zellen mittels Southern<br />
Blot Analyse<br />
(A) Schematische Darstellung des Wildtyp ROSA26-Locus und des ROSA26-Locus nach homologer Rekombination mit den Targeting-Vektor<br />
RLUC. Fragmente <strong>von</strong> EcoRV geschnittener genomischer DNA der Klone wurden im Southern-Blot mit der RP-Sonde, welche ein Fragment des<br />
EcoRI/HindIII-geschnittenen Vektors ROSA26-5’ und gegen den ROSA26-Promotor gerichtet ist, detektiert. E1/E2/E3: Exons, ROSA5’/ROSA3’:<br />
homologe Sequenzen des ROSA26-Locus (B) Die HMW-DNAs <strong>von</strong> 6 RLUC-Klonen wurden mit EcoRV geschnitten und im Southern-Blot mit der<br />
zum ROSA26-Promotor homologen RP-Sonde hybridisiert, K: negativ Kontrolle, wildtyp D3 <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Zur Verifizierung dieses Ergebnisses wurden RLUC-Klone basierend auf der <strong>ES</strong>-Zelllinie<br />
IB10 generiert. Um ausschließen zu können, dass die niedrige Expression <strong>von</strong> LUCTA2N7<br />
nach Integration im ROSA26-Locus in D3-Zellen durch die Orientierung der Kassette <strong>zur</strong>
2 Ergebnisse 33<br />
Umgebung des Integrationsortes bestimmt wird, wurden außerdem mit dem Vektor RLUC-R<br />
transgene <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> etabliert.<br />
Nach Elektroporation der linearisierten Vektoren RLUC und RLUC-R in IB10-Zellen und<br />
Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium konnten 28 RLUC-Klone und 6 RLUC-R Klone<br />
selektiert werden. Für Southern-Blot Analysen wurden die genomischen DNAs <strong>von</strong> 6 RLUCbzw.<br />
allen RLUC-R Klonen mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut (Abb.22A und 23A).<br />
Mit der RP-Sonde konnte in den RLUC-Klonen 2 und 4 die Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 in<br />
den ROSA26-Locus gezeigt werden (Abb.23B, 3.1kb Fragment). In den restlichen Klonen<br />
wurde nur das parentale, 11.5kb grosse Fragment des ROSA26-Locus detektiert, was darauf<br />
hindeutet, dass in diesen Klonen vermutlich eine Integration der Expressionskassette in<br />
zufällige Genorte stattgefunden hat. Durch Hybridisierung der EcoRV-geschnittenen DNAs<br />
der RLUC-Klone mit einer neo-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Fusionsgens Tkneo<br />
gerichtet ist, konnte in den Klonen 2 und 4 die Vollständigkeit der Integration <strong>von</strong><br />
LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Bei den<br />
restlichen Klonen bestätigte sich die Vermutung, dass die Expressionskassette in zufällige<br />
Genorte integriert wurde. Aus der Analyse der genomischen DNAs der RLUC-R Klone mit<br />
der RP-Sonde (Abb.23A) konnte geschlußfolgert werden, dass in den RLUC-R Klonen 2, 4<br />
und 6 die Kassette LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus integriert wurde (Abb.23C, 4.8kb<br />
Fragment). Mittels der Luc-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Luciferase-Gens gerichtet ist<br />
(Abb.23A), konnte jedoch die korrekte Integration der Expressionskassette in den ROSA26-<br />
Locus bzw. die Vollständigkeit der Integration nur im Klon 6 bestätigt werden (Abb.23D,<br />
3.2kb und 10kb Fragment). Bei den restlichen Klonen wurde die Integration der<br />
Expressionskassette in zufällige Genorte nachgewiesen (Abb.23D).<br />
A<br />
ROSA26-Locus nach Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 mittels des Vektors RLUC-R<br />
EcoRV EcoRV<br />
EcoRV EcoRV<br />
F5<br />
F<br />
Pro.<br />
ROSA5‘<br />
TKneo<br />
TA2<br />
Luciferase<br />
ROSA3‘<br />
EcoRV<br />
4.8 kb 3.2 kb<br />
10.0 kb<br />
RP-Sonde<br />
Luc-Sonde<br />
B RLUC<br />
C RLUC-R<br />
D<br />
RLUC-R<br />
21.2 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 K<br />
21.2 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6 K<br />
21.2 kb<br />
M 1 2 3 4 5 6<br />
K<br />
11.5kb<br />
11.5kb<br />
10.0kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
3.1kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
4.8kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
3.2kb<br />
2.0 kb<br />
2.0 kb<br />
2.0 kb<br />
RP-Sonde<br />
RP-Sonde<br />
Luc-Sonde<br />
Abb. 23 Nachweis der Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus <strong>von</strong> IB10 <strong>ES</strong>-Zellen mittels<br />
Southern Blot Analyse<br />
(A) Schematische Darstellung des ROSA26-Locus nach homologer Rekombination mit den Targeting-Vektor RLUC-R. Fragmente <strong>von</strong><br />
EcoRV geschnittener genomischer DNA der Klone wurden im Southern Blot mit der RP-Sonde, welche ein Fragment des EcoRI/HindIIIgeschnittenen<br />
Vektors ROSA26-5’ und gegen den ROSA26-Promotor gerichtet ist, detektiert. E1/E2/E3: Exons, ROSA5’/ROSA3’: homologe<br />
Sequenzen des ROSA26-Locus (B) Die HMW-DNAs <strong>von</strong> 6 RLUC-Klonen wurden mit EcoRV geschnitten und im Southern-Blot mit der<br />
zum ROSA26-Promotor homologen RP-Sonde hybridisiert. Die korrekte Integration der LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus liefert<br />
eine Bande <strong>von</strong> 3.1kb, der Wildtyp ROSA26-Locus eine Bande <strong>von</strong> 11.5kb (vergleiche Abb.22A). (C) Die HMW-DNAs der 6 RLUC-R<br />
Klone wurden mit EcoRV geschnitten und mit der RP-Sonde hybridisiert. Die korrekte Integration <strong>von</strong> LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus<br />
liefert eine Bande <strong>von</strong> 4.8kb. (D) Die EcoRV-geschnittenen HMW-DNAs der RLUC-R Klone wurden mit der Luc-Sonde, die gegen das<br />
Luciferase-Gen gerichtet ist, hybridisert. Banden der Größe 3.2kb und 10.0kb zeigen die Vollständigkeit der intergierter LUCTA2N7-<br />
Kassette. K: wildtyp IB10 <strong>ES</strong>-Zellen
2 Ergebnisse 34<br />
Die RLUC- bzw. RLUC-R Klone mit vollständig integrierter LUCTA2N7-<br />
Expressionskassette im ROSA26-Locus wurden hinsichtlich ihrer Luciferase-Expression<br />
untersucht. In den RLUC-Klonen 2 und 4 wurde keine, im RLUC-R Klon 6 nur eine niedrige<br />
Luciferase-Aktivität (∼240 rlu) detektiert.<br />
Die Untersuchungen der D3- und IB10-Klone mit integrierter LUCTA2N7-Kassette im<br />
ROSA26-Locus als auch die Untersuchung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellklonen mit integrierter LUCTN7-<br />
Kassette in zufälligen Genorten (Kap.2.2.4) lassen die Schlussfolgerung zu, dass das TetOff-<br />
System unabhängig vom Genort in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig exprimierend ist. Da die autoregulierte<br />
Expression der TetOff-Kassetten in NIH3T3-Zellen jedoch sehr hoch war, wurde im<br />
Folgenden untersucht, ob nach in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen mit integrierter TetOff-<br />
Expressionkassette im ROSA26-Locus erhöhte Luciferase-Expressionen zu messen sein<br />
werden.<br />
2.2.5.2 In vitro Differenzierung<br />
Aufgrund des Unterschiedes in der Expression des <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen und in den Maus-Fibroblastenzellen NIH3T3 wurde angenommen, dass die Expression<br />
des Systems vom Differenzierungsstand der Zellen abhängt. Um dies zu überprüfen, wurden<br />
<strong>ES</strong>-Zellen mit intergierter LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus der Zelllinie D3 (RLUC-<br />
Klon Kl. 3) in vitro differenziert (Kap.1.3). Durch verschiedene terminale Retinsäure-<br />
Induktionen wurden unterschiedlich differenzierte Zellen generiert und diese hinsichtlich ihrer<br />
Luciferase-Expression im Vergleich zu undifferenzierten Zellen des parentalen RLUC-Klons<br />
untersucht.<br />
Der erste Schritt der Differenzierung war die Bildung <strong>von</strong> sogenannten Embryonic Bodies.<br />
Dazu wurde eine bestimmte Anzahl <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen in einem definierten Volumen des<br />
Differenzierungsmediums in Form eines Tropfens hängend an den Deckel einer<br />
Bakterienplatte kultiviert (Hanging-Drop Methode). Dies führt <strong>zur</strong> spontanen Aggregation der<br />
Zellen, der sich die primäre Strukturierung und die Entwicklung zum cystischen Embryonic<br />
Body anschließt. Die dadurch gebildeten Zellaggregate wurden dann auf Bakterienplatten,<br />
danach auf gelatinierte Mehrloch-Platten <strong>zur</strong> weiteren Entwicklung ausgesät (Wobus, 2001).<br />
Für die Differenzierung wurden verschiedene Protokolle aufgestellt, die sich hinsichtlich des<br />
Zeitpunktes und der Dauer einer Retinsäure-Induktion unterscheiden und in Abbildung 24<br />
zusammengefasst sind (vergleiche Kap.1.3).<br />
+RA<br />
[-/+/+]<br />
+RA<br />
[+/+/+]<br />
-RA<br />
+RA<br />
-RA<br />
[-/+/-]<br />
+RA<br />
+RA<br />
-RA<br />
[+/+/-]<br />
-RA<br />
+RA<br />
-RA<br />
[-/-/+]<br />
[-/-/-]<br />
-RA<br />
-RA<br />
[+/-/-]<br />
0 2<br />
7<br />
19 [Tag]<br />
Hanging<br />
Drops<br />
Bakterienplatten<br />
gelatinierte 24-Loch bzw.<br />
12-Loch Zellkulturplatten<br />
0 2<br />
6<br />
19 [Tag]<br />
Hanging<br />
Drops<br />
Bakterienplatten<br />
gelatinierte 24-Loch bzw.<br />
12-Loch Zellkulturplatten<br />
Kultivierung mit Retinsäure<br />
Kultivierung ohne Retinsäure<br />
Abb. 24 Übersicht: Differenzierungsstrategien (Protokolle)<br />
Die <strong>ES</strong>-Zellen wurden 2 Tage mit bzw. ohne Retinsäure (RA) als Hangings Drops, dann 4 oder 5 Tage mit bzw. ohne Retinsäure auf<br />
Bakterienplatten und anschließend bis <strong>zur</strong> Luciferase-Messung mit bzw. ohne Retinsäure auf gelatinierten 24- bzw. 12-Loch-Platten<br />
kultiviert.
2 Ergebnisse 35<br />
Aus den Zellaggregaten (Abb.26A1) wuchsen nach Aussaat auf gelatinierten Zellkulturplatten<br />
in kurzer Zeit differenzierte Zellen aus (Abb.26A2, Outgrowths). Es wurden vereinfacht die<br />
Outgrowths hinsichtlich ihrer Morphologie, A: langgezogenen (Abb.26A) und B:<br />
fibroblasten-ähnliche Zellen (Abb.26B), unterschieden. Bei einer Vielzahl <strong>von</strong> Outgrowths<br />
war jedoch eine Zuordnung zu einer der Zelltypen nicht möglich, da zuerst fibroblastoide<br />
Zellen aus den Aggregaten auswuchsen, aber im Laufe der Kultivierung sich an den Rändern<br />
der Outgrowths langgezogene Zellen entwickelten. Die Outgrowths konnten in zwei eindeutig<br />
unterscheidbare Kompartimente unterteilt werden (Abb.26D, Morphologie AB).<br />
Es konnte festgestellt werden, dass Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-Induktion den<br />
Differenzierungvorgang, sichtbar durch die Zellmorphologie der Outgrowths, stark<br />
beeinflussen. Findet während der Kultivierung in Hanging-Drops und auf den<br />
Bakterienplatten keine Retinsäure-Stimulation statt (Protokoll [-/-/+] und [-/-/-]), bestehen die<br />
Outgrowths der Aggregate ausschließlich aus fibroblasten-ähnlichen Zellen (Abb.26B und<br />
26C, Morphologie B), unabhängig, ob die darauffolgende Kultivierung auf gelatinierten<br />
Platten mit Retinsäure-haltigem Medium durchgeführt wird. Dagegen kommt es durch<br />
Retinsäure-Induktion während der Kultivierung auf den Bakterienplatten (Tag 2-7) zu einer<br />
Entwicklung sowohl fibroblastoider als auch langgezogener Zellen (Abb.26D und 26E,<br />
Protokoll [-/+/+] und [-/+/-]). Hier kann man vorwiegend Outgrowths der Morphologie A und<br />
AB finden. Ein Retinsäure-Stimulation über den gesamten Kultivierungszeitraum lenkt die<br />
Differenzierung hin zu ausschließlich langgezogenen Zellen (Abb.26F, Protokoll [+/+/+]).<br />
Wird die Retinsäure-Induktion dagegen vorzeitig abgebrochen (Protokoll [+/+/-] und [+/-/-]),<br />
findet man nur noch teilweise Outgrowths mit langgezogenen Zellen (Abb.26A, Morphologie<br />
A). Hier kann man mehr Outgrowths mit ausschließlich fibroblastoiden Zellen (Abb.26G,<br />
Morphologie B) oder mit Kompartimenten aus fibroblastoiden und langgezogenen Zellen<br />
(Abb.26G, Morphologie AB) finden. Die Folgen der Retinsäure-Induktion auf die<br />
Differenzierung sind in Tabelle 4 zusammengefasst.<br />
Nach Abschluß der in vitro Differenzierung wurden die Luciferase-Expressionen der<br />
differenzierten Zellen bestimmt. Die Luciferase-Aktivität undifferenzierter Zellen des<br />
Ausgangsklons (RLUC-Klon Kl. 3) und der differenzierter Zellen wurden prozentual<br />
zueinander in Bezug gebracht (Abb.25). Die Regulation der Expression wurde nicht<br />
untersucht.<br />
relative Luciferase-Expression [%]<br />
100000<br />
10000<br />
1000<br />
100<br />
10<br />
1<br />
K [-/+/+] [-/+/-] [-/-/+] [-/-/-] [+/+/+] [+/+/-] [+/-/-]<br />
Morphologie A/AB A/AB B B A B/AB B/AB<br />
Abb. 25 Relative Luciferase-Expression der differenzierten Zellen<br />
Die Luciferase-Expressionen der nach entsprechenden Protokollen differenzierten Zellen mehrerer Outgrowths aus einem oder mehreren 12-<br />
Loch wurden bestimmt und auf die Expression undifferenzierter Zellen des Parentalklons RLUC Kl.3 der <strong>ES</strong>-Zelllinie D3 (K: 100%)<br />
normiert. Auf der x-Achse des Diagramms sind die verschiedenen Differenzierungsprotokolle (vergleiche Abb.24) und die beobachtet<br />
Morphologie der Outgrowths aufgelistet
2 Ergebnisse 36<br />
Interessanterweise zeigen die meisten der differenzierten Zellen eine deutliche Steigerung der<br />
Luciferase-Expression. Die differenzierten Zellen, die sich durch Retinsäure-Induktion über<br />
den gesamten Differenzierungszeitraum entwickelten (Morphologie A), zeigen eine ca.<br />
45fach erhöhte Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll [+/+/+]). Findet dagegen die<br />
Retinsäure-Induktion nur innerhalb der ersten 2 Tage statt, differenzieren die Zellen verstärkt<br />
in eine andere Richtung (Morphologie B und AB). Die durchschnittliche Expression der<br />
Zellen ist 7fach, maximal 20fach erhöht (Abb.25, Protokoll [+/-/-]). Die Retinsäure-<br />
Stimulation für 7 Tage führt dagegen zu differnzierten Zellen (Morphologie B und AB) mit<br />
nicht signifikanter Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll [+/+/-]). Eine durchschnittlich<br />
26fache, maximal 100fache Erhöhung der Luciferase-Aktivität ist in differenzierten Zellen<br />
(Morphologie A und AB) messbar, die sich nach Retinsäure-Stimulation zwischen Tag 2 und<br />
7 entwickelt haben (Abb.25, Protokoll [-/+/-]). Wird die Retinsäure-Stimulation auch an den<br />
darauffolgenen Tagen (Tag 7-19) aufrechterhalten, entstehen zwar morphologisch ähnliche<br />
Outgrowths (Morphologie A und AB), allerdings zeigen die Zellen dieser Outgrowths nur<br />
noch eine im Durchschnitt 3fache, maximal 6fache Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll<br />
[-/+/+]). Findet die Kultivierung mit Retinsäure erst ab Tag 7 statt, wird eine andere<br />
Differenzierungsrichtung induziert (Morphologie B). Die Luciferase-Expression der<br />
differenzierten Zellen ist im Durchschnitt 3fach, maximal 13fach erhöht (Abb.25, Protokoll<br />
[-/-/+]). Keine signifikante Luciferase-Expression zeigen differenzierte Zellen (Morphologie<br />
B), die sich ohne Retinsäure-Induktion entwickelt haben (Abb.25, Protokoll [-/-/-]).<br />
Die relativen Luciferase-Expressionen der differenzierten Zellen sind in Tabelle 4<br />
vergleichend zusammengefasst.<br />
Retinsäure-Stimulation<br />
1 3<br />
7/8 [Tag] 20<br />
- + +<br />
- + -<br />
- - +<br />
- - -<br />
+ + +<br />
+ + -<br />
+ - -<br />
Morphologie der Outgrowths<br />
A AB B<br />
•••<br />
••••<br />
-<br />
-<br />
••••<br />
••<br />
•<br />
•••<br />
••••<br />
-<br />
-<br />
-<br />
•••<br />
••••<br />
••<br />
•<br />
••••<br />
••••<br />
-<br />
•••<br />
••••<br />
Luciferase<br />
Expression<br />
Faktor<br />
•• 3<br />
•••• 26<br />
•• 3<br />
• 1<br />
•••• 45<br />
• 1<br />
••• 7<br />
Tab. 4 Übersicht: terminale Retinsäure-Induktion und resultierende Differenzierung und Luciferase-<br />
Expression<br />
In Abhängigkeit vom Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-Induktion waren in: •••• sehr vielen, ••• vielen, •• wenigen, • sehr wenigen<br />
Outgrowths der Aggregate langgezogene (Morphologie A), fibroblastoide Zellen (Morphologie B) oder beide Zelltypen zu finden<br />
(Morphologie AB). Die Luciferase-Expression mehrerer Outgrowths eines oder mehrerer 12-Loch wurde bestimmt und mit der Expression<br />
des parentalen <strong>ES</strong>-Zellklons verglichen. Der Faktor ergibt sich aus den Mittelwerten der Expressionen der Outhrowths im Vergleich <strong>zur</strong><br />
Expression des parentalen RLUC Klon Kl.3 der <strong>ES</strong>-Zelllinie D3. Es konnten: •••• sehr hohe, ••• hohe, •• niedrige, • keine signifikanten<br />
Luciferase-Expressionen detektiert werden.<br />
Die Expressionsanalysen der in vitro differenzierten Zellen beweisen, dass ein autoreguliertes<br />
TetOff-System in differenzierten Zellen zu hohen Expressionen führen kann, während in<br />
undifferenzierten <strong>ES</strong>-Zellen die Expression niedrig ist. Die Daten bestätigen, dass die<br />
Expression <strong>von</strong> dem Differenzierungsstatus der Zelle abhängt. Die Expression der TetOff-<br />
Kassette variiert jedoch in Abhängigkeit <strong>von</strong> der Differenzierungsrichtung. Es kann<br />
geschlussfolgert werden, dass in transgenen Mäusen das autoregulierte TetOff-System<br />
funktional sein sollte. Zur Überprüfung dieser Vermutung bedarf es jedoch der <strong>Etablierung</strong><br />
einer transgenen Maus, was im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt werden konnte.
2 Ergebnisse 37<br />
A [+/+/-]<br />
Embryonic<br />
Body<br />
1 2<br />
3 4<br />
Embryonic<br />
Body<br />
A<br />
Outgrowth<br />
Tag 8 Tag 11 Tag 14 Tag 14<br />
B [-/-/+]<br />
C [-/-/-]<br />
1 2<br />
1 2<br />
B<br />
B<br />
D [-/+/+] E [-/+/-]<br />
1 2<br />
1 2<br />
A<br />
B<br />
A<br />
B<br />
A<br />
B<br />
A<br />
B<br />
F [+/+/+]<br />
A<br />
G [+/-/-]<br />
B<br />
A<br />
Abb. 26 Morphologie der Outgrowths in<br />
Abhängigkeit <strong>von</strong> der terminalen Retinsäure-<br />
Induktion<br />
Die <strong>ES</strong>-Zellen wurden 2 Tage mit bzw. ohne Retinsäure in<br />
Hanging Drops, dann 4 bzw. 5 Tage mit bzw. ohne Retinsäure<br />
auf Bakterienplatten und abschließend mit bzw. ohne<br />
Retinsäure auf gelatinierten Zellkulturplatten kultiviert.<br />
A: Outgrowth eines Embryonic Body [+/+/-] zwischen Tag 8<br />
und 14, Morphologie A. B: (1) Outgrowths [-/-/+], Tag 11,<br />
(2) 4fache Vergößerung, Morphologie B. C: (1) Outgrowths<br />
[-/-/+], Tag 11, (2) 4fache Vergrößerung, Morphologie B. D:<br />
(1) Outgrowths [-/+/+], Tag 14, (2) 2fache Vergößerung,<br />
Morphologie AB. E: (1) Outgrowths [-/-/-], Tag 14, (2) 2fache<br />
Vergößerung, Morphologie AB. F: Outgrowths [+/+/+], Tag<br />
14, Morphologie A. G: Outgrowths [+/-/-], Tag 14,<br />
Morphologie AB
2 Ergebnisse 38<br />
2.2.5.3 Aktivierung der Luciferase-Expression durch konstitutiv exprimierte<br />
Transaktivatoren<br />
Es wird vermutet, dass die Expression <strong>von</strong> TetOff-Kassetten in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig ist<br />
(Kap.2.2.4). Daher wurde untersucht, inwieweit die Expression einer genomisch integrierten<br />
<strong>autoregulierten</strong> TetOff-Kassette in <strong>ES</strong>-Zellen durch konstitutiv exprimierte Transaktivatoren<br />
induziert werden kann.<br />
In Zellen eines Klons mit integrierter LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus der Zelllinie<br />
D3 (RLUC-Klon Kl. 3) (Kap.2.2.5) wurden unterschiedliche Mengen der Expressionsvektoren<br />
pUHrT62-1 und ptTA2 transfiziert. Der Vektor pUHrT62-1 exprimiert konstitutiv<br />
den reversen Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b), der Vektor ptTA2 den<br />
Transaktivator tTA2 (Baron et al., 1997). Nach Kultivierung der transfizierten Zellen in<br />
Induktionsmedium wurde die Luciferase-Aktivität bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die<br />
Expression des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes durch die Expression der Transaktivatoren in<br />
Abhängigkeit vom Transaktivator und <strong>von</strong> der Transaktivator-Menge beeinflusst werden<br />
kann. Mit Zunahme der Transaktivator-Konzentration steigt die Luciferase-Expression an.<br />
Während mit Transaktivator tTA2 scheinbar eine Sättigung erreicht wird, kann mittels des<br />
reversen Transaktivators rtTA2-M2 die Luciferase-Expression im gleichen<br />
Konzentrationsbereich weiter gesteigert werden (Abb.27, 6µg, 10µg).<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
1831<br />
1221<br />
985<br />
576<br />
198<br />
24<br />
85<br />
144<br />
0 0.5 2 6 10 0.5 2 6 10 µg<br />
ptTA2 [µg]<br />
prtTA2-M2 [µg]<br />
Abb. 27 Induktion der Expression der LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen durch<br />
konstitutiv exprimierte Transaktivatoren<br />
Es wurden 0.5, 2, 6 bzw. 10 µg der Vektoren ptTA2 bzw. pUHrT62-1 in je 2⋅10 5 Zellen des RLUC-Klons Kl.3 der Linie D3 mit integrierter<br />
LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus transfiziert. Nach zweitägiger Kultivierung der Zellen unter induzierenden Bedingungen (ptTA2: -<br />
Doxycyclin, pUHrT62-1: +Doxycyclin) wurde die transiente Luciferase-Expression der Zellen bestimmt.<br />
Der Versuch zeigt, dass die im ROSA26-Locus integrierte Kassette funktional ist und<br />
aktiviert werden kann. Der reverse Transaktivator rtTA2-M2 besitzt ein deutlich höheres<br />
Induktionspotenzial als der Transaktivator tTA2. Daraus ist zu schlussfolgern, dass die<br />
niedrige Expression autoregulierter TetOff-Expressionskassetten in <strong>ES</strong>-Zellen sowohl<br />
transient als auch nach Integration in zufällige Genorte (Kap.2.2.4) bzw. in den ROSA26-<br />
Locus (Kap.2.2.5) auf ein allgemein niedriges Expressionspotenzial des TetOff-Systems in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen aufgrund einer niedrigen Aktivität der in diesem System verwendeten<br />
Transaktivatoren <strong>zur</strong>ückzuführen ist. Es scheint, dass dagegen ein autoreguliertes TetOn-<br />
System mit dem reversen Transaktivator rtTA2-M2 zu einer Verbesserung der Expression<br />
führen kann.
2 Ergebnisse 39<br />
Im Folgenden wurde deshalb der Transaktivator einer <strong>autoregulierten</strong> TetOff-<br />
Expressionskassette gegen den reversen Transaktivators rtTA2-M2 ausgetauscht und die<br />
Expression der resultierenden TetOn-Kassette in <strong>ES</strong>-Zellen analysiert.<br />
2.3 <strong>Etablierung</strong> eines TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Expressionssystems<br />
in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Es wurde gezeigt, dass die Expression <strong>von</strong> TetOff-Kassetten in <strong>ES</strong>-Zellen sehr niedrig ist, was<br />
erklärt, dass mit dem TetOff-System nur stabile <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit nicht signifikanter<br />
Reportergen-Expression etabliert werden konnten (Kap.2.2.4 und 2.2.5). Deshalb wurden<br />
alternative autoregulierte Expressionskassetten, basierend auf dem TetOn- (Kap.1.1.1.2),<br />
E.REXOff- (Kap.1.1.3) und PIPOff-System (Kap.1.1.2), konstruiert. Außerdem wurde <strong>zur</strong><br />
Verbesserung der Detektierbarkeit der Expression statt der Wildtyp-Luciferase eine aktivere<br />
Luciferase als Reportergen eingesetzt.<br />
2.3.1 Optimierung der Expressionsanalyse durch Einsatz einer aktiveren Luciferase<br />
Durch Austausch der Wildtyp-Luciferase im Konstrukt LUCTA2N7 gegen die aktivere<br />
Luciferase luc + aus dem Vektor pGL3basic (Promega), hier als Luicferase-3 bezeichnet,<br />
wurde der Vektor LUC3TA2N7 konstruiert. Zur Überprüfung der Luciferase-Expression<br />
wurde dieses Konstrukt in NIH3T3- als auch in <strong>ES</strong>-Zellen der Linien D3, IB10 und CCE<br />
transfiziert. Als Kontrolle wurde der Ausgangsvektor LUCTA2N7 verwendet. Anschließend<br />
wurden die transienten Luciferase-Expressionen der Zellen bestimmt. Die Luciferase-<br />
Aktivität des Konstruktes LUC3TA2N7 wurde auf die des Konstruktes LUCTA2N7 der<br />
jeweiligen Zelllinie abgeglichen. Da die Konstrukte sich nur durch das Luciferase-Gen<br />
unterscheiden, beschreibt dieser Abgleich den Aktivitätsunterschied der Luciferasen<br />
(Abb.28).<br />
relative Luciferase-Expression<br />
9<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
NIH3T3-Zellen<br />
D3-Zellen<br />
IB10-Zellen<br />
CCE-Zellen<br />
LUCTA2N7<br />
LUC3TA2N7<br />
AF 1.0 4.9<br />
1.0 7.5 1.0 7.0 1.0 3.2<br />
Abb. 28 Vergleich der Luciferase-Aktivitäten der Konstrukte LUCTA2N7 und LUC3TA2N7<br />
Es wurden jeweis 5 µg der Konstrukte LUCTA2N7 und LUC3TA2N7 in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen und in je 5⋅10 5 <strong>ES</strong>-Zellen der Linien D3,<br />
IB10 und CCE transfiziert. Die transiente Luciferase-Expression wurde nach 2 Tagen bestimmt. Die Expression <strong>von</strong> LUC3TA2N7 wurde auf<br />
die des Konstruktes LUCTA2N7 der jeweiligen Zelllinie abgeglichen. Die Aktivität der Luciferase-3 wird durch den Aktivitätsfaktor AF<br />
beschrieben.<br />
Aus den Daten ist zu entnehmen, dass in allen getesteten <strong>Zelllinien</strong> die Luciferase-3<br />
funktional und deutlich aktiver als die ursprüngliche Luciferase ist. In D3- und IB10-Zellen<br />
zeigt die Luciferase-3 eine um den Faktor 7 bis 7.5, in NIH3T3-Zellen um den Faktor 5 und
2 Ergebnisse 40<br />
in CCE-Zellen um den Faktor 3 erhöhte Aktivität gegenüber der Wildtyp-Luciferase<br />
(Abb.28). Auch in stabil exprimierenden NIH3T3-Klonen, die durch Elektroporation des<br />
linearisierten Konstruktes LUC3TA2N7 generiert wurden, konnte ein hohe Luciferase-<br />
Aktivität (∼127.000 bis ∼4.500.000 rlu, ∅ 1.800.000 rlu) nachgewiesen werden (Einzeldaten<br />
nicht gezeigt), die im Vergleich zu den LUCTA2N7-Klonen (Abb.19, ∼61.000 bis ∼500.000<br />
rlu, ∅ 218.000 rlu) durchschnittlich um den Faktor 9 erhöht war.<br />
Es wurde außerdem der Vektor LUC3TA2E generiert, der anstelle des NRF708-IR<strong>ES</strong> ein<br />
EMCV-IR<strong>ES</strong> trägt und für die Klonierung des <strong>autoregulierten</strong> TetOn-Expressionsvektors<br />
eingesetzt werden sollte. Die transiente Expression dieses Konstruktes in NIH3T3- und <strong>ES</strong>-<br />
Zellen war ähnlich hoch wie die des Konstruktes LUC3TA2N7 (Daten nicht gezeigt).<br />
2.3.2 Untersuchung der transienten Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOn-,<br />
E.REXOff- und PIPOff-Kassetten<br />
Auf Basis der Vektoren LUC3TA2N7 und LUC3TA2E wurden die <strong>autoregulierten</strong> TetOn-,<br />
E.REXOff- und PIPOff-Expressionsvektoren mit Luciferase-3 als Reportergen konstruiert.<br />
Durch Austausch des Transaktivators tTA2 im Konstrukt LUC3TA2E gegen den reversen<br />
Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) wurde der Vektor LUC3rTA2E generiert<br />
(Abb.30). Die Insertion des bidirektionalen Promotors P biET und des Transaktivators ET<br />
(Kap.1.1.3) an die Stelle des bidrektionalen Promotors P bi und des Transaktivators tTA2 im<br />
Konstrukt LUC3TA2N7 führte zum Vektor LUC3REX (Abb.30) bzw. die Insertion des<br />
bidirektionalen Promotors P biPIT und des Transaktivators PIT (Kap.1.1.2) zum Konstrukt<br />
LUC3PIP (Abb.30).<br />
Die Funktionalität der Konstrukte LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP wurde in NIH3T3-<br />
Zellen und in den <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> D3, IB10 und CCE untersucht. Nach Transfektion der<br />
verschiedenen Konstrukte in die Zellen wurden diese unter induzierenden sowie<br />
reprimierenden Bedingungen kultiviert. Anschließend wurden die transienten Luciferase-<br />
Expressionen bestimmt und auf die Expression des Vektors LUC3TA2E in der jeweiligen<br />
Zelllinie im induzierten Zustand normiert (Abb.29). Daraus ergaben sich die<br />
Expressionsfaktoren EF, die das Expressionspotenzial der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte<br />
LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP im Vergleich zum Konstrukt LUC3TA2E in den<br />
Zellen verdeutlichen (Abb.29). Die Regulationsfaktoren RF wurden durch den Quotienten aus<br />
relativer Luciferase-Expression der Konstrukte im induzierten und reprimierten Zustand<br />
gebildet und beschreiben das Regulationspotenzial der Konstrukte.<br />
Aus den Expressions- und Regulationsdaten kann geschlussfolgert werden, dass mit dem<br />
TetOn-System (LUC3rTA2E) im Vergleich zum TetOff-System (LUC3TA2E) höhere<br />
Expressionen im induzierten, als auch sehr niedrige Expressionen im reprimierten Zustand in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen erreicht werden können, was sich letztlich auch in hohen Regulationsfaktoren<br />
widerspiegelt. Deshalb scheint dieses Expressionssystem eine gute Möglichkeit zu bieten, um<br />
autoreguliert exprimierende <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> zu etablieren. Durch das PIPOff-System<br />
(LUC3PIP) können im Vergleich zum TetOff-System insbesondere in D3- und CCE-Zellen<br />
im induzierten Zustand hohe Luciferase-Expressionen erreicht werden. Allerdings ist die<br />
Expression weniger gut regulierbar. Das E.REXOff-System (LUC3REX) ist nur niedrig<br />
exprimierend, jedoch, wenn auch nur minimal, aktiver als das TetOff-System (LUC3TA2E).<br />
Da die <strong>autoregulierten</strong> TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Systeme in <strong>ES</strong>-Zellen transient höhere<br />
Expressionen als das TetOff-System erlauben, wurden im Folgenden mit den Kassetten<br />
LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP versucht, stabil exprimierende <strong>ES</strong>-Zellklone zu<br />
generieren.
2 Ergebnisse 41<br />
A<br />
1,4<br />
NIH3T3-Zellen<br />
B<br />
30<br />
D3-Zellen<br />
relative Luciferase-Expression [rlu]<br />
1,2<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
relative Luciferase-Expression [rlu]<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP<br />
0<br />
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP<br />
EF<br />
1.0<br />
1.1<br />
0.1<br />
1.1<br />
EF<br />
1.0<br />
27<br />
2.4<br />
13<br />
RF<br />
12<br />
24<br />
7<br />
24<br />
RF<br />
4.7<br />
68<br />
3.4<br />
6.2<br />
C<br />
6,0<br />
IB10-Zellen<br />
D<br />
50<br />
CCE-Zellen<br />
relative Luciferase-Expression [rlu]<br />
5,0<br />
4,0<br />
3,0<br />
2,0<br />
1,0<br />
0,0<br />
EF<br />
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP<br />
1.0<br />
4.2<br />
1.4<br />
1.6<br />
relative Luciferase-Expression [rlu]<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
EF<br />
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP<br />
1.0<br />
39<br />
3.7<br />
17<br />
RF<br />
1.4<br />
37<br />
7.0<br />
1.5<br />
RF<br />
1.4<br />
135<br />
11<br />
38<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
Abb. 29 Vergleich der transienten Luciferase-Expressionen der Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E,<br />
LUC3REX und LUC3PIP in NIH3T3-, D3-, IB10- und CCE-Zellen<br />
Es wurden jeweis 5 µg der Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen und in je 5⋅10 5 <strong>ES</strong>-<br />
Zellen der Linien D3, IB10 und CCE transfiziert. Die transiente Luciferase-Expression im induzierten (•) und reprimierten Zustand ()<br />
wurde nach 2 Tagen bestimmt. Die Expression der Konstrukte wurde auf die des Konstruktes LUC3TA2E der jeweiligen Zelllinie<br />
abgeglichen. Das Expressionspotenzial der Konstrukte wird durch den Expressionsfaktor EF, das Regulationskapazität durch den<br />
Regulationsfaktor RF beschrieben.<br />
2.3.3 Untersuchung der stabilen Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOn-, E.REXOffund<br />
PIPOff-Kassetten in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Die linearisierten Konstrukte LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP wurden in CCE- und<br />
IB10-Zellen elektroporiert und diese mit Selektionsmedium bis <strong>zur</strong> Klonbildung kultiviert. Es<br />
konnten jeweils 10 CCE-Klone mit den Konstrukten LUC3REX und LUC3PIP und 5 CCE-<br />
Klone mit LUC3rTA2E sowie 13 IB10-Klone mit dem Konstrukt LUC3REX, 5 IB10-Klone<br />
mit LUC3PIP und 4 IB10-Klone mit dem Konstrukt LUC3rTA2E selektiert werden. Diese<br />
wurden im Southern-Blot analysiert. Dazu wurden die genomischen DNAs der Klone mit<br />
EcoRV verdaut und mit der neo-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet<br />
ist (Abb.30, Randfragment-Detektion), bzw. mit der Luc3-Sonde, welche zum 3’-Bereich des<br />
Luciferase-3-Gens homolog und zum Nachweis der Vollständigkeit der Integration der<br />
Kassetten in das Genom der Zellen dient (Abb.30), hybridisiert.
2 Ergebnisse 42<br />
LUC3rTA2E<br />
5‘<br />
EcoRV<br />
F<br />
pA pA Luc 3<br />
P bi<br />
rTA2<br />
EMCV<br />
EcoRV<br />
TKneo<br />
F5<br />
EcoRV<br />
pA 3‘<br />
> 4.6 kb<br />
Luc3-Sonde<br />
> 2.2 kb<br />
neo-Sonde<br />
LUC3REX<br />
5‘<br />
EcoRV<br />
EcoRV<br />
F<br />
P biETR<br />
F5<br />
pA pA Luc 3 ET N TKneo<br />
pA<br />
EcoRV<br />
3‘<br />
> 4.1 kb<br />
Luc3-Sonde<br />
> 2.2 kb<br />
neo-Sonde<br />
LUC3PIP<br />
5‘<br />
EcoRV<br />
F<br />
pA pA Luc 3<br />
P biPIT<br />
PIT<br />
EcoRV<br />
F5<br />
N TKneo<br />
pA<br />
EcoRV<br />
3‘<br />
1 kb<br />
> 4.4 kb<br />
> 2.2 kb<br />
Luc3-Sonde<br />
neo-Sonde<br />
Abb. 30 Schematische Darstellung der Vektoren LUC3rTA2, LUC3REX und LUC3PIP nach Integration<br />
in das Genom der Zielzellen<br />
Darstellung der Vektoren LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP sowie der im Southern Blot detektierbaren Fragmente nach Restriktion<br />
der genomischen DNA <strong>von</strong> selektierten Klonen mit dem Restriktionsenzym EcoRV und Hybridisierung mit einer neo-Sonde, die gegen den<br />
3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet ist (Randfragmentgröße min. 2.2 kb), und mit einer Luc3-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des<br />
Luciferase-3 Gens gerichtet ist (Randfragmentgröße min. 4.1, 4.4 bzw. 4.6 kb).<br />
CCE-Klone<br />
A<br />
21.2 kb<br />
LUC3rTA2E<br />
B<br />
LUC3REX<br />
LUC3PIP<br />
1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M<br />
21.2 kb<br />
C<br />
21.2 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
2.0 kb<br />
2.0 kb<br />
IB10-Klone<br />
D<br />
LUC3rTA2E<br />
E<br />
LUC3REX<br />
1 2 3 4 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 M<br />
F<br />
LUC3PIP<br />
21.2 kb<br />
21.2 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
2.0 kb<br />
Abb. 31 Southern Blot Analyse <strong>von</strong> CCE- und IB10-Klonen mit integrierter LUC3rTA2E-, LUC3REXund<br />
LUC3PIP-Kassette<br />
Es wurden 5 µg der linearisierten Vektoren LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in 5⋅10 6 CCE-Zellen bzw. IB10-Zellen elektroporiert.<br />
Nach Selektion <strong>von</strong> G418-resistenten Klonen wurden die genomischen DNAs isoliert, mit EcoRV geschnittenen und mit der neo-Sonde<br />
hybridisiert (Detektion des Tkneo-Gens, Fragment > 2.2 kb): Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf<br />
mehrfache Integrationen der jeweiligen Kassette hin. Zum Nachweis der kompletten Integration der Kassetten wurden die DNAs mit der<br />
Luc3-Sonde hybridisiert (Detektion <strong>von</strong> Luciferase-3). Klone mit einer oder mehreren vollständig integrierten Kassetten sind mit <br />
gekennzeichnet. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert.
2 Ergebnisse 43<br />
Es zeigte sich, dass die Mehrzahl der selektierten CCE-Klone eine singuläre Kopie der<br />
Kassette besitzen (Abb.31, Fragment >2.2 kb). Weiterhin wurde festgestellt, dass das<br />
Konstrukt LUC3rTA2E in 3 <strong>von</strong> 5 (Abb.31A), LUC3REX in 7 <strong>von</strong> 8 (Abb.31B) und<br />
LUC3PIP in 6 <strong>von</strong> 8 Klonen (Abb.31C) mit singulärer Kopie vollständig integriert wurde.<br />
Bei den IB10-Klonen mit LUC3rTA2E-Kassette zeigte sich, dass Klon 2 eine singuläre,<br />
jedoch unvollständige Kopie der Kassette besitzt (Abb.31D, Fragment >2.2 kb). In den<br />
Klonen 3 und 4 wurden zweifache, allerdings vollständige Integrationen festgestellt<br />
(Abb.31D). Dagegen wurde in der Mehrzahl der LUC3REX-Klone singuläre und vollständige<br />
Integrationen detektiert (Abb.31E). Bei den LUC3PIP-Klonen konnte nur in den Klonen mit<br />
mehrfacher Integration die Vollständigkeit wenigstens einer Kassette nachgewiesen werden<br />
(Abb.31F).<br />
Für die Untersuchung der Luciferase-Expression und Regulation wurden die Zellen der Klone<br />
mit vollständig integrierten Expressionskassetten unter induzierenden bzw. reprimierenden<br />
Bedingungen kultiviert. Von den beiden CCE-Klonen mit LUC3rTA2E-Kassette zeigte Klon<br />
2 eine hohe Luciferase-Aktivität (Abb.32A). In den CCE-Klonen mit LUC3REX-Konstrukt,<br />
Klon 1, 7 und 9, wurden ebenfalls hohe Luciferase-Aktivitäten detektiert (Abb.32A). Dagegen<br />
wurde in keinem der LUC3PIP-Klone eine signifikante Expression nachgewiesen. Die<br />
Expression des LUC3rTA2E-Klons konnte nicht reguliert werden (Abb.32A). Dagegen waren<br />
die Expressionen der drei LUC3REX-Klone regulierbar (Abb.32A).<br />
Bei den IB10-Klonen mit vollständig integrierten Expressionskassetten konnte nur in dem<br />
LUC3rTA2E-Klon 4 eine sehr hohe, regulierbare Expression festgestellt werden (Abb.32B).<br />
In dem LUC3REX-Klon 9 wurde ebenfalls Luciferase-Aktivität nachgewiesen. Jedoch war<br />
diese niedrig und wenig regulierbar (Abb.32B). Die restlichen LUC3rTA2E- und LUC3REX-<br />
Klone bzw. alle LUC3PIP-Klone zeigten keine Expression.<br />
A<br />
CCE-Klone<br />
B<br />
IB10-Klone<br />
50000<br />
47642<br />
50000<br />
45845<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
19799<br />
24242<br />
14950<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
3370<br />
0<br />
2 1 7 9<br />
0<br />
4 9<br />
LUC3rTA2E<br />
LUC3REX<br />
LUC3rTA2E<br />
LUC3REX<br />
RF<br />
1.1 2.5<br />
13 3.4 RF 141<br />
2.5<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
Abb. 32 Luciferase-Expression <strong>von</strong> CCE- und IB10-Klonen mit integrierter LUCrTA2E bzw. LUC3REX-<br />
Kassette<br />
Zellen der CCE-Klone bzw. IB10-Klone mit vollständig integrierter LUC3rTA2E- und LUC3REX- und LUC3PIP-Kassette wurden unter<br />
expressionsinduzierenden bzw. reprimierenden Bedingungen kultiviert und anschließend hinsichtlich der Luciferase-Expression [rlu]<br />
untersucht. Der Regulationsfaktor RF wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten und reprimierten Zustand<br />
gebildet. In (A) ist die Luciferase-Aktivität exprimierender CCE-Klone, in (B) die <strong>von</strong> exprimierenden IB10-Klonen mit LUC3rTA2E bzw.<br />
LUC3REX-Kassette dargestellt. Die restlichen, im Southern-Blot identifizierten Klone mit vollständig integrierter LUC3rTA2E-,<br />
LUC3REX- bzw. LUC3PIP-Kassette zeigten keine Luciferase-Aktivität.
2 Ergebnisse 44<br />
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass im Gegensatz zum Vektor LUC3PIP die <strong>autoregulierten</strong><br />
Kassetten LUC3rTA2E und LUC3REX die <strong>Etablierung</strong> autoreguliert exprimierender <strong>ES</strong>-<br />
Zellen prinzipiell ermöglichen. Die Expression des Reportergens ist signifikant, wobei die<br />
Kassette LUC3rTA2E das höchste Expressionspotenzial besitzt. Außerdem kann die<br />
Expression in der Mehrzahl der exprimierenden Klone in unterschiedlichem Ausmaß reguliert<br />
werden, wobei dies wie auch die Höhe der Expression durch den für die Expression<br />
notwendigen Transaktivator und durch die Umgebung des Integrationsort der Kassette<br />
bestimmt wird.<br />
Die Untersuchung der transienten Expression des Konstruktes LUC3rTA2E zeigt, dass mit<br />
einem <strong>autoregulierten</strong> TetOn-System die höchsten Expressionen im Vergleich zu anderen<br />
<strong>autoregulierten</strong> Expressionssystemen in <strong>ES</strong>-Zellen erreicht werden (Kap.2.3.2). Deshalb war<br />
vermutet worden, dass mit diesem Expressionssystem viele <strong>ES</strong>-Zellklone mit hohen<br />
Luciferase-Expressionen generiert werden können. Jedoch führte die Elektroporation der<br />
LUC3rTA2E-Kassette in IB10- und CCE-Zellen zu einer nicht erwarteten niedrigen Zahl <strong>von</strong><br />
G418-resistenten Zellklonen. Nur wenige dieser Klone zeigten eine hohe Expression<br />
(Abb.32). Ähnliches wurde bei der <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit dem TetOff-System<br />
festgestellt (Kap.2.2.4). Die geringe Zahl selektierter Klone nach Elektroporation und die<br />
nicht signifikante Expression dieser Klone wurden mit einem niedrigen Expressionspotenzial<br />
des TetOff-Systems aufgrund einer niedrigen Aktivität des Transaktivators in den <strong>ES</strong>-Zellen<br />
begründet. Das TetOn-System ist dagegen hoch exprimierend (Kap.2.3.2), was zu der<br />
Erwartung führte, dass dieses System im Gegensatz zum TetOff-System die <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong><br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> erleichtern würde. Möglicherweise kommt es aufgrund des hohen<br />
Induktionspotenzials des reversen Transaktivators rTA2-M2 jedoch zu toxischen<br />
Transaktivator-Konzentrationen in den <strong>ES</strong>-Zellen, die Squelching bewirken und zum Tod der<br />
Zellen führen können (Kap.1.1.1.3). Das würde bedeuten, dass nur die Zellen mit genomisch<br />
integrierter TetOn-Kassette überleben, die eine für die Aufrechterhaltung der G418-Resistenz<br />
ausreichende Expression aufweisen. Diese muss jedoch niedrig genug sein, dass keine<br />
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen erreicht werden.<br />
Im Folgenden wurde untersucht, inwieweit das autoregulierte TetOn-System in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Squelching induzieren kann.<br />
2.3.4 Squelching-Effekt <strong>von</strong> LUC3rTA2E<br />
Zur Überprüfung der Squelching-Kapazität des reversen Transaktivators rtTA2-M2 wurde die<br />
Auswirkung der Transaktivator-Expression auf die konstitutive Expression eines<br />
unabhängigen Reportergens in <strong>ES</strong>-Zellen untersucht. Dazu wurde das autoregulierte<br />
Konstrukt LUC3rTA2E und zum Vergleich die Konstrukte LUC3TA2E, LUC3REX und<br />
LUC3PIP mit dem Vektor pEFlacZ, welcher eine durch einen EF1α-Promotor vermittelte,<br />
konstitutive β-Galactosidase-Expression ermöglicht, in <strong>ES</strong>-Zellen der Linie D3, IB10 und<br />
CCE kotransfiziert. Die Zellen wurden unter induzierenden und reprimierenden Bedingungen<br />
kultiviert. Anschließend wurden die transienten β-Galactosidase-Expressionen der Zellen<br />
untersucht. Das Verhältnis der β-Galactosidase-Expression bei Repression und Induktion der<br />
Expression des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes beschreibt den Einfluß des exprimierten<br />
Transaktivators auf die konstitutive Expression des Konstruktes pEFLacZ und ist ein Maß für<br />
das Squelching-Potenzial des jeweiligen Transaktivators (Abb.33).
2 Ergebnisse 45<br />
1,2<br />
LUC3TA2E<br />
1,2<br />
LUC3rTA2E<br />
1,2<br />
LUC3REX<br />
1,2<br />
LUC3PIP<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
relative beta-Galactosidase-Expression<br />
relative beta-Galactosidase-Expression<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0,0<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
relative beta-Galactosidase-Expression<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
relative beta-Galactosidase-Expression<br />
7<br />
5<br />
E 0.77 1.1 0.74<br />
E 0.33 0.37 0.4<br />
E 0.88 0.78 0.56<br />
E 0.74 0.36 0.5<br />
induziert<br />
reprimiert<br />
Abb. 33 Relative β-Galactosidase-Expression <strong>von</strong> pEFLacZ in Abhängigkeit <strong>von</strong> der Expression der<br />
Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in D3-, IB10- und CCE-Zellen<br />
Es wurde die relative β-Galactosidase-Expression des Konstruktes pEFLacZ bei (•) induzierter Expression der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte<br />
LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in D3-, IB10- und CCE-Zellen auf die β-Galactosidase-Expression bei ()<br />
reprimierter Expression der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte normiert. E: normierte Expression <strong>von</strong> pEFLacZ bei induzierter Expression der<br />
<strong>autoregulierten</strong> Konstrukte.<br />
Die Daten zeigen, dass die Induktion der <strong>autoregulierten</strong> Expression in Abhängigkeit vom<br />
exprimierten Transaktivator die β-Galactosidase-Expression beeinflusst. Der rtTA2-M2-<br />
Transaktivator des Konstruktes LUC3rTA2E bewirkt im Vergleich zu den Transaktivatoren<br />
tTA2 (LUC3TA2E), ET (LUC3REX) und PIT (LUC3PIP) in den drei <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> die<br />
stärkste Abnahme der β-Galactosidase-Expression (Abb.33). Die Expression <strong>von</strong> PIT<br />
resultiert ebenfalls in einer Reduktion der β-Galactosidase-Expression, jedoch ist der Effekt<br />
geringer als bei Expression <strong>von</strong> rtTA2-M2. Die Transaktivatoren tTA2 und ET beeinflussen<br />
am wenigsten die Expression <strong>von</strong> β-Galactosidase. Allerdings werden diese im Vergleich zu<br />
rtTA2-M2 und PIT in den <strong>ES</strong>-Zellen nur wenig exprimiert, was sich anhand der geringen<br />
Luciferase-Expression der Vektoren LUC3TA2E und LUC3REX in diesen Zellen zeigte<br />
(Abb.29). Da jeder Transaktivator der hier verwendeten Konstrukte eine vollständige (ET,<br />
PIT) bzw. minimale (tTA2, rtTA2-M2) transkriptionsaktivierende VP16-Domäne enthält, die<br />
für das Squelching verantwortlich gemacht wird, ist der Einfluss auf die β-Galactosidase-<br />
Expression direkt durch die Aktivität des Transaktivators bestimmt: Je aktiver dieser ist, desto<br />
höhere Transaktivator-Konzentrationen werden in den Zellen erreicht und desto stärker wird<br />
die β-Galactosidase-Expression <strong>von</strong> pEFLacZ reprimiert.<br />
Um das Squelching des Transaktivators rtTA2-M2 bei der Generierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellklonen<br />
näher beschreiben zu können, wurde die Auswirkung unterschiedlicher Transaktivator-<br />
Expressionen, reguliert durch Doxycyclin während der Selektion, auf die Bildung <strong>von</strong> Klonen<br />
untersucht. Es wurde basierend auf die Versuche <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit dem<br />
TetOn-System (Kap.2.3.3) vermutet, dass bei hoher Induktion der Expression die<br />
Transaktivator-Konzentrationen zum Squelching führen, was die Selektion <strong>von</strong> Klonen<br />
limitiert, während bei niedrigerer Induktion durch die veringerten Transaktivator-Mengen die<br />
<strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> Klonen verbessert werden kann.<br />
Das linearisierte Konstrukt LUC3rTA2E wurde in CCE-Zellen elektroporiert und diese zu<br />
gleichen Teilen auf Zellkulturplatten ausgesät. Die Zellen wurden in Selektionsmedium mit<br />
unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentrationen (0 bis 2000 ng/ml Doxycyclin) kultiviert.<br />
Dadurch kommt es in unterschiedlichem Ausmaß in den Zellen <strong>zur</strong> Expression des
2 Ergebnisse 46<br />
Transaktivators. Nach Abschluss der Selektion wurden die G418-resistenten Zellklone gezählt<br />
und zu Zellgemischen zusammengeführt, die nach weiterer Kultivierung in entsprechenden<br />
Doxycyclin-haltigem bzw. freiem Selektionsmedium hinsichtlich der Luciferase-Expression<br />
untersucht wurden. In der Abbildung 34 sind die ermittelten Klonzahlen pro 500.000<br />
elektroporierten Zellen und die Luciferase-Expressionen der Zellgemische in Bezug <strong>zur</strong><br />
Doxycyclin-Konzentration des für die Kultivierung jeweils verwendeten Mediums gestellt.<br />
10<br />
9<br />
8<br />
100000<br />
10000<br />
Anzahl G418-<br />
resistenter Klone<br />
relative Luciferase-<br />
Expression<br />
Anzahl G418-resistenter Zellklone<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
1000<br />
100<br />
Luciferase-Expression [rlu]<br />
2<br />
10<br />
1<br />
0<br />
0 1 10 50 100 1000 2000<br />
Doxycyclin-Konzentration [ng/ml]<br />
1<br />
Abb. 34 <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> CCE-Klonen mit integrierter LUC3rTA2E-Kassette in Abhängigkeit <strong>von</strong> der<br />
Doxycyclin-Konzentration<br />
Es wurden 7.5 µg des linearisierten Konstruktes LUC3rTA2E in 7.5⋅10 6 CCE-Zellen elektroporiert. Jeweils 5⋅10 5 elektroporierte Zellen<br />
wurden auf einzelne Kulturplatten ausgesät und in Medien mit G418 und unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentration kultiviert. Nach<br />
Selektion wurde die Zahl der G418-resistenten Zellen pro 5⋅10 5 ausgesäter Zellen bestimmt und aus den Klongemischen die Luciferase-<br />
Expression ermittelt. In der Abbildung sind die Zahl der G418-resistenten Klone und die Luciferase-Expression der Klongemische gegen die<br />
Doxycyclin-Konzentration des Kultivierungsmediums aufgetragen.<br />
Wie erwartet, bewirken ansteigende Doxycyclin-Konzentrationen im Kultivierungsmedium<br />
zunächst eine verstärkte Induktion der Expression der <strong>autoregulierten</strong> Kassette LUC3rTA2E,<br />
was eine Zunahme G418-resistenter Zellklone <strong>zur</strong> Folge hat (Abb.34, 0 bis 100 ng/ml<br />
Doxycyclin). Die weitere Zunahme der Doxycyclin-Konzentration führt dann jedoch zu einer<br />
Abnahme der Klonzahlen (Abb.34, 1000-2000 ng/ml). Vermutlich kommt es durch die<br />
maximale Induktion der Expression des Transaktivators in den Zellen zum Squelching. Die<br />
Luciferase-Expression zeigt eine direkte Abhängigkeit <strong>zur</strong> Doxycylin-Konzentration. Mit<br />
ansteigender Doxyclin-Konzentration steigt die Luciferase-Aktivität in den Zellgemischen an<br />
und erreicht bei 1000 ng/ml Doxycyclin ihr Maximum (Abb.34).<br />
Aus den bisherigen Daten kann geschlussfolgert werden, dass das TetOn-System zu hohen<br />
Expressionen in <strong>ES</strong>-Zellen führt, jedoch durch hohe Expressionen des TetOn-Transaktivators<br />
verstärkt Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen auftritt, was die <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> transgenen <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong><br />
limitiert. Die Expression des TetOn-Systems kann jedoch während der Selektion durch
2 Ergebnisse 47<br />
gezielte Doxycyclin-Zugabe eingestellt werden (Abb.34, 100 ng/ml), was zu mehr <strong>ES</strong>-<br />
Zellklonen führt, die eine ausreichende Lucifease-Expression aufweisen.<br />
2.4 Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie<br />
Die Markierung <strong>von</strong> Genorten in Zellen mit heterospezifischen FRT-Sites ermöglicht die<br />
anschließende Integration jeder beliebigen Expressionskassette in diese Genorte. Dadurch<br />
können die Expressionen <strong>von</strong> <strong>autoregulierten</strong> Kassetten im identischen chromosmalen<br />
Hintergrund verglichen werden. Es wird erwartet, dass das Expressions- und<br />
Regulationsverhalten der integrierten Austauschkonstrukte vorhersagbar ist (Verhoeyen et al.,<br />
2001).<br />
In den Arbeiten <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998, 2001) wurde der Kassettenaustausch mittels einer<br />
sogenannten Selektionsfalle selektiert. Durch Integration eines Promotors und eines<br />
Startcodons in einen, mit heterospezifischen FRT-Sites markierten Genort in NIH3T3-Zellen<br />
konnte die Expression des ATG-defizienten, bereits genomisch verankerten Selektionsgens<br />
Neomycinphosphotransferase aktiviert werden, was die Anreicherung G418-resistenter<br />
Austauschklone ermöglichte. Diese Positiv-Selektion ermöglichte eine Austauscheffizienz<br />
<strong>von</strong> 100%. Im Gegensatz dazu sollte bei der in dieser Arbeit angewandten<br />
Kassettenaustauschstrategie der Austausch mittels Negativ-Selektion durch Wegfall des<br />
Selektionsmarkers Thymidinkinase in Austauschklonen angereichert werden. Allerdings kann<br />
durch spontane Reduktion der Transkription des Tkneo-Gen und damit einer Reduktion der<br />
Thymidinkinase-Aktivität (Askew et al., 1993, Wu et al., 1994, Seibler et al., 1998) oder<br />
durch Deletionen und/oder Rearrangements des Parentalkonstruktes mit resultierendem<br />
Thymidinkinase-Verlust die Gancyclovir-Sensitivität aufgehoben werden, was zu<br />
sogenannten falsch positiven Zellklonen führt. Um die Zahl dieser Zellklone zu minimieren,<br />
wird bei der in dieser Arbeit angewandten Austauschstrategie durch Integration eines<br />
Startcodons im Leseraster zum bereits verankerten neo-Gen die<br />
Neomycinphosphotransferase-Expression aufrechterhalten. Daduch wird außerdem einer<br />
spontanen Abschaltung der <strong>autoregulierten</strong> Expression des Austauschkonstruktes in<br />
Austauschklonen entgegengewirkt.<br />
Die aufgestellte Austauschstrategie (Kap.2.1.2) wurde in NIH3T3-Zellen mit integrierter<br />
autoregulierter TetOff-Kassette überprüft.<br />
2.4.1 Kassettenaustausch in NIH3T3-Zellen<br />
Basierend auf den <strong>autoregulierten</strong> TefOff-Expressionskassetten wurde der ähnlich aufgebaute<br />
Austauschvektor TGALTA2E generiert (Abb.35). Dieser erlaubt die autoregulierte<br />
Expression des Reportergens β-Galactosidase. Nach Integration der Austauschkassette in den<br />
markierten Genlocus werden die Austauschklone anhand des Verlustes des Thymidinkinase-<br />
Gens mittels Gancylovir-Selektion angereichert. Dagegen bleiben die parentalen Zellen<br />
aufgrund ihrer Thymidinkinase-Aktivität Gancyclovir sensitiv und sterben letztlich ab. Die<br />
sequenzspezifische Rekombination wird durch die Flipase Flpe (flp enhanced, Buchholz et<br />
al., 1998), einer thermostabileren Variante der ursprünglichen Flipase Flp (Broach und Hicks,<br />
1980) am effizientesten vermittelt. Diese kann durch das Konstrukt pFGFUS als<br />
Fusionsprotein mit eGFP (enhanced green fluorescent protein) in transfizierten Zellen<br />
exprimiert werden. Durch die eGFP-Expression können die Zellen, in denen das<br />
Fusionsprotein Flpe-eGFP exprimiert wird, im FACS-Gerät sortiert werden. Somit können<br />
bereits frühzeitig Zellen angereichert werden, in denen aufgrund der Flipase-Expression<br />
Kassettenaustausch möglich ist.
2 Ergebnisse 48<br />
TGALTA2E<br />
(Austauschkonstrukt)<br />
F<br />
F5<br />
1 kb<br />
β-Galactosidase<br />
TA2<br />
EMCV<br />
ATG<br />
+ pFGFUS<br />
Genlocus mit<br />
LUCTN7-Kassette<br />
F H F5<br />
H<br />
5‘ Luciferase TA N TK - neo<br />
3‘<br />
Genlocus nach<br />
Kassettenaustausch<br />
2.5 kb<br />
neo-Sonde<br />
H<br />
F<br />
H<br />
H F5<br />
H<br />
5‘ β-Galactosidase<br />
TA2 EMCV neo<br />
3‘<br />
ATG<br />
> 5.1 kb 1.5 kb<br />
Gal-Sonde<br />
neo-Sonde<br />
Abb. 35 Schematische Darstellung des Kassettenaustausches<br />
Das Austauschkonstrukt TGALTA2E erlaubt die autoregulierte Expression <strong>von</strong> β-Galactosidase. Das Konstrukte pFGFUS dient der<br />
Expression <strong>von</strong> Flpe-Rekombinase, die die Integration des Austauschkonstruktes in den mit dem Konstrukt LUCTN7 versehenen Genort<br />
katalysiert. Durch den Austausch kommt es zum Verlust des Thymidinkinase-Gens. Gleichzeitig wird ein ATG im Leseraster zum neo-Gen<br />
inseriert, so dass die EMCV-vermittelte Expression <strong>von</strong> neo aufrechterhalten wird (Genlocus nach Kassettenaustausch). Nach Restriktion der<br />
HMW-DNA <strong>von</strong> Austauschklonen mit HindIII (H) kann im Southern-Blot mit einer neo-Sonde der Austausch nachgewiesen werden<br />
(Fragement 1.5kb). Mit der Gal-Sonde kann die spezifische Integration <strong>von</strong> zufälligen Integrationen unterschieden werden.<br />
Für den Kassettenaustausch wurden Zellen des NIH3T3-Klons 18 mit singulär integrierter<br />
LUCTN7-Kassette eingesetzt (Kap.2.2.3). Die Konstrukte TGALTA2E und pFGFUS wurden<br />
in die Zellen kotransfiziert. Nach FACS-Sortierung wurden die eGFP-positiven Zellen in<br />
Kulturmedium mit Gancyclovir und G418 kultiviert. Es wurden 30 Gancyclovir-/G418-<br />
resistente Klone isoliert. Der Kassettenaustausch wurde anschließend durch Untersuchung der<br />
β-Galactosidase-Expression der selektierten Klone und im Southern-Blot analysiert. Dazu<br />
wurden die genomischen DNAs der Klone mit HindIII verdaut und mit der neo-Sonde, die<br />
gegen das Neomycinphosphotransferase-Gen gerichtet ist, hybridisiert (Abb.35).<br />
In den Klonen 11, 12, 21, 23, 27 und 30 konnte ein Kassettenaustausch nachgewiesen werden<br />
(Abb.36A, Fragment 1.5kb). In den restlichen Klonen wurden das Parentalkonstrukt<br />
(Abb.36A, Fragment 2.5kb) bzw. Fragmente abweichender Größe detektiert (Daten nicht<br />
gezeigt). Da diese Klone Gancyclovir-resistent waren, wurde angenommen, dass diese<br />
aufgrund unspezifischer Deletionen und/oder Rearrangements des parentalen Konstruktes<br />
oder durch Reduktion der Expression des parentalen Tkneo-Gens keine oder eine nicht<br />
ausreichende Thymidinkinase-Aktivität aufwiesen. Die G418-Resistenz dieser Klone ist<br />
möglicherweise damit zu erklären, dass die Neomycinphosphotransferase-Aktivität für die<br />
G418-Selektion ausreicht. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass das prokaryrontische<br />
Vektorrückgrat des Flipase-exprimierenden Konstruktes pFGFUS mit dem Kanamycin-<br />
Resistenzgen in das Genom dieser Zellen zufällig integriert wurde, was ebenfalls zu einer<br />
G418-Resistenz führen kann.<br />
Um die spezifische bzw. zufällige Integration des Austauschkonstruktes in das Genom der<br />
Austauschklone nachzuweisen, wurden die HindIII-verdauten, genomischen DNAs im
2 Ergebnisse 49<br />
Southern-Blot mit einer gegen das β-Galacosidase-Gen gerichteten Gal-Sonde hybridisiert<br />
(Abb.35). Dabei konnte die spezifische Integration des Austauschkonstruktes in den<br />
Austauschklonen 27 und 30 gezeigt werden (Abb.36B, Fragment >5.1 kb). In den restlichen<br />
Austauschklonen wurden neben der spezifischen Integration in den markierten Genort<br />
zufällige Integrationen des Austauschkonstruktes in das Genom der Zellen nachgewiesen<br />
(Abb.36B)<br />
A<br />
TGALTA2E<br />
M<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 K M<br />
5.0 kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
1.4 kb<br />
2.5kb<br />
1.5kb<br />
0.9 kb<br />
neo-Sonde<br />
B<br />
M 11 12 21 23 27 30<br />
21.2 kb<br />
5.0 kb<br />
>5.1kb<br />
3.5 kb<br />
2.0 kb<br />
Gal-Sonde<br />
Abb. 36 Southern-Blot Analyse <strong>von</strong> Austauschklonen<br />
Es wurden 36 µg des Vektors TGALTA2E und 12 µg des Vektors pFGFUS in 6⋅10 5 NIH3T3-Zellen des Klons 18 mit singulär integrierter<br />
LUCTN7-Kassette transfiziert. Nach Sortierung eGFP-positiver Zellen im FACS und Selektion mit Gancyclovir/G418 wurden die HWM-<br />
DNAs resistenter Klone isoliert und mit HindIII geschnitten. (A) Mit der neo-Sonde wurde der Kassettenaustausch detektiert (Fragment<br />
1.5kb). Falsch-positive Klone besitzen entweder die Parentalkassette (Fragment 2.5kb) bzw. ein deletiertes und/oder rearrangiertes<br />
Parentalkonstrukt (Fragment >2.5kb, Daten nicht gezeigt). (B) Zum Nachweis zusätzlicher Integrationen des Austauschkonstruktes in<br />
Austauschklonen wurden die HindIII-geschnittenen HMW-DNAs mit der Gal-Sonde hybridisiert. Eine Bande pro Spur (Fragement >5.1)<br />
bedeutet die Integration <strong>von</strong> TGALTA2 im markierten Genort, mehrere Banden deuten auf zusätzliche Integrationen der Austauschkassette<br />
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert. K: NIH3T3-Zellen mit integrierter LUCTN7-Kassette, Kl.18<br />
Die Austauschklone wurden hinsichtlich ihrer β-Galactosidase-Expression untersucht. In allen<br />
Austauschklonen konnte eine β-Galactosidase-Aktivität gemessen werden. Die<br />
Austauschklone 27 und 30 ohne zusätzliche Integrationen der Kassette TGALTA2E zeigen<br />
erwartungsgemäß eine übereinstimmende β-Galactosidase-Aktivität und spiegeln somit die<br />
tatsächliche β-Galactosidase-Expression in dem definierten Genort wieder. Dagegen werden<br />
die Expressionen der anderen Austauschklone durch zusätzliche Integrationen des<br />
Austauschkonstruktes bestimmt und weichen deshalb <strong>von</strong> den homogenen Expressionswerten<br />
der Klone 27 und 30 ab. Die Regulierbarkeit der β-Galactosidase-Expression wurde nicht<br />
untersucht.
2 Ergebnisse 50<br />
1,5<br />
beta-Galactosidase-Expression [rlu]<br />
1<br />
0,5<br />
0<br />
1,2<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,4<br />
0,2<br />
11 12 21 23 27 30<br />
Klon<br />
Abb. 37 β-Galactosidase Expression der Austauschklone<br />
Die Austauschklone wurden hinsichtlich ihrer β-Galactosidase-Expression untersucht. Die gemessenen β-Galactosidase-Aktivitäten wurden<br />
auf die Proteinmengen abgeglichen<br />
Der Versuch zeigt, dass ein Kassettenaustausch entsprechend der Austauschstrategie<br />
(Kap.2.1.2) möglich ist. Es wurde jedoch eine Vielzahl falsch-positiver Klone selektiert.<br />
Diese hatten entweder durch unspezifische Deletionen und/oder Rearrangements des<br />
parentalen Konstruktes oder durch Reduktion der Transkription des Tkneo-Gens eine für<br />
Gancyclovir-Selektion nicht ausreichende Thymidinkinase-Aktivität. Die gleichzeitige,<br />
kontinuierliche Selektion mit G418 sollte verhindern, dass diese falsch-positven Klone<br />
überleben, was jedoch nicht der Fall war. Möglicherweise kam es <strong>zur</strong> zufälligen Integration<br />
des Vektors pFGFUS, der durch sein Kanamycin-Resistenzgen G418-Resistenz vermitteln<br />
kann. Allerdings ist es auch denkbar, dass trotz reduzierter Transkription des parentalen<br />
Tkneo-Gens in den Klonen die Neomycinphosphotransferase-Aktivität für die<br />
Gewährleistung der G418-Resistenz ausreichte. Um die Effizienz des Kassettenaustausches<br />
zu steigern, bedarf es daher einer Modifikation der Austauschstrategie hinsichtlich einer<br />
stringenteren Selektion. Dies wird in der Diskussion weitläufig erörtert.
3 Diskussion 51<br />
3 Diskussion<br />
Das Ziel dieser Arbeit war die <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit hoher, strikt regulierbarer<br />
Reportergen-Expression. Weiterhin sollten diese für die regulierbare Expressionen <strong>von</strong><br />
beliebigen Transgenen wiederverwendet werden können. Dazu sollten mittels eines<br />
<strong>autoregulierten</strong>, Reportergen-exprimierenden Konstruktes Genorte in <strong>ES</strong>-Zellen mit<br />
heterospezifischen FRT-Sites markiert werden, so dass in diese Loci nachträglich ein<br />
autoreguliertes, Transgen-exprimierendes Austauschkonstrukt durch Flp-vermittelte<br />
Rekombination integriert werden kann.<br />
Im ersten Schritt der Arbeit wurde die Verwendbarkeit eines <strong>autoregulierten</strong> TetOff-<br />
Konstruktes in <strong>ES</strong>-Zellen überprüft. Außerdem wurden autoregulierte TetOn-, E.REXOffund<br />
PIPOff-Kassetten konstruiert und diese in <strong>ES</strong>-Zellen mit dem TetOff-System verglichen,<br />
mit dem Ziel, das am besten exprimierende und regulierbare System in <strong>ES</strong>-Zellen zu finden.<br />
Zu Vergleichszwecken wurden die verschiedenen Systeme auch in NIH3T3-Zellen getestet,<br />
da in mehreren Publikationen die Funktionalität der Systeme in differenzierten Zellen<br />
beschrieben wurde. Im letzten Schritt der Arbeit wurde die Austauschstrategie hinsichtlich<br />
Funktionalität und Austauscheffizienz in NIH3T3-Zellen untersucht.<br />
3.1 Autoregulierte Expressionssysteme in NIH3T3- und <strong>ES</strong>-Zellen<br />
3.1.1 Optimierung der Tkneo-Expression durch Austausch des IR<strong>ES</strong>-Elements<br />
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der autoregulierte Expressionsvektor LUCTP, basierend<br />
auf dem TetOff-Expressionssystem, entwickelt, welcher <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong> transgener <strong>ES</strong>-<br />
<strong>Zelllinien</strong> mit regulierbarer Expression eingesetzt werden sollte. Die Funktionalität dieses<br />
Konstruktes wurde in NIH3T3-Zellen nach Elektroporation untersucht. Die isolierten<br />
NIH3T3-Zellklone mit genomisch integrierter LUCTP-Kassette zeigten eine hohe,<br />
regulierbare Expression (Abb.13). Jedoch waren die Zellen nicht Gancyclovir-sensitiv. Dies<br />
wurde auf eine geringe Tkneo-Expression <strong>zur</strong>ückgeführt. Da entsprechend der<br />
Kassettenaustauschstrategie (Kap.2.1.2) die Zellen, in denen ein Kassettenaustausch<br />
stattgefunden hat, durch den Verlust der Thymidinkinase-Aktivität selektiert werden sollen,<br />
musste die Expression <strong>von</strong> Tkneo des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes erhöht werden. Deshalb<br />
wurde das Polio-IR<strong>ES</strong> des Vektors LUCTP gegen das aktivere EMCV-IR<strong>ES</strong> (Borman et al.,<br />
1997; Oumard et al., 2000), was in <strong>ES</strong>-Zellen als auch in transgenen Mäusen funktional ist<br />
(Kim et al., 1992), und gegen den murinen 5’-UTR des NRF (NF-κB repressing factor)-Genes<br />
(NRF-IR<strong>ES</strong>) bzw. Deletionsmutanten (Oumard, 2001) ausgetauscht. Insbesondere die NRF-<br />
IR<strong>ES</strong> Elemente besitzen ein vielfach höheres translationsinitiierendes Potenzial als das Poliound<br />
das EMCV-IR<strong>ES</strong> (Oumard et al., 2000; Oumard, 2001; Hennecke et al., 2001). Während<br />
die Polio- bzw. EMCV-IR<strong>ES</strong> vermittelte Translation des zweiten Cistrons meist geringer<br />
ausfällt als die cap-abhängige des ersten Cistrons (Dirks et al., 1994; Mizuguchi et al., 2000),<br />
ist für bicistronische Konstrukte mit NRF-IR<strong>ES</strong> ein umgekehrtes Expressionsverhältnis <strong>von</strong><br />
ersten und zweiten Cistron gezeigt worden. Allerdings hängen die Expressionshöhen <strong>von</strong> den<br />
exprimierten Genen ab, so dass eine Umordnung der Gene im ersten und zweiten Cistron auch<br />
zu gegenteiligen Effekten führen kann (Oumard, 2001, Hennecke et al., 2001). Da durch den<br />
Austausch des IR<strong>ES</strong>-Elements im <strong>autoregulierten</strong> Konstrukt LUCTP die Anordnung der<br />
Cistrons tTA und Tkneo nicht verändert wurde, war die Translation und damit die
3 Diskussion 52<br />
Expressionshöhe <strong>von</strong> Tkneo in erster Linie <strong>von</strong> der translationsinitiierenden Aktivität des<br />
inserierten IR<strong>ES</strong> abhängig.<br />
Die Konstrukte mit den verschiedenen IR<strong>ES</strong>-Elementen wurden hinsichtlich der IR<strong>ES</strong>vermittelten<br />
Translation <strong>von</strong> Tkneo in NIH3T3-Zellen anhand der Bildung <strong>von</strong> G418-<br />
resistenten Klonen nach Transfektion untersucht (Abb.14). Dabei zeigte sich, dass durch das<br />
EMCV-IR<strong>ES</strong>, in größerem Ausmaß durch die verschiedenen NRF-IR<strong>ES</strong> Elemente die<br />
Translation des zweiten Cistrons Tkneo verstärkt werden konnte, was sich in der Zunahme<br />
G418-resistenter Klone widerspiegelte. Die Translation des ersten Cistrons tTA wurde durch<br />
die IR<strong>ES</strong>-Elemente nur marginal beeinflusst, was sich in ähnlichen Luciferase-Expressionen<br />
der G418-resistenten Klongemische zeigte. Durch die Zunahme der Expression <strong>von</strong> Tkneo<br />
und damit verstärkte Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen konnte auch die Gancyclovir-<br />
Sensitivität der Zellen erhöht werden. Insbesondere durch die NRF-IR<strong>ES</strong> Elemente wurde<br />
eine Tkneo-Expression vermittelt, die in einer Gancyclovir-Sensitivität aller transfizierten<br />
Zellen resultierte, während die schwächere EMCV-vermittelte Expression in einem geringen<br />
Anteil auch zu Gancyclovir-resistenten Zellen führte. Mit dem Konstrukt LUCTN7, welches<br />
eine NRF-IR<strong>ES</strong> Deletionsmutante trägt, konnte das hohe translationsinitiierende Potenzial des<br />
NRF-IR<strong>ES</strong> auch in stabil exprimierenden NIH3T3-Zellklonen nach Elektroporation bestätigt<br />
werden: ca. 90% der G418-resistenten Klone waren Gancyclovir-sensitiv. Diese Klone<br />
zeigten ebenfalls eine hohe autoregulierte Expression, die stark reprimiert werden konnte<br />
(Abb.16).<br />
3.1.2 Das autoregulierte TetOff-System ist in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig exprimierend<br />
Bisherige Publikationen zeigen, dass TetOff-Systeme in differenzierten Zellen wie HeLa,<br />
HEK293, CHO1, NIH3T3 und in Geweben transgener Mäuse funktional sind und zu hohen,<br />
regulierbaren Expressionen eines Transgens führen (Kap.1.1.1). Dies konnte auch in dieser<br />
Arbeit durch Expressionsanalysen des <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Systems in der embryonalen<br />
Mausfibroblasten-Zelllinie NIH3T3 bestätigt werden (Kap.2.2.3). Da das Konstrukt LUCTN7<br />
in diesen Zellen ein hohes Expressions- und Regulationspotenzial besitzt, wurde es <strong>zur</strong><br />
<strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> <strong>autoregulierten</strong>, transgenen <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> eingesetzt. Nach Elektroporation in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen wurden jedoch sehr wenige G418-resistente Klone selektiert, die minimale, nicht<br />
signifikante Luciferase-Expressionen aufwiesen (Kap.2.2.4). Auch nach Integration in einen<br />
definierten Genort, dem ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991), konnte keine<br />
signifikante Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Kassette festgestellt werden (Kap.2.2.5),<br />
obwohl in diesen Locus inserierte Gene ab dem 8-Zell-/Blastozysten-Stadium ubiquitär<br />
exprimiert werden (Zambrowicz et al., 1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano,<br />
1999, Srinivas et al., 2001) und dieser Locus weitestgehend <strong>von</strong> reprimierenden Einflüssen<br />
abgeschirmt zu sein scheint.<br />
Es wurde vermutet, dass das autoregulierte TetOff-Expressionssystem unabhängig vom<br />
Integrationsort in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig exprimierend ist. Auch die Untersuchung der transienten<br />
Expression des <strong>autoregulierten</strong> TetOff-System in <strong>ES</strong>-Zellen zeigte, dass dieses System in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen nur niedrige Expressionen erlaubt, während mit diesem System in NIH3T3-Zellen<br />
hohe Expressionen erzielt wurden (Abb.17). Verantwortlich dafür könnten die Toxizität als<br />
auch eine niedrige Aktivität des exprimierten Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen sein.
3 Diskussion 53<br />
3.1.2.1 Das TetOff-System in <strong>ES</strong>-Zellen (publizierte Daten)<br />
In mehreren Publikationen wurde die <strong>Etablierung</strong> eines TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen gezeigt.<br />
Von Era und Witte (2000) wurde ein TetOff-System <strong>zur</strong> Expression des Oncogens P210 Bcr-<br />
Abl in <strong>ES</strong>-Zellen etabliert. Das System basierte auf dem Transaktivator tTA2 (Baron et al.,<br />
1997), dessen konstitutive Expression durch eine CAG-Promotor (β-Chicken-Actin-Promotor<br />
mit CMV-Enhancer, Niwa et al., 1991) kontrolliert wurde. Von Shin et al. (1999) wurde eine<br />
<strong>ES</strong>-Zelllinie generiert, die eine konstitutive Expression des Transaktivators tTA, kontrolliert<br />
durch den endogenen Promotor Ednrb, aufwies und für die regulierte Expression des Ednrb-<br />
Gens in transgenen Mäusen verwendet wurde. Fedorov et al. (2001a, 2001b) etablierte <strong>ES</strong>-<br />
<strong>Zelllinien</strong> mit konstitutiver tTA-Expression durch Integration einer tTA-exprimierenden<br />
Kassette mit humanen CMV-Promotor in zufällige Genorte. Diese <strong>ES</strong>-Zellen wurden <strong>zur</strong><br />
Generierung tTA-exprimierender Mäuse eingesetzt und mit transgenen Mäusen, die<br />
Transaktivator-abhängig ein Reportergen exprimierten, gekreuzt. In den Nachkommen konnte<br />
eine regulierte Reportergen-Expression in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden.<br />
Interessanterweise wurde aber in keiner der Arbeiten die Transaktivator-Expression bzw. die<br />
Transaktivator-abhängige Transgen-Expression in <strong>ES</strong>-Zellen genau quantifiziert. Somit<br />
existieren bisher keine publizierten Daten, die das TetOff-System hinsichtlich<br />
Expressionshöhe und Regulierbarkeit in <strong>ES</strong>-Zellen beschreiben.<br />
3.1.2.2 TetOff-Transaktivatoren können in <strong>ES</strong>-Zellen Squelching hervorrufen<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass das autoregulierte TetOff-System in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen nur zu niedrigen Expressionen führt. Dies kann möglicherweise mit einem toxischen<br />
Effekt des exprimierten Transaktivators erklärt werden.<br />
Der Transaktivator tTA ist eine Fusion aus der Tet-Repressor Domäne TetR und der<br />
transkriptionsaktivierenden Domäne VP16 (Gossen und Bujard, 1992). In mehreren<br />
Publikationen wurde gezeigt, dass VP16 toxisch für Zellen sein kann. Da VP16 mit einer<br />
Vielzahl <strong>von</strong> Faktoren des Transkriptionsapparates interagiert (Chi et al., 1995, Jacob und<br />
Luse, 1996; Flint und Shenk, 1997), kann es bei hohen Konzentrationen <strong>von</strong> VP16 bzw. des<br />
Transaktivators tTA durch Reduktion des zellulären Pools der Transkriptionsfaktoren <strong>zur</strong><br />
Inhibition <strong>von</strong> RNA-Transkriptionsprozessen und letztlich zum Tod der Zellen kommen<br />
(Sadowski et al., 1988, Triezenberg et al., 1988; Shockett et al., 1995, Saez et al., 1997; Gallia<br />
und Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Dieser sogenannte Squelching-Effekt wurde auch in<br />
transgenen Mäusen beobachtet (Byrne und Ruddle, 1989; Böger und Gruss, 1999). Im 2- bzw.<br />
4-Zell-Stadium der Embryogenese (Tag 1.5-2.5) ist eine hohe Expression <strong>von</strong> VP16 letal<br />
(Yueh et al., 2000). Bei niedriger VP16-Expression wird dagegen die Embryonalentwicklung<br />
nicht behindert. In späteren Stadien der Embryogenese scheinen dagegen höhere<br />
Expressionen <strong>von</strong> VP16 bzw. <strong>von</strong> Transaktivatoren mit VP16-Domäne weniger toxische<br />
Nebeneffekte zu bewirken (Byrne und Ruddle, 1989; Gardner et al., 1996; Yaworsky et al.,<br />
1997; Yueh et al., 1998; Böger und Gruss, 1999; Shin et al., 1999; Fedorov et al., 2001a;<br />
Fedorov et al., 2001b). Das bedeutet, dass Zellen der frühen Phase der Entwicklung sensitiver<br />
für Squelching sind als Zellen der späten Phase. In <strong>ES</strong>-Zellen (Zellen der frühen Phase)<br />
sollten deshalb nur niedrige Konzentrationen <strong>von</strong> VP16 bzw. des Transaktivators mit VP16-<br />
Domäne toleriert werden. Es scheint, dass das TetOff-System daher in <strong>ES</strong>-Zellen nur niedrig<br />
exprimierend sein darf, um in <strong>ES</strong>-Zellen stabil etabliert werden zu können.
3 Diskussion 54<br />
Basierend auf den bisher publizierten Daten können deshalb folgende Hypothesen aufgestellt<br />
werden, die die beobachtete niedrige Expression des <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Systems aufgrund<br />
<strong>von</strong> Squelching erklären könnten:<br />
(A) Es ist vorstellbar, dass bei einem hohen Expressionspotenzial des Konstruktes LUCTN7<br />
und daraus resultierenden, hohen Transaktivator-Konzentrationen in <strong>ES</strong>-Zellen Squelching-<br />
Effekte auftreten, die zum Absterben hoch exprimierender Zellen führen (heterologes<br />
Squelching). Die Selektion wäre daher auf ausschließlich niedrig exprimierende Zellklone<br />
limitiert, die eine geringe und damit verträgliche Transaktivator-Expression, jedoch eine<br />
ausreichende Tkneo-Expression bzw. Neomycinphosphotransferase-Aktivität besitzen.<br />
(B) Squelching-Effekte könnten allerdings auch direkt das Expressionspotenzial der<br />
<strong>autoregulierten</strong> Kassette in <strong>ES</strong>-Zellen beeinflussen. Hohe Mengen an Transaktivator-<br />
Proteinen könnten direkt die Transaktivator-abhängige Expression des Reporter- bzw.<br />
Selektionsgens negativ beeinflussen (homologes Squelching). Die Folge wäre, dass die<br />
Expression der <strong>autoregulierten</strong> Kassette soweit angepasst, soweit reduziert wird, dass keine<br />
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen erreicht werden. Auch hier würde das<br />
reduzierte Expressionspotenzial der Kassette nur noch die Selektion <strong>von</strong> Zellen mit niedriger<br />
Expression erlauben.<br />
In einer transienten Expressionsanalyse wurde das Squelching-Potenzial des TetOff-<br />
Transaktivators bestätigt (Kap.2.3.4). Dazu wurde der Einfluß eines autoreguliert<br />
exprimierten TetOff-Transaktivators auf die konstitutive Expression eines zweiten<br />
Reportergens in verschiedenen <strong>ES</strong>-Zellen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass durch die<br />
Expression des Transaktivators die Expression des zweiten Reportergens um durchschnittlich<br />
13% reduziert wurde (Abb.33).<br />
Eine Möglichkeit, das Squelching des TetOff-Systems zu verringern, könnte der Einsatz <strong>von</strong><br />
TetOff-Transaktivatoren, die weniger toxisch sind, bieten (Baron et al., 1997). Es ist denkbar,<br />
dass diese in <strong>ES</strong>-Zellen in höheren Konzentrationen toleriert werden können, was die<br />
<strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> stabilen <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit signifikanter Expression erlauben könnte.<br />
3.1.2.3 Durch weniger toxische TetOff-Transaktivatoren kann die Expression des<br />
TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen nicht erhöht werden<br />
Um die möglicherweise toxischen Nebenwirkungen des Konstruktes LUCTN7 in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
zu vermindern, wurde der Wildtyp-Transaktivator u.a. gegen die TetOff-<br />
Transaktivatormutante tTA2 ausgetauscht (LUCTA2N7). Dieser Transaktivator wird laut<br />
Literatur bei ähnlicher Aktivität in dreifach höheren Konzentrationen als der Wildtyp-<br />
Transaktivator in Zellen toleriert (Baron et al., 1997). Es wurde erwartet, dass durch<br />
Reduktion des Squelchings die Expression des <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
gesteigert werden kann, was zu erhöhten Klonzahlen nach Elektroporation und höheren<br />
Luciferase-Expressionen führen könnte.<br />
In NIH3T3-Zellen zeigte der Vektor LUCTA2N7 eine ähnliche Expression wie das parentale<br />
Konstrukt LUCTN7 mit dem Wildtyp-Transaktivator, sowohl transient (Abb.18) als auch<br />
stabil nach genomischer Integration (Abb.19). Die Expressionspotenziale der <strong>autoregulierten</strong><br />
Konstrukte schienen allein durch die ähnlichen Aktivitäten der Transaktivatoren tTA und<br />
tTA2 definiert zu werden. Ein durch niedrigere Toxizität des Transaktivators tTA2<br />
hervorgerufener, positiver Einfluss auf die Expression konnte nicht beobachtet werden.<br />
In der Untersuchung der transienten Expression der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
konnten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (Abb.18). Die<br />
verminderte Toxizität des Transaktivators tTA2 des Vektors LUCTA2N7 führte entgegen der<br />
Vermutung nicht zu einer Steigerung der Expression. Deshalb wird angenommen, dass<br />
weniger durch den Transaktivator induziertes Squelching als eine allgemein in <strong>ES</strong>-Zellen
3 Diskussion 55<br />
niedrige Aktivität der Transaktivatoren für die niedrige Expression der <strong>autoregulierten</strong><br />
Konstrukte in diesen Zellen verantwortlich ist.<br />
3.1.2.4 Die niedrige Expression des TetOff-Systems ist begründet durch eine niedrige<br />
Aktivität des TetOff-Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen, nicht aber durch Squelching<br />
Es ist anzunehmen, dass aufgrund der niedrigen Aktivität des TetOff-Transaktivators das<br />
TetOff-System in <strong>ES</strong>-Zellen niedrig exprimierend ist. Dies bestätigte der Vergleich der<br />
Aktivität des TetOff-Transaktivators tTA2 (Baron et al., 1997) und des TetOn-Transaktivators<br />
rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) in <strong>ES</strong>-Zellen. Es wurde versucht, die niedrige Expression<br />
der TetOff-Kassette im ROSA26-Locus durch Übertransfektion des TetOff-Transaktivators<br />
tTA2 bzw. des TetOn-Transaktivators rtTA2-M2 zu aktivieren. Abhängig vom<br />
übertransfizierten Transaktivator konnte die geringe Reportergen-Expression der transgenen<br />
<strong>ES</strong>-Zellen erhöht werden: mit dem Transaktivator tTA2 um das ca. 50fache, mit dem reversen<br />
Transaktivator rtTA2-M2 um das ca. 500fache (Abb.27). Der Versuch zeigte, dass der<br />
TetOff-Transaktivator weniger aktiv als der TetOn-Transaktivator ist, und lässt die<br />
Vermutung zu, dass die niedrige Expression der <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Systeme in erster<br />
Linie durch eine niedrige Aktivität des TetOff-Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen bestimmt wird.<br />
3.1.2.5 Die Expression des TetOff-Systems ist nach in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<br />
Zellen deutlich erhöht<br />
Die Beobachtungen in dieser Arbeit hinsichtlich des Expressionspotenzials des TetOff-<br />
Systems in <strong>ES</strong>-Zellen und NIH3T3-Zellen verdeutlichten, dass in <strong>ES</strong>-Zellen das System<br />
niedrig, in NIH3T3-Zellen jedoch hoch exprimierend ist. In NIH3T3-Zellen führte das<br />
TetOff-System transient wie auch nach stabiler Integration in das Genom der Zellen zu hohen<br />
Expressionen. In <strong>ES</strong>-Zellen war dagegen die Expression dieses System sehr gering (Kap.2.2.4<br />
und 2.2.5). Um das unterschiedliche Expressionsverhalten des TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
und differenzierten Zellen an einem definierten Genort zu untersuchen, wurden transgene <strong>ES</strong>-<br />
Zellen mit einer TetOff-Kassette im ROSA26-Locus in vitro differenziert. Anschließend<br />
wurde die Expression der differenzierten Zellen bestimmt. Daraus konnten direkte<br />
Rückschlüsse auf die Aktivtität des TetOff-Systems in beiden Zelltypen gezogen werden.<br />
Während in undifferenzierten <strong>ES</strong>-Zellen eine Reportergen-Expression nicht nachzuweisen<br />
war, zeigten die in vitro differenzierten Zellen bis zu 100fach erhöhte Expressionen (Abb.25),<br />
abhängig <strong>von</strong> der Differenzierungsrichtung, die durch Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-<br />
Stimulation bestimmt wurde (Tab.4). Die höhere Expression des TetOff-Systems nach in vitro<br />
Differenzierung kann mit einer höheren Toleranz der differenzierten Zellen gegenüber hohen<br />
Transaktivator-Konzentrationen oder aber mit einer höheren Aktivität des Transaktivators in<br />
diesen Zellen erklärt werden.<br />
Da ein genomisch integriertes TetOff-System in <strong>ES</strong>-Zellen zu keinen signifikanten<br />
Expressionen führt, besteht durch die in vitro Differenzierung der <strong>ES</strong>-Zellen die Möglichkeit,<br />
den Integrationsort hinsichtlich Expressions- und Regulationskapazität zu beurteilen.
3 Diskussion 56<br />
3.1.3 Das TetOn-System ist in <strong>ES</strong>-Zellen hoch exprimierend<br />
Die Integration <strong>von</strong> <strong>autoregulierten</strong> Expressionsvektoren des TetOff-Systems sowohl in<br />
zufällige Genorte als auch in den ROSA26-Locus <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen führte zu <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit<br />
sehr niedriger Transgen-Expression (Kap.2.2.4 und 2.2.5). Begründet wurde dies mit einem<br />
niedrigen Expressionspotenzial des TetOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen. Deshalb wurden weitere<br />
autoregulierte Expressionskassetten konstruiert, die nicht auf dem TetOff-System beruhen. Es<br />
wurde das TetOn- (Kap.1.1.1.2), sowie das E.REXOff- (Kap.1.1.3) und das PIPOff-System<br />
(Kap.1.1.2) auf das in dieser Arbeit eingesetzte autoregulierte Expressionssystem adaptiert,<br />
was den Austausch <strong>von</strong> Transaktivatoren (Abb.38) und teilweise <strong>von</strong> bidirektionalen<br />
Promotoren beinhaltete. Dadurch war es möglich, verschiedene autoregulierte<br />
Expressionssysteme hinsichtlich ihrer Verwendung <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong> autoregulierter <strong>ES</strong>-<br />
<strong>Zelllinien</strong> zu beurteilen.<br />
System<br />
Transaktivator<br />
TetOff<br />
tTA2<br />
F F F<br />
TetOn<br />
E.REXOff<br />
PIPOff<br />
rtTA2-M2<br />
ET<br />
PIT<br />
tetR<br />
tetR*<br />
MphR(A)<br />
Pip<br />
F* F* F* (*mutiert)<br />
VP16<br />
VP16<br />
Abb. 38 Schematische Darstellung der Transaktivtoren tTA2, rtTA2-M2, ET und PIT<br />
Die Transaktivatoren bestehen aus einer 5’-Repressor-Domäne und einer 3’-gelegenen transkriptionsaktivierenden Domäne. Der<br />
Transaktivator tTA2 (TetOff-System) besitzt eine Tet-Repressor-Domäne und 3 minimale, modifizierte, transkriptionsaktivierende Domänen<br />
aus VP16 (F-Domäne, Kap.1.1.1.3). Der Transaktivator rtTA2-M2 (TetOn-System) besitzt eine in 4 Aminosäuren modifizierte Tet-<br />
Repressor-Domäne und minimale, modifizierte, transkriptionsaktivierende Domänen <strong>von</strong> VP16, basierend auf den F-Domänen. Der<br />
Transaktivator ET (E.REXOff-System) besitzt eine MphR(A)-Domäne und die nicht modifizierte Transaktivierungsdomäne <strong>von</strong> VP16 (C-<br />
Terminus). Der Transaktivator PIT (PIPOff-System) besitzt einen Pip-Repressor und ebenfalls die nicht modifizierte<br />
Transaktivierungsdomäne <strong>von</strong> VP16 (C-Terminus). Die C-terminale Transaktivierungsdomäne <strong>von</strong> VP16 enthält eine <strong>zur</strong> F-Domäne<br />
ähnliche minimale Sequenz.<br />
3.1.3.1 Das TetOn-System führt zu hohen Expressionen in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Mit dem reversen Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) wurde basierend auf dem<br />
TetOff-Konstrukt LUC3TA2E der autoregulierte TetOn-Expressionsvektor LUC3rTA2E<br />
entwickelt. Da die TetOn- und TetOff-Kassetten sich nur hinsichtlich des Transaktivators<br />
unterscheiden, konnte das Expressionsverhalten des TetOn-Systems direkt mit dem TetOff-<br />
System bzw. die Aktivität des TetOn-Transaktivators mit der des TetOff-Transaktivators<br />
verglichen werden.<br />
In NIH3T3-Zellen zeigte das TetOn-System transient eine marginal erhöhte Expression im<br />
Vergleich zum TetOff-System (Abb.29A). Dagegen konnten in D3- und CCE-Zellen mit der<br />
TetOn-Kassette vielfach höhere Expressionen als mit dem TetOff-Konstrukt erzielt werden<br />
(Abb.29B und 29D). Das bedeutet, dass in <strong>ES</strong>-Zellen das TetOn-System ein höheres<br />
Expressionspotenzial besitzt als das TetOff-System. Auch das Regulationspotenzial des<br />
TetOn-Systems war in NIH3T3-Zellen, insbesondere in <strong>ES</strong>-Zellen höher als beim TetOff-<br />
System. Da die Expressionen der beiden Systeme im reprimierten Zustand ähnlich waren, ist<br />
die niedrigere Regulierbarkeit des TetOff-Systems auf die niedrigere Expression nach<br />
Induktion <strong>zur</strong>ückzuführen. Die Expressionsdifferenz zwischen TetOff- und TetOn-System in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen konnte durch einen weiteren Versuch bestätigt werden, in welchem der konstitutiv<br />
exprimierte, reverse Transaktivator rtTA2-M2 die Transaktivator-abhängige Expression der<br />
im ROSA26-Locus <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen integrierten <strong>autoregulierten</strong> TetOff-Kassette LUCTA2N7<br />
in größeren Umfang induzieren konnte als der TetOff-Transaktivator tTA2 (Abb.27).
3 Diskussion 57<br />
Der beobachtete Expressionsunterschied der beiden Systeme in <strong>ES</strong>-Zellen kann<br />
möglicherweise mit einem Aktivitätsunterschied der Transaktivatoren tTA2 und rtTA2-M2 in<br />
diesen Zellen erklärt werden. So wurde gezeigt, dass bestimmte Aminosäureveränderungen in<br />
der ursprünglichen Repressor-Domäne für eine Erhöhung des Aktivierungspotenzials des<br />
Transaktivators rtTA2-M2 verantwortlich sind (Urlinger et al., 2000b). Die modifizierten<br />
minimalen Transaktivierungsdomänen im reversen Transaktivator rtTA2-M2 könnten zu einer<br />
verbesserten Stabilität der rtTA2-M2-mRNA bzw. des Proteins und somit zu einer höheren<br />
Translationsrate bzw. Konzentration des reversen Transaktivators in Zellen führen. So besitzt<br />
der Transaktivator rtTA2-M2 u.a. keine potentiellen Splice-Donor- und Splice-<br />
Akzeptorstellen, keine potentiellen Schnittstellen für Endonukleasen und keine<br />
Basenabfolgen, die die Ausbildung <strong>von</strong> Haarnadelstrukturen bewirken können (Urlinger et al.,<br />
2000b).<br />
3.1.3.2 Der TetOn-Transaktivator induziert Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Das erhöhte transiente Expressionsniveau der TetOn-Kassette LUC3rTA2E in <strong>ES</strong>-Zellen im<br />
Vergleich zu TetOff-Konstrukten suggerierte, dass mit diesem System die <strong>Etablierung</strong> einer<br />
Vielzahl hoch exprimierender, transgener <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> möglich wäre. Jedoch wurden nur<br />
wenige Klone selektiert, <strong>von</strong> denen nur einige eine hohe, teilweise regulierbare Expression<br />
aufwiesen (Abb.32). Der Grund dafür wird in einer, durch hohe Expression erreichten hohen<br />
Konzentration des reversen Transaktivators gesehen, die toxisch für <strong>ES</strong>-Zellen ist (Kap.2.3.4).<br />
Es konnte gezeigt werden, dass durch die transiente, autoregulierte Expression des reversen<br />
Transaktivators in <strong>ES</strong>-Zellen die konstitutive Expression eines zweiten Reportergens im<br />
Durchschnitt um 63% reduziert wurde (Abb.33). In einem weiteren Versuch konnte gezeigt<br />
werden, das bei niedrigen Expressionen des reversen Transaktivators, eingestellt durch<br />
definierte Doxycyclin-Mengen, ein direkter Zusammenhang zwischen Konzentration des<br />
Transaktivators und Induktion der <strong>autoregulierten</strong> Expression zu erkennen ist (Abb.34).<br />
Übersteigt die Transaktivator-Konzentration in den <strong>ES</strong>-Zellen jedoch einen bestimmten Wert,<br />
scheint die Induktion durch Squelching-Effekte überlagert zu werden, die zum Tod der Zellen<br />
führen können (Abb.34). Bei maximaler Induktion der Expression sollten daher nur wenige<br />
<strong>ES</strong>-Zellklone mit genomisch integrierter LUC3rTA2E-Kassette selektiert werden können.<br />
3.1.4 Das E.REXOff- und das PIPOff-System führen zu geringeren Expressionen,<br />
aber auch geringerem Squelching in <strong>ES</strong>-Zellen als das TetOn-System<br />
Das TetOn-System zeigte zwar ein hohes Expressionspotenzial in <strong>ES</strong>-Zellen, jedoch konnten<br />
mit diesem System nur wenige <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit hoher Expression generiert werden. Dies<br />
wurde auf die Toxizität des reversen Transaktivators rtTA2-M2 <strong>zur</strong>ückgeführt. Da Squelching<br />
mit der Aktivität des Transaktivators, die autoregulierte Expression zu induzieren, korreliert,<br />
wurden die Aktivitäten <strong>von</strong> alternativen Transaktivatoren im <strong>autoregulierten</strong> System<br />
untersucht. Mit dem Transaktivator ET (Weber et al., 2002a) und einem ET-abhängigen<br />
bidirektionalen Promotor des E.REXOff-Systems wurde die Expressionskassette LUC3REX,<br />
mit dem Transaktivator PIP (Fussenegger et al., 2000) und dem dazugehörigen bidrektionalen<br />
Promotor des PIPOff-Systems der Expressionsvektor LUC3PIP generiert. Diese<br />
Transaktivatoren besitzen wie die in dieser Arbeit verwendeten TetOff-Transaktivatoren bzw.<br />
der TetOn-Transaktivator rtTA2-M2 eine auf VP16 basierende, transkriptionsaktivierende<br />
Domäne (Abb.38). Es wurde erhofft, dass die Transaktivatoren dieser Systeme aktiver als die<br />
TetOff-Transaktivatoren sind, so dass höhere Expressionen als mit dem TetOff-System in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen erreicht werden können. Allerdings sollte die Aktivität der Transaktivatoren niedriger
3 Diskussion 58<br />
sein als die des reversen Transaktivator rtTA2-M2, so dass durch die exprimierten<br />
Transaktivatoren weniger Squelching als mit dem TetOn-Transaktivator in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
induziert wird.<br />
In NIH3T3-Zellen zeigte das E.REXOff-System nur eine sehr niedrige transiente Expression,<br />
die ca. 10% des TetOff-Systems entsprach (Abb.29A). Dagegen konnte mit dem PIPOff-<br />
System eine ähnlich hohe transiente Expression wie mit dem TetOff- und dem TetOn-System<br />
erzielt werden. In <strong>ES</strong>-Zellen war die transiente Expression des E.REXOff-Systems nur wenig<br />
höher als die des TetOff-Systems. Dagegen zeigte das PIPOff-System Expressionen, die<br />
zwischen denen des E.REXOff- und des TetOn-Systems lagen. Insbesondere in D3- und<br />
CCE-Zellen waren diese vielfach höher als die des E.REXOff- bzw. TetOff-Systems<br />
(Abb.29B und 29D). Die Regulationspotenziale beider Systeme waren gering. Beim<br />
E.REXOff-System ist dies mit einer niedrigen Expression im induzierten Zustand, beim<br />
PIPOff-System mit einer hohen Basalexpression zu erklären.<br />
Nach diesen Ergebnissen wurde erwartet, dass insbesondere mit dem PIPOff-System<br />
autoregulierte <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> etablierbar sind. Jedoch konnten nur wenige <strong>ES</strong>-Zellklone<br />
selektiert werden, die, obwohl in den meisten Klonen die vollständige Integrationen der<br />
Kassette in das Genom der Zellen nachgewiesen wurde, keine bzw. eine sehr geringe<br />
Expression aufwiesen (Kap.2.3.3). Dies wurde mit einem, durch hohe Expression des<br />
Transaktivators PIP verursachtem Squelching erklärt, begründet mit der Beobachtung, dass<br />
die Expression des Transaktivators PIT die Expression eines konstitutiv exprimierten<br />
Reportergens um durchschnittlich 46% inhibierte (Abb.33).<br />
Da das E.REXOff-System eine niedrigere transiente Expression als das TetOff-System in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen aufwies, wurde nicht erwartet, dass mit diesem System <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit<br />
autoregulierter Expression etabliert werden könnten. Jedoch wurden <strong>ES</strong>-Zellklone selektiert,<br />
<strong>von</strong> denen einige eine signifikante Expression zeigten. Diese war niedriger als bei den<br />
Zellklonen mit integrierter TetOn-Kassette (Abb.32). Da es durch den transient exprimierten<br />
Transaktivator ET zu einer Reduktion der Expression eines konstitutiv exprimierten<br />
Reportergens um durchschnittlich 29% kam (Abb.33), ist es denkbar, dass Squelching die<br />
Selektion der wenigen exprimierenden <strong>ES</strong>-Zellklonen beeinflusst hat. Aufgrund der<br />
beobachteten, niedrigen transienten Expression des <strong>autoregulierten</strong> E.REXOff-System in <strong>ES</strong>-<br />
Zellen ist jedoch eher da<strong>von</strong>auszugehen, dass das niedrige Expressionspotenzial in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
der Grund für die geringe Zahl an selektierten Zellklonen war.<br />
3.1.5 Vergleich der <strong>autoregulierten</strong> Expressionssysteme in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Die Untersuchungen der transienten Expression des <strong>autoregulierten</strong> TetOff-, TetOn-,<br />
E.REXOff- und PIPOff-Systems in <strong>ES</strong>-Zellen verdeutlichten die Unterschiede der Systeme<br />
hinsichtlich ihrer Expressionspotenziale. Das TetOn- und PIPOff-System zeigten hohe<br />
Expressionen (Abb.29), die allerdings einhergingen mit starken Squelching-Effekten<br />
(Abb.33). Dagegen war das TetOff-System niedrig exprimierend (Abb.29), was sich auch in<br />
einem geringen Squelching widerspiegelte (Abb.33). Das E.REXOff-System führte dagegen<br />
zu höheren <strong>autoregulierten</strong> Expressionen (Abb.29), die jedoch auch ein verstärktes<br />
Squelching bewirkten (Abb.33). Das bedeutet, dass mit ansteigender Expression des Systems<br />
zunehmend Squelching-Effekte durch den exprimierten Transaktivator auftreten. Da die<br />
Transaktivatoren VP16- bzw. minimale VP16-Transaktivierungsdomänen aufweisen, die für<br />
Squelching verantwortlich sind, wird daher die Toxizität der Transaktivatoren durch die Höhe<br />
ihrer Expression bestimmt, die <strong>von</strong> ihrer Aktivität, die Expression autoreguliert zu induzieren,<br />
abhängt. Je aktiver das Expressionssystem ist, desto stärker kann durch den autoreguliert<br />
exprimierten Transaktivator Squelching induziert werden. Dies kann einerseits zum Zelltod<br />
führen (heterologes Squelching), anderseits auch die Expression des <strong>autoregulierten</strong> Systems
3 Diskussion 59<br />
negativ beeinflussen (homologes Squelching). In Tabelle 5 sind die Systeme hinsichtlich ihrer<br />
Expressionskapazität und resultierendem Squelching-Potenzial geordnet.<br />
Expression EF (%) Squelching SF (%)<br />
TetOff • 4 14<br />
E.REXOff • 11 29<br />
PIPOff ••• 45 46<br />
TetOn ••••• 100 63<br />
Expressionsfaktor EF: • 0-20%, ••• 41-60%, ••••• 81-100%<br />
Squelching-Faktor SF: 0-20%, 21-40%, 41-60%, 61-80%<br />
Tab. 5 Vergleich <strong>von</strong> Expression und Squelching der <strong>autoregulierten</strong> Konstrukte in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Es sind die gemittelten, transienten Expressionen der verschiedenen <strong>autoregulierten</strong> Systeme in <strong>ES</strong>-Zellen, beschrieben durch den<br />
Expressionsfaktor EF in % (normiert auf die Expression des TetOn-Systems), zusammengefasst. Das Squelching-Potenzial der Systeme<br />
wurde durch Bestimmung der transienten, konstitutiven Expression eines zweiten Reportergens nach Induktion der Expression der<br />
kotransfizierten <strong>autoregulierten</strong> Expressionskassetten in verschiedenen <strong>ES</strong>-Zellen bestimmt und gemittelt. Der Squelching-Faktor SF [%]<br />
beschreibt den Einfluß des exprimierten Transaktivator auf die Expression dieses Reportergens.<br />
Das autoregulierte TetOn-System besitzt <strong>von</strong> den untersuchten Expressionssystemen das<br />
höchste Expressionspotenzial, was die <strong>Etablierung</strong> hoch exprimierender, autoregulierbarer<br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> ermöglichte. Mit den anderen Systemen wurden <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit nicht<br />
nachweisbarer oder niedrigerer Expression generiert. Wie jedoch die Untersuchung in vitro<br />
differenzierter Zellen mit integriertem TetOff-System zeigte (Kap.2.2.5.2), kann es nach in<br />
vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen zu deutlichen Expressionenssteigerungen kommen.<br />
Daher besteht die Möglichkeit, die Expressions- und Regulationskapazität <strong>von</strong> niedrig<br />
exprimierenden <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> auf Ebene in vitro differenzierter Zellen zu bewerten.<br />
Da aufgrund der Toxizität des exprimierten Transaktivators rtTA2-M2 die Generierung <strong>von</strong><br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit integriertem TetOn-System eingeschränkt wird, was sich in der geringen<br />
Zahl selektierter Klone nach Elektroporation widerspiegelte, bedarf es <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong><br />
<strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> mit regulierbarer, hoher Expression eines größeren Screening-Aufwandes.<br />
Durch Reduktion der Expression mittels Doxycyclin, was zu niedrigeren und damit weniger<br />
toxischen Transaktivator-Konzentrationen führt, wäre es möglich, die Zahl stabiler Klone zu<br />
erhöhen. Es wäre auch denkbar, durch Einsatz anderer Transaktivierungsdomänen wie p65<br />
oder E2F4 die Toxizität des reversen Transaktivators zu reduzieren (Kap.3.3.1.2).<br />
3.2 Flp-vermittelter Kassettenaustausch<br />
Die Kassettenaustauschstrategie (Kap.2.1.2) wurde an dem parentalen NIH3T3-Klon 18 mit<br />
singulär integrierter, autoregulierter Expressionskassette LUCTN7 überprüft (Kap.2.4). Als<br />
Austauschvektor diente das autoregulierte Konstrukt TGALTA2E. Der Kassettenaustausch ist<br />
mit dem Verlust der Thymidinkinase-Aktivität verbunden, weshalb nach Kotransfektion des<br />
Austauschkonstruktes und des Flipase-exprimierenden Vektors pFGFUS Gancyclovirresistente<br />
Zellen selektiert wurden (Negativ-Selektion). Es besteht die Möglichkeit, dass<br />
Zellen durch spontane, positionsabhängige Inaktivierung die Thymidinkinase-Expression<br />
verlieren (Askew et al., 1993; Wu et al., 1994), was bei alleiniger Selektion mit Gancyclovir<br />
zu falsch-positiven Klonen führen kann. Um diese Zellen, in denen die Expression <strong>von</strong> Tkneo<br />
reduziert bzw. inaktiviert ist, zu eliminieren, wurden die transfizierten Zellen nicht nur mit<br />
Gancyclovir sondern auch mit G418 kultiviert. Austauschklone werden dagegen durch die<br />
G418-Selektion nicht eliminiert, da nach Kassettenaustausch die Expression des bereits<br />
verankerten neo-Gens in den Zellen aufrechterhalten wird.
3 Diskussion 60<br />
3.2.1 Die Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion ist funktional, jedoch<br />
wenig effizient<br />
Nach Kotransfektion des Austauschkonstruktes und des Flipase-exprimierenden Vektors in<br />
die Zellen konnten Gancyclovir-/G418-resistente Zellklone selektiert werden (Kap.2.4). In<br />
20% der Zellklone konnte ein Kassettenaustausch, in 23% das Vorhandensein der parentalen<br />
Expressionskassette und in 57% weder ein Kassettenaustausch noch das vollständige<br />
Parentalkonstrukt detektiert werden.<br />
Bei den Klonen, in denen weder der Kassettenaustausch noch das Parentalkonstrukt<br />
nachweisbar war (57%), wurde angenommen, dass unspezifische Deletionen oder<br />
Rearrangements des Parentalkonstruktes zum Verlust der Tkneo-Expression führten, was die<br />
Resistenz dieser Klone gegenüber Gancyclovir erklären könnte. Da in permanenten <strong>Zelllinien</strong><br />
wie NIH3T3 zirkuläre Plasmide effizient in zufällige Genorte integrieren können, wurde<br />
vermutet, dass diese Klone durch zufällige, genomische Integration des Kanamycin-<br />
Resistenzgens des Flp-exprimierenden Konstruktes pFGFUS G418-Resistenz erlangten.<br />
Dieses auf dem Vektorrückgrat befindliche prokaryontische Gen könnte in eukaryotischen<br />
Zellen durch einen endogenen Promotor exprimiert worden sein. Zufällige Integrationen eines<br />
Flp-exprimierenden Konstruktes während eines Kassettenaustauschversuches wurden bereits<br />
in der Arbeit <strong>von</strong> Seibler (1999) beobachtet. Bei einem ähnlichen Ansatz mit ausschließlich<br />
Negativ-Selektion wurde eine 14%ige Integrationshäufigkeit eines Flp-exprimierenden<br />
Konstruktes festgestellt. Diese Integrationen hatten jedoch keine Bedeutung bei der Selektion<br />
<strong>von</strong> Austauschklonen.<br />
Die Gancyclovir-/G418-resistenten Klone, in denen ausschließlich die vollständige parentale<br />
Expressionskassette nachgewiesen wurde (23%), könnten aufgrund einer positionsabhängigen<br />
Inaktivierung des Tkneo-Gens Resistenz gegenüber Gancyclovir erlangt haben (Askew et al.,<br />
1993; Wu et al., 1994). Diese Klone waren jedoch weiterhin G418-resistent, so dass <strong>von</strong> einer<br />
vollständigen transkriptionellen Inaktivierung der Tkneo-Expression nicht ausgegangen<br />
werden kann. Durch Methylierung regulatorischer Sequenzen (Feng et al., 2001), durch<br />
Verlust <strong>von</strong> DNAseI hypersensitiver Stellen im Genom oder Reduktion der Zugänglichkeit<br />
des Chromatins (Francastel et al., 1999) kann die Expression eines Transgenes reduziert bzw.<br />
inaktiviert werden. Möglicherweise sind dies Gründe für eine verminderte autoregulierte<br />
Expression der parentalen Kassette. Die Expression <strong>von</strong> Tkneo bleibt dadurch bestehen, was<br />
<strong>zur</strong> Aufrechterhaltung der G418-Resistenz in diesen Zellen ausreichte, jedoch für eine<br />
Gancyclovir-Sensitivität zu gering war.<br />
In 20% der Gancyclovir-/G418-resistenten Klone wurde der Kassettenaustausch gezeigt. In<br />
der Mehrzahl dieser Klone wurden jedoch weitere Integrationen des Austauschkonstruktes in<br />
zufälligen Genorten nachgewiesen. Dies wird in Kapitel 3.2.2 näher diskutiert. In 7% aller<br />
Gancyclovir-/G418-resistenten Klone, wurde schließlich das Austauschkonstrukt einzig im<br />
markierten Genlocus detektiert. In der Arbeit <strong>von</strong> Seibler (1999) wurde bei der Untersuchung<br />
des Kassettenaustausches in verschiedenen Genorten Austauschraten abzügliche<br />
unspezifischer Integrationen des Austauschkonstruktes <strong>von</strong> 7-56% erreicht. Daraus kann<br />
geschlussfolgert werden, dass die in dieser Arbeit berechnete Austauschfrequenz für den<br />
Integrationsort im LUCTN7-Klon 18 mit 7% im unteren Bereich liegt. Wie Seibler (1999)<br />
zeigte, sind die Austauschraten vom Genort des integrierten Parentalkonstruktes abhängig.<br />
Vermutlich werden diese durch die Zugänglichkeit der Rekombinase zum Genort bestimmt.<br />
Es wurde festgestellt, dass Rekombinationen in transkriptionell inaktiven Loci sehr ineffizient<br />
verlaufen (Schübeler et al., 1997). Dies würde bedeuten, dass in niedrig exprimierenden<br />
Genorten die Möglichkeiten für einen Kassettenaustausch geringer wären als in hoch<br />
exprimierenden. Eine Korrelation zwischen Austauscheffizienz und Expressionshöhe konnte<br />
jedoch in diesem Fall nicht beobachtet werden. Trotz hoher Expression des in dieser Arbeit
3 Diskussion 61<br />
eingesetzten parentalen Zellklons (Abb.16, Klon 18) konnten nur wenige Klone mit<br />
Kassettenaustausch isoliert werden.<br />
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die aufgestellte Kassettenaustauschstrategie funktional<br />
ist. Jedoch ist die Austauscheffizienz gering: In 80% der isolierten Klone fand kein<br />
Kassettenaustausch statt. Es wurde erwartet, dass durch die Aufrechterhaltung der<br />
Neomycinphosphotransferase-Aktivität in Austauschklonen verhindert werden kann, dass<br />
falsch-positive Klone mit reduzierter bzw. abgeschalteter Tkneo-Expression selektiert<br />
werden. Allerdings wurde eine Vielzahl dieser Klone, die eine vollständige Parentalkassette<br />
aufwiesen, isoliert (23%). Das bedeutet, dass Neomycinphosphotransferase als<br />
Selektionsmarker für die Eleminierung solcher Klone nicht sensitiv genug ist. Für diesen<br />
Zweck ist es daher empfehlenswert, ein sensitiveres Positiv-Selektionsgen einzusetzen. Die<br />
Mehrzahl der falsch-positiven Klone, die möglicherweise durch Deletion oder<br />
Rearrangements der Parentalkassette Gancyclovir-resistent waren, könnte durch zufällige<br />
Integration des Kanamycin-Resistenzgens des Flp-exprimierenden Vektors G418-Resistenz<br />
erlangt haben (57%). Aufgrund der hohen Effizienz illegetimer Rekombination in permanten<br />
<strong>Zelllinien</strong> ist es deshalb empfehlenswert, für den Kassettenaustausch einen Flipaseexprimierenden<br />
Vektor zu verwenden, der keine G418-Resistenz vermitteln kann.<br />
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Kassettenaustausch auf Basis der vorgestellten<br />
Austauschstrategie mit Negativ-Selektion zu niedrigeren Austauschraten als ein<br />
Kassettenaustausch mit stringenter Positiv-Selektion (Verhoeyen et al., 1998) führt. So<br />
konnten in der Arbeit <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998) mit der Positiv-Selektion unter<br />
Verwendung einer Selektionsfalle Austauscheffizienzen <strong>von</strong> 100% erreicht werden. Um die<br />
hohe Zahl falsch-positiver Klone zu reduzieren, die bei Negativ-Selektion des<br />
Austauschereignisses unter Verwendung des Negativ-Selektionsmarkers Thymidinkinase<br />
selektiert werden, bedarf es daher einer Modifikation der Austauchstrategie. Möglichkeiten<br />
<strong>zur</strong> Optimierung des Kassettenaustausches sind in Kapitel 3.3.2 beschrieben.<br />
3.2.2 Der Kassettenaustausch führt zu einem hohen Anteil an Austauschklonen mit<br />
zusätzlich integrierten Austauschkonstrukten<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass in der Mehrzahl der Klone mit integriertem<br />
Austauschkonstrukt im markierten Genort auch Integrationen des Austauschkonstruktes in<br />
zufällige Genorte stattgefunden hatten. Dies wurde auch in der Arbeit <strong>von</strong> Seibler (1999), in<br />
der in NIH3T3-Zellen in ähnlicher Weise der Flp-vermittelte Kassettenaustausch mit<br />
ausschließlich Negativ-Selektion untersucht wurde, festgestellt. Es wurden in Abhängigkeit<br />
vom Genort Austauschraten <strong>von</strong> 43-100% beobachtetet. In der Mehrzahl der Austauschklone<br />
lagen zusätzliche Integrationen des Austauschkonstruktes vor, so dass die Austauschraten<br />
abzüglich dieser unspezifischen Integrationen letztlich 7-56% betrugen. Die Integrationen<br />
sind damit zu begründen, dass in permanenten <strong>Zelllinien</strong> durch illegitme Rekombination<br />
zirkuläre Plasmide effizient in zufällige Genorte integrieren können. In der Arbeit <strong>von</strong> Seibler<br />
betrug der Anteil <strong>von</strong> Austauschklonen mit zusätzlicher Integration des Austauschkonstruktes<br />
gegenüber Austauschklonen mit singulärer Integration 44-88%. In der vorliegenden Arbeit<br />
lag der Anteil der Klone mit zusätzlicher Integration für einen untersuchten parentalen Klon<br />
bei 65% und damit im Bereich der in Seibler’s Arbeit (1999) festgestellten Rate. Die<br />
Wahrscheinlichkeit für illegitime Rekombination in permanenten <strong>Zelllinien</strong> hängt <strong>von</strong> der bei<br />
der Transfektion eingesetzten Menge an DNA ab. Da jedoch auch die Wahrscheinlichkeit des<br />
Kassettenaustausches durch die transfizierte Menge an Austauschkonstrukt bestimmt wird,<br />
scheint die Optimierung des Transfektionsprotokolls <strong>zur</strong> Senkung des Anteils an<br />
Austauschklonen mit zufälliger Integration wenig erfolgversprechend. In bisherigen Ansätzen<br />
wurde ein hoher Überschuss an Austauschkonstrukt gegenüber Flp-exprimierenden Konstrukt
3 Diskussion 62<br />
in Transfektionen eingesetzt. Dies bedeutet, dass nach Transfektion in Flipase-exprimierenden<br />
Zellen eine hohe Konzentration an Austauschkonstrukt vorliegen sollte. Dadurch wird die<br />
Wahrscheinlichkeit einerseits für den Kassettenaustausch, anderseits auch für die illegitime<br />
Rekombination erhöht. Eine Möglichkeit <strong>zur</strong> Umgehung dieses Problems wäre, den Anteil<br />
des Austauschkonstruktes gegenüber dem des Flp-exprimierenden Vektors im<br />
Transfektionsansatz drastisch zu senken. Dadurch würden in Zellen, die Flipase exprimieren,<br />
nur wenige Austauschkonstrukte vorliegen. Möglicherweise könnte damit trotz verringerter<br />
Wahrscheinlichkeit für einen Kassettenaustausch die Wahrscheinlichkeit für illegitime<br />
Rekombination reduziert werden. Die Kassettenaustauscheffizienz wäre zwar niedrig, der<br />
Anteil an Austauschklonen mit zusätzlichen Integrationen des Austauschkonstruktes sollte<br />
jedoch minimiert werden können.<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998) wurde der Kassettenaustausch durch<br />
Komplementierung eines bereits verankerten, ATG-defizienten neo-Gens über Positiv-<br />
Selektion angereichert. Dabei wurden keine Austauschklone mit zusätzlichen Integrationen<br />
des Austauschkonstruktes selektiert. Obwohl das Austauschkonstrukt im Vektorrückgrat ein<br />
HygTk-Gen aufwies, welches in den transfizierten Zellen eine Thymidinkinase-Expression<br />
ermöglicht und somit eine Negativ-Selektion mit Gancyclovir erlaubt, war diese zusätzliche<br />
Selektion nicht notwendig, um Austauschklone mit zufällig integriertem Austauschkonstrukt<br />
zu eliminieren. Eine mögliche Erklärung liegt jedoch nicht vor.<br />
3.2.3 Die Expression des integrierten Austauschkonstruktes ist vorhersagbar<br />
Die β-Galactosidase-Expressionen der isogenen Austauschklone ohne unspezifische<br />
Integrationen des Austauschkonstruktes waren erwartungsgemäß identisch (Abb.37).<br />
In den Arbeiten <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (2001) und Schübeler (1998) wurde gezeigt, dass,<br />
soweit die Expression eines Parentalkonstruktes in einen markierten Genort bekannt ist, die<br />
Expression eines Austauschkonstruktes nach Integration in den gleichen Locus vorhersagbar<br />
ist. Das bedeutet, dass ein hoch exprimierender Genort eine hohe Expression eines beliebigen<br />
Gens nach Kassettenaustausch ermöglicht, ein niedrig exprimierender Genort dagegen nur<br />
niedrige Expressionen eines integrierten Austauschkonstruktes erlaubt. Seibler (1999) stellte<br />
fest, dass es nach Austausch eines genomisch integrierten Konstruktes mit TK-Promotor<br />
gegen ein Konstrukt mit PGK-Promotor <strong>zur</strong> Verschiebung der Expressionshöhen kam, die<br />
zwischen den verschiedenen Klonen und somit in Abhängigkeit vom markierten<br />
Integrationsort variierte. Die Expressionen der Austauschklone waren nicht vorhersagbar.<br />
Dies wurde mit unterschiedlichen, durch die chromosomale Umgebung festgelegten,<br />
transkriptionellen Aktivitäten des TK- bzw. PGK-Promotors begründet, d.h. der<br />
Positionseffekt eines Locus wirkt sich unterschiedlich auf verschiedene Promotoren aus. Für<br />
eine Vorhersagbarkeit der Expression ist es daher notwendig, dass das Austauschkonstrukt<br />
ähnlich aufgebaut ist wie das Parentalkonstrukt im markierten Genort bzw. den gleichen<br />
Promotor trägt.<br />
Das entsprechend der Austauschstrategie (Kap.2.1.2) in dieser Arbeit eingesetzte<br />
Austauschkonstrukt war ähnlich konstruiert wie das autoregulierte TetOff-Konstrukt, das <strong>zur</strong><br />
Markierung <strong>von</strong> Genorten in NIH3T3-Zellen eingesetzt wurde. Da der Kassettenaustausch<br />
keine Veränderung des Promotors nachsichzog, die autoregulierte Expression weiterhin vom<br />
gleichen bidirektionalen, Transaktivator-abhängigen Promotor kontrolliert wurde, war<br />
erwarten worden, dass die Expression des Reportergens β-Galactosidase vorhersagbar ist.
3 Diskussion 63<br />
3.2.4 Anwendung der Kassettenaustauschstrategie in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
Die in dieser Arbeit aufgestellte Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion wurde so<br />
konzipiert, dass sie prinzipiell auch in <strong>ES</strong>-Zellen anwendbar ist. Da in <strong>ES</strong>-Zellen im<br />
Gegensatz zu permanenten <strong>Zelllinien</strong> wie NIH3T3 zirkuläre Plasmide sehr ineffizient in das<br />
Genom integrieren, sollte ein Kassettenaustausch in <strong>ES</strong>-Zellen vorwiegend zu<br />
Austauschklonen mit ausschließlich im markierten Genort integrierter Austauschkassette<br />
führen. Daher sollte die Effizienz des Kassettenaustausches in <strong>ES</strong>-Zellen höher sein als in<br />
NIH3T3-Zellen. In der Arbeit <strong>von</strong> Seibler et al. (1998) wurde in verschiedenen <strong>ES</strong>-Zellklonen<br />
ein Kassettenaustausch mit Negativ-Selektion durchgeführt. Es wurde ein<br />
Neomycinphosphotransferase-exprimierendes Austauschkonstrukt durch Flp-vermittelte<br />
Rekombination in verschiedene Loci <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen, die mit einer HygTk-exprimierenden<br />
Kassette markiert waren, integriert. Die Selektion mittels Gancyclovir führte zu<br />
Austauschraten zwischen 21-38%, abhängig vom Integrationsort. Durch zusätzliche Selektion<br />
auf Neomycinphosphotransferase-Expression mit G418 (Positiv-Selektion) konnte die<br />
durchschnittliche Austauscheffizienz <strong>von</strong> 27% auf 85% gesteigert werden.<br />
3.2.5 Ein Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion ist effizienter als mit Negativ-<br />
Selektion<br />
Ein Kassettenaustausch kann wie in dieser Arbeit über Negativ-Selektion oder mittels<br />
sogenannter Selektionsfallen angereichert werden. Bei letzterer Methode, der Positiv-<br />
Selektion, wird der Kassettenaustausch entweder durch Integration eines Promotors bzw.<br />
IR<strong>ES</strong>-Elements und eines Startcodons in den markierten Locus und resultierender<br />
Aktivierung der Expression eines ATG-defizienten, bereits genomisch verankerten<br />
Selektionsgens (Verhoeyen et al., 1998, 2001) oder durch Integration eines vollständigen<br />
Selektionsmarkers in einen Genort mit Promotor, selektiert (Schübeler et al., 1998).<br />
Die Negativ-Selektion mit Gancyclovir führt für viele Integrationsorte zu spontan resistenten<br />
Zellklonen, in denen die Expression der Thymidinkinase entweder inaktiviert, reduziert oder<br />
aufgrund unspezifischer Deletion oder Rearrangements der parentalen Expressionskassette<br />
aufgehoben ist. Die Rate der Spontanresistenz und die Austauscheffizienz variieren dabei<br />
zwischen verschiedenen Loci (Karreman et al., 1996; Schübeler et al., 1997; Seibler et al.,<br />
1998; Seibler, 1999).<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998) wurde in mehreren parentalen NIH3T3-Zellklonen<br />
mit retroviral integrierter Expressionskassette, die <strong>von</strong> Wildtyp FRT- und FRT-Mutante F5<br />
flankiert wird, der Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion durchgeführt. Durch<br />
Komplementierung eines ATG-defizienten Neomycinphosphotransferase-Gens im markierten<br />
Genlocus wurden G418-resistente Austauschklone selektiert. Dabei zeigte sich, dass durch<br />
Positiv-Selektion Austauscheffizienzen <strong>von</strong> 100% erreicht werden. Die Verwendung eines<br />
Positiv-Selektionsmarkers hat jedoch den Nachteil, dass dieser die Expression anderer Gene<br />
beeinflussen kann (Kim et al., 1992; Fiering et al., 1993; Pham et al., 1996, Wildner et al.,<br />
1998; Mei et al., 2000). Insbesondere der Selektionsmarker Neomycinphosphotransferase<br />
kann die Expression benachbarter Gene reprimieren (Artelt et al., 1991).<br />
3.2.6 Das neo-Gen kann die Expression benachbarter Gene negativ beeinflussen<br />
Von Artelt et al. (1991) wurde gezeigt, dass das neo-Gen die Expression eines benachbarten<br />
Gens durch supressiven Einfluss auf den zugehörigen Promotor reduziert. Dieser cisagierende,<br />
negative Effekt tritt auch auf, wenn das neo-Gen nicht transkribiert wird, und ist
3 Diskussion 64<br />
unabhängig <strong>von</strong> der Insertion und Orientierung des neo-Gens zum Promotor. Andere<br />
Selektionsmarker wie das Puromycin-Resistenzgen zeigen dagegen keine Auswirkungen auf<br />
die Expression <strong>von</strong> beachbarten Genen. Auch Wildner et al. (1998) konnte den negativen<br />
Einfluss des neo-Gens beobachten. So führte die Exzision <strong>von</strong> neo, welches im zweiten<br />
Cistron eines bicistronischen retroviralen Konstruktes lokalisiert war, zu einer signifikanten<br />
Erhöhung der LTR-vermittelten Expression <strong>von</strong> GFP im ersten Cistron. Fiering et al. (1993)<br />
zeigte, dass die Integration einer mit FRT-Sites flankierten neo-Kassette in den LCR des β-<br />
Globin-Locus mittels homologer Rekombination zum Abbruch der β-Globin-Expression und<br />
<strong>zur</strong> Reduktion der DNAseI-Sensitivität einer 3’gelegenen hypersensitiven Site führte. Nach<br />
Flp-vermittelter Exzision der neo-Sequenz konnte der ursprüngliche Phenotyp, β-Globin-<br />
Expression und hohe Sensitivität der DNAseI-hypersensitven Site, jedoch wiederhergestellt<br />
werden. Die Repression der β-Globin-Expression wurde nicht durch die Deletion im LCR,<br />
sondern durch die neo-Sequenz verursacht. Daher ist es notwendig, das neo-Gen zu entfernen.<br />
Durch Flankierung des neo-Gens mit loxP-Site kann, wie in dieser Arbeit angedacht, dieses<br />
durch Cre-Rekombinase exzisiert werden (Kap.2.1.2).<br />
3.3 Perspektiven<br />
3.3.1 Optimierung der <strong>autoregulierten</strong> Expression in <strong>ES</strong>-Zellen<br />
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass <strong>von</strong> den untersuchten <strong>autoregulierten</strong><br />
Systemen das TetOn-System zu den höchsten Expressionen in <strong>ES</strong>-Zellen führte, gefolgt vom<br />
PIPOff-, E.REXOff- und TetOff-System. Jedoch konnte auch festgestellt werden, dass in<br />
Abhängigkeit <strong>von</strong> der Expressionshöhe des System, die durch die jeweilige Aktivität des<br />
Transaktivators bestimmt wird, Squelching-Effekte durch den exprimierten Transaktivator in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen auftraten (Kap.2.3.4).<br />
Durch Verwendung schwächerer Promotoren, insbesondere in den hoch exprimierenden<br />
<strong>autoregulierten</strong> TetOn- und PIPOff-Systemen, oder durch gezielten Einsatz endogener<br />
Faktoren wie Doxycyclin (TetOn) bzw. Pristinamycin (PIPOff) besteht die Möglichkeit, die<br />
Transaktivator-Expression soweit zu reduzieren, so dass keine toxischen Transaktivtor-<br />
Konzentrationen in den Zellen erreicht werden. Dabei wird die Expression des<br />
Transaktivators so eingestellt, dass einerseits Squelching minimiert wird, anderseit dabei eine<br />
maximale Induktion erreicht werden kann (Kap.2.3.4). Die Transaktivatoren der untersuchten<br />
Expressionssysteme enthalten minimale oder vollständige transkriptionsaktivierende<br />
Domänen des viralen VP16-Proteins. Diese werden für das Squelching verantwortlich<br />
gemacht. Daher ist es auch denkbar, durch Austausch der VP16-basierenden<br />
Transaktivierungsdomänen in den Transaktivatoren gegen alternative transkriptionsaktivierende<br />
Domänen die Toxizität der Transaktivatoren zu verringern. Dies wird im<br />
Folgenden diskutiert.<br />
3.3.1.1 Reduktion der <strong>autoregulierten</strong> Expression durch Modifikation des Promotors<br />
Durch den Einsatz schwacher Promotoren besteht die Möglichkeit, die Transaktivator-<br />
Expression zu reduzieren. Der auf einem minimalen CMV-Promotor basierende<br />
Transaktivator-abhängige Promotor P hCMV*-1 (Gossen und Bujard, 1992) ist einer der stärksten<br />
bekannten Promotoren. Expressionen, die mit diesem Promotor erreicht werden, übertreffen<br />
Expressionen mit dem Wildtyp CMV-Promotor um das 35fache (Yin et al, 1996; Freundlieb<br />
et al., 1999). Ein minimaler Thymidinkinase-Promotor führt dagegen zu einer um Faktor 10
3 Diskussion 65<br />
reduzierten Basalexpression und um Faktor 100 verringerten Expression nach Induktion<br />
(Gossen und Bujard, 1992), was in <strong>autoregulierten</strong> Systemen in einer niedrigeren<br />
Transaktivator-Expression mit weniger Squelching resultiert (Strathdee et al., 1999). Auch die<br />
Anzahl der Operator-Sequenzen im Transaktivator-abhängigen Promotor kann die Expression<br />
beeinflussen. In der Arbeit <strong>von</strong> Fussenegger et al. (2000) wurde gezeigt, das ein bzw. zwei<br />
statt drei Operatoren im Promotor P PIR (PIPOff-System) zu einer ca. 70%igen- bzw. 45%igen<br />
Reduktion der Expression führen. Durch Insertionen <strong>von</strong> Nukleotiden zwischen Operator-<br />
Sequenz und Minimal-Promotor kann ebenfalls die Expression beeinflusst werden. Von<br />
Weber et al. (2002b) wurde die Auswirkung <strong>von</strong> Linker-Sequenzen mit 0 bis 10 bp Länge im<br />
Promotor P PIR untersucht. Bei 8 bp wurden im Durschnitt die höchsten Expressionen erzielt,<br />
während die Linker 10 bp und 6 bp zu einer Reduktion der Expression führten. Die niedrigste<br />
Expression zeigte der Linker-freie Promotor mit einer 100fach geringeren Expression als der<br />
Promotor mit 8 bp Linker.<br />
Durch Modifikation des Promotors im <strong>autoregulierten</strong> Expressionssystem kann die<br />
Expression des Transaktivators verringert werden, was zu niedrigeren und damit weniger<br />
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen führt. Allerdings sinkt dadurch auch<br />
die Expression des Transgens und des Selektionsgens. Daher muss experimentell untersucht<br />
werden, inwieweit veränderte Promotoren die autoregulierte Expression beeinflussen, so dass<br />
die Transaktivator-Expression nur minimales Squelching bewirkt bei gleichzeitig<br />
ausreichender Expression des Selektionsmarkers. Es ist durchaus möglich, dass die Reduktion<br />
der <strong>autoregulierten</strong> Expression zu einer niedrigen Expression des Selektionsgen führt, so daß<br />
eine Positiv-Selektion <strong>von</strong> Zellen nach Integration der <strong>autoregulierten</strong> Kassette in das Genom<br />
beeinträchtigt wird.<br />
3.3.1.2 Verwendung weniger toxischer Transaktivatoren<br />
Die verwendeten Transaktivatoren der verschiedenen <strong>autoregulierten</strong> Systeme enthalten<br />
minimale bzw. vollständige VP16-Transaktivierungsdomänen. Wie bereits in Kap. 3.1.5<br />
diskutiert wurde, kann bei hoher Expression der Transaktivatoren mit VP16-Domäne durch<br />
Interaktion der transakriptionsaktivierenden Domäne <strong>von</strong> VP16 mit verschiedenen<br />
Transkriptionsfaktoren die Konzentration dieser Faktoren in den Zellen reduziert werden<br />
(Squelching), was zum Tod der Zellen führen kann. Dabei besteht ein Zusammenhang<br />
zwischen der Aktivität des Transaktivators, die autoregulierte Expression zu induzieren, und<br />
dem Auftreten <strong>von</strong> Squelching. Durch die weniger aktiven Transaktivatoren des TetOff- und<br />
E.REXOff-System werden in <strong>ES</strong>-Zellen nur niedrigen Expressionen und daher weniger<br />
toxische Transaktivator-Konzentrationen erzielt, was sich in geringem Squelching<br />
widerspiegelt. Dagegen führen die aktiveren Transaktivatoren des TetOn- und PIPOff-<br />
Systems zu hohen Expressionen, die einhergehen mit starken Squelching-Effekten. Dies<br />
beeinträchtigte die <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> <strong>autoregulierten</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong>. Daher scheint es sinnvoll,<br />
die transkriptionsaktivierende Domäne <strong>von</strong> VP16 in diesen Transaktivatoren durch alternative<br />
Transaktivierungsdomänen, die weniger Squelching verursachen, zu ersetzen und auf ihre<br />
Verwendbarkeit im <strong>autoregulierten</strong> System in <strong>ES</strong>-Zellen zu testen. Folgende<br />
Transaktivierungsdomänen kommen dafür in Frage.
3 Diskussion 66<br />
3.3.1.2.1 Die Transaktivierungsdomäne p65<br />
Von Urlinger et al. (2000a) wurden verschiedene nicht-virale, humane Aktivierungsdomänen<br />
an Tet-Repressor-Domänen, die auch Bestandteil des Transaktivators tTA (TetOff-System,<br />
Gossen und Bujard, 1992) bzw. des Transaktivators rtTA-S2 (TetOn-System, Urlinger et al.,<br />
2000b) sind, fusioniert und hinsichtlich ihres transkriptionsaktivierenden Potenzials<br />
untersucht. Insbesondere die p65-Domäne aus NF-κB (Schmitz und Bäuerle, 1991) zeigte in<br />
verschiedenen Zellen eine zu VP16 vergleichbare Aktivität. Die Expressions- und<br />
Regulationsfaktoren der Transaktivatoren tTA-p65 (TetOff) und rtTA-S2-p65 (TetOn) waren<br />
im Vergleich zu den VP16-Transaktivatoren tTA und rtTA-S2 als auch untereinander<br />
ähnlich. In der Arbeit <strong>von</strong> Weber et al. (2002b) wurde die Fusion der p65-Domäne mit der<br />
MphR(A)-Domäne des ET-Transaktivators (E.REXOff-System, Weber et al., 2000a) bzw. mit<br />
der Pip-Domäne des Transaktivators PIT (PIPOff-System, Fussenegger et al., 2000)<br />
untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Fusion MphR(A)-p65 in geringerem Ausmaß als der<br />
Transaktivator ET mit VP16-Domäne in verschiedenen permanenten <strong>Zelllinien</strong> die<br />
Transaktivator-abhängige Expression induzieren kann. Dagegen führte der PIT-Transaktivator<br />
mit p65-Domäne in NIH3T3- und HT1080 zu höheren Expressionen als der ursprüngliche<br />
Transaktivator PIT mit VP16-Domäne. In K562-Zellen ist das Expressionspotenzial <strong>von</strong> PIT<br />
jedoch höher als das des Transaktivators mit p65-Domäne. Auffallend ist, dass die Induktion<br />
bzw. Repression der Pip-p65 Fusion in den verschiedenen Zellen variiert. In NIH3T3-Zellen<br />
führte Pristinamycin zu Induktion, in HT1080-Zellen <strong>zur</strong> Repression der Expression. In<br />
K562-Zellen wurde kein Einfluss <strong>von</strong> Pristinamycin auf die Expression festgestellt. Anhand<br />
der bisherigen Erkenntnisse scheinen daher Fusionen aus p65-Aktivierungsdomäne und Tet-<br />
Repressor-Domäne (Tet-System) bzw. MphR(A)-Domäne (E.REX-System) potentielle<br />
Transaktivatoren für autoregulierte Expressionssysteme darzustellen und sollten deshalb in<br />
<strong>ES</strong>-Zellen getestet werden.<br />
3.3.1.2.2 Die Transaktivierungsdomäne E2F4<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Akagi et al. (2001) wurde die modifizierte Aktivierungsdomäne des<br />
humanen Transkriptionsfaktors E2F4 an die Tet-Repressor-Domäne des Tetracyclinabhängigen,<br />
reversen Transaktivators rtTA (Gossen et al., 1995) fusioniert. Das<br />
Induktionspotenzial des Transaktivators wurde mit dem <strong>von</strong> rtTA in verschiedenen Zellen<br />
verglichen. Dabei zeigte sich, dass der Transaktivator rtTA höhere transiente Expressionen<br />
erlaubt als der Transaktivator mit E2F4-Domäne. Mit diesem konnten dagegen mehr stabil<br />
exprimierende Zelllininen generiert werden. Die Fusionen <strong>von</strong> E2F4 mit MphR(A) bzw. Pip<br />
(Weber et al., 2002b) waren ebenfalls weniger aktiv als die jeweiligen VP16-Varianten. Der<br />
Transaktivator Pip-E2F4 zeigte in ähnlicher Weise wie die Fusion Pip-p65 eine <strong>von</strong> der<br />
Zelllinie abhängige Varianz in der Pristinamycin-bedingten Induktion/Repression der<br />
Expression. Da die Fusionen der Aktivierungsdomäne E2F4 mit der Tet-Repressor- als auch<br />
MphR(A)-Domäne nur geringere Expressionen als die jeweiligen VP16-Varianten<br />
ermöglichen (Akagi et al., 2001, Weber et al., 2002b), könnte es sein, dass mit einem<br />
Transaktivator mit E2F4-Domäne keine Expressionssteigerung im <strong>autoregulierten</strong><br />
Expressionssystem in <strong>ES</strong>-Zellen erreicht werden kann. Trotzdem scheint es sinnvoll,<br />
Transaktivatoren mit der Aktivierungsdomäne E2F4 in <strong>ES</strong>-Zellen zu testen, da nicht<br />
sichergestellt ist, ob Transaktivatoren mit E2F4-Domäne weniger toxisch in <strong>ES</strong>-Zellen sind<br />
als Transaktivatoren mit VP16-Domäne.
3 Diskussion 67<br />
3.3.1.2.3 Beurteilung der Transaktivatoren mit p65- bzw. E2F4-<br />
Transaktivierungsdomäne hinsichtlich ihres Einsatzes <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong><br />
autoregulierter <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong><br />
In den zitierten Publikationen wurden mögliche Squelching-Effekte der Transaktivatoren mit<br />
p65- bzw. E2F4-Aktivierungsdomäne nicht beobachtet bzw. untersucht. Da jedoch die p65-<br />
Domäne ähnliche Strukturen und Sequenzmotive wie die VP16-Domäne aufweist (Cress und<br />
Triezenberg, 1991; Regier et al., 1993; Blair et al., 1994), besteht die Möglichkeit, dass diese<br />
mit den selben Transkriptionsfaktoren wie die Aktivierungsdomäne <strong>von</strong> VP16 interagiert, was<br />
transkriptionelles Squelching bewirken kann (Schmitz et al., 1994). Von der E2F4-Domäne<br />
werden dagegen keine negativen Auswirkungen erwartet (Ginsberg et al., 1994; Akagi et al.,<br />
2001), jedoch sind Transaktivatoren mit dieser Domäne wenig aktiv. Das Induktionspotenzial<br />
<strong>von</strong> Transaktivatoren mit p65-Aktivierungsdomäne wurde bisher nur in den <strong>Zelllinien</strong><br />
NIH3T3-, HT1080-, CHOK1-, HeLa und in B- und T-Lymphozyten (Urlinger et al., 2000a;<br />
Weber et al., 2002b), das des Transaktivators mit E2F4-Aktivierungsdomäne in NIH3T3-,<br />
HT1080-, K562-, COS7-, SaOs2- und HeLa-Zellen (Akagi et al., 2001; Weber et al., 2002b),<br />
jedoch nicht in embryonalen Stammzellen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde<br />
gezeigt, dass die verschiedenen <strong>autoregulierten</strong> Expressionssysteme in differenzierten Zellen<br />
eine vielfach höhere Expression als in <strong>ES</strong>-Zellen ermöglichen. Dies wurde mit einer höheren<br />
Toleranz der differenzierten Zellen gegenüber toxischen Transaktivator-Konzentrationen und<br />
einem höheren Induktionspotenzial der Transaktivatoren in differenzierten Zellen begründet<br />
(Kap. 3.1.5). Urlinger et al. (2000a) zeigte, das die Expressionen der p65-Transaktivatoren in<br />
differenzierten Zellen ähnlich aktiv waren wie die VP16-Varianten. Deshalb ist zu vermuten,<br />
dass die p65-Transaktivatoren auch in <strong>ES</strong>-Zellen ein ähnlichens Induktionspotenzial wie die<br />
VP16-Transaktivatoren besitzen. Die Expressionshöhe würde dann durch das Squelching-<br />
Potenzial der Transaktivatoren definiert. Ist die p65-Domäne weniger toxisch als die VP16-<br />
Domäne, könnte dies zu einer verstärkten Expression führen, was sich in einer höheren Zahl<br />
selektierbarer <strong>ES</strong>-Zellklone widerspiegeln könnte.<br />
3.3.2 Optimierung der Kassettenaustauschstrategie<br />
3.3.2.1 Positiv-Selektion statt Negativ-Selektion beim Kassettenaustausch<br />
Da ein Kassettenaustausch vielfach effizienter mit einem Positiv-Selektionsmarker als mit<br />
einem Negativ-Selektionsmarker selektiert werden kann, wäre es sinnvoll, die<br />
Austauschstrategie <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998, 2001) auf die in dieser Arbeit verwendeten<br />
Strategie zu adaptieren. In Abbildung 39 ist eine mögliche Austauschstrategie, basierend auf<br />
Positiv-Selektion durch Komplementierung eines ATG-defizienten neo-Gens (∆neo)<br />
dargestellt.<br />
Die Generierung parentaler Zellklone mit integrierter, autoregulierter Kassette erfolgt mittels<br />
eines <strong>autoregulierten</strong> Konstruktes, welches den Selektionsmarker Hygromycin-B-<br />
Phosphotransferase exprimiert (Positiv-Selektion). Für den Kassettenaustausch können<br />
Austauschplasmide eingesetzt werden, die auf dem in dieser Arbeit konstruierten Vektor<br />
beruhen (Kap.2.4). Austauschklone werden mit G418 selektiert (Positiv-Selektion). Wird wie<br />
in der Arbeit <strong>von</strong> Verhoeyen et al. (1998) eine parentale Kassette mit HygTk-Gen <strong>zur</strong><br />
Selektion parentaler Zellklone eingesetzt, wäre es auch möglich, aufgrund der<br />
Thymidinkinase-Aktivität <strong>von</strong> HygTk die Positiv-Selektion mit einer Negativ-Selektion unter<br />
Verwendung <strong>von</strong> Gancyclovir zu kombinieren. Allerdings wurde gezeigt, dass bereits die<br />
Positiv-Selektion allein ausreicht, um eine hohe Austauscheffizienz zu erreichen (Verhoeyen
3 Diskussion 68<br />
et al., 1998). Durch eine zusätzliche Negativ-Selektion konnte die Austauschrate nicht weiter<br />
gesteigert werden.<br />
Statt Hyg bzw. HygTk könnte auch das Puromycin-Resistenzgen bzw. die Fusion aus<br />
Puromycinacetyltransferase und Thymidinkinase PACTK bzw. Pu∆Tk als Positiv- bzw.<br />
Positiv-/Negativ-Selektionsmarkers (Karreman, 1998; Chen und Bradley, 2000) <strong>zur</strong> Selektion<br />
<strong>von</strong> parentalen Zellklonen eingesetzt werden.<br />
Genlocus mit autoregulierter Expressionskassette<br />
F<br />
P bi<br />
5‘ pA Luciferase TA IR<strong>ES</strong> Hyg<br />
+ Flp-Rekombinase<br />
F5 loxP loxP<br />
pA ∆neo pA 3‘<br />
• Hygromycin-Resistenz<br />
• keine G418-Resistenz<br />
→ Positiv-Selektion<br />
Austauschkonstrukt<br />
F<br />
P bi<br />
F5<br />
Gen X<br />
TA<br />
IR<strong>ES</strong><br />
ATG<br />
Genlocus nach Kassettenaustausch<br />
F<br />
P bi<br />
F5 loxP loxP<br />
5‘ pA Gen X<br />
TA IR<strong>ES</strong> ∆neo pA 3‘<br />
ATG<br />
• keine Hygromycin-Resistenz<br />
• G418-Resistenz<br />
→ Positiv-Selektion<br />
Abb. 39 Alternativer Kassettenaustausch mit Positiv- Selektion<br />
Die autoregulierte Kassette enthält den Positiv-Selektionsmarker Hyg (Hygromycin-B-Phosphotransferase) und ein ein ATG-freies neo-Gen.<br />
Es können Hygromycin-resistente Zellen selektiert werden (Positiv-Selektion). Durch den Kassettenaustausch wird das Hyg-Gen durch ein<br />
Startcodon im markierten Genlocus ersetzt, so dass die Austauschzellen durch G418-Selektion selektiert werden können (Positiv- Selektion).<br />
Eine ähnliche Strategie, „Plug-and-Socket“-Strategie genannt, wurde <strong>von</strong> Detloff et al. (1994)<br />
<strong>zur</strong> Markierung bekannter Genorte und <strong>zur</strong> nachfolgenden Integration eines Transgens in<br />
diese Loci entwickelt. Statt den Genort mit einem ATG-defizienten Positiv-Selektionsmarker<br />
zu versehen, wurde ein 5’-verkürztes HPRT-Minigen (Hypoxanthinphosphoribosyltransferase)<br />
∆HPRT integriert. Nach Selektion <strong>von</strong> parentalen Klonen, die das Selektionsgen<br />
neo exprimierten (Positiv-Selektion), wurde ein Austauschkonstrukt, welches den HPRT-<br />
Promotor und den 5’-Bereich des HPRT-Minigens (Exon 1) HPRT∆ trägt, in den markierten<br />
Genlocus mittels homologer Rekombination integriert, was <strong>zur</strong> Komplementierung des<br />
Selektionsgens HPRT führte. Austauschklone wurden mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-<br />
Thymidin) selektiert (Positiv-Selektion).<br />
Wie in Kapitel 3.2.6 beschrieben wird, kann das neo-Gen, wie in der Arbeit <strong>von</strong> Verhoeyen et<br />
al. (1998) als Positiv-Selektionsmarkers des Kassettenaustausches verwendet, die Expression<br />
benachbarter Gene negativ beeinflussen (Artelt et al., 1991). Deshalb empfiehlt es sich,<br />
alternative Positiv-Selektionsmarker wie HPRT oder Puromycinacetyltransferase einzusetzen.<br />
Es ist auch möglich, dass neo-Gen durch loxP-Sites zu flankieren, so dass dieses durch Cre-<br />
Rekombinase exzisiert werden kann. Dieser Schritt bedeutet jedoch eine weitere Modifikation<br />
der transgenen Zellen, was zeitaufwendig ist und bei transgenen <strong>ES</strong>-Zellen die<br />
Keimbahngängigkeit dieser Zellen beeinträchtigen könnte.
3 Diskussion 69<br />
3.3.2.2 Alternative Negativ-Selektion des Kassettenaustausches<br />
Der Selektionsmarker HPRT kann nicht nur <strong>zur</strong> Positiv- sondern auch <strong>zur</strong> Negativ-Selektion<br />
verwendet werden. Mittels HAT können Zellen selektiert werden, die eine HPRT-Expression<br />
aufweisen, dagegen führt 6-TG (6-Thioguanin) zum Tod dieser Zellen (Melton et al., 1984;<br />
Reid et al., 1990; Valancius und Smithies, 1991). Eine Bedingung für die Verwendung <strong>von</strong><br />
HPRT als Positiv-Selektionsmarker bei der Generierung trangener <strong>Zelllinien</strong> und als Negativ-<br />
Selektionsmarker beim Kassettenaustausch ist, dass die parentalen Zellen HPRT-defizient<br />
sind. In den <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> E14TG2a (Hooper et al., 1987), HM-1 (Magin et al., 1992) und<br />
E14.1TG3B1 (Tsuda et al., 1997) liegt das „house-keeping-gene“ HPRT partiell deletiert vor<br />
und wird daher nicht exprimiert. In verschiedenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mit<br />
dem Positiv-/Negativ-Selektionsmarker HPRT stabile, HAT-resistente <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> generiert<br />
werden können, die eine hohe Sensitivität gegenüber 6-TG besitzen und <strong>zur</strong> Generierung <strong>von</strong><br />
transgenen Mäusen geeignet sind (Stacey et al., 1994; Melton et al.,1997). Deshalb sollte es<br />
möglich sein, die Markierung <strong>von</strong> Genorten in <strong>ES</strong>-Zellen als auch einen Austausch der<br />
integrierten Kassetten mit HPRT zu selektieren. Das bedeutet, dass an die Position des Tkneo-<br />
Gens im <strong>autoregulierten</strong> Expressionsvektor das HPRT-Minigen gesetzt wird (Abb.40). Die<br />
Integration des Konstruktes in das Genom HPRT-defizienter <strong>ES</strong>-Zellen nach Elektroporation<br />
wird mittels HAT selektiert. Basierend auf dem bisherigen Austauschkonstrukt (Kap.2.4)<br />
kann eine Selektionsmarker-freie Expressionskassette für den Kassettenaustausch verwendet<br />
werden. Austauschklone werden durch den Verlust des HPRT-Gens mittels 6-TG selektiert.<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass bei Verwendung <strong>von</strong> Thymidinkinase als<br />
Negativ-Selektionsmarker des Kassettenaustausches eine Vielzahl falsch-positiver Klone, die<br />
gegen Gancyclovir spontan resistent waren, selektiert wurde. Dies wurde mit einer<br />
positionsabhängigen Inaktivierung des Tk-Gens erklärt (Askew et al., 1993; Wu et al., 1994).<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Melton et al. (1997) wurde die Stabilität der Expression des HPRT-Gens in<br />
verschiedenen Loci in <strong>ES</strong>-Zellen untersucht. Die Frequenz der Spontanresistenz gegenüber 6-<br />
TG variierte in Abhängigkeit vom Genort bzw. <strong>von</strong> der Expressionshöhe (Positionseffekt)<br />
und lag in fünf <strong>von</strong> sechs untersuchten Loci zwischen
3 Diskussion 70<br />
Statt eines HPRT-Minigens kann auch der Positiv-/Negativ-Selektionsmarker GPT<br />
(Guaninphosphoribosyltransferase) verwendet werden. Für die Positiv-Selektion wird MPA/X<br />
(Mycophenolsäure/Xanthin), für die Negativ-Selektion 6-TG eingesetzt. Dabei ist es<br />
wiederum notwendig, dass die Ausgangszelllinie HPRT-defizient ist. In der Arbeit <strong>von</strong><br />
Sullivan et al. (2001) wurden mit einem GPT-exprimierenden Konstrukt Genorte in HPRTdefizienten<br />
HT1080-Zellen markiert. Die Kultivierung der Zellen mit 6-TG führte zu ca. 4%<br />
spontan resistenten Klonen. Die Frequenz der Spontanresistenz ist damit niedriger als die<br />
Spontanresistenzrate bei Verwendung <strong>von</strong> Thyimidinkinase als Negativ-Selektionsmarker.<br />
Deshalb könnte <strong>zur</strong> Selektion des Kassettenaustausches auch der Marker GPT Verwendung<br />
finden.<br />
3.3.2.3 Thymidinkinase-Expression in männlichen Mäusen führt <strong>zur</strong> Infertilität<br />
In einigen Publikationen wurde gezeigt, dass bei männlichen Mäuse, die ein Thymidinkinase-<br />
Gen (Tk) aus dem Herpes Simplex Virus tragen, Infertilität auftreten kann (Al-Shawi et al.,<br />
1988, 1991; Braun et al., 1990; Ellison et al., 1995, 2000). Begründet wurde dies mit einer<br />
ektopischen Expression <strong>von</strong> Tk im Hoden dieser Mäuse, die <strong>zur</strong> Unterbrechung der<br />
Spermatogenese führt. Das Ausmaß der Unfruchtbarkeit ist dabei <strong>von</strong> der Höhe der<br />
testikularen Thymidinkinase-Expression abhängig (Al-Shawi et al., 1991). Während höhere<br />
Expressionen die Spermatogenese in frühen Stadien unterbrechen, beeinträchtigen niedrigere<br />
Expressionen die Spermatogenese nur in geringem Umfang, so dass die männlichen Mäuse<br />
fertil bleiben. Jedoch zeigten auch die Spermien dieser Tiere entweder eine veränderte<br />
Motilität (Al-Shawi et al., 1991) oder eine veränderte Morphologie (Hüttner et al., 1993). Die<br />
weiblichen transgenen Mäuse exprimierten dagegen Thymidinkinase nicht ektopisch und<br />
blieben deshalb fertil.<br />
Es ist angedacht, aus <strong>autoregulierten</strong> <strong>ES</strong>-<strong>Zelllinien</strong> transgene Mäuse zu etablieren. Da die<br />
bisher eingesetzten Konstrukte im induzierten Zustand in <strong>ES</strong>-Zellen und letztlich in Mäusen<br />
<strong>zur</strong> Expression <strong>von</strong> Thymidinkinase führen, wäre es sinnvoll, dass die Generierung transgener<br />
Mauslinien unter reprimierenden Bedingungen stattfindet. So kann durch Doxycyclin im<br />
Trinkwasser die Expressionen <strong>von</strong> TetOff-Systemen in transgenen Mäusen endogen<br />
reprimiert werden (Fedorov et al., 2001a). Weiterhin können auch <strong>ES</strong>-Zellen nach<br />
Kassettenaustausch für die Generierung transgener Mäuse eingesetzt werden, da diese keine<br />
Thymidinkinase exprimieren. Dies erlaubt gleichzeitig die Überprüfung, ob die <strong>ES</strong>-Zellen<br />
nach Kassettenaustausch noch keimbahnfähig sind.<br />
3.4 Ausblick<br />
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expressionspotenziale<br />
autoregulierter Expressionssysteme in differenzierten Zellen und embryonalen Stammzellen<br />
unterschiedlich sind. In transienten Expressionsstudien wurde festgestellt, dass in NIH3T3-<br />
Zellen vielfach höhere Expressionen mit den verschiedenen, <strong>autoregulierten</strong> Systemen<br />
erreicht werden können als in <strong>ES</strong>-Zellen (Kap.2.2 und 2.3). Auch nach in vitro<br />
Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen mit einer TetOff-Expressionskassette im ROSA26-Locus<br />
wurden vielfach höhere Expressionen des Reportergens gemessen (Kap.2.2.5.2). Dies<br />
begründet die Erwartung, dass in Mäusen, die aus transgenen <strong>ES</strong>-Zellen mit autoregulierter<br />
Expressionskassette generiert werden, eine regulierbare Reportergen-Expression zu<br />
beobachten sein wird. Daher wird beabsichtigt, die im Rahmen dieser Arbeit etablierte <strong>ES</strong>-<br />
Zelllinie mit integrierter TetOff-Kassette im ROSA26-Locus <strong>zur</strong> <strong>Etablierung</strong> <strong>von</strong> transgenen<br />
Mäusen einzusetzen. Die Expression in der Maus kann durch Doxycylin im Trinkwasser
3 Diskussion 71<br />
(Fedorov et al., 2001a) reguliert werden. Die Bestimmung der Transgen-Expression soll nach<br />
Isolation einzelner Organproben z.B. durch Messung einer Reporter-Aktivität, durch RT-PCR<br />
bzw. Northern-Analyse erfolgen. Wird eine <strong>ES</strong>-Zelllinie mit autoregulierter Luciferase-<br />
Expression für die <strong>Etablierung</strong> transgener Mäuse eingesetzt, kann die Expression <strong>von</strong><br />
Luciferase im lebenden Organismus mittels hochempfindlicher CCD-Kameras, die nach<br />
Injektion des Luciferins in die Maus die Umsetzung dieses Substrates durch die Luciferase,<br />
begleitet durch eine Emission <strong>von</strong> Photonen, detektieren können (Thompson et al., 1995;<br />
Honigman et al., 2001; Bhaumik und Gambhir, 2002), beobachtet werden.<br />
Nach der Charakterisierung der <strong>autoregulierten</strong> Expression in einer transgenen Maus ist<br />
angedacht, die Expressionskassette der parentalen, transgenen <strong>ES</strong>-Zelllinie gegen eine<br />
autoregulierte Kassette zu ersetzen, die ein anderes als das ursprüngliche Transgen exprimiert.<br />
Aus den Zellen eines Austauschklons soll wiederum eine transgene Mauslinie etabliert<br />
werden. Es wird erwartet, dass diese Mäuse das gleiche Expressionsprofil aufweisen wie die<br />
zuvor generierte transgene Maus. Trifft dies zu, sollte es möglich sein, jedes beliebige Gen in<br />
der Maus vorhersagbar reguliert zu exprimieren. Dies setzt lediglich die Integration einer<br />
<strong>autoregulierten</strong> Austauschkassette mit beliebigem Transgen in den markierten Genlocus der<br />
charakterisierten <strong>ES</strong>-Zelllinie voraus. Dadurch können in wenigen Schritten transgene Mäuse<br />
mit gewünschtem Expressionsprofil generiert und die Auswirkungen des Transgens auf den<br />
Organismus untersucht werden.
4 Material und Methoden 72<br />
4 Material und Methoden<br />
4.1 Geräte<br />
Tischzentrifugen<br />
Kühlzentrifugen<br />
Eppendorf 5417C<br />
Heraeus Biofuge 13<br />
Heraeus Christ Minifuge GL<br />
Hettich Rontana/S<br />
Sorval Superspeed RC5<br />
Minifuge Heraeus-Christ<br />
Biofuge fresco<br />
Festwinkelrotoren: GSA, GS3, SS34<br />
Schwingbecherrotor: HB4<br />
Photometer Hitachi U-1100<br />
Fluorometer Hoefer Dyna Quant 200<br />
Fluoreszenz-Elisa-Reader Wallace Victor 2 1420 Multilabel counter<br />
Labsystems Multiskan<br />
Gelelektrophoresekammer BRL Horizon 58<br />
BRL Horizon 1114<br />
BRL Horizon 2025<br />
Owl Separation System, Model: A2<br />
Mikroskop<br />
UV-Kammer<br />
Leitz Labovert FS<br />
Leica DMIL<br />
Hanau<br />
Phosphoimager Molecular Dynamics Storm 860<br />
Videograph<br />
Biotec Fischer Video Densitometer<br />
Mitsubishi Thermodrucker und Personal Computer<br />
Netzgeräte Desaga Mains Power Supply Unit 1200/200<br />
Biorad Power Pac 300<br />
Durchflusscytometer & Software<br />
FACScan <strong>von</strong> Becton Dickinson<br />
FACSCalibur <strong>von</strong> Becton Dickinson<br />
Macintosh Quadra 650<br />
Luminometer Berthold Lumat LB 9501<br />
Zellzähler<br />
Schärfe System Casy 1 DT<br />
Zellkultur-Inkubatoren Forma Scientific Water-jacketed Incubator Modell 3336
4 Material und Methoden 73<br />
Cleanbenches<br />
pH-Meter<br />
PCR-Maschine<br />
Mecaplex, Sterilcard Hood VBM600 und SG400<br />
Heraeus, HLB 2448<br />
Heraeus, HSP 18<br />
M 50, Beckmann<br />
M 340, Beckmann<br />
Biometra T3 Thermocycler<br />
Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480<br />
Thermomixer Eppendorf Thermomixer 5436<br />
Vortex Scientific Industries Vortex Genie 2<br />
Elektroporator<br />
Biorad Gene Pulser und Pulse Controller<br />
Hybridisierungsofen Robbins Scientific Hybridization Incubator Model 310<br />
Stuart Scientific Hybridization Incubator<br />
Laborschüttler<br />
Wasseraufbereitung<br />
Heidolph<br />
Millipore Milli-Q<br />
4.2 Material<br />
Es wurden Chemikalien der Firmen Amersham, Bayer, Biolabs, Boehringer, Difco, Flow,<br />
Fluka, Gibco, Hoechst, Invitek, Macherey-Nagel, Merck, Peqlab, Pharmacia, Promega,<br />
Qiagen, Serva, Sigma, Stratagene und USB. Die Enzyme lieferten Amersham-Buchler, BRL,<br />
Biolabs, Boehringer, Pharmacia, Roche Pharma und USB. Oligonukleotidsynthesen und<br />
DNA-Sequenzierungen wurden <strong>von</strong> der Firma MWG durchgeführt.<br />
Das Plastik-Zellkulturmaterial für die eukaryontischen Zellen wurde <strong>von</strong> den Firmen Costar,<br />
Gibco, Greiner, Nunc und Seromed bezogen.<br />
Die Texte, Grafiken und Tabellen in dieser Arbeit wurden mit den Programmen Word,<br />
Powerpoint und Excel der Firma Microsoft erstellt. Die Bearbeitung <strong>von</strong> Bilddateien erfolgte<br />
mit dem Programm Photoshop 5.0 der Firma Adobe. Zur Auswertung <strong>von</strong> Autoradiographien<br />
wurde das Programm Image Quant Version 5.0 <strong>von</strong> Molecular Dynamics benutzt. Zur<br />
Entwicklung <strong>von</strong> Klonierungsschritten, zum Auffinden <strong>von</strong> PCR-Primern-Sequenzen und <strong>zur</strong><br />
Restriktionskartierung wurde das Programm Vector NTI 4.0 und 5.0 der Firma ATCC<br />
verwendet. Zur Literaturrecherge dienten die Internet-Portale Medline<br />
(www.ncbi.nlm.nih.gov) und Current Contents (isi1.newisiknowledge.com).
4 Material und Methoden 74<br />
4.3 Allgemeine Grundtechniken<br />
4.3.1 Sterilisieren durch Hitze<br />
Glasgeräte werden 4 h bei 180°C im Trockenschrank sterilisiert. Jegliche Materialen aus<br />
Plastik wie Eppendorffgefäße und Pipettenspitzen, Lösungen und Holzstäbe werden 25 min<br />
bei 121°C autoklaviert. Andere Utensilien wie Pipetten, Filter, Säulen sind vom Hersteller<br />
steril verpackt.<br />
4.3.2 Sterilisieren durch Filtration<br />
Lösungen, die nicht autoklaviert werden können, werden mit Filtern mit einer Porengröße <strong>von</strong><br />
2 µm (Sartorius) sterilisiert.<br />
4.3.3 Phenolisieren <strong>von</strong> DNA<br />
Phenol (Fa. Roth): redestilliertes, in TE-Puffer äquilibriertes Phenol (pH 7.8 bis 8.0),<br />
0.1% (w/v) 8-Hydroxychinolin<br />
TE-Puffer: 0.1 mM EDTA, 10mM Tris/HCl in H 2 O, pH 8.0<br />
Zur Entfernung <strong>von</strong> Proteinen und <strong>zur</strong> Entsalzung einer wässrigen DNA-haltigen Lösung wird<br />
diese mit Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (24:1) im gleichen Verhältnis<br />
versetzt und auf dem Vortexer vorsichtig vermischt. Durch einminütige Zentrifugation bei<br />
13.000 rpm werden wässrige und Phenol-haltige Phase getrennt. Die obere wässrige Phase<br />
enthält die DNA und wird daher bis <strong>zur</strong> Interphase abgenommen. Die untere Phase wird mit<br />
gleichem Volumen TE-Puffer versetzt, wieder gevortext und ein weiteres Mal für 1 min bei<br />
13.000 rpm zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase der ersten<br />
Extraktion vereint. Zur Entfernung <strong>von</strong> Phenolresten kann die wässrige Phase mit<br />
Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung behandelt werden. Anschließend kann die DNA gefällt<br />
werden.<br />
4.3.4 Fällung <strong>von</strong> DNA<br />
LiCl/Ethanol:<br />
0.6 M LiCl in Ethanol (Lagerung bei -20°C)<br />
Die DNA-haltige Lösung wird mit 2fachem Volumen LiCl/Ethanol-Lösung versetzt und für<br />
mindestens 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die DNA durch 30 minütige<br />
Zentrifugation bei 15.000 rpm und 4°C abgetrennt. Zur Entsalzung wird die DNA mit<br />
70%igem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknung wird die DNA in TE-<br />
Puffer aufgenommen.
4 Material und Methoden 75<br />
4.4 DNA-Modifizierung<br />
4.4.1 Spaltung <strong>von</strong> DNA mit Restriktionsenzymen<br />
Zur Spaltung <strong>von</strong> DNA wird diese mit einer Konzentration <strong>von</strong> maximal 1 µg/µl unter den,<br />
vom Hersteller der Enzyme angegebenden Reaktionsbedingungen wie zu verwendender<br />
Puffer, Reaktionstemperatur, Reaktionszeit mit dem Restriktionsenzym kultiviert. Die<br />
Reaktion kann in den meisten Fällen durch 10 minütiges Erhitzen bei 65°C, Zugabe <strong>von</strong> 1:20<br />
0.5 M EDTA zum Restriktionsansatz oder Phenolisierung abgestoppt werden.<br />
4.4.2 Auffüllen <strong>von</strong> 5’-überstehenden Enden<br />
10x Klenow-Puffer:<br />
dNTP-Mix:<br />
50 mM Tris/HCl in H 2 O, pH7.2, 10 mM MgSO 4 , 0.1 mM DTT<br />
je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP<br />
Es werden maximal 1 µg DNA mit 5’-überstehenden Enden mit 4 µl des dNTP-Mixes und<br />
1-2 U Klenow-Enzym (Gesamtvolumen 30 µl) bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Reaktion<br />
wird durch Phenolisierung gestoppt und die DNA durch Fällung isoliert.<br />
4.4.3 Dephosphorylierung <strong>von</strong> DNA-Fragmenten<br />
10x Phosphatase-<br />
Puffer:<br />
Stopp-Lösung:<br />
500 mM Tris/HCl, pH9.0, 10 mM MgCl 2 , 1 mM ZnCl 2 ,<br />
1 mM Spermidin<br />
125 mM EDTA, 1% SDS<br />
Zur Verhinderung der Religation eines gespaltenen Vektors werden die 5- oder 3’-<br />
überstehenden Enden mit alkalischer Phosphatase („calf intestine phosphatase“:CIP)<br />
dephosphoryliert. Dazu werden 20-100 pmol überstehende Enden mit 10x Phosphatase-Puffer<br />
und 1-2 U alkalischer Phosphatase (Gesamtvolumen 50 µl) bei 37°C für 15 min und<br />
anschließend bei 56°C für weitere 15 min inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe <strong>von</strong> 1 µl<br />
Stopp-Lösung und durch Inkubation bei 65°C für 10 min abgebrochen. Die DNA wird durch<br />
Phenolisierung gereinigt und durch Fällung isoliert.<br />
4.4.4 Oligohybridisierung<br />
Kurze Nukleotidfragmente mit bekannter Sequenz, die in Vektoren eingefügt werden sollen,<br />
können durch Oligohybridisierung geschaffen werden. Dazu werden jeweils 5 µg<br />
komplementäre Nukleotidstränge mit maximal 150 bp in deionisiertem H 2 O (Gesamtvolumen<br />
25 µl) bei 80-90°C für 5 min inkubiert. Der Ansatz wird langsam auf RT abgekühlt und kann<br />
direkt in einer Ligation eingesetzt werden.
4 Material und Methoden 76<br />
4.4.5 Ligation <strong>von</strong> DNA-Fragmenten<br />
5x Ligase-Puffer:<br />
250 mM Tris/HCl, pH7.6, 50 mM MgCl 2 , 25% (w/v) PEG8000,<br />
5 mM ATP, 5 mM DTT<br />
In einem 10 µl Ansatz mit 2 µl 5x Ligase-Puffer 2 U T4-DNA-Ligase werden ca. 20 fmol<br />
eines zuvor gegebenenfalls dephosphorylierten Vektors und ca. 60 fmol eines zu<br />
inserierenden DNA-Fragmentes bei RT für mindestens 4 h oder bei 4°C über Nacht inkubiert.<br />
Die Reaktion wird durch Zugabe <strong>von</strong> 1 µl 0.5 M EDTA abgestoppt. Überstehende,<br />
komplementäre DNA-Enden werden schnell und vollständig verknüpft. Glatte DNA-Enden<br />
(blunt) erfordern höhere Enzymkonzentrationen.<br />
4.4.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)<br />
(Saiki et al., 1988)<br />
Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Verfahren <strong>zur</strong> Vermehrung bestimmter DNA-<br />
Sequenzen. Dabei wird der natürliche Replikationszyklus der Zelle nachgeahmt. Die Zahl der<br />
DNA-Moleküle verdoppelt sich bei jedem Zyklus, so dass eine DNA-Sequenz bis zu 10 9 -fach<br />
vermehrt wird (exponentieller Anstieg).<br />
Für dieses Verfahren muss die zu amplifizierende Sequenz bekannt sein, so dass geeignete,<br />
sogenannte Oligonukleotid-Primer hergestellt werden können. Der Amplifikationsprozess<br />
besteht aus drei, sich wiederholenden Stufen. Zunächst wird die doppelsträngige DNA bei<br />
hoher Temperatur (94-96°C) in zwei Einzelstränge zerlegt (Denaturierung). Anschließend<br />
binden bei niedriger Temperatur die Oligonukleotid-Primer an komplementäre Sequenzen an<br />
3’-Grenzen der jeweiligender DNA-Einzelstränge (Annealing). Durch eine DNA-Polymerase<br />
werden die Primer verlängert (Primer-Extension). Danach kann der Zyklus <strong>von</strong> neuem<br />
beginnen. Da der erste Schritt der PCR eine hohe Temperatur erfordert, können nur<br />
thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden. In den meisten Fällen wird daher die<br />
sogenannte Taq-Polymerase aus Thermophilus aquaticus verwendet, die bei höheren<br />
Temperaturen (ca. 70°C) aktiv ist. Oft werden zusätzliche Polymerasen mit sogenannter<br />
„proof reading“-Aktivität in der PCR eingesetzt. Diese verhindern Fehler bei der<br />
Extensionsreaktion, indem sie durch die Taq-Polymerase eingebaute Fehler in den<br />
synthetisierten Sequenzen korregieren. Die Fehlerquote wird dadurch auf 1/10 verringert.<br />
Dies erlaubt die Amplifikation <strong>von</strong> Sequenzen mit einer Länge <strong>von</strong> bis zu 15 kbp.<br />
Expand TM Long Template PCR (Roche Pharma)<br />
10x PCR-Puffer: 13-22.5 mM MgCl 2 , 500 mM Tris/HCl, pH9.2, 160 mM (NH 4 ) 2 SO 4<br />
Polymerase-Mix:<br />
10x dNTP-Mix<br />
Taq-Polymerase,<br />
Pwo-Polymerase aus Pyrococcus woesei (Korrekturenzym)<br />
jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP<br />
Es werden 4.5 µl des 10x PCR-Puffers mit 4 µl 10x dNTP-Mix, 5 µl Primer A (10 pmol/µl), 5<br />
µl Primer B (10 pmol/µl) und 5 µl DNA-Templat (100 pg Plasmid oder 100 ng HMW-DNA)<br />
in einem Gesamtvolumen <strong>von</strong> 45 µl in einem sterilen PCR-Reaktionsgefäß vermischt. Der<br />
Ansatz wird in eine PCR-Maschine auf 95°C für 4-6 min erhitzt. Dann wird der Ansatz bei<br />
68°C für 10 min inkubiert. In dieser Zeit erfolgt die Zugabe der Polymerasen (0.7 µl<br />
Polymerase-Mix, 0.5 µl 10x PCR-Puffer, 3.8 µl H 2 O). Anschließend beginnt die eigentliche
4 Material und Methoden 77<br />
PCR in den beschriebenen drei Stufen, hier als Beispiel: Denaturierung bei 95°C für 30-60<br />
sec, Annealing der Primer bei 40-60°C für 60 sec, Extension bei 68°C. Die Dauer des<br />
letzteren Schrittes hängt <strong>von</strong> der Länge der zu amplifizierenden Sequenz ab (ca. 1000 bp pro<br />
60 sec). Die Annealing-Zeit wird durch die Primer-Länge (15-30 bp) und den GC-Gehalt<br />
(Optimum bei ca. 50%) bestimmt. Der Zyklus wird 25- bis 35-mal wiederholt. In den meisten<br />
Fällen wird anschließend ein einzelner Elongationsschritt bei 68°C für 7-10 min durchgeführt.<br />
4.4.7 Agarose-Gelelektrophorese<br />
TAE-Puffer:<br />
5x Probenpuffer:<br />
40 mM Tris/Acetat, pH7.5, 20 mM NaOAc, 1 mM EDTA<br />
15% Ficoll, 50 mM EDTA, 1x TAE, 0.05% Bromphenolblau,<br />
0.05% Xylencyanol<br />
Zur Anfertigung eines 1%igen Gels wird 1 g Agarose in 100 ml kochendem TAE-Puffer<br />
gelöst. Die flüssige Agarose wird mit 1 µl Ethidiumbromid-Lösung (5 mg/ml) versetzt und in<br />
eine Gelkammer mit Kämmen <strong>zur</strong> Formung <strong>von</strong> Geltaschen gegossen. Nach dem Abkühlen<br />
und gleichzeitigem Erstarren der Agarose wird die Gelkammer in eine mit TAE-Puffer<br />
gefüllte Elektrophorese-Kammer gesetzt. Vor dem Auftragen der Proben werden diese mit 1/5<br />
Volumen des 5x Probenpuffer vermischt und bei 65°C für 10 min inkubiert. Zur Abschätzung<br />
der Größe <strong>von</strong> DNA-Fragmenten wird neben den Proben ein Größenmarker aufgetragen. Die<br />
Elektrophorese erfolgt bei ca. 100 V und 30 mA. Anschließend können die aufgetrennten<br />
DNA-Fragmente unter UV-Licht (360 nm) betrachtet werden. Zur präparativen Gewinnung<br />
<strong>von</strong> DNA-Fragmenten werden diese aus dem Gel geschnitten und unter Zuhilfenahme des<br />
„QIAquick“-Kits isoliert.<br />
4.4.8 Isolierung <strong>von</strong> DNA aus Agarosegelen (QIAquick-Kit, Quiagen)<br />
Die zu isolierende DNA wird aus dem Agarose-Gel geschnitten. Das Gelstück wird unter<br />
Hochsalzbedingungen bei 50°C für 10 min geschmolzen. Die Lösung wird auf eine Silica-<br />
Membran gegeben und bei 13.000 rpm für 1 min abzentrifugiert. Dabei bindet die DNA an<br />
die Säulenmatrix, während die Agarose-Salz-Lösung sedimentiert. Nach Waschen der Säule<br />
mit einem Ethanol-haltigem Puffer kann die DNA mittels TE-Puffer oder H 2 O durch<br />
Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min eluiert werden.<br />
4.5 Radioaktive Detektionsmethoden<br />
4.5.1 Random priming mit „Rediprime DNA Labelling System” (Amersham Life<br />
Science)<br />
Labelling-Mix:<br />
dATP, dGTP, dTTP, exonukleasefreies Klenow-Enzym,<br />
Oligonukleotidprimer (9mer)<br />
Es werden 2.5-100 ng DNA (z.B. Probe für Southern Blot Analyse) in einem Gesamtvolumen<br />
<strong>von</strong> 45 µl sterilem H 2 O aufgenommen und bei 95°C im Wasserbad für 5 min erhitzt. Die<br />
Lösung wird in einem Eisbad abgekühlt und anschließend zum Labelling-Mix gegeben. Nach
4 Material und Methoden 78<br />
Zugabe <strong>von</strong> 5 µl α- 32 P-dCTP wird der Ansatz bei 37°C für 10-30 min inkubiert. Die Reaktion<br />
wird durch 2 µl 0.5 M EDTA abgestoppt. Die markierte DNA wird über Micro-Spin TM G50-<br />
Säulen (Pharmacia Biotech) <strong>von</strong> nicht eingebauten Nukleotiden abgetrennt. Dazu wird der<br />
Reaktionsansatz auf die Säule gegeben und bei 2800 rpm für 2 min zentrifugiert. Für den<br />
Einsatz in Southern Blot Analysen wird die DNA durch Erhitzen bei 95°C im Wasserbad für<br />
5 min und anschließender Abkühlung im Eisbad denaturiert.<br />
4.5.2 Klenow-Markierung<br />
10x dNTP-Mix<br />
jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP<br />
Zur Größenbestimmung <strong>von</strong> Fragmenten im Southern Blot wird eine mit 35 S-dATP markierte,<br />
HindIII/EcoRI-verdaute λ-DNA eingesetzt. Dieser Größenmarker wird durch eine<br />
Auffüllreaktion mit dem Klenow-Enzym hergestellt. Dazu werden ca. 1 µg λ-DNA in einem<br />
Gesamtvolumen <strong>von</strong> 20 µl mit 2 µl 10x dNTP-Mix, 4 µl α- 35 S-dATP (>1000 Ci/mmol) und 2<br />
U Klenow-Enzym versetzt. Nach Inkubation bei 37°C für 1 h wird die Reaktion mit 20 µl<br />
Stop-Lösung (0.5 M EDTA) abgebrochen und die DNA über eine Sephadex G50-Säule<br />
aufgereinigt.<br />
4.5.3 Southern-Blot Analyse<br />
4.5.3.1 Isolierung <strong>von</strong> hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen<br />
„Modified Bradleys“-<br />
Lösung:<br />
Natriumacetat-Lösung:<br />
10 mM Tris/HCl, pH/.5, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5% SDS,<br />
1 mg/ml Proteinase K<br />
75 mM Natriumacetat in Ethanol<br />
Die Zellen einer konfluent bewachsenen 9.1 cm 2 Kulturplatte werden mit PBS gewaschen und<br />
in 0.5 ml „Modified Bradleys“-Lösung aufgenommen. Die Lösung wird in ein Eppendorf-<br />
Gefäß überführt und bei 55°C über Nacht inkubiert. Anschließend wird die DNA der Zellen<br />
durch Inkubation mit 1 ml Natriumacetat-Lösung für 2-3 h bei RT gefällt und durch<br />
Zentrifugation bei 5000 rpm für 5 min pelletiert. Die DNA wird durch Zugabe <strong>von</strong> 0.5 ml<br />
70%igem Ethanol für 30 min gewaschen und anschließend erneut bei 5000 rpm für 5 min<br />
abzentrifugiert. Der Waschschritt wird wiederholt, bevor die DNA nach Trocknen bei RT für<br />
10 min in 30 µl TE-Puffer aufgenommen werden kann. Die isolierte HMW-DNA kann direkt<br />
in Southern-Blot Analysen oder für andere Untersuchungen (z.B. RT-PCR) eingesetzt<br />
werden.<br />
4.5.3.2 Enzymatischer Verdau der hochmolekularen DNA (HMW-DNA)<br />
Es werden 8-10 µg der aufgereinigten HMW-DNA in einem Gesamtvolumen <strong>von</strong> 20 µl mit 2<br />
µl 10x Restriktionspuffer, 0.5 µl RNase (10 µg/ml), 0.5 µl BSA (100x) und 20-40 U<br />
Restriktionsenzym versetzt. Anschließend erfolgt die Inkubation des Reaktionsansatzen bei<br />
entsprechender, vom Restriktionsenzym abhängiger Reaktionstemperatur über Nacht. Die<br />
restriktierte DNA wird mit 8 µl 6x Probenpuffer versetzt und auf einem 0.8%igem Agarose-
4 Material und Methoden 79<br />
Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Als Größenmarker wird eine<br />
HindIII/EcoRI-verdaute λ-DNA eingesetzt.<br />
35 S-markierte, mit<br />
4.5.3.3 DNA-Transfer<br />
Die elektrophoretisch aufgetrennte DNA wird auf eine positiv geladene Nylonmembran<br />
(Hybond-XL oder -N + , Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Dazu wird das Agarose-<br />
Gel zuerst in 0.4 M NaOH-Lösung neutralisiert. Für den Transfer langer DNA-Fragmente (>5<br />
kb) empfiehlt sich eine vorherige Depurinierung mittels 0.25 M HCl für ca. 30 min, da die<br />
DNA-Fragmente während des alkalischen Transfers in Teilfragmente zerfallen und somit aus<br />
dem Gel austreten können. Das Gel wird mit der Oberseite auf exakt zugeschnittene, feuchte<br />
Filterpapierstreifen (Whatman 3MM), dessen Ränder in 0.4 M NaOH eintauchen, gelegt. Die<br />
Unterseite des Gels wird mit der Nylonmembran bedeckt. Auf diese werden zwei Lagen<br />
weiteres, feuchtes Filterpapier, eine Lage trockenes Filterpapier und ein Stapel mit<br />
saugfähigem Papier gelegt. Die Apparatur wird mit ca. 500 g Gewicht beschwert.<br />
Nach ca. 6 h ist der DNA-Transfer vom Gel auf die Nylonmembran abgeschlossen. Die<br />
Nylonmembran wird in 2x SSC neutralisiert und bei 80°C für 2 h inkubiert.<br />
4.5.3.4 Hybridisierung der restriktierten HMW-DNA<br />
Hybridisierungslösung:<br />
Waschlösung A:<br />
Waschlösung B:<br />
1 M NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH7.5, 10% Dextransulfat, 1% SDS, 250<br />
µg/ml Salmon Sperm DNA (sonifiziert) (Lagerung bei -20°C)<br />
2x SSC, 0.5% SDS<br />
1x SSC, 0.1% SDS<br />
Es werden 20 ml der Hybridisierungslösung bei 65°C im Wasserbad aufgetaut, bei 95°C im<br />
Wasserbad für 10 min erhitzt und wieder auf 65°C abgekühlt. Die Lösung wird in eine<br />
Glasröhre für den Hybridisierungsofen überführt. Außerdem wird die Nylonmembran mit<br />
restriktierter HMW-DNA mit der DNA-freien Seite an die Innenwand der Glasröhre gelegt.<br />
Dann wird eine denaturierte, radioaktiv-markierte Probe in die Glasröhre gegeben. Die<br />
Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 65°C im Hybridisierungsofen.<br />
Anschließend wird die Nylonmembran bei RT für 5 min, bei 65°C für 30 min und bei 65°C<br />
für 5 min mit Waschlösung A gewaschen. Bei hoher Strahlung der Membran empfiehlt sich<br />
ein Waschschritt bei 65°C für 30 min mit Waschlösung B. Die Membran wird dann feucht in<br />
Folie verpackt und in eine Expositionskassette (Phosphoimager) gelegt.<br />
4.5.3.5 Rehybridisierung der restriktierten HMW-DNA<br />
Die Nylonmenbran wird mit kochendem 0.5%igem SDS für ca. 30 min bis Erreichen <strong>von</strong> RT<br />
gewaschen. Dabei wird die an DNA-Fragmenten auf der Membran gebundene radioaktivmarkierte<br />
Probe abgelöst. Die Vollständigkeit dieses Prozesses wird durch Exposition<br />
sichergestellt. Anschließend kann die Nylonmembran für eine weitere Hybridisierung<br />
verwendet werden.
4 Material und Methoden 80<br />
4.6 Arbeiten mit E.coli<br />
4.6.1 Verwendete Bakterienstämme<br />
XL1-Blue:<br />
DH10B:<br />
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,<br />
lac [F´ proAB, lacI q Z)M15, Tn10, (tet r )], (Bullock, 1987)<br />
F’, mcrA )-(mrr hsdRMS-mcrBC), N80dlacZ)M15, )lacX74, deoR,<br />
recA1, ara)139, )(ara, leu)7697, galU, galK, λ - , rpsL, end A1, nupG<br />
(Gibco BRL)<br />
4.6.2 Medien<br />
LB-Medium:<br />
Ampicillin:<br />
Kanamycin:<br />
SOG-Medium:<br />
10 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl<br />
50 mg/ml Ampicillin in Ethanol, sterilfiltriert<br />
100 mg/ml Kanamycin in H 2 O, sterilfiltriert<br />
20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl,<br />
2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM Glucose<br />
(MgSO 4 und Glucose werden vor Gebrauch zugesetzt)<br />
4.6.3 Herstellung <strong>von</strong> Agarplatten<br />
Es werden 15 g Agar (Difco) zu 1 l LB-Medium gegeben und aufgekocht. Nach Abkühlen der<br />
Agar-Lösung werden für Ampicillin-haltige Agarplatten 1 ml Ampicillin-Lösung (50 mg/ml),<br />
für Kanamycin-haltige Platten 0.5 ml Kanamycin-Lösung (100 mg/ml) <strong>zur</strong> Agar-Lösung<br />
gegeben und diese auf Bakterienplatten verteilt.<br />
4.6.4 Herstellung elektrokompetenter Bakterien<br />
Die Bakterien werden in 5 bis 10 ml LB-Medium unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C über<br />
Nacht vorkultiviert. Am nächsten Tag wird die Bakterienkultur zu 1 l LB-Medium gegeben<br />
und abermals unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C kultiviert. Zwischenzeitlich wird <strong>von</strong> der<br />
Bakteriensuspension der O.D.-Wert bei 600 nm im Photometer bestimmt. Wird ein O.D.-Wert<br />
<strong>von</strong> ca. 0.6 bis 0.8 erreicht, hat die exponentielle Wachstumsphase ihr Ende erreicht. Die<br />
Inkubation wird beendet, indem die Bakteriensuspension in vorgekühlten Zentrifugenbecher<br />
gegeben und die Bakterien durch 10 minütige Zentrifugation bei 3000 rpm (GS3-Rotor) und<br />
4°C als Pellet abgetrennt werden. Nach Resuspension in kaltem, sterilem Wasser und<br />
wiederholter Zentrifugation werden die Bakterien in 20 ml kalter, 10%iger Glycerin-Lösung<br />
aufgenommen und 15 min bei 3500 rpm (SS34-Rotor) und 4°C zentrifugiert. Die Bakterien<br />
werden anschließend in 2 bis 3 ml kalter, 10%iger Glycerin-Lösung resuspendiert, in Aliquots<br />
zu 50 µl in Eppendorf-Gefäße überführt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei<br />
-70°C gelagert. Anschließend kann die Kompetenz der Bakterien bestimmt werden. Dazu<br />
wird eine definierte Menge eines Standard-Plasmides in die Bakterien transformiert
4 Material und Methoden 81<br />
(Kap.4.6.5) und anhand der nach Ausplattierung auf Agarplatten erhaltenen Klonzahlen die<br />
Transformationseffizienz berechnet, die bei 10 9 bis 10 10 Transformanten pro µg<br />
transformierter DNA liegen sollte.<br />
4.6.5 Elektrotransformation kompetenter Bakterien<br />
Durch ein elektrisches Feld, welches kurzfristig durch Anlegen einer hohen Spannung<br />
entsteht und dessen Feldstärke dann exponentiell abnimmt, kann die Membran der Zielzellen<br />
depolarisiert werden, so dass Löcher in der Membran entstehen. Durch diese können die<br />
einzuschleusenden DNAs, aber auch andere Makromoleküle in das Zellinnere gelangen.<br />
Es werden 50 µl kompetente Bakterien aufgetaut, auf Eis gestellt und mit ca. 1 µl verdünnter<br />
DNA-Lösung oder Ligationsansatz versetzt, vermischt und in eine vorgekühlte<br />
Transformationsküvette mit 0.2 cm Elektrodenabstand gegeben. Diese wird in der Gene-<br />
Pulser-Apparatur einem elektrischen Feld (2.5 kV, 25 µF, 200 Ω) ausgesetzt. Die Impulsdauer<br />
sollte bei 4 bis 5 ms liegen. Sofort nach Transformation werden die Bakterien in 1 ml SOG-<br />
Medium aufgenommen und 30 min unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C inkubiert.<br />
Anschließend werden Aliquots der Bakterienkultur auf Agarplatten mit Selektionsmedium<br />
ausplattiert und diese über Nacht bei 37°C bis <strong>zur</strong> Klonbildung kultiviert.<br />
4.6.6 Konservierung <strong>von</strong> Bakterien<br />
Zur kurzfristigen Lagerung werden Bakterien mit einer Impföse auf Agarplatten<br />
ausgestrichen. Nach Inkubation der Platte bei 37°C über Nacht wird diese bei 4°C<br />
aufbewahrt. Für eine langfristige Lagerung werden Bakterien über Nacht in LB-Medium unter<br />
Schütteln (180 rpm) bei 37°C kultiviert. Die Bakteriensuspension wird im Verhältnis 1:1 mit<br />
87%iger Glycerin-Lösung vermischt und in Glasgefäßen bei -20°C oder -70°C aufbewahrt.<br />
4.6.7 Isolierung <strong>von</strong> Plasmid-DNA aus Bakterien im analytischen Maßstab<br />
STET-Puffer:<br />
80 g/l Sucrose, 0.5% Triton X100, 50 mM EDTA,<br />
10 mM Tris/HCl (pH 8.0) in H 2 O<br />
TE-Puffer: 0.1 mM EDTA, 10mM Tris/HCl in H 2 O, pH 8.0<br />
0.2<br />
Lysozym: 10 mg/ml Lysozym in TE-Puffer<br />
Ammoniumacetat: 8 M NH 4 Oac in H 2 O<br />
TE-RNase:<br />
10 µg/ml RNase A in TE-Puffer<br />
Es werden 2 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum mit den zu untersuchenden<br />
Bakterien angeimpft und diese für 4 bis 16 Stunden unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C<br />
kultiviert. Die Bakterien werden in Eppendorfgefäßen 1 min bei 5000 rpm abzentrifugiert und<br />
anschließend in 500 µl STET-Puffer resuspendiert und mit 50 µl Lysozym-Lösung versetzt.<br />
Nach 2 bis 3 minütiger Inkubation bei RT werden die Bakterien 90 s in einen 95°C heißen<br />
Thermoblock erhitzt und anschließend 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Das zähflüssige<br />
Pellet wird mit Hilfe eines Zahnstochers entfernt. Die klare Lösung wird mit 50 µl
4 Material und Methoden 82<br />
Ammoniumacetat-Lösung und 500 µl Isopropanol vermischt und erneut 5 min bei 14.000 rpm<br />
zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird nach kurzem Trocken bei RT in 50 bis 100 µl TE-RNase-<br />
Lösung aufgenommen.<br />
4.6.8 Isolierung <strong>von</strong> Plasmid-DNA aus Bakterien im präparativen Maßstab<br />
(QUIAGEN)<br />
Resuspensionspuffer:<br />
Lysepuffer:<br />
Neutralisierungspuffer:<br />
50 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A<br />
200 mM NaOH, 1% (w/v) SDS<br />
3.0 M Kaliumacetat, pH5.5<br />
Äquilibrierungspuffer: 750 mM NaCl, 50 mM MOPS pH 7.0,<br />
15% (v/v) Isopropanol, 0.15% TritonX100<br />
Waschpuffer:<br />
Elutionspuffer:<br />
1.0 M NaCl, 50 mM MOPS pH 7.0, 15% (v/v) Isopropanol<br />
1.25 M NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.5, 15% (v/v) Isopropanol<br />
Es werden 200 ml (Midi-Präparation) bzw. 500 ml (Maxi-Präparation) Antibiotika-haltiges<br />
LB-Medium mit den Bakterien angeimpft und über Nacht unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C<br />
inkubiert. Am nächsten Tag werden die Bakterien 10 min bei 6.000 x g und 4°C zentrifugiert<br />
und in 4 ml bzw. 10 ml Resuspensionspuffer aufgenommen. Die Bakteriensuspension wird<br />
vorsichtig bei RT mit 4 ml bzw. 10 ml Lysepuffer versetzt. Die Lysierung der Bakterien wird<br />
nach 5 min durch Zugabe <strong>von</strong> 4 ml bzw. 10 ml Neutralisierungspuffer abgebrochen Nach<br />
weiteren 20 min Inkubation auf Eis werden die bakteriellen Bestandteile durch 30 minütige<br />
Zentrifugation bei 20.000 x g und 4°C abgetrennt. Der Überstand mit Plasmid-DNA wird<br />
über Filter auf eine mit 4 ml bzw. 10 ml Äquilibrierungspuffer vorbehandelte<br />
Anionenaustauschersäule gegeben, die Plasmid-DNA bei bestimmter Salzkonzentration und<br />
pH-Wert binden kann. Zur Entfernung <strong>von</strong> RNA, Proteinen und niedermolekularen<br />
Verbindungen wird die Säule zweimal mit 10 ml bzw. 30 ml Waschpuffer gewaschen.<br />
Anschließend wird die gebundene Plasmid-DNA mit 5 ml bzw. 10 ml Elutionspuffer eluiert<br />
und in3.5 ml bzw. 10.5 ml Isopropanol gefällt. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 15.000 x<br />
g und 4°C wird die DNA mit 70%igem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach<br />
Trocknung wird die Plasmid-DNA in TE oder H 2 O aufgenommen.
4 Material und Methoden 83<br />
4.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen<br />
4.7.1 Verwendete <strong>Zelllinien</strong><br />
NIH3T3<br />
D3<br />
IB10<br />
embryonale Mausfibroblasten-Zelllinie (ATCC CRL-1658)<br />
murine embryonale Stammzelllinie<br />
murine embryonale Stammzelllinie, Subklon der Linie E14<br />
CCE murine embryonale Stammzelllinie (Robertson et al., 1986)<br />
MEF<br />
embryonale Mausfibroblasten (Feeder-Zellen), G418-resistent<br />
4.7.2 Grundmedien<br />
DMEM-Grundmedium<br />
(Dulbecco’s Modification of Eagle’s<br />
Medium)<br />
PBS<br />
(Phosphate buffered saline)<br />
13.63 g/l DMEM-Pulver; 3.67 g/l (44mM) NaHCO 3 ;<br />
2.6 g/l (10mM) HEP<strong>ES</strong>; pH 7.2<br />
8 g/l (140mM) NaCl; 0.2<br />
TEP<br />
100x Pen/Strep<br />
100x Glutamin<br />
100x Natriumpyruvat<br />
Gelatine-Lösung<br />
FCS<br />
<strong>ES</strong>GRO (Lif)<br />
G418<br />
Erythromycin<br />
Pristinamycin<br />
Doxycyclin<br />
6 mM EDTA, 0.1-0.2% Trypsin (Gibco) in PBS<br />
6.06 mg/ml Ampicillin (10000 U/ml), 10 mg/ml Streptomycin<br />
(10mg/ml), zum Lösen mit NaOH auf pH7.4 einstellen<br />
(Lagerung bei –20°C)<br />
29,23 mg/ml Glutamin (Lagerung bei –20°C)<br />
100 mM Natriumpyruvat<br />
0.1% (w/v) Gelatine in PBS oder H 2 O, autoklaviert<br />
JRH Bioscience<br />
10 6 U/ml (Chemicon International, Inc.)<br />
100 mg/ml G418 in H 2 O, sterilfiltriert<br />
10 µg/µl Erythromycin in Ethanol<br />
1.5 µg/µl Pristinamycin in DMSO<br />
1 mg/ml Doxycyclin in 70% Ethanol, sterilfiltiriert<br />
(Lagerung bei –20°C)<br />
1000x β-Mercapthoethanol 100 mM Mercapthoethanol (7.014 µl pro 1 ml H 2 O)
4 Material und Methoden 84<br />
4.7.3 Kulturmedien<br />
für NIH3T3-Zellen:<br />
für <strong>ES</strong>-Zellen:<br />
für Feeder-Zellen:<br />
1x Pen/Strep, 1x Glutamin, 10% (v/v) FCS (aktiv)<br />
DMEM-Grundmedium<br />
1x Pen/Strep, 1x Glutamin<br />
1x nichtessentielle Aminosäuren<br />
1x Natriumpyruvat, 15% (v/v) FCS (inaktiv*)<br />
1x β-Mercaapthoethanol<br />
DMEM-Grundmedium<br />
0.1% (v/v) <strong>ES</strong>GRO<br />
1x Pen/Strep, 1x Glutamin<br />
1x nichtessentielle Aminosäuren<br />
1x Natriumpyruvat, 10% (v/v) FCS (inaktiv*)<br />
1x β-Mercaapthoethanol<br />
DMEM-Grundmedium<br />
4.7.4 Gelatinierung <strong>von</strong> Zellkulturgefäßen<br />
*Das FCS wird durch Inkubation bei 56°C für 30 min inaktiviert.<br />
Für die Anheftung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen in Kulturgefäßen muss der Boden der Gefäße mit Gelatine<br />
beschichtet sein. Dazu werden die Kulturgefäße mit 0.1%iger Gelatine-Lösung bedeckt und<br />
für mindestens 30 min im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Vor der Aussaat der <strong>ES</strong>-Zellen<br />
wird die überschüssige Gelatine-Lösung entfernt.<br />
4.7.5 Präparation <strong>von</strong> Zellkulturgefäßen mit Feeder-Zellen<br />
<strong>ES</strong>-Zellen der Linie D3 und IB10 werden auf Zellkulturgefäßen, die mit Feeder-Zellen<br />
beschichtet sind, kultiviert. Dafür muss jedoch die Teilungsfähigkeit der Feeder-Zellen<br />
aufgehoben werden. Dazu werden die Zellen in der Strahlenquelle (204.6 Gy/h) für 520 s, was<br />
einer Strahlendosis <strong>von</strong> ca. 3000 rad entspricht, bestrahlt. Die bestrahlten Feeder werden in<br />
flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Für die Anheftung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-Zellen in Kulturgefäßen wird<br />
der Zellgefäßbodens mit Feederzellen beschichtet (ca. 2.5⋅10 4 Zellen/cm 2 ).<br />
4.7.6 Zählung <strong>von</strong> Zellen<br />
NIH3T3- und Feeder-Zellen können mit dem automatischen Zellzähler CASY1 gezählt<br />
werden. <strong>ES</strong>-Zellen lassen sich aufgrund ihrer geringeren Größe nur mit einer Neubauer- bzw.<br />
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer zählen.<br />
4.7.7 Kultivierung <strong>von</strong> Zellen<br />
Die Zellen werden in geeigneten Kulturgefäßen bei 37°C und 5% CO 2 in einem nassbegasten<br />
Brutschrank in entsprechendem Medium kultiviert. Je nach Zelldichte wird nach 2 bis 5<br />
Tagen das Medium gewechselt. Spätestens nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen<br />
passagiert.
4 Material und Methoden 85<br />
4.7.8 Passagieren <strong>von</strong> Zellen<br />
Nach Waschen der Zellen mit PBS werden diese mit TEP überschichtet und für wenige<br />
Minuten inkubiert. Dadurch lösen sich die Zellen vom Boden des Kulturgefäßes ab. Zur<br />
Inaktivierung des Trypsins wird die Zellsuspension mit mindestens der doppelten Menge an<br />
serumhaltigen Kulturmedium versetzt und resuspendiert. Die Zellsuspension kann in<br />
gewünschter Konzentration in Aliquots auf andere Kulturgefäße überführt werden.<br />
4.7.9 Langzeitlagerung <strong>von</strong> Zellen<br />
Logarithmisch wachsende Zellen einer kleinen Flasche (ca. 3⋅10 6 Zellen) werden mit PBS<br />
gewaschen, trypsiniert und in Medium aufgenommen. Die Zellen werden 5 min bei 1000 rpm<br />
zentrifugiert und anschließend in 2 ml kaltem FCS mit 0.5% DMSO resuspendiert. Verteilt in<br />
Aliquots auf Kryo-Röhrchen (Bio-Freeze-Vials, Fa. Costar) werden die Zellen für maximal 60<br />
min auf Eis, danach für 24 h bei -70°C und anschließend dauerhaft in flüssigem Stickstoff<br />
gelagert. Das Auftauen der Zellen erfolgt im 37°C-Wasserbad. Zur Entfernung des DMSO<br />
werden die Zellen in Kulturmedium aufgenommen, für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und<br />
anschließend wiederum in Kulturmedium resuspendiert. Danach können die Zellen auf<br />
Kulturgefäße ausgesät werden.<br />
4.7.10 Gentransfer-Methoden<br />
Zum Einbringen <strong>von</strong> Fremd-DNA in eukaryontische Zellen mit dem Ziel einer stabilen<br />
Integration eines Transgens in das Genom der Zellen, für einen Kassettenaustausch bzw. <strong>zur</strong><br />
zeitweiligen Expression eines Transgens können unterschiedlichen Transfektionssysteme<br />
angewendet werden.<br />
4.7.10.1 Transfektion mittels Calciumphosphat/DNA-Präzipitation<br />
Einen Tag vor Transfektion wird eine definierte Anzahl zu transfizierender Zellen in<br />
Kulturflaschen oder Mehrlochplatten ausgesät, abhängig <strong>von</strong> der Art des Experimentes und<br />
des Zelltyps. Am nächsten Tag wird mindestens 4 h vor Transfektion das Kulturmedium<br />
gewechselt. In einem PP-Röhrchen werden 2fach konzentrierter HEBS-Puffer und in einem<br />
weiteren PP-Röhrchen in gleicher Volumenmenge zirkuläre oder linearisierte DNA (bei<br />
geringen DNA-Mengen gegebenenfalls zusätzlich hochmolekulare, sogenannter Carrier-<br />
DNA), CaCl 2 -Lösung und H 2 O vorgelegt. Letzteres Gemisch wird unter Vortexen zum<br />
HEBS-Puffer getropft. Es kommt zu einer sichtbaren Bildung <strong>von</strong> Präzipitaten aus DNA und<br />
Calciumphosphat. Nach 5 bis 15 min bei Raumtemperatur wird die Präzipitat-Suspension in<br />
das Kulturmedium der Zellen überführt. Am nächsten Tag werden überschüssige Präzipitate<br />
durch Wechsel des Mediums entfernt.<br />
HEBS-Puffer: 280 mM NaCl, 50 mM HEP<strong>ES</strong>, 1.5 mM Na 2 HPO 4 in H 2 O, pH 7.1<br />
CaCl 2 -Lösung:<br />
2.5 M CaCl 2 in H 2 O
4 Material und Methoden 86<br />
Zelllinie für: Aussaat <strong>von</strong>: auf: Transfektion<br />
(Zellen) 2xHEBS CaCl 2 Σ<br />
stabile Expression 1⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl<br />
NIH3T3 transiente Expression 1⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl<br />
Kassettenaustausch 6⋅10 5 10cm-Platte 906 µl 90.6 µl 1812 µl<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
transiente Expression 5 - 7.5⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl<br />
4.7.10.2 Transfektion mittels Elektroporation<br />
Das zu transfizierende Plasmid wird mit geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert und<br />
aufgereinigt. Die zu transfizierenden Zellen werden mit PBS gewaschen, mit TEP gelöst und<br />
in Medium aufgenommen. Nach Bestimmung der Zellkonzentration wird eine definierte<br />
Anzahl <strong>von</strong> Zellen 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und dann in maximal 700 µl PBS oder<br />
serumfreien Medium aufgenommen. Nach Zugabe der DNA wird die Zellsuspension in eine 4<br />
mm Elektroporationsküvette überführt und in der Elektroporationskammer (Biorad Gene<br />
Pulser) elektroporiert. Anschließend werden die elektroporierten Zellen unverzüglich mit<br />
Kulturmedium versetzt und auf 10cm-Kulturplatten ausgesät. Nach 24 h erfolgt der erste<br />
Mediumwechsel.<br />
Zelllinie Zellzahl: DNA-Menge Spannung Kapazität<br />
NIH3T3 1⋅10 6 10 µg 250V/cm 500 µF<br />
D3<br />
IB10<br />
CCE<br />
5⋅10 6 - 1⋅10 7 5 - 10 µg 240V/cm 475 µF<br />
4.7.10.3 Stabile Expression – Selektion <strong>von</strong> G418-resistenten Zellklonen<br />
Zwei Tage nach Transfektion/Elektroporation beginnt die Selektion <strong>von</strong> stabil transfizierte<br />
Zellen durch Verwendung eines Selektionsmediums. Die nach Calciumphosphat-Methode<br />
transfizierten Zellen werden gleichzeitig in Aliquots auf großflächigere Kulturgefäße<br />
passagiert. Die Selektion mit G418 ist nach 7 bis 12 Tagen abgeschlossen, und es können<br />
resistente Klone isoliert werden. Diese werden zuvor unter dem Mikroskop markiert. Dann<br />
werden die Klone mit PBS gewaschen und mit wenig PBS überschichtet. Mittels einer 20µl-<br />
Pipette werden die Zellen der Klone vorsichtig abgelöst und auf 96-Loch-Platten mit 20 µl<br />
TEP pro Loch passagiert. Anschließend werden die trypsinierten Zellen in 100 µl Medium<br />
resuspendiert und auf eine weitere 96-Loch-Platte überführt. Kurz vor dem Erreichen der<br />
Konfluenz werden die Zellen auf nächstgößeren Mehrlochplatten ausgesät.<br />
Selektionsmedien <strong>zur</strong> Selektion G418-resistenter Zellklone:<br />
NIH3T3-Zellen:<br />
D3-Zellen:<br />
IB10-Zellen:<br />
CCE-Zellen:<br />
Kulturmedium für NIH3T3-Zellen mit 1000 µg/ml G418<br />
Kulturmedium für <strong>ES</strong>-Zellen mit 300 µg/ml<br />
Kulturmedium für <strong>ES</strong>-Zellen mit 350 µg/ml G418<br />
Kulturmedium für <strong>ES</strong>-Zellen mit 350 µg/ml G418
4 Material und Methoden 87<br />
In Abhängigkeit vom elektroporierten Vektor ist die Kultivierung der Zellen mit<br />
Selektionsmedium, welches Doxycyclin (2 µg/ml) enthält, erforderlich.<br />
4.7.10.4 Transiente Expression<br />
Zwei Tage nach Transfektion werden die Zellen mit PBS gewaschen und in 1 ml PBS gelöst.<br />
TEP wird nicht verwendet. Bei Bedarf wird die Zellzahl bestimmt. Die Zellsuspension wird<br />
anschliesend 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet kann bei -20°C gelagert oder<br />
direkt <strong>zur</strong> Untersuchung der Transgen-Expression weiterverarbeitet werden.<br />
In Abhängigkeit vom transfizierten Vektor und der Art des Experimentes ist die Kultivierung<br />
der Zellen mit Medium, welches Doxycyclin (2 µg/ml), Erythromycin (10 µg/ml) oder<br />
Pristinamycin (6 µg/ml) enthält, erforderlich.<br />
4.7.11 In vitro Differenzierung<br />
Differenzierungsmedium: 1x Pen/Strep, 1x Glutamin<br />
1x nichtessentielle Aminosäuren<br />
20% (v/v) FCS (aktiv)<br />
DMEM-Grundmedium<br />
Es werden <strong>ES</strong>-Zellen auf gelatinierten Zellkulturgefäßen ausgesät und wenigstens einen Tag<br />
vor dem Versuch in LIF-freiem Medium kultiviert. Es wird eine Zellkonzentration <strong>von</strong> 20000<br />
Zellen pro ml Differenzierungsmedium eingestellt. Für die in vitro Differenzierung <strong>von</strong> <strong>ES</strong>-<br />
Zellen nach der sogenannten Hanging-Drop Methode (Übersicht: Wobus et al., 2001) werden<br />
im ersten Schritt jeweils 20 µl (ca. 400 Zellen) dieser Zellsuspension als hängender Tropfen<br />
an den Deckel einer Bakterienplatte ausgesät. Die dadurch gebildeten Zellaggregate werden<br />
dann auf Bakterienplatten, danach auf gelatinierte Mehrloch-Platten <strong>zur</strong> weiteren Entwicklung<br />
ausgesät. In Abhängigkeit <strong>von</strong> Zeitpunkt und Dauer einer Retinsäure-Induktion können<br />
unterschiedliche Differenzierungsrichtungen induziert werden.<br />
4.8 Proteinanalytik<br />
4.8.1 Aufschluss <strong>von</strong> Zellen<br />
Zur Bestimmung der Expressionshöhe <strong>von</strong> Reportergenen wie Luciferase und β-<br />
Galactosidase und <strong>zur</strong> Normierung der gemessenen Reporter-Aktivitäten auf die<br />
Proteinmenge müssen die wasserlöslichen Proteine der Zellen isoliert werden. Die meistens<br />
<strong>von</strong> einer 6-Loch-Platte stammenden und als Pellet vorliegenden Zellen werden in maximal<br />
150 µl 250 mM Tris-Puffer pH7.6 resuspendiert. Anschließend werden die Zellen unter<br />
mehrmaligem Wechsel zwischen 37°C-Wasserbad und flüssigem Stickstoff-Bad<br />
aufgeschlossen („Freeze & Thaw Lyse“). Nach Zentrifugation für mindestens 10 min bei<br />
15.000 rpm und 4°C kann der Protein-haltige Zelllysatüberstand vermessen werden.
4 Material und Methoden 88<br />
4.8.2 Nachweis <strong>von</strong> β-Galactosidase<br />
4.8.2.1 Färbung <strong>von</strong> Zellen<br />
Fixierlösung:<br />
2% Formaldeyhd, 0.1% Glutaraldehyd in PBS<br />
Färbelösung: 5 mM K 3 Fe(CN) 6 , 5 mM K 4 FE(CN) 6 , 2 mM MgCl 2 ,<br />
100 µg/ml X-Gal (einzelne Komponenten als 100fach Stocklösung<br />
in PBS bzw. X-Gal in Dimethylformamid, Lagerung bei -20°C, für<br />
die Anwendung mit PBS verdünnen)<br />
Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und mit Fixierlösung für 2 min versetzt.<br />
Nach erneutem Waschen der Zellen mit PBS werden diese für 10 min in PBS inkubiert.<br />
Anschließend wird die Färbelösung auf die Zellen gegeben. Bereits nach 30 min Inkubation<br />
im Brutschrank bei 37°C kann die β-Galactosidase-Expression in Form <strong>von</strong> blaugefärbten<br />
Zellen unter dem Mikroskop beobachtet werden.<br />
4.8.2.2 Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivtät<br />
Die bakterielle β-Galactosidase kann das 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosid in Galactose<br />
und das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon spalten. Letzteres emittiert bei einer<br />
Anregungswellenlänge <strong>von</strong> 365 nm Licht der Wellenlänge <strong>von</strong> 450 nm. Die gemessene<br />
Lichtmenge ist direkt proportional <strong>zur</strong> β-Galactosidase-Aktivität und gibt daher die Höhe der<br />
β-Galactosidase-Expression in den Zellen wieder.<br />
Substratpuffer: 60 mM Na 2 H 2 PO 4 , 40 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM HCl, 1 mM MgSO 4 ,<br />
50 mM β-Mercapthoethanol<br />
MUG-Puffer:<br />
Reaktionspuffer:<br />
4-Methylbelliferryl-β-D-Galactosid in Dimethylformamid<br />
(Lagerung in Dimthylformamid bei -20°C)<br />
1/50 MUG-Puffer in Substratpuffer<br />
In einer 96-Loch Platte für optische Tests werden in den Löchern der ersten Reihe 180 µl<br />
bzw. 190 µl für die Messung der Aktivität des β-Galactosidase-Standards, in den restlichen<br />
Löchern jeweils 100 µl Substrat-Puffer vorgelegt. In die Löcher der ersten Reihe werden<br />
weiterhin 10 µl eines β-Galactosidase-Standards bzw. 20 µl des Zellüberstandes gegeben.<br />
Anschließend werden aus den Löchern der ersten Reihe 100 µl der Suspension entnommen<br />
und in je ein Loch der zweiten Reihe überführt. Diese 1:2 Verdünnung wird bis <strong>zur</strong> letzten<br />
Reihe fortgesetzt. Die sich nun in jedem Loch befindende 100 µl Protein-Verdünnung wird<br />
mit je 100 µl Reaktionspuffer versetzt. Anschließend wird nach Anregung mit 365 nm die<br />
Lichtemission bei 450 nm automatisch zum Zeitpunkt 0, 6 und 12 min gemessen (Wallace<br />
Victor 2 ). Die β-Galactosidase-Aktivität der Zellextrakte lässt sich anhand der<br />
β-Galactosidase-Standardreihe berechnen.
4 Material und Methoden 89<br />
4.8.3 Bestimmung der Luciferase-Aktivität<br />
Die Firefly-Luciferase aus Photinus pyralis (Leuchtkäfer) katalysiert die Oxidation des<br />
Luciferins in Oxyluciferin. Bei dieser Reaktion werden Photonen freigesetzt, die durch<br />
photodetektorische Messung Auskunft über die Höhe der Expression des Enzyms in<br />
untersuchten Zellen geben.<br />
Luciferase-Puffer:<br />
ATP-Lösung:<br />
Luciferin-Lösung<br />
Reaktionspuffer:<br />
25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO 4 in H 2 O, pH7.8<br />
5 mM ATP in H 2 O, pH7.5 (Lagerung bei -20°C)<br />
0.3 mM Luciferin (synthetisches D-Luciferin),<br />
25 mM Glycylglycin in H 2 O, pH7.8 (Lagerung bei -20°C)<br />
1/5 ATP-Lösung in Luciferase-Puffer<br />
Es werden 10 µl des Zelllysatüberstandes zu 400 µl Luciferase-Reaktionspuffers, vorgelegt in<br />
einem Messröhrchen, gegeben und direkt im Luminometer durch automatische Zugabe <strong>von</strong><br />
50 µl Luciferin-Lösung vermessen (Messdauer 10 sec). Die Luciferase-Aktivität wird auf die<br />
Proteinkonzentration oder die Zellzahl normiert (rlu).<br />
4.8.4 Proteinbestimmung nach Bradford<br />
Bradford-Lösung:<br />
Protein-Standard:<br />
0.07 mg/ml Coomassie Brilliantblau G250, 5% (v/v) Ethanol,<br />
8.5% (w/v) Phosphorsäure in H 2 O<br />
3 mg/ml Lysozym in H 2 0 (Lagerung bei -20°C)<br />
In einer 96-Loch Platte für optische Tests werden in den Löchern der ersten Reihe 190 µl, in<br />
den restlichen Löchern jeweils 100 µl H 2 O vorgelegt. In die Löcher der ersten Reihe werden<br />
weiterhin 10 µl eines Proteinstandards und 10 µl des Zellüberstandes gegeben. Anschließend<br />
werden aus den Löchern der ersten Reihe 100 µl der Suspension entnommen und in je ein<br />
Loch der zweiten Reihe überführt. Diese 1:2 Verdünnung wird bis <strong>zur</strong> letzten Reihe<br />
fortgesetzt. Die sich nun in jedem Loch befindende 100 µl Protein-Verdünnung wird mit je<br />
100 µl Bradford-Lösung versetzt. Anschließend wird die Absorption bei 595 nm gemessen<br />
(Labsystems Multiskan). Der Proteingehalt der Zellextrakte lässt sich anhand der Absorption<br />
des Proteinstandards (Eichgerade) bestimmen.
5 Vektoren und Oligonukleotide 90<br />
5 Vektoren und Oligonukleotide<br />
5.1 Vektoren<br />
5.1.1 Verwendete Vektoren<br />
pAPTKNEF Karreman et al. (1996)<br />
PLU Klehr et al. (1991)<br />
pBSRlucEFluc Hennecke et al. (2001)<br />
pBSRlucmuNFluc Oumard (2001)<br />
pCF133<br />
pCF138<br />
pEFLacZ<br />
pEGFP1<br />
pFGFUS<br />
pGL3basic<br />
pMT7PLNL2<br />
PRBT1<br />
pRBTTTA<br />
PSBC1Luc<br />
Fussenegger, ETH-Zürich<br />
Fux und Fussenegger (2003c)<br />
Hafner, GBF-Braunschweig<br />
Firma Clontech<br />
Seibler, GBF-Braunschweig<br />
Firma Promega<br />
Unsinger, GBF-Braunschweig<br />
Unsinger, GBF-Braunschweig<br />
Unsinger, GBF-Braunschweig<br />
W. Dirks, GBF-Braunschweig<br />
PSBC2 Dirks et al. (1993)<br />
pTARGET1<br />
PtTA2<br />
PtTA3<br />
PtTA4<br />
Verhoeyen, GBF-Braunschweig<br />
Firma Clontech<br />
Firma Clontech<br />
Firma Clontech<br />
PUHD15-1 Gossen und Bujard (1992)<br />
pUHrT62-1<br />
Urlinger et al. (2000b)
5 Vektoren und Oligonukleotide 91<br />
pZeosvlacZ<br />
Firma Invitrogen<br />
ROSA26-1 Soriano (1999)<br />
ROSA26-5’ Soriano (1999)<br />
5.1.2 Hergestellte Vektoren<br />
PSBC2Tkneo<br />
Das Tkneo-Gen wurde aus dem Vektor pAPTKNEF durch Restriktion<br />
mit EcoRI, gefolgt <strong>von</strong> einer Auffüllung der 5’-überstehenden Enden<br />
und eine Restriktion mit BglII entnommen. Das Plasmid pSBC2 wurde<br />
mit SalI linearisiert, gefolgt <strong>von</strong> einer Auffüllung der 5’-überstehenden<br />
Enden und einer Restriktion mit BamHI. Ansschließend wurde das<br />
Tkneo-Gen in den geöffneten Vektor inseriert.<br />
[SV40-Promotor]-[Tkneo]-[SV40-PolyA]<br />
PSBC2TkneoL Mittels der Primer Neo54/LoxP3H wurde aus dem Plasmid<br />
pMT7PLNL2 eine Sequenz amplifiziert, die das neo-Gen und am<br />
3’-Ende eine Wildtyp-loxP-Sequenz enthielt. Diese wurde mit PvuII<br />
und HindIII geschnitten und in den mit PvuII/HindIII geöffneten Vektor<br />
pSBC2Tkneo inseriert.<br />
[SV40-Promotor]-[Tkneo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
PSBC2TkneoLML<br />
Aus den Oligomeren MLNHEI5 und MLNHEI3 wurde mittels<br />
Oligohybridisierung ein DNA-Fragment geschaffen, das die Sequenz<br />
für die FRT-Mutante F5 und für die Wildtyp-LoxP-Site enthielt. Diese<br />
wurde in den mit SpeI geöffneten Vektor pSBC2TkneoL inseriert.<br />
[SV40-Promotor]-[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
pRBTTA<br />
Das Gen des Transaktivators tTA wurde aus dem Vektor pRBTTTA<br />
durch Restriktion mit EcoRI/HindIII entnommen und in den mit<br />
EcoRI/HindIII geöffneten Vektor pRBT1 inseriert. Das Transaktivator-<br />
Gen wurde somit unter Kontrolle des Tet-regulierbaren bidirektionalen<br />
Promotors gestellt. Im 3’-Bereich des Transaktivator-Gen schließt sich<br />
ein Polio-IR<strong>ES</strong> an.<br />
[Pbi]-[tTA]-[Polio-IR<strong>ES</strong>]<br />
pRBTTALucF<br />
Mittels der Primer LucFRT/Luc3 wurde aus dem Plasmid pLU eine<br />
Sequenz amplifiziert, die das Luciferase-Gen und am 3’-Ende eine<br />
Wildtyp-FRT-Site enthielt. Diese wurde mit PvuII geschnitten und in<br />
den mit SwaI geöffneten Vektor pRBTTA inseriert.<br />
[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IR<strong>ES</strong>]
5 Vektoren und Oligonukleotide 92<br />
pRBTTALFTN Das Tkneo-Gen mit integrierter F5- und loxP-Seqeunz und 3’-<br />
flankierter loxP-Sequenz wurde aus dem Vektor pSBC2TkneoLML<br />
durch Restriktion mit NotI/XmnI entnommen und in den mit NotI/XmnI<br />
geöffneten Vektor pRBTTALucF inseriert.<br />
[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-<br />
[SV40-PolyA]<br />
LUCTP<br />
Mittels der Primer TKPolyA5/TKPolyA3 wurde aus dem Vektor<br />
pEGFP1 das TK-PolyA amplifiziert. Das Amplifikat wurde mit AatII<br />
geschnitten und in den mit AatII geöffneten Vektor pRBTTALFTN<br />
inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-[F5-loxP]-<br />
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTE<br />
Mittels der Primer EMCV5/EMCV3 wurde aus dem Vektor<br />
pBSRlucEFluc das EMCV-IR<strong>ES</strong> amplifiziert. Das Amplifikat wurde<br />
mit PmeI/MluI geschnitten und in den mit PmaCI/MluI geöffneten<br />
Vektor LUCTP inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[EMCV-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-[F5-loxP]-<br />
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTN Mittels der Primer MNRF/3MNRF wurde aus dem Vektor<br />
pBSRlucmuNFluc das murine NRF-IR<strong>ES</strong> amplifiziert. Das Amplifikat<br />
wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden Enden<br />
aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF-IR<strong>ES</strong> wurde in den mit<br />
PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende aufgefüllten<br />
Vektor LUCTP inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-[F5-loxP]-<br />
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTN6<br />
Mittels der Primer MNIA608/3MNRF wurde aus dem Vektor<br />
pBCRLUCNLUC das NRF608-IR<strong>ES</strong> (608-857bp) amplifiziert. Das<br />
Amplifikat wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden<br />
Enden aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF608-IR<strong>ES</strong> wurde<br />
in den mit PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende<br />
aufgefüllten Vektor LUCTP inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF608-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
5 Vektoren und Oligonukleotide 93<br />
LUCTN7<br />
Mittels der Primer MNIA708/3MNRF wurde aus dem Vektor<br />
pBCRLUCNLUC das NRF708-IR<strong>ES</strong> (708-857bp) amplifiziert. Das<br />
Amplifikat wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden<br />
Enden aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF608-IR<strong>ES</strong> wurde<br />
in den mit PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende<br />
aufgefüllten Vektor LUCTP inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTA2N7<br />
Aus dem Vektor ptTA2 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA2<br />
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit<br />
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTA3N7<br />
Aus dem Vektor ptTA3 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA3<br />
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit<br />
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA3]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUCTA4N7<br />
Aus dem Vektor ptTA4 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA4<br />
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit<br />
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA4]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUC3TA2N7<br />
Das Luciferase-Gen Luc3 wurde aus dem Vektor pGL3basic durch<br />
Restriktion mit NheI/BamHI entnommen und in den mit SpeI/BglII<br />
geöffneten Vektor LUCTA2N7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF7-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUC3TA2E<br />
LUC3rTA2E<br />
Das Luciferase-Gen Luc3 wurde aus dem Vektor pGL3basic durch<br />
Restriktion mit NheI/BamHI entnommen und in den mit SpeI/BglII<br />
geöffneten Vektor GALTA2E inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[tTA2]-[EMCV-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
Der reverse Transaktivator rtTA2-M2 wurde aus dem Vektor<br />
pUHDrtTA2S-M2 durch Restriktion mit PmeI/BamHI entnommen und<br />
in den mit PmeI/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2E inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[rtTA2-M2]-[EMCV-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-[F5-<br />
loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
5 Vektoren und Oligonukleotide 94<br />
LUC3REX<br />
Mittels der Primer 5PCF133/138 und 3PCF133/138 wurde aus dem<br />
Vektor pCF133 eine Sequenz amplifiziert, die den Erythromycinabhängigen<br />
bidirektionalen Promotor und den Transaktivator ET<br />
enthielt. Das mit BglII geschnittene Amplifikat wurde in den mit<br />
BglII/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2N7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiREX]-[ET]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
LUC3PIP<br />
Mittels der Primer 5PCF133/138 und 3PCF133/138 wurde aus dem<br />
Vektor pCF138 eine Sequenz amplifiziert, die den Pristinamycinabhängigen<br />
bidirektionalen Promotor und den Transaktivator PIT<br />
enthielt. Das mit BglII geschnittene Amplifikat wurde in den mit<br />
BglII/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2N7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiPIP]-[PIT]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
GALTN7<br />
GALTA2E<br />
Das β-Galactosidase-Gen wurde aus dem Vektor pZeosvlacZ durch<br />
Restriktion mit SpeI/BglII entnommen und in den mit SpeI/BglII<br />
geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[Pbi]-[tTA]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
Der Vektor GALTN7 wurde mit ScaI/StuI gespalten. Die isolierte<br />
Sequenz enthielt das β-Galactosidase-Gen und den Tet-abhängigen<br />
Promotor. Der Vektor LUCTA2N7 wurde mit StuI/BamHI gespalten.<br />
Die isolierte Seqeunz enthielt den Transaktivator tTA2. Der Vektor<br />
LUCTE wurde mit ScaI/BamHI gespalten. Die isolierte Sequenz<br />
enthielt das EMCV-IR<strong>ES</strong>, das Tkneo-Gen mit Rekombinase-<br />
Erkennungsstellen sowie das Amp-Gen und OriC. Die 3 isolierten<br />
Sequenzen wurden miteinander ligiert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[Pbi]-[tTA2]-[EMCV-IR<strong>ES</strong>]-[Tk]-<br />
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]<br />
TGALTA2E<br />
Mittels der Primer 5ATGF5 und 3OriCAmp wurde aus dem Vektor<br />
pTARGET1 eine Sequenz amplifiziert, die das Amp-Gen und OriC<br />
sowie im 5’-Bereich eine F5-Sequenz aufwies. Das Amplifikat wurde<br />
mit NcoI/XhoI geschnittenen. Der Vektor GALTA2E wurde mit<br />
SpeI/XhoI gespalten. Die isolierte Sequenz enthielt das Galactosidase-<br />
Gen und im 3’-Bereich die Wildtyp-FRT-Sequenz sowie das TK-PolyA.<br />
Der Vektor GALTA2E wurde mit SpeI/NcoI gespalten. Die isolierte<br />
Sequenz enthielt den Tet-abhängigen bidirektionalen Promotor, den<br />
Transaktivator tTA2 und das EMCV-IR<strong>ES</strong>. Die 3 isolierten Sequenzen<br />
wurden miteinander ligiert.<br />
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[PbiPIP]-[tTA2]-[EMCV-IR<strong>ES</strong>]-[F5]
5 Vektoren und Oligonukleotide 95<br />
LUCTA2N7N<br />
Mittels der Primer NHE5/NHE3 wurde aus dem Vektor LUCTA2N7<br />
eine Sequenz amplifiziert, die das Ampicilin-Resistenz-Gen und den<br />
OriC enthielt. Das Amplifikat wurde mit SspI/Bst1107I geschnitten und<br />
in den mit SspI/Bst1107I geöffneten Vektor LUCTA2N7 inseriert. Die<br />
autoregulierte Expressionskassette wurde dadurch mit 2 flankierenden<br />
NheI-Restriktionsschnittstellen versehen.<br />
[NheI]-[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiPIP]-[PIT]-[NRF7-IR<strong>ES</strong>]-<br />
[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]-[NheI]<br />
RLUC<br />
Aus dem Vektor LUCTA2N7N wurde durch Restriktion mit NheI die<br />
autoregulierte Expressionskassette entnommen und in den mit XbaI<br />
geöffneten Vektor ROSA26-1 inseriert.<br />
[ROSA5’]-[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-<br />
[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]-[ROSA3’]<br />
RLUC-R<br />
Aus dem Vektor LUCTA2N7N wurde durch Restriktion mit NheI die<br />
autoregulierte Expressionskassette entnommen und in den mit XbaI<br />
geöffneten Vektor ROSA26-1 inseriert. Die Orientierung der<br />
<strong>autoregulierten</strong> Kassette ist invers zum Vektor RLUC.<br />
[ROSA5’]-[SV-PolyA]-[loxP]-[neo]-[loxP-F5]-[Tk]-[NRF708-IR<strong>ES</strong>]-<br />
[tTA2]-[Pbi]-[Luc]-[FRT]-[TK-PolyA]-[ROSA3]<br />
Abkürzungen: F5 FRT-Mutante F5<br />
Gal β-Galactosidase-Gen<br />
Luc3 Luciferase-3 Gen<br />
neo Neomycinphosphotransferase-Gen<br />
Pbi Tetracyclin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
PbiPIP Pristinamycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
PbiREX Erythromycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
ROSA3’ Homologe Sequenz zum ROSA26-Locus<br />
ROSA5’ Homologe Sequenz zum ROSA26-Locus<br />
Tk Thymidinkinase-Gen<br />
Tkneo Fusionsgen aus Thymidinkinase- und Neomycinphosphotransferase-Gen<br />
5.2 Primer/Oligomere<br />
3MNRF<br />
3OriCAmp<br />
5’-AGT GGCGCGCC CAAGTGTGGGCTATACC-3’<br />
AscI 3’-Bereich vom murinen NRF<br />
5’-GGGGGGGGG CTCGAG ACCATATGTCGGGCCGCGTTG-3’<br />
XhoI<br />
3’-Bereich nach OriC<br />
3PCF133/138 5’-GGGGGGCCCCCC AGATCT GGATCC CTACCCACCGTACTCGTCAATTC-3’<br />
BglII BamHI 3’-Bereich nach Transaktivator ET bzw. PIT<br />
(pCF133, pCF138)<br />
5ATGF5<br />
5’-CCCCCGGGGGG CCATGG GG AGATCT GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCC-3’<br />
NcoI BglII FRT-Mutante F5<br />
5PCF133/138 5’-GGGGGGCCCCCC AGATCT TCTAGA GGTGGGCGAATTCCACCACACTG-3’<br />
BglII XbaI 5’-Bereich vor bidirektionalem Promotor<br />
(pCF133, pCF138)
5 Vektoren und Oligonukleotide 96<br />
EMCV3<br />
EMCV5<br />
LoxP3H<br />
Luc3<br />
LucFRT<br />
MLNHEI3<br />
MLNHEI5<br />
MNIA608<br />
MNIA708<br />
MNRF<br />
Neo54<br />
NHE3<br />
NHE5<br />
TKPolyA3<br />
TKPolyA5<br />
5’- GGGGCCCCCAG ACGCGT GTTGATGGCCGGGGTACGAAGCCAT<br />
MluI<br />
3’-Bereich vom EMCV-IR<strong>ES</strong><br />
GGTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3’<br />
CCCCGGGGCTGCAGTTTAAAC GCGGCCGCGAAATTAATACG-3’<br />
PmeI<br />
5’-Bereich vom EMCV-IR<strong>ES</strong><br />
5’-CCCGGGG AAGCTT CGTACTCTATAGGCTTCAGG-3’<br />
HindIII 3’-Bereich nach loxP-Site- und neo-Gen<br />
5’-CCCGGGG CAGCTG ACTAGT GGTACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’<br />
PvuII SpeI 5’-Bereich des Luciferase-3 Gens (pGL3basic)<br />
5’-CCCGGGG CAGCTG<br />
PvuII<br />
GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC AGATCT<br />
Wildtyp FRT-Site<br />
BglII<br />
TTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3’<br />
3’-Bereich des Luciferase-Gens<br />
CTAGCG TATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT<br />
loxP-Site<br />
GAAGTTCCTATACCTTTTGAAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCG<br />
FRT-Mutante F5<br />
CTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTTCAAAAGGTATAGGAACTTC<br />
FRT-Mutante F5<br />
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACG<br />
loxP-Site<br />
5’-AGCCT GTCGAC ATCTCTCCAGCCCCTGTG-3’<br />
SalI 5’-Bereich im murinen NRF bei 608 bp<br />
5’-AGCCT GTCGAC TGATTCTTTCTTTTCATCCA-3’<br />
SalI 5’-Bereich im murinen NRF bei 708 bp<br />
5’-GGCAGCCT GTCGAC CCTTTCATCCCCCAAAAGTTACC-3’<br />
SalI 5’-Bereich vom murinen NRF-IR<strong>ES</strong><br />
5’-GGCCGAGATCTATG TCTGATGCCGCCGTGTTCCGG-3’<br />
neo-Gen (intern)<br />
5’-CCCCGGGGG AATATT GCTAGC GAAAAAGGAAGAGTATG-3’<br />
SspI NheI 5’-Bereich vor Amp-Gen<br />
5’- CCCCGGGGG GTATAC GCTAGC TGGCTTAACTATGCGG-3’<br />
Bst1107I NheI Bereich vor OriC<br />
5’-GGGGGGCCCCC GACGTC CTCGAG GCTATGGCAGGGCCTGCCGC-3’<br />
AatII XhoI 3’-Bereich Tk-PolyA<br />
5’-GGGGGGCCCCC GACGTC ATTTAAAT GGGGGAGGCTAACTGAAACACG-3’<br />
AatII SwaI 5’-Bereich Tk-PolyA
6 Abkürzungen 97<br />
6 Abkürzungen<br />
A<br />
Abb.<br />
ATCC<br />
ATG<br />
ATP<br />
βgeo<br />
bp<br />
BSA<br />
C<br />
CIP<br />
CMV<br />
Cre<br />
CTP<br />
DME<br />
DMSO<br />
DNA<br />
DNaseI<br />
dNTP<br />
DTT<br />
E.coli<br />
E.REXOff<br />
EDTA<br />
EF<br />
eGFP<br />
EMCV<br />
<strong>ES</strong><br />
ET<br />
ETR<br />
F<br />
F5<br />
FACS<br />
FCS<br />
Flp<br />
Flpe<br />
FRT<br />
G<br />
G418<br />
Gal<br />
GFP<br />
GTP<br />
Adenosin<br />
Abbildung<br />
American Type Culture Collection<br />
Translationsstart<br />
Adenosintriphosphat<br />
Fusion aus β-Galactosidase und Neomycinphosphotransferase<br />
Basenpaar<br />
Rinderserumalbumin<br />
Cytosin<br />
Alkalische Phosphatase<br />
Cytomegalovirus<br />
cyclization recombination (Cre-Rekombinase)<br />
Cytidintriphosphat<br />
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium<br />
Dimethylsulfoxid<br />
Desoxyribonukleinsäure<br />
Desoxyribonuklease I<br />
Desoyxribonucleotidtriphosphat<br />
Dithioreitol<br />
Escherichia coli<br />
Eryhtromycin-abhängiges Expressionssystem<br />
Ethylendiamintetraessigsäure<br />
Expressionsfaktor<br />
enhanced green fluorescent protein<br />
Encephalomyocarditis Virus<br />
embryonale Stammzellen<br />
Erythromycin-abhängiger Transaktivator<br />
Operatorsequenz des mph(A)-Promotors<br />
Wildtyp FRT-Site<br />
Mutante der FRT-Site<br />
fluorescence-activated cell sorting<br />
fötales Kälberserum<br />
Flp-Rekombinase<br />
Flp enhanced<br />
Flp recognition target (Erkennungssequenz der Flp-Rekombinase)<br />
Guanin<br />
Aminoglycosid-2’-Deoxystreptin (Gentamycin-Derivat)<br />
β-Galactosidase<br />
green fluorescent protein<br />
Guanosintriphosphat
6 Abkürzungen 98<br />
h<br />
HEP<strong>ES</strong><br />
HMW-DNA<br />
HSV<br />
Hyg<br />
HygTk<br />
IR<strong>ES</strong><br />
Kap.<br />
kb<br />
kbp<br />
kDa<br />
kV<br />
l<br />
LacZ<br />
loxP<br />
Luc<br />
Luc3<br />
min<br />
mph(A)<br />
MphR(A)<br />
mRNA<br />
MUG<br />
N<br />
neo<br />
NRF<br />
NRF708<br />
O.D.<br />
ori<br />
pA<br />
P bi<br />
P biPIT<br />
P biREX<br />
PBS<br />
PCR<br />
Pip<br />
PIPOff<br />
PIT<br />
Polio<br />
RA<br />
RF<br />
rlu<br />
RMCE<br />
RNA<br />
Stunde<br />
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure<br />
High molecular weight DNA<br />
herpes simplex virus<br />
Hygromycin-B-Phosphotransferase<br />
Fusion aus Hyg und Tk<br />
internal ribosomal entry site<br />
Kapitel<br />
1000 Basen<br />
1000 Basenpaare<br />
1000 Dalton<br />
1000 Volt<br />
Liter<br />
β-Galactosidase<br />
Locus of X-over (Erkennungssequenz der Cre-Rekombinase)<br />
Luciferase<br />
Luciferase-3 (luc + , Promega)<br />
Minute<br />
macrolide-inactivating 2’-phosphotransferase I<br />
Repressordomäne <strong>von</strong> mph(A)<br />
messenger RNA<br />
4-Methylumbelliferryl-β-D-Galactosid<br />
NRF708-IR<strong>ES</strong><br />
Neomycinphosphotransferase<br />
5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NF-κB repressing factor), 1-857 bp<br />
5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NF-κB repressing factor), 708-857 bp<br />
optische Dichte<br />
origin of replication<br />
polyA<br />
Tetracyclin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
Pristinamycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
Erythromycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor<br />
phosphate buffer saline<br />
Polymerase Kettenreaktion<br />
Pristinamycin induced protein (Repressor-Domäne)<br />
Pristinamycin-abhängiges Expressionssystem<br />
Pristinamycin-abhängiger Transaktivator<br />
Poliovirus<br />
Retinsäure<br />
Regulationsfaktor<br />
relative light units<br />
recombinase mediated cassette exchange<br />
Ribonukleinsäure
6 Abkürzungen 99<br />
RNase<br />
RP<br />
rpm<br />
rtTA<br />
rtTA2-M2<br />
Ribonuklease<br />
ROSA26-Promotor<br />
Umdrehungen pro Minute<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
SDS Natriumdodecylsulfat<br />
sec<br />
Sekunde<br />
SV40 Simian Virus 40<br />
Tab.<br />
Tet<br />
tetO<br />
TetOff<br />
TetOn<br />
TetR<br />
Tk<br />
Tris<br />
tTA<br />
tTA2<br />
tTA3<br />
tTA4<br />
V<br />
v/v<br />
w/v<br />
Tabelle<br />
Tetracyclin<br />
Operatorsequenz des Tetracyclin-Resistenzsystems<br />
Tetracyclin-abhängiges Expressionssystem<br />
Tetracyclin-abhängiges Expressionssystem<br />
Tetracyclin Repressordomäne<br />
Thymidinkinase<br />
Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator<br />
Volt<br />
Volumen/Volumen (Volumenprozent)<br />
Gewicht/Volumen (Gewichtsprozent)
7 Literatur 100<br />
7 Literatur<br />
Abremski, K. und Hoess, R. (1985) Phage P1 Cre-loxP site-specific recombination. Effects<br />
of DNA supercoiling on catenation and knotting of recombinant products. J Mol Biol.<br />
184(2):211-220.<br />
Adams, D.E., Bliska, J.B. und Cozzarelli, N.R. (1992) Cre-lox recombination in<br />
Escherichia coli cells. Mechanistic differences from the in vitro reaction J Mol Biol.<br />
226(3):661-673.<br />
Akagi, K., Kanai, M., Saya, H., Kozu, T. und Berns, A. (2001) A novel tetracyclinedependent<br />
transactivator with E2F4 transcriptional activation domain. Nucleic Acids Res.<br />
29(4):E23.<br />
Albert, H., Dale, E.C., Lee, E. und Ow, D.W. (1995) Site-specific integration of DNA into<br />
wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome. Plant J. 7(4):649-659.<br />
Al-Shawi, R., Burke, J., Jones, C.T., Simons, J.P. und Bishop, J.O. (1988) A Mup<br />
promoter-thymidine kinase reporter gene shows relaxed tissue-specific expression and confers<br />
male sterility upon transgenic mice. Mol Cell Biol. 8(11):4821-4828.<br />
Al-Shawi, R., Burke, J., Wallace, H., Jones, C., Harrison, S., Buxton, D., Maley, S.,<br />
Chandley, A. und Bishop, J.O. (1991) The herpes simplex virus type 1 thymidine kinase is<br />
expressed in the testes of transgenic mice under the control of a cryptic promoter. Mol Cell<br />
Biol. 11(8):4207-4216.<br />
Andrews, B.J., Beatty, L.G. und Sadowski, P.D. (1987) Isolation of intermediates in the<br />
binding of the FLP recombinase of the yeast plasmid 2-micron circle to its target sequence.<br />
J Mol Biol. 193(2):345-58.<br />
Araki, K., Araki, M. und Yamamura, K. (1997) Targeted integration of DNA using mutant<br />
lox sites in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 25(4):868-872.<br />
Artelt, P., Grannemann, R., Stocking, C., Friel, J., Bartsch, J. und Hauser, H. (1991) The<br />
prokaryotic neomycin-resistance-encoding gene acts as a transcriptional silencer in eukaryotic<br />
cells. Gene. 99(2):249-254.<br />
Askew, G.R., Doetschmann, T. und Lingrel, J.B. (1993) Site-directed point mutations in<br />
embryonic stem cells: a gene-targeting tag-and-exchange strategy. Mol Cell Biol. 13(7):4115-<br />
4124.<br />
Bagutti, C., Wobus, A.M., Fassler, R. und Watt, F.M. (1996) Differentiation of embryonal<br />
stem cells into keratinocytes: comparison of wild-type and beta 1 integrin-deficient cells. Dev<br />
Biol. 179(1):184-196.<br />
Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J.E. und Gottlieb, D.I. (1995) Embryonic stem<br />
cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168(2):342-357.<br />
Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M. und Bujard, H. (1995) Co-regulation of two gene<br />
activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23(17):3605-3606.<br />
Baron, U., Gossen, M. und Bujard, H. (1997) Tetracycline-controlled transcription in<br />
eukaryotes: novel transactivators with graded transactivation potential. Nucleic Acids Res.<br />
25(14):2723-2729.
7 Literatur 101<br />
Baron, U., Schnappinger, D., Helbl, V., Gossen, M., Hillen, W. und Bujard, H. (1999)<br />
Generation of conditional mutants in higher eukaryotes by switching between the expression<br />
of two genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(3):1013-1018.<br />
Baubonis, W. und Sauer, B. (1993) Genomic targeting with purified Cre recombinase.<br />
Nucleic Acids Res. 21(9):2025-2029.<br />
Beatty, L.G., Babineau-Clary, D., Hogrefe, C. und Sadowski, P.D. (1986) FLP sitespecific<br />
recombinase of yeast 2-micron plasmid. Topological features of the reaction. J Mol<br />
Biol. 188(4):529-544.<br />
Bethke, B. und Sauer, B. (1997) Segmental genomic replacement by Cre-mediated<br />
recombination: genotoxic stress activation of the p53 promoter in single-copy transformants.<br />
Nucleic Acids Res. 25(14):2828-2834.<br />
Bhaumik, S. und Gambhir, S.S. (2002) Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene<br />
expression in living mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(1):377-382.<br />
Blair, W.S., Bogerd, H.P., Madore, S.J. und Cullen, B.R. (1994) Mutational analysis of the<br />
transcription activation domain of RelA: Identification of highly synergistic minimal acidic<br />
activation module. Mol Cell Biol. 14(11):7226-7234.<br />
Blanc, V., Salah-Bey, K., Folcher, M. und Thompson, C.J. (1995) Molecular<br />
characterization and transcriptional analysis of a multidrug resistance gene cloned from the<br />
pristinamycin-producing organism, Streptomyces pristinaespiralis. Mol Microbiol. 17(5):989-<br />
999<br />
Block, A., Puls, F., Müller, J., Milasinovic, D., Igelmann, D., Schafer, P., Kupfermann,<br />
N., Schmoldt, A., Ameis, D. und Greten, H. (2003) Highly suppressible expression of<br />
single-chain interleukin-12 by doxycycline following adenoviral infection with a single-vector<br />
Tet-regulatory system. J Gene Med. 5(3):190-200.<br />
Böger, H. und Gruss, P. (1999) Functional determinants for the tetracycline-dependent<br />
transactivator tTA in transgenic mouse embryos. Mech Dev. 83(1-2):141-153.<br />
Borman, A.W., Le Mercier, P., Girard, M. Und Kean, K.M. (1997) Comparision of<br />
picornaviral IR<strong>ES</strong>-driven internal initiation of translation in cultured cells of different origins.<br />
Nucleic Acids Res. 25(5):925-932<br />
Boshart, M., Weber, F., Jahn, G., Dorsch-Hasler, K., Fleckenstein, B. und Schaffner, W.<br />
(1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human<br />
cytomegalovirus. Cell. 41(2):521-530.<br />
Bouhassira, E.E., Westerman, K. und Leboulch, P. (1997) Transcriptional behavior of<br />
LCR enhancer elements integrated at the same chromosomal locus by recombinase-mediated<br />
cassette exchange. Blood. 90(9):3332-3344.<br />
Braun, R.E., Lo, D., Pinkert, C.A., Widera, G., Flavell, R.A., Palmiter, R.D. und<br />
Brinster, R.L. (1990) Infertility in male transgenic mice: disruption of sperm development by<br />
HSV-tk expression in postmeiotic germ cells. Biol Reprod. 43(4):684-693.<br />
Brüstle, O., Jones, K.N., Learish, R.D., Karram, K., Choudhary, K., Wiestler, O.D.,<br />
Duncan, I.D. und McKay, R.D. (1999) Embryonic stem cell-derived glial precursors: a<br />
source of myelinating transplants. Science. 85(5428):754-756.<br />
Buchholz, F. und Stewart, A.F. (2001) Alteration of Cre recombinase site specificity by<br />
substrate-linked protein evolution. Nat Biotechnol. 19(11):1047-1052.<br />
Buchholz, F., Angrand, P.O. und Stewart, A.F. (1998) Improved properties of FLP<br />
recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol. 16(7):657-662.
7 Literatur 102<br />
Buchholz, F., Ringrose, L., Angrand, P.O., Rossi, F. und Stewart, A.F. (1996) Different<br />
thermostabilities of FLP and Cre recombinases: implications for applied site-specific<br />
recombination. Nucleic Acids Res. 24(21):4256-4262.<br />
Byrne, G.W. und Ruddle, F.H. (1989) Multiplex gene regulation: a two-tiered approach to<br />
transgene regulation in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 86(14):5473-5477.<br />
Case, M.E. (1986) Genetical and molecular analyses of qa-2 transformants in Neurospora<br />
crassa. Genetics. 113(3):569-587.<br />
Chen, J., Kelz, M.B., Zeng, G., Sakai, N., Steffen, C., Shockett, P.E., Picciotto, M.R.,<br />
Duman, R.S. und Nestler, E.J. (1998) Transgenic animals with inducible, targeted gene<br />
expression in brain. Mol Pharmacol. 54(3):495-503.<br />
Chen, Y.T. und Bradley, A. (2000) A new positive/negative selectable marker, puDeltatk,<br />
for use in embryonic stem cells. Genesis. 28(1):31-35.<br />
Chi, T., Lieberman, P., Ellwood, K. und Carey, M. (1995) A general mechanism for<br />
transcriptional synergy by eukaryotic activators. Nature. 377(6546):254-257.<br />
Chin, L., Tam, A., Pomerantz, J., Wong, M., Holash, J., Bardeesy, N., Shen, Q.,<br />
O'Hagan, R., Pantginis, J., Zhou, H., Horner, J.W. 2nd, Cordon-Cardo, C.,<br />
Yancopoulos, G.D. und DePinho, R.A..(1999) Essential role for oncogenic Ras in tumour<br />
maintenance. Nature. 400(6743):468-472<br />
Choi, K., Kennedy, M., Kazarov, A., Papadimitriou, J.C. und Keller, G. (1998) A<br />
common precursor for hematopoietic and endothelial cells. Development. 125(4):725-32.<br />
Choulika, A., Guyot, V. und Nicolas, J.F. (1996) Transfer of single gene-containing long<br />
terminal repeats into the genome of mammalian cells by a retroviral vector carrying the cre<br />
gene and the loxP site. J Virol. 70(3):1792-1798.<br />
Christ, N. und Dröge, P. (2002) Genetic manipulation of mouse embryonic stem cells by<br />
mutant lambda integrase. Genesis. 32(3):203-208.<br />
Christ, N., Corona, T. und Dröge, P. (2002) Site-specific recombination in eukaryotic cells<br />
mediated by mutant λ integrase: implications for synaptic complex formation and the<br />
reactivity of episomal DNA segments. J Mol Biol. 319(2):305-314<br />
Chtarto, A., Bender, H.U., Hanemann, C.O., Kemp, T., Lehtonen, E., Levivier, M.,<br />
Brotchi, J., Velu, T. und Tenenbaum, L. (2003) Tetracycline-inducible transgene<br />
expression mediated by a single AAV vector. Gene Ther. 10(1):84-94.<br />
Conover, J.C., Ip, N.Y., Poueymirou, W.T., Bates, B., Goldfarb, M.P., De Chiara, T.M.<br />
und Yancopoulos, G.D. (1993) Ciliary neurotrophic factor maintains the pluripotentiality of<br />
embryonic stem cells. Development. 119(3):559-565<br />
Corces, V. und Pellicer, A. (1984) Identification of sequences involved in the transcriptional<br />
control of a Drosophila heat-shock gene. J Biol Chem. 259(23):14812-14817.<br />
Craig, N. (1988) The mechanism of conservative site-specific recombination. Annu. Rev.<br />
Genet. 22:77-106.<br />
Cress, A. und Triezenberg, S.J. (1991) Nucleotide and deduced amino acid sequences of the<br />
gene encoding virion protein 16 of herpes simplex virus type 2. Gene. 103(2):235-238.<br />
Cullen, B.R., Lomedico, P.T. und Ju, G. (1984) Transcriptional interference in avian<br />
retroviruses implications for the promoter insertion model of leukaemogenesis. Nature.<br />
307(5948):241-245.
7 Literatur 103<br />
Cundliffe, E. (1989) How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu Rev<br />
Microbiol. 43:207-33.<br />
Damke, H., Gossen, M., Freundlieb, S., Bujard, H. und Schmid, S.L. (1995) Tightly<br />
regulated and inducible expression of dominant interfering dynamin mutant in stably<br />
transformed HeLa cells. Methods Enzymol. 257:209-220.<br />
Dani, C., Smith, A.G., Dessolin, S., Leroy, P., Staccini, L., Villageois, P., Darimont, C.<br />
und Ailhaud, G. (1997) Differentiation of embryonic stem cells into adipocytes in vitro.<br />
J Cell Sci. 110(11):1279-1285.<br />
de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M. und te Riele, H. (1995) Inactivation of<br />
the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance,<br />
hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82(2):321-330.<br />
De Lozanne, A. und Spudich, J.A. (1987) Disruption of the Dictyostelium myosin heavy<br />
chain gene by homologous recombination. Science. 236(4805):1086-1091.<br />
Detloff, P.J., Lewis, J., John, S.W., Shehee, W.R., Langenbach, R., Maeda, N. und<br />
Smithies, O. (1994) Deletion and replacement of the mouse adult beta-globin genes by a<br />
"plug and socket" repeated targeting strategy. Mol Cell Biol. 14(10):6936-6943.<br />
Deuschle, U., Meyer, W.K. und Thiesen, H.J. (1995) Tetracycline-reversible silencing of<br />
eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15(4):1907-1914.<br />
Dirks, W., Schaper, F., Kirchhoff, S., Morelle, C. und Hauser, H. (1994) A<br />
multifunctional vector family for gene expression in mammalian cells. Gene. 149(2):387-388.<br />
Dirks, W., Wirth, M. und Hauser, H. (1993) Dicistronic transcription units for gene<br />
expression in mammalian cells. Gene. 128(2):247-249<br />
Doetschman, T., Gregg, R.G., Maeda, N., Hooper, M.L., Melton, D.W., Thompson, S.<br />
und Smithies, O. (1987) Targetted correction of mutant HPRT gene in mouse embryonic<br />
stem cells. Nature. 330(6148):576-578.<br />
Doetschman, T., Maeda, N. und Smithies, O. (1988) Targeted mutation of the Hprt gene in<br />
mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(22):8583-8587.<br />
Doetschman, T.C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W. und Kemler, R. (1985) The in<br />
vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk<br />
sac, blood islands and myocardium. J Embryol Exp Morphol. 87:27-45.<br />
Drab, M., Haller, H., Bychkov, R., Erdmann, B., Lindschau, C., Haase, H., Morano, I.,<br />
Luft, F.C. und Wobus, A.M. (1997) From totipotent embryonic stem cells to spontaneously<br />
contracting smooth muscle cells: a retinoic acid and db-cAMP in vitro differentiation model.<br />
FASEB J. 11(11):905-915.<br />
Dymecki, S.M. (1996) Flp recombinase promotes site-specific DNA recombination in<br />
embryonic stem cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93(12):6191-6196.<br />
Dymecki, S.M. und Tomasiewicz, H. (1998) Using Flp-recombinase to characterize<br />
expansion of Wnt1-expressing neural progenitors in the mouse. Dev Biol. 201(1):57-65.<br />
Ellison, A.R., Wallace, H., Al-Shawi, R. und Bishop, J.O. (1995) Different transmission<br />
rates of herpesvirus thymidine kinase reporter transgenes from founder male parents and male<br />
parents of subsequent generations. Mol Reprod Dev. 41(4):425-434.<br />
Ellison, A.R., West, J.D., Spears, N., Murray, A., Everett, C.A. und Bishop, J.O. (2000)<br />
Failure of founder transgenic male mice to transmit an attenuated HSV thymidine kinase<br />
transgene results from mosaicism and sperm competition. Mol Reprod Dev. 55(3):249-255.
7 Literatur 104<br />
Era, T. und Witte, O.N. (2000) Regulated expression of P210 Bcr-Abl during embryonic<br />
stem cell differentiation stimulates multipotential progenitor expansion and myeloid cell fate.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 97(4):1737-1742.<br />
Evans, M.J. und Kaufman, M.H. (1981) Establishment in culture of pluripotential cells<br />
from mouse embryos. Nature. 292(5819):154-156.<br />
Farley, F.W., Soriano, P., Steffen, L.S. und Dymecki, S.M. (2000) Widespread<br />
recombinase expression using FLPeR (flipper) mice. Genesis. 28(3-4):106-110<br />
Fedorov, L.M., Tyrsin, O.Y., Krenn, V., Chernigovskaya, E.V. und Rapp, U.R. (2001a)<br />
Tet-system for the regulation of gene expression during embryonic development. Transgenic<br />
Res. 10(3):247-258.<br />
Fedorov, L.M., Tyrsin, O.Y., Sakk, O., Ganscher, A. und Rapp, U.R. (2001b) Generation<br />
dependent reduction of tTA expression in double transgenic NZL-2/tTA CMV mice. Genesis.<br />
31(2):78-84.<br />
Feng, Y.Q., Lorincz, M.C., Fiering, S., Greally, J.M. und Bouhassira, E.E. (2001)<br />
Position effects are influenced by the orientation of a transgene with respect to flanking<br />
chromatin. Mol Cell Biol. 21(1):298-309.<br />
Fiering, S., Kim, C.G., Epner, E.M. und Groudine, M. (1993) An "in-out" strategy using<br />
gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory<br />
elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
90(18):8469-8473<br />
Finley, M.F., Devata, S. und Huettner, J.E. (1999) BMP-4 inhibits neural differentiation of<br />
murine embryonic stem cells. J Neurobiol. 40(3):271-287.<br />
Flint, J. und Shenk, T. (1997) Viral transactivating proteins. Annu Rev Genet. 31:177-212.<br />
Folcher, M., Morris, R.P., Dale, G., Salah-Bey-Hocini, K., Viollier, P.H. und Thompson,<br />
C.J. (2001) A transcriptional regulator of a pristinamycin resistance gene in Streptomyces<br />
coelicolor. J Biol Chem. 276(2):1479-1485.<br />
Folger, K., Thomas, K. und Capecchi, M.R. (1984) Analysis of homologous recombination<br />
in cultured mammalian cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 49:123-38.<br />
Fraichard, A., Chassande, O., Bilbaut, G., Dehay, C., Savatier, P. und Samarut J. (1995)<br />
In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J Cell<br />
Sci. 108(10):3181-3188.<br />
Francastel, C., Walters, M.C., Groudine, M. und Martin, D.I. (1999) A functional<br />
enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to<br />
centrometric heterochromatin. Cell. 99(3):259-269.<br />
Freundlieb, S., Schirra-Muller, C. und Bujard, H. (1999) A tetracycline controlled<br />
activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.<br />
J Gene Med. 1(1):4-12.<br />
Friedrich, G. und Soriano, P. (1991) Promoter traps in embryonic stem cells: a genetic<br />
screen to identify and mutate developmental genes in mice. Genes Dev. 5(9):1513-1523.<br />
Frohberg, C., Heins, L. und Gatz, C. (1991) Characterization of the interaction of plant<br />
transcription factors using a bacterial repressor protein. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
88(23):10470-10474.
7 Literatur 105<br />
Fukushige, S. und Sauer, B. (1992) Genomic targeting with a positive-selection lox<br />
integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells. Proc Natl<br />
Acad Sci U S A. 89(17):7905-7909.<br />
Furth, P.A., St-Onge, L., Boger, H., Gruss, P., Gossen, M., Kistner, A., Bujard, H. und<br />
Hennighausen, L. (1994) Temporal control of gene expression in transgenic mice by a<br />
tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 91(20):9302-9306.<br />
Fussenegger, M. (2001). The impact of mammalian gene regulation concepts on functional<br />
genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog.<br />
17(1):1-51.<br />
Fussenegger, M., Morris, R.P., Fux, C., Rimann, M., <strong>von</strong> Stockar, B., Thompson, C.J.<br />
und Bailey, J.E. (2000) Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells.<br />
Nat Biotechnol. 18(11):1203-1208.<br />
Fussenegger, M., Moser, S., Ma<strong>zur</strong>, X. und Bailey, J.E. (1997) Autoregulated<br />
multicistronic expression vectors provide one-step cloning of regulated product gene<br />
expression in mammalian cells. Biotechnol Prog. 13(6):733-740.<br />
Fux, C. und Fussenegger, M. (2003a) Toward higher order control modalities in mammalian<br />
cells-independent adjustment of two different gene activities. Biotechnol Prog. 19(1):109-120.<br />
Fux, C. und Fussenegger, M. (2003b) Bidirectional expression units enable streptograminadjustable<br />
gene expression in mammalian cells. Biotechnol Bioeng. 83(5):618-625.<br />
Gallia, G.L. und Khalili, K. (1998) Evaluation of an autoregulatory tetracycline regulated<br />
system. Oncogene. 16(14):1879-1884.<br />
Gardner, D.P., Byrne, G.W., Ruddle, F.H. und Kappen, C. (1996) Spatial and temporal<br />
regulation of a lacZ reporter transgene in a binary transgenic mouse system. Transgenic Res.<br />
5(1):37-48.<br />
Gates, C.A. und Cox, M.M. (1988) FLP recombinase is an enzyme. Proc Natl Acad Sci<br />
U S A. 85(13):4628-4632.<br />
Gatz, C. und Quail, P.H. (1988) Tn10-encoded tet repressor can regulate an operatorcontaining<br />
plant promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(5):1394-1397.<br />
Gatz, C., Kaiser, A. und Wendenburg, R. (1991) Regulation of a modified CaMV 35S<br />
promoter by the Tn10-encoded Tet repressor in transgenic tobacco. Mol Gen Genet.<br />
227(2):229-237.<br />
Gill, G. und Ptashne, M. (1988). Negative effect of the transcriptional activator GAL4.<br />
Nature. 344(6184):721-724.<br />
Ginsberg, D., Vairo, G., Chittenden, T., Xiao, Z.X., Xu, G., Wydner, K.L., DeCaprio,<br />
J.A., Lawrence, J.B. und Livingston, D.M. (1994) E2F-4, a new member of the E2F<br />
transcription factor family, interacts with p107. Genes Dev. 8(22):2665-2679.<br />
Golic, K.G. (1991) Site-specific recombination between homologous chromosomes in<br />
Drosophila. Science. 252(5008):958-961.<br />
Golic, K.G. und Lindquist, S. (1989) The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific<br />
recombination in the Drosophila genome. Cell. 59(3):499-509.<br />
Goodrich, J.A., Hoey, T., Thut, C.J., Admon, A. und Tjian, R. (1993) Drosophila<br />
TAFII40 interacts with both a VP16 activation domain and the basal transcription factor<br />
TFIIB. Cell. 75(3):519-530.
7 Literatur 106<br />
Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by<br />
tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(12):5547-5551<br />
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W. und Bujard, H. (1995)<br />
Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268(5218):1766-<br />
1769.<br />
Gossler, A., Doetschman, T., Korn, R., Serfling, E. und Kemler, R. (1986) Transgenesis<br />
by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
83(23):9065-9069.<br />
Gu, H., Zou, Y.R. und Rajewsky, K. (1993) Independent control of immunoglobulin switch<br />
recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene<br />
targeting. Cell. 73(6):1155-1164.<br />
Guan, K., Rohwedel, J. und Wobus, A.M. (1999) Embryonic stem cell differentiation<br />
model: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell<br />
differentiation in vitro. Cytotechnology. 30(1-3):211-226<br />
Guay, D.R. (1996) Macrolide antibiotics in paediatric infectious diseases. Drugs. 51(4):515-<br />
536.<br />
Guo, F., Gopaul, D.N. und van Duyne, G.D. (1997) Structure of Cre recombinase<br />
complexed with DNA in a site-specific recombination synapse. Nature. 389(6646):40-46.<br />
Haber, J.E. (1997) A super new twist on the initiation of meiotic recombination. Cell.<br />
189(2):163-166.<br />
Hartley, J.L. und Donelson, J.E. (1980) Nucleotide sequence of the yeast plasmid. Nature.<br />
286(5776):860-865.<br />
Hayes, S. und O'Hare, P. (1993) Mapping of a major surface-exposed site in herpes simplex<br />
virus protein Vmw65 to a region of direct interaction in a transcription complex assembly.<br />
J Virol. 67(2):852-862.<br />
Hennecke, M., Kwissa, M., Metzger, K., Oumard, A., Kröger, A., Schirmbeck, R.,<br />
Reimann, J. und Hauser, H. (2001) Composition and arrangement of genes define the<br />
strength of IR<strong>ES</strong>-driven translation in bicistronic mRNAs. Nucleic Acids Res. 29(16):3327-<br />
3334.<br />
Herault, Y., Rassoulzadegan, M., Cuzin, F. und Duboule, D. (1998) Engineering<br />
chromosomes in mice through targeted meiotic recombination (TAMERE). Nat Genet.<br />
20(4):381-384.<br />
Hillen, W. und Berens, C. (1994) Mechanisms underlying expression of Tn10 encoded<br />
tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48:345-369.<br />
Hillen, W., Gatz, C., Altschmied, L., Schollmeiner und K., Meier, I. (1983) Control of<br />
expression of the Tn10-encoded tetracycline resistance genes: equilibrium and kinetic<br />
investigations of the regulatory reactions. J Mol Biol. 169(3):707-721<br />
Hinnen, A., Hicks, J.B. und Fink, G.R. (1978) Transformation of yeast. Proc Natl Acad Sci<br />
U S A. 75(4):1929-1933<br />
Hinrichs, W., Kisker, C., Duvel, M., Müller, A., Tovar, K., Hillen, W. und Saenger, W.<br />
(1994) Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic<br />
resistance. Science. 264(5157):418-420.<br />
Hoess, R.H. und Abremski, K. (1984) Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre<br />
with the recombining site loxP. Proc Natl Acad Sci U S A. 81(4):1026-1029.
7 Literatur 107<br />
Hoess, R.H. und Abremski, K. (1985) Mechanism of strand cleavage and exchange in the<br />
Cre-lox site-specific recombination system. J Mol Biol. 181(3):351-362.<br />
Hoess, R.H., Wierzbicki, A. und Abremski, K. (1986) The role of the loxP spacer region in<br />
P1 site-specific recombination. Nucleic Acids Res. 14(5):2287-2300.<br />
Hofmann, A., Nolan, G.P. und Blau, H.M. (1996) Rapid retroviral delivery of tetracyclineinducible<br />
genes in a single autoregulatory cassette. Proc Natl Acad Sci U S A. 93(11):5185-<br />
5190.<br />
Holliday, R. (1968) Genetic recombination in fungi. Replication and recombination of<br />
genetic material, j.W. Peacock and R.D. Brooks, eds. Canberra, Australian Academy of<br />
Science. 157-174<br />
Honigman, A., Zeira, E., Ohana, P., Abramovitz, R., Tavor, E., Bar, I., Zilberman, Y.,<br />
Rabinovsky, R., Gazit, D., Joseph, A., Panet, A., Shai, E., Palmon, A., Laster, M. und<br />
Galun, E. (2001) Imaging transgene expression in live animals. Mol Ther. 4(3):239-249.<br />
Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S. und Monk, M. (1987) HPRT-deficient<br />
(Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature.<br />
326(6110):292-295.<br />
Howe, J.R., Skryabin, B.V., Belcher, S.M., Zerillo, C.A. und Schmauss, C. (1995) The<br />
responsiveness of a tetracycline-sensitive expression system differs in different cell lines.<br />
J Biol Chem. 270(23):14168-14174.<br />
Huang, L.C., Wood, E.A. und Cox, M.M. (1991) A bacterial model system for<br />
chromosomal targeting. Nucleic Acids Res. 19(3):443-448.<br />
Hüttner, C.S., Zhang, P., Van Etten, R.A. und Tenen, D.G. (2000) Reversibility of acute<br />
B-cell leukaemia induced by BCR-ABL1. Nature Genet. 24(1):57-60<br />
Hüttner, K.M., Pudney, J., Milstone, D.S., Ladd, D. und Seidman, J.G. (1993) Flagellar<br />
and acrosomal abnormalities associated with testicular HSV-tk expression in the mouse. Biol<br />
Reprod. 49(2):251-261.<br />
Ingles, C.J., Shales, M., Cress, W.D., Triezenberg, S.J. und Greenblatt, J. (1991)<br />
Reduced binding of TFIID to transcriptionally compromised mutants of VP16. Nature.<br />
351(6327):588-590.<br />
Jacob, G.A. und Luse, D.S. (1996) GAL4-VP16 stimulates two RNA polymerase II<br />
promoters primarily at the preinitiation complex assembly step. Gene Expr. 5(3):193-203.<br />
Jang, S.K., Krausslich, H.G., Nicklin, M.J., Duke, G.M., Palmenberg, A.C. und<br />
Wimmer, E. (1988) A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus<br />
RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. J Virol. 62(8):2636-2643.<br />
Jasin, M., de Villiers, J., Weber, F. und Schaffner, W. (1985) High frequency of<br />
homologous recombination in mammalian cells between endogenous and introduced SV40<br />
genomes. Cell. 43(3 Pt 2):695-703.<br />
Jayaram, M. (1985) Two-micrometer circle site-specific recombination: the minimal<br />
substrate and the possible role of flanking sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 82(17):5875-<br />
5879.<br />
Kamper, M.R., Gohla, G. und Schluter, G. (2002) A novel positive tetracycline-dependent<br />
transactivator (rtTA) variant with reduced background activity and enhanced activation<br />
potential. FEBS Lett. 517(1-3):115-120.
7 Literatur 108<br />
Karreman, C. (1998) A new set of positive/negative selectable markers for mammalian cells.<br />
Gene. 218(1-2):57-61.<br />
Karreman, S., Hauser, H. und Karreman, C. (1996) On the use of double FLP recognition<br />
targets (FRTs) in the LTR of retroviruses for the construction of high producer cell lines.<br />
Nucleic Acids Res. 24(9):1616-1624.<br />
Kellendonk, C., Tronche, F., Monaghan, A.P., Angrand, P.O., Stewart, F. und Schutz,<br />
G. (1996) Regulation of Cre recombinase activity by the synthetic steroid RU 486. Nucleic<br />
Acids Res. 24(8):1404-1411.<br />
Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T. und Wiles, M.V. (1993) Hematopoietic<br />
commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13(1):473-<br />
486.<br />
Kilby, N.J., Snaith, M. und Murray, J. (1993) Site specific recombinases: tools for genome<br />
engineering. Trends Genet. 9(12):413-421.<br />
Kim, D.G., Kang, H.M., Jang, S.K. und Shin, H.S. (1992) Construction of a bifunctional<br />
mRNA in the mouse by using the internal ribosomal entry site of the encephalomyocarditis<br />
virus. Mol Cell Biol. 12(8):3636-3643<br />
Kisseberth, W.C., Brettingen, N.T., Lohse, J.K. und Sandgren, E.P. (1999) Ubiquitous<br />
expression of marker transgenes in mice and rats. Dev Biol. 214(1):128-138.<br />
Kistner, A., Gossen, M., Zimmermann, F., Jerecic, J., Ullmer, C., Lübbert, H. und<br />
Bujard, H. (1996) Doxycycline-mediated quantitative and tissue specific control of gene<br />
expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93(20):10933-10938.<br />
Klehr, D., Maass, K. und Bode, J. (1991) Scaffold-attached regions from the human<br />
inerferon β domain can be used to enhance the stable expression of genes under the control of<br />
various promoters. Biochemistry. 30(5):1264-1270.<br />
Koch, K.S., Aoki, T., Wang, Y., Atkinson, A.E., Gleiberman, A.S., Glebov, O.K. und<br />
Leffert, H.L. (2000) Site-specific integration of targeted DNA into animal cell genomes.<br />
Gene. 249(1-2):135-144.<br />
Kozak, M. (1984) Compilation and analysis of sequences upstream from the translational<br />
start site in eukaryotic mRNAs. Nucleic Acids Res. 12(2):857-872.<br />
Kramer, J., Hegert, C., Guan, K., Wobus, A.M., Muller, P.K. und Rohwedel, J. (2000)<br />
Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and<br />
BMP-4. Mech Dev. 92(2):193-205.<br />
Krestel, H.E., Mayford, M.R., Seeburg, P.H. und Sprengel, R. (2001) A GFP-equipped<br />
bidirectional expression module well suited for monitoring tetracycline-regulated gene<br />
expression in mouse. Nucleic Acids Res. 29(7):E39.<br />
Kucherlapati, R.S., Eves, E.M., Song, K.Y., Morse, B.S. und Smithies, O. (1984)<br />
Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by<br />
treatment of input DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81(10):3153-3157.<br />
Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M. und Rajewsky, K. (1995) Inducible gene targeting in<br />
mice. Science. 269(5229):1427-1429<br />
Kuhstoss, S. und Rao, R.N. (1991) Analysis of the integration function of the streptomycete<br />
bacteriophage phi C31. J Mol Biol. 222(4):897-908.
7 Literatur 109<br />
Kyba, M., Perlingeiro, R.C.R. und Daley, G.Q. (2002) HoxB4 confers definitive lymphoidmyeloid<br />
engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic<br />
progenitors. Cell. 109(1):29-37<br />
Lakso, M., Sauer, B., Mosinger, B. Jr, Lee, E.J., Manning, R.W., Yu, S.H., Mulder, K.L.<br />
und Westphal, H. (1992) Targeted oncogene activation by site-specific recombination in<br />
transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(14):6232-6236.<br />
Landy, A. (1989) Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific<br />
recombination. Annu Rev Biochem. 58:913-949.<br />
Langer, S.J., Ghafoori, A.P., Byrd, M. und Leinwand, L. (2002) A genetic screen<br />
identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res. 30(14):3067-3077.<br />
Lee, G. und Saito, I. (1998) Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cremediated<br />
recombination. Gene. 216(1):55-65.<br />
Lee, Y.S., Kim, S.T., Kim, G.W., Lee, M. und Park, J.S. (2000) An engineered lox<br />
sequence containing part of a long terminal repeat of HIV-1 permits Cre recombinasemediated<br />
DNA excision. Biochem Cell Biol. 78(6):653-658.<br />
Leuchtenberger, S., Perz, A., Gatz, C. und Bartsch, J.W. (2001) Conditional cell ablation<br />
by stringent tetracycline-dependent regulation of barnase in mammalian cells. Nucleic Acids<br />
Res. 29(16):E76.<br />
Li, Z.W., Stark, G., Gotz, J., Rulicke, T., Gschwind, M., Huber, G., Muller, U. und<br />
Weissmann, C. (1996) Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene<br />
deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells.<br />
Proc Nat Acad Sci USA. 93(12):6158-6162<br />
Lin, F.L., Sperle, K. und Sternberg, N. (1984) Homologous recombination in mouse L<br />
cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 49:139-149.<br />
Lin, Y.S., Ha, I., Maldonado, E., Reinberg, D. und Green, M.R. (1991) Binding of general<br />
transcription factor TFIIB to an acidic activating region. Nature. 353(6344):569-571.<br />
Liu, S., Qu, Y., Stewart, T.J., Howard, M.J., Chakrabortty, S., Holekamp, T.F. und<br />
McDonald, J.W. (2000) Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and<br />
myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
97(11):6126-6131.<br />
Logie, C. und Stewart, A.F. (1995) Ligand-regulated site-specific recombination. Proc Natl<br />
Acad Sci U S A. 92(13):5940-5944.<br />
Lyznik, L.A., Mitchell, J.C., Hirayama, L. und Hodges, T.K. (1993) Activity of yeast FLP<br />
recombinase in maize and rice protoplasts. Nucleic Acids Res. 21(4):969-975.<br />
Mack, A., Sauer, B., Abremski, K. und Hoess, R. (1992) Stoichiometry of the Cre<br />
recombinase bound to the lox recombining site. Nucleic Acids Res. 20(17):4451-4455.<br />
Magin, T.M., McWhir, J. und Melton, D.W. (1992) A new mouse embryonic stem cell line<br />
with good germ line contribution and gene targeting frequency. Nucleic Acids Res.<br />
20(14):3795-3796.<br />
Mansour, S.L., Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1988) Disruption of the protooncogene<br />
int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations<br />
to non-selectable genes. Nature. 336(6197):348-352.
7 Literatur 110<br />
Mansuy, I.M., Mayford, M., Jacob, B., Kandel, E.R. und Bach, M.E. (1998) Restricted<br />
and regulated overexpression reveals calcineurin as a key component in the transition from<br />
short-term to long-term memory. Cell. 92(1):39-49<br />
Mao, X., Fujiwara, Y. und Orkin, S.H. (1999) Improved reporter strain for monitoring Cre<br />
recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(9):5037-5042.<br />
Margolin, J.F., Friedman, J.R., Meyer, W.K., Vissing, H., Thiesen, H.J. und Rauscher,<br />
F.J. 3rd. (1994) Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains. Proc<br />
Natl Acad Sci U S A.: 91(10):4509-13.<br />
Martin, G.R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in<br />
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78(12):7634-<br />
7638.<br />
Matsuda, T., Nakamura, T., Nakao, K.T., Katsuki, M., Heike, T. und Yokota, T. (1999)<br />
STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem<br />
cells. EMBO J. 18(15):4261-4269.<br />
Mayford, M., Bach, M.E., Huang, Y.Y., Wang, L., Hawkins, R.D. und Kandel E.R.<br />
(1996) Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.<br />
Science. 274(5293):1678-1683.<br />
McLeod, M., Craft, S. und Broach, J.R. (1986) Identification of the crossover site during<br />
FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol<br />
Cell Biol. 6(10):3357-3367.<br />
Mei, Q., Kothary, R. und Wall, R. (2000) The tkNeo gene, but not the pgkPuro gene, can<br />
influence the ability of the β-globin LCR to enhance and confer position-independent<br />
expression onto the β-globin gene. Exp Cell Res. 260(2):304-312<br />
Melton, D.W., Ketchen, A.M. und Selfridge, J. (1997) Stability of HPRT marker gene<br />
expression at different gene-targeted loci: observing and overcoming a position effect.<br />
Nucleic Acids Res. 25(19):3937-3943.<br />
Melton, D.W., Konecki, D.S., Brennand, J. und Caskey, C.T. (1984) Structure, expression,<br />
and mutation of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
81(7):2147-2151.<br />
Meselson, M.S. und Radding, C.M. (1975) A general model for genetic recombination. Proc<br />
Natl Acad Sci U S A. 72(1):358-361.<br />
Metzger, D. und Feil, R. (1999) Engineering the mouse genome by site-specific<br />
recombination. Curr Opin Biotechnol. 10(5):470-6.<br />
Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H. und Chambon, P. (1995) Conditional site-specific<br />
recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc<br />
Natl Acad Sci U S A. 92(15):6991-6995.<br />
Miller-Hance, W.C., LaCorbiere, M., Fuller, S.J., Evans, S.M., Lyons, G., Schmidt, C.,<br />
Robbins, J. und Chien, K.R. (1993) In vitro chamber specification during embryonic stem<br />
cell cardiogenesis. Expression of the ventricular myosin light chain-2 gene is independent of<br />
heart tube formation. J Biol Chem. 268(33):25244-25252.<br />
Mizuguchi, H., Xu, Z., Ishii-Watabe, A., Uchida, E. und Hayakawa, T. (2000) IR<strong>ES</strong>dependent<br />
second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene<br />
expression in a bicistronic vector. Mol Ther. 1(4):376-382.
7 Literatur 111<br />
Moser, S., Rimann, M., Fux, C., Schlatter, S., Bailey, J.E. und Fussenegger, M. (2001)<br />
Dual-regulated expression technology, a new era in adjusting heterologous gene expression in<br />
mammalian cells. J Gene Med. 3(6):1-23.<br />
Moser, S., Schlatter, S., Fux, C., Rimann, M., Bailey, J.E. und Fussenegger, M. (2000)<br />
An update of pTRIDENT multicistronic expression vectors: pTRIDENTs containing novel<br />
strptogramin-responsive promotors. Biotechnol Prog. 16(5):724-735.<br />
Müller, G., Hecht, B., Helbl, V., Hinrichs, W., Saenger, W. und Hillen, W. (1995)<br />
Characterization of non-inducible Tet repressor mutants suggests conformational changes<br />
necessary for induction. Nat Struct Biol. 2(8):693-703.<br />
Nagy, A. (2000) Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis.<br />
26(2):99-109.<br />
Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I. und Smith, A. (1998) Self-renewal of pluripotent<br />
embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12(13):2048-2060<br />
Niwa, H., Yamamura, K. und Miyazaki, J. (1991) Efficient selection for high-expression<br />
transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108(2):193-199.<br />
Noguchi, N., Emura, A., Matsuyama, H., O'Hara, K., Sasatsu, M. und Kono, M. (1995)<br />
Nucleotide sequence and characterization of erythromycin resistance determinant that encodes<br />
macrolide 2'-phosphotransferase I in Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother.<br />
39(10):2359-2363.<br />
Noguchi, N., Takada, K., Katayama, J., Emura, A. und Sasatsu, M. (2000) Regulation of<br />
transcription of the mph(A) gene for macrolide 2’-phosphotransferase I in Escherichia coli:<br />
characterization of the regulatory gene mphR(A). J Bacteriol. 182(18):5052-5058<br />
O’Gorman, S., Fox, D.T. und Wahl, G.M. (1991) Recombinase-mediated gene activation<br />
and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251(4999):1351-1355.<br />
O'Brien, K., Otto, K. und Rao, R.N. (1997) Construction and characterization of a oneplasmid<br />
system for the controlled expression of genes in mammalian cells by tetracycline.<br />
Gene. 184(1):115-120.<br />
Orban, P.C., Chui, D. und Marth, J.D. (1992) Tissue- and site-specific DNA recombination<br />
in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(15):6861-6855.<br />
Orth, P., Cordes, F., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W. und Hinrichs, W. (1998)<br />
Conformational changes of the Tet repressor induced by tetracycline trapping. J Mol Biol.<br />
279(2):439-447.<br />
Oumard, A. (2001) Translationsregulation des Transkriptionsfaktors NRF : Funktionelle<br />
Charakterisierung eines zellulären IR<strong>ES</strong>-Elementes, Dissertation. Technische Universität<br />
Braunschweig<br />
Oumard, A., Hennecke, M., Hauser, H. und Nourbakhsh, M. (2000) Translation of NRF<br />
mRNA is mediated by highly efficient internal ribosome entry. Mol Cell Biol. 20(8):2755-<br />
2759<br />
Pham, C.T., MacIvor, D.M., Hug, B.A., Heusel, J.W. und Ley, T.J. (1996) Long-range<br />
disruption of gene expression by a selectable marker cassette. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
93(23):13090-13095.<br />
Piquet-Pellorce, C., Grey, L., Mereau, A. und Heath, J.K. (1994) Are LIF and related<br />
cytokines functionally equivalent? Exp Cell Res. 213(2):340-347.
7 Literatur 112<br />
Postle, K., Nguyen, T.T. und Bertrand, K.P. (1984) Nucleotide sequence of the repressor<br />
gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12(12):4849-4863.<br />
Ramirez-Solis, R., Liu, P. und Bradley, A. (1995) Chromosome engineering in mice.<br />
Nature. 378(6558):720-724.<br />
Rausch, H. und Lehmann, M. (1991) Structural analysis of the actinophage phi C31<br />
attachment site. Nucleic Acids Res. 19(19):5187-5189.<br />
Rayssiguier, C., Thaler, D.S. und Radman, M. (1989) The barrier to recombination<br />
between Escherichia coli and Salmonella typhimurium is disrupted in mismatch-repair<br />
mutants. Nature. 342(6248):396-401.<br />
Regier, J.L., Shen, F. und Triezenberg, S.J. (1993) Pattern of aromatic and hydrophobic<br />
amino acids critical for one of two subdomains of the VP16 transcriptional activator. Proc<br />
Natl Acad Sci U S A. 90(3):883-887.<br />
Reid, L.H., Gregg, R.G., Smithies, O. und Koller, B.H. (1990) Regulatory elements in the<br />
introns of the human HPRT gene are necessary for its expression in embryonic stem cells.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 87(11):4299-4303.<br />
Reid, L.H., Shesely, E.G., Kim, H.S. und Smithies, O. (1991) Cotransformation and gene<br />
targeting in mouse embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 11(5):2769-2777<br />
Rideout, W.M. 3rd, Wakayama, T., Wutz, A., Eggan, K., Jackson-Grusby, L., Dausman,<br />
J., Yanagimachi, R. und Jaenisch, R. (2000) Generation of mice from wild-type and<br />
targeted <strong>ES</strong> cells by nuclear cloning. Nat Genet. 24(2):109-110.<br />
Ringrose, L., Lounnas, V., Ehrlich, L., Buchholz, F., Wade, R. und Stewart, A.F. (1998)<br />
Comparative kinetic analysis of FLP and cre recombinases: mathematical models for DNA<br />
binding and recombination. J Mol Biol. 284(2):363-384.<br />
Risau, W., Sariola, H., Zerwes, H.G., Sasse, J., Ekblom, P., Kemler, R. und Doetschman<br />
T. (1988) Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies.<br />
Development. 102(3):471-478.<br />
Robertson, E., Bradley, A., Kühn, M. und Evans, M. (1986) Germ-line transmission of<br />
genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature.<br />
323(6087):445-448.<br />
Rodriguez, C.I., Buchholz, F., Galloway, J., Sequerra, R., Kasper, J., Ayala, R., Stewart,<br />
A.F. und Dymecki, S.M. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an<br />
alternative to Cre-loxP. Nat Genet. 25(2):139-140.<br />
Rohwedel, J., Guan, K. und Wobus A.M. (1999) Induction of cellular differentiation by<br />
retinoic acid in vitro. Cells Tissues Organs. 165(3-4):190-202.<br />
Rohwedel, J., Guan, K., Zuschratter, W., Jin, S., Ahnert-Hilger, G., Furst, D., Fassler,<br />
R. und Wobus, A.M. (1998a) Loss of beta1 integrin function results in a retardation of<br />
myogenic, but an acceleration of neuronal, differentiation of embryonic stem cells in vitro.<br />
Dev Biol. 201(2):167-184.<br />
Rohwedel, J., Kleppisch, T., Pich, U., Guan, K., Jin, S., Zuschratter, W., Hopf, C., Hoch,<br />
W., Hescheler, J., Witzemann, V. und Wobus, A.M. (1998b) Formation of postsynapticlike<br />
membranes during differentiation of embryonic stem cells in vitro. Exp Cell Res.<br />
239(2):214-225.
7 Literatur 113<br />
Rohwedel, J., Maltsev, V., Bober, E., Arnold, H.H., Hescheler, J. und Wobus, A.M.<br />
(1994) Muscle cell differentiation of embryonic stem cells reflects myogenesis in vivo:<br />
developmentally regulated expression of myogenic determination genes and functional<br />
expression of ionic currents. Dev Biol. 164(1):87-101.<br />
Rose, T.M., Weiford, D.M., Gunderson, N.L. und Bruce, A.G. (1994) Oncostatin M<br />
(OSM) inhibits the differentiation of pluripotent embryonic stem cells in vitro. Cytokine.<br />
6(1):48-54<br />
Roth, D.B. und Wilson, J.H. (1986) Nonhomologous recombination in mammalian cells:<br />
role for short sequence homologies in the joining reaction. Mol Cell Biol. 6(12):4295-4304.<br />
Rothstein, R.J. (1983) One-step gene disruption in yeast. Methods Enzymol. 101:202-211.<br />
Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S. und Ptashne, M. (1988) GAL4-VP16 is an unusually<br />
potent transcriptional activator. Nature. 335(6190):563-564.<br />
Sadowski, P.D. (1993) Site-specific genetic recombination: hops, flips and flops. FASEB J.<br />
7(9):760-767.<br />
Sadowski, P.D. (1995) The Flp recombinase of the 2-microns plasmid of Saccharomyces<br />
cerevisiae. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 51:53-91.<br />
Saez, E., No, D., West, A. und Evans, R.M. (1997) Inducible gene expression in mammalian<br />
cells and transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 8(5):608-616.<br />
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B.<br />
und Erlich, H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a<br />
thernostable DNA polymerase. Science. 239(4839):487-491.<br />
Salah-Bey, K. und Thompson, C.J. (1995) Unusual regulatory mechanism for a<br />
Streptomyces multidrug resistance gene, ptr, involving three homologous protein-binding<br />
sites overlapping the promoter region. Mol Microbiol. 17(6):1109-1119.<br />
Salah-Bey, K., Blanc, V. und Thompson, C.J. (1995) Stress-activated expression of a<br />
Streptomyces pristinaespiralis multidrug resistance gene (ptr) in various Streptomyces spp.<br />
and Escherichia coli. Mol Microbiol. 17(5):1001-1012.<br />
Sauer, B. (1994) Site-specific recombination: Developments and applications. Curr. Opin.<br />
Biotechnol. 5(5):521-527.<br />
Sauer, B. (1996) Multiplex Cre/lox recombination permits selective site-specific DNA<br />
targeting to both a natural and an engineered site in the yeast genome. Nucleic Acids Res.<br />
24(23):4608-4613.<br />
Sauer, B. (1998) Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods.<br />
14(4):381-392.<br />
Sauer, B. und Henderson, N. (1990) Targeted insertion of exogenous DNA into the<br />
eukaryotic genome by the Cre recombinase. New Biol. 2(5):441-449.<br />
Schaft, J., Ashery-Padan, R., van der Hoeven, F., Gruss, P. und Stewart, A.F. (2001)<br />
Efficient FLP recombination in mouse <strong>ES</strong> cells and oocytes. Genesis. 31(1):6-10.<br />
Scherer, S. und Davis, R.W. (1979) Replacement of chromosome segments with altered<br />
DNA sequences constructed in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(10):4951-4955.<br />
Schlake, T. und Bode, J. (1994) Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the<br />
exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry. 33(43):12746-<br />
12751.
7 Literatur 114<br />
Schmidt, E.E., Taylor, D.S., Prigge, J.R., Barnett, S. und Capecchi, M.R. (2000)<br />
Illegitime Cre dependent chromosome rearrangements in transgenic mouse spermatids. Proc<br />
Natl Acad Sci U S A. 97(25):13702-13707<br />
Schmitt, R.M., Bruyns, E. und Snodgrass, H.R. (1991) Hematopoietic development of<br />
embryonic stem cells in vitro: cytokine and receptor gene expression. Genes Dev. 5(5):728-<br />
740.<br />
Schmitz, M.L. und Bäuerle, P.A. (1991) The p65 subunit is responsible for the strong<br />
transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO J. 10(12):3805-3817.<br />
Schmitz, M.L., dos Santos Silva. M.A., Altmann, H., Czisch, M., Holak, T.A. und<br />
Bäuerle, P.A. (1994) Structural and functional analysis of the NF-kappa B p65 C terminus.<br />
An acidic and modular transactivation domain with the potential to adopt an alpha-helical<br />
conformation. J Biol Chem. 269(41):25613-25620.<br />
Schübeler, D. (1998). Sequenzspezifische Expression <strong>zur</strong> Expression <strong>von</strong> Fremdgenen und<br />
<strong>zur</strong> Analyse cis-agierender Elemente. Dissertation. Technische Universität Braunschweig<br />
Schübeler, D., Maaß, K. und Bode, J. (1998) Retargeting of retroviral integration sites for<br />
the predictable expression of transgenes and the analysis of cis-acting sequences.<br />
Biochemistry. 37(34):11907-11914.<br />
Schübeler, D., Mielke, C. und Bode, J. (1997) Excision of an integrated provirus by the<br />
action of FLP-recombinase. In vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33(10):825-830.<br />
Schuldiner, M., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Melton, D.A. und Benvenisty, N. (2000)<br />
Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic<br />
stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(21):11307-11312.<br />
Seibler, J. (1999) Sequenzspezifische Rekombination <strong>zur</strong> gezielten Manipulation des<br />
Mammaliagenoms. Dissertation. Technische Universität Braunschweig<br />
Seibler, J. und Bode, J. (1997) Double-Reciprocal Crossover Mediated by FLP-<br />
Recombinase: A Concept and an Assay Biochemistry. 36(7):1740 -1747<br />
Seibler, J., Schübeler, D., Fiering, S., Groudine, M. und Bode, J. (1998) DNA cassette<br />
exchange in <strong>ES</strong> cells mediated by Flp recombinase: an efficient strategy for repeated<br />
modification of tagged loci by marker-free constructs. Biochemistry. 1998 37(18):6229-6234.<br />
Selva, E.M., New, L., Crouse, G.F. und Lahue, R.S. (1995) Mismatch correction acts as a<br />
barrier to homeologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 139(3):1175-<br />
1188.<br />
Senecoff, J.F. und Cox, M.M. (1986) Directionality in FLP protein-promoted site-specific<br />
recombination is mediated by DNA-DNA pairing. J. Biol. Chem. 261(16):7380-7386.<br />
Senecoff, J.F., Bruckner, R.C. und Cox, M.M. (1985) The FLP recombinase of the yeast 2-<br />
micron plasmid: characterization of its recombination site. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
82(21):7270-7274.<br />
Senecoff, J.F., Rossmeissl, P.J. und Cox, M.M. (1988) DNA recognition by the FLP<br />
recombinase of the yeast 2 mu plasmid. A mutational analysis of the FLP binding site. J Mol<br />
Biol. 201(2):405-421.<br />
Shin, M.K., Levorse, J.M., Ingram, R.S. und Tilghman, S.M. (1999) The temporal<br />
requirement for endothelin receptor-B signalling during neural crest development. Nature.<br />
402(6761):496-501.
7 Literatur 115<br />
Shinohara, A. und Ogawa, T. (1995) Homologous recombination and the roles of doublestrand<br />
breaks. Trends Biochem Sci. 20(10):387-391.<br />
Shockett, P., Difilippantonio, M., Hellman, N. und Schatz, D.G. (1995) A modified<br />
tetracycline-regulated system provides autoregulatory, inducible gene expression in cultured<br />
cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 92(14):6522-6526.<br />
Silver, D.P. und Livingston, D.M. (2001) Self-excising retroviral vectors encoding the Cre<br />
recombinase overcome Cre-mediated cellular toxicity. Mol. Cell. 8(1):233-243.<br />
Silverman, N., Agapite, J. und Guarente, L. (1994) Yeast ADA2 protein binds to the VP16<br />
protein activation domain and activates transcription. Proc Natl Acad Sci U S A.<br />
91(24):11665-11668.<br />
Smith, A.G. und Hooper, M.L. (1987) Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity<br />
which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells.<br />
Dev Biol. 121(1):1-9.<br />
Smith, A.J. und Berg, P. (1984) Homologous recombination between defective neo genes in<br />
mouse 3T6 cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 49:171-181.<br />
Smithies, O., Gregg, R.G., Boggs, S.S., Koralewski, M.A. und Kucherlapati R.S. (1985)<br />
Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous<br />
recombination. Nature. 317(6034):230-234.<br />
Smithies, O., Koralewski, M.A., Song, K.Y. und Kucherlapati, R.S. (1984) Homologous<br />
recombination with DNA introduced into mammalian cells. Cold Spring Harb Symp Quant<br />
Biol. 49:161-170.<br />
Soriano, P. (1999) Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat<br />
Genet. 21(1):70-71.<br />
Soukharev, S., Miller, J.L. und Sauer, B. (1999) Segmental genomic replacement in<br />
embryonic stem cells by double lox targeting. Nucleic Acids Res. 27(18):e21.<br />
Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C.S., William, C.M., Tanabe, Y., Jessell, T.M. und<br />
Costantini, F. (2001) Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP<br />
into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1(1):4.<br />
Stacey, A., Schnieke, A., McWhir, J., Cooper, J., Colman, A. und Melton, D.W. (1994)<br />
Use of double-replacement gene targeting to replace the murine alpha-lactalbumin gene with<br />
its human counterpart in embryonic stem cells and mice. Mol Cell Biol. 14(2):1009-1016.<br />
Stahl, F.W. (1979) Genetic recombination: Thinking about it in phage and fungi. San<br />
Francisco: W.H. Freeman<br />
Stark, W.M., Boocock, M.R. und Sherratt, D.J. (1992) Catalysis by site-specific<br />
recombinases. Trends Genet. 8(12):432-439.<br />
Steele, R.E., Bakken, A.H. und Reeder R.H. (1984) Plasmids containing mouse rDNA do<br />
not recombine with cellular ribosomal genes when introduced into cultured mouse cells. Mol<br />
Cell Biol. 4(4):576-582.<br />
St-Onge, L., Furth, P.A. und Gruss, P. (1996) Temporal control of Cre recombinase in<br />
transgenic mice by a tetracycline responsive promoter. Nucleic Acids Res. 24(19):3875-3877<br />
Strathdee, C.A., McLeod, M.R. und Hall, J.R. (1999) Efficient control of tetracyclineresponsive<br />
gene expression from an autoregulated bi-directional expression vector. Gene.<br />
229(1-2):21-29.
7 Literatur 116<br />
Strübing, C., Ahnert-Hilger, G., Shan, J., Wiedenmann, B., Hescheler, J. und Wobus,<br />
A.M. (1995) Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in<br />
vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech Dev. 53(2):275-287.<br />
Sullivan, M.J., Carpenter, A.J. und Porter, A.C. (2001) A 'select and swap' strategy for the<br />
isolation of clones with tightly regulated transgenes. Eur J Biochem. 268(6):1605-1612.<br />
Szostak, J.W., Orr-Weaver, T.L., Rothstein, R.J. und Stahl, F.W. (1983) The doublestrand<br />
break repair model for recombination. Cell. 33(1):25-35.<br />
Templeton, N.S., Roberts, D.D. und Safer, B. (1997) Efficient gene targeting in mouse<br />
embryonic stem cells. Gene Ther. 4(7):700-709.<br />
Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1986) Introduction of homologous DNA sequences into<br />
mammalian cells induces mutations in the cognate gene. Nature. 324(6092):34-38.<br />
Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Site-directed mutagenesis by gene targeting in<br />
mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51(3):503-512.<br />
Thomas, K.R., Folger, K.R. und Capecchi, M.R. (1986) High frequency targeting of genes<br />
to specific sites in the mammalian genome. Cell. 44(3):419-428.<br />
Thompson, E.M., Adenot, P., Tsuji, F.I. und Renard, J.P. (1995) Real time imaging of<br />
transcriptional activity in live mouse preimplantation embryos using a secreted luciferase.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 92(5):1317-1321.<br />
Thorpe, H.M. und Smith, M.C. (1998) In vitro site-specific integration of bacteriophage<br />
DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc Natl Acad Sci<br />
U S A. 95(10):5505-5510<br />
Thorpe, H.M., Wilson, S.E. und Smith, M.C. (2000) Control of directionality in the sitespecific<br />
recombination system of the Streptomyces phage phiC31. Mol Microbiol. 38(2):232-<br />
241.<br />
Thyagarajan, B., Guimaraes, M.J., Groth, A.C. und Calos, M.P. (2000) Mammalian<br />
genomes contain active recombinase recognition sites. Gene. 244(1-2):47-54.<br />
Tremblay, P., Meiner, Z., Galou, M., Heinrich, C., Petromilli, C., Lisse, T., Cayetano, J.,<br />
Torchia, M., Mobley, W., Bujard, H., DeArmond, S.J. und Prusiner, S.B. (1998)<br />
Doxycycline control of prion protein transgene expression modulates prion disease in mice.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 95(21):12580-12585.<br />
Tribble, G., Ahn, Y.T., Lee, J., Dandekar, T. und Jayaram, M. (2000) DNA recognition,<br />
strand selectivity, and cleavage mode during integrase family site-specific recombination.<br />
J Biol Chem. 275(29):22255-22267.<br />
Triezenberg, S.J., Kingsbury, R.C. und McKnight, S.L. (1988) Functional dissection of<br />
VP16, the transactivator of herpes simplex virus immediate early gene expression. Genes<br />
Dev. 2(6):718-729.<br />
Triezenberg, S.J., LaMarco, K.L. und McKnight, S.L. (1988) Evidence of DNA: protein<br />
interactions that mediate HSV-1 immediate early gene activation by VP16. Genes Dev.<br />
2(6):730-742.<br />
Tsuda, H., Maynard-Currie, C.E., Reid, L.H., Yoshida, T., Edamura, K., Maeda, N.,<br />
Smithies, O. und Jakobovits, A. (1997) Inactivation of mouse HPRT locus by a 203-bp<br />
retroposon insertion and a 55-kb gene-targeted deletion: establishment of new hprt-deficient<br />
mouse embryonic stem cell lines. Genomics. 42(3):413-421.
7 Literatur 117<br />
Umlauf, S.W. und Cox, M.M. (1988) The functional significance of DNA sequence<br />
structure in a site-specific genetic recombination reaction. EMBO J. 7(6):1845-1852.<br />
Urlinger, S., Baron, U., Thellmann, M., Hasan, M.T., Bujard, H. und Hillen, W. (2000b)<br />
Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel<br />
mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(14):7963-7968.<br />
Urlinger, S., Helbl, V., Guthmann, J., Pook, E., Grimm, S. und Hillen, W. (2000a) The<br />
p65 domain from NF-kappaB is an efficient human activator in the tetracycline-regulatable<br />
gene expression system. Gene.: 247(1-2):103-110.<br />
Utomo, A.R.H., Nikitin, A.Y. und Lee, W.H. (1999) Temporal, spatial, and cell typespecific<br />
control of Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice. Nat Biotechnol.:<br />
17(11):1091-1096.<br />
Valancius, V. und Smithies, O. (1991) Testing an "in-out" targeting procedure for making<br />
subtle genomic modifications in mouse embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 11(3):1402-<br />
1408.<br />
Van Duyne, G.D. (2001) A structural view of cre-loxp site-specific recombination. Annu Rev<br />
Biophys Biomol Struct. 30:87-104.<br />
Verhoeyen, E., Hauser. H. und Wirth, D. (1998) Efficient targeting of retrovirally FRTtagged<br />
chromosomal loci. Tech. Tips Online. Nr. S0168-9625(98)01515-01517.<br />
Verhoeyen, E., Hauser. H. und Wirth, D. (2001) Evaluation of retroviral vector design in<br />
defined chromosomal loci by FLP-mediated cassette replacemant. Hum. Gene Ther.<br />
12(8):933-944.<br />
Vooijs, M., van der Valk, M., te Riele, H. und Berns, A. (1998) Flp-mediated tissuespecific<br />
inactivation of the retinoblastoma tumor suppressor gene in the mouse. Oncogene.<br />
17(1):1-12.<br />
Waite, L.L. und Cox, M.M. (1995) A protein dissociation step limits turnover in FLP<br />
recombinase-mediated site-specific recombination. J Biol Chem. 270(40):23409-23414.<br />
Waldman, A.S. und Liskay, R.M. (1988) Dependence of intrachromosomal recombination<br />
in mammalian cells on uninterrupted homology. Mol Cell Biol. 8(12):5350-5357.<br />
Wallenburg, J.C., Nepveu, A. und Chartrand, P. (1987) Integration of a vector containing<br />
rodent repetitive elements in the rat genome. Nucleic Acids Res. 15(19):7849-7863.<br />
Wang, R., Clark, R. und Bautch, V.L. (1992) Embryonic stem cell-derived cystic embryoid<br />
bodies form vascular channels: an in vitro model of blood vessel development. Development.<br />
114(2):303-316.<br />
Weber, W., Fux, C., Daoud-el Baba, M., Keller, B., Weber, C.C., Kramer, B.P., Heinzen,<br />
C., Aubel, D., Bailey, J.E. und Fussenegger, M. (2002a) Macrolide-based transgene control<br />
in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol. 20(9):901-907.<br />
Weber, W., Kramer, B.P., Fux, C., Keller, B. und Fussenegger, M. (2002b) Novel<br />
promotor/transactivator configurations for macrolide- and streptogramin-responsive transgene<br />
expression in mammalian cells. J Gene Med. 4(6):676-686.<br />
Weber, W., Marty, R.R., Keller, B., Rimann, M., Kramer, B.P. und Fussenegger, M.<br />
(2002c) Versatile macrolide-responsive mammalian expression vectors for multiregulated<br />
multigene metabolic engineering. Biotechnol Bioeng. 80(6):691-705.
7 Literatur 118<br />
Wildner, O., Candotti, F., Krecko, E.G., Xanthopoulos, K.G., Ramsey, W.J. und Blaese,<br />
R.M. (1998) Generation of a conditionally neo(r)-containing retroviral producer cell line:<br />
effects of neo(r) on retroviral titer and transgene expression. Gene Ther. 5(5):684-691.<br />
Wiles, M.V. und Johansson, B.M. (1999) Embryonic stem cell development in a chemically<br />
defined medium. Exp Cell Res. 247(1):241-248.<br />
Williams, J.D. und Sefton, A.M. (1993) Comparison of macrolide antibiotics. J Antimicrob<br />
Chemother. 31 Suppl C:11-26.<br />
Williams, R.L., Hilton, D.J., Pease, S., Willson, T.A., Stewart, C.L., Gearing, D.P.,<br />
Wagner, E.F. Metcalf, D., Nicola, N.A. und Gough, N.M. (1988) Myeloid leukaemia<br />
inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature.<br />
336(6200):684-687.<br />
Wobus, A.M. (2001) Potential of embryonic stem cells. Mol Aspects Med. 22(3):149-164.<br />
Wobus, A.M., Kaomei, G., Shan, J., Wellner, M.C., Rohwedel, J., Guanju, J.,<br />
Fleischmann, B., Katus, H.A., Hescheler, J. und Franz, W.M. (1997) Retinoic acid<br />
accelerates embryonic stem cell-derived cardiac differentiation and enhances development of<br />
ventricular cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 29(6):1525-1539.<br />
Wobus, A.M., Kleppisch, T., Maltsev, V. und Hescheler, J. (1994) Cardiomyocyte-like<br />
cells differentiated in vitro from embryonic carcinoma cells P19 are characterized by<br />
functional expression of adrenoceptors and Ca2+ channels. In Vitro Cell Dev Biol Anim.<br />
30A(7):425-434.<br />
Wobus, A.M., Wallukat, G. und Hescheler, J. (1991) Pluripotent mouse embryonic stem<br />
cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to<br />
adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48(3):173-182.<br />
Wright, A.P., Maundrell, K. und Shall, S. (1986) Transformation of Schizosaccharomyces<br />
pombe by non-homologous, unstable integration of plasmids in the genome. Curr Genet.<br />
10(7):503-508.<br />
Wu, H., Liu, X. und Jänisch, R. (1994) Double replacement: Strategy for efficient<br />
introduction of subtle mutations into the murine Col1α-1 gene by homologous recombination<br />
in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 91(7):2819-2823.<br />
Wutz, A. und Jänisch, R. A. (2000) shift from reversible to irreversible X inactivation is<br />
triggered during <strong>ES</strong> cell differentiation. Mol Cell. 5(4):695-705.<br />
Yamamoto, A., Lucas, J.J. und Hen, R. (2000) Reversal of neuropathology and motor<br />
dysfunction in a conditional model of Huntington’s disease. Cell. 101(1):57-66.<br />
Yaworsky, P.J., Gardner, D.P. und Kappen, C. (1997) Transgenic analyses reveal<br />
developmentally regulated neuron- and muscle-specific elements in the murine neurofilament<br />
light chain gene promoter. J Biol Chem. 272(40):25112-25120.<br />
Yin, D.X., Zhu, L. und Schimke, R.T. (1996) Tetracycline-controlled gene expression<br />
system achieves high-level and quantitative control of gene expression. Anal Biochem.<br />
235(2):195-201.<br />
Yoshida, Y. und Hamada, H. (1997) Adenovirus-mediated inducible gene expression<br />
through tetracycline-controllable transactivator with nuclear localization signal. Biochem<br />
Biophys Res Commun. 230(2):426-430<br />
Yueh, Y.G., Gardner, D.P. und Kappen, C. (1998) Evidence for regulation of cartilage<br />
differentiation by the homeobox gene Hoxc-8. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(17):9956-9961.
7 Literatur 119<br />
Yueh, Y.G., Yaworsky, P.J. und Kappen, C. (2000) Herpes simplex virus transcriptional<br />
activator VP16 is detrimental to preimplantation development in mice. Mol Reprod Dev.<br />
55(1):37-46.<br />
Zambrowicz, B.P., Imamoto, A., Fiering, S., Herzenberg, L.A., Kerr, W.G. und Soriano,<br />
P. (1997) Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain<br />
leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic<br />
cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(8):3789-3794.<br />
Zhang, H., Hasty, P. und Bradley, A. (1994) Targeting frequency for deletion vectors in<br />
embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 14(4):2404-2410.<br />
Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E.A., Jurecic, V. und Bradley, A. (2000) Engineering<br />
mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell<br />
Biol. 20(2):648-655.
7 Literatur 120<br />
Danksagung<br />
Herrn Prof. Dr. Jürgen Bode und Herrn Prof. Dr. Leopold Flohé danke ich dafür, dass sie<br />
diese Arbeit vor der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität<br />
Braunschweig vertreten. Herrn Prof. Dr. Jahn danke ich für seine Bereitschaft <strong>zur</strong> Teilnahme<br />
an der Prüfungskommission.<br />
Die vorliegende Arbeit wurde unter Anleitung <strong>von</strong> Frau Dr. Dagmar Wirth und Herrn Dr.<br />
Hansjörg Hauser in der Arbeitsgruppe Regulation und Differenzierung an der Gesellschaft für<br />
Biotechnologische Forschung mbH (GBF), Braunschweig angefertig.<br />
Mein besonderer Dank gilt Dagmar Wirth, die mich motivierte, viele Denkanstöße gab und<br />
sich stets mit meiner Arbeit konstruktiv auseinandersetzte. Hansjörg Hauser danke ich für<br />
seinen unerschütterlichen Optimismus und für sein großes Interesse an meiner Arbeit.<br />
Mein Dank geht an alle ehemaligen und derzeitigen Kollegen der Arbeitsgruppe „EUGEN“,<br />
die mir viele Anregungen und Hilfen gaben und mir Spaß und Freude bei der täglichen Arbeit<br />
und im Privatleben bereiteten.<br />
Ich danke insbesondere Els Verhoeyen und Meike Tümmler für einen tollen Start in das<br />
Laborleben, Jacqueline Unsinger und Dirk Spitzer für eine gute Zwischenzeit, Tobias May,<br />
Roland Schucht, Alexander Jockwer, Sabrina Herrmann und Susann Herrmann für ein klasse<br />
Finish. Weiterhin danke ich den Mitarbeiter des SAR-Labors wie Kristina Nehlsen, Sandra<br />
Götze und Karin Maaß für die netten und witzigen Gespräche und für ihre stille Toleranz,<br />
wenn ich ihnen auf die Nerven ging. An Maria Höxter geht mein Dank für ihre<br />
Zellsortierungen. Alexandra Baer, Tobias May und Dagmar Wirth danke ich für die kritische<br />
Durchsicht des Manuskripts.<br />
Ich danke Alex für fast zwei Jahre gemeinsames Leben, für ihre Unterstützung und Hilfe, für<br />
die Geborgenheit, die ich an ihrer Seite fand, für die schönen Momente in dieser Zeit, für ihr<br />
Durchhalten in schweren Tagen, für die Träume, die wir hatten, für die Liebe, die Sie mir gab.<br />
Ich danke Beate für alles, was mich bis hierher gebracht hat, für die vielen Jahre während des<br />
Studiums, für die Anerkennung und den Glauben an mich.<br />
Ich danke meinem Sohn Louis für seine grenzenlose Liebe, die mir am Ende den Halt und die<br />
Hoffnung gab, den Weg zu beenden. Ich bin glücklich, dass es Dich gibt.<br />
Ich danke meinen besten Freunden Markus, Börge, Sebastian und Christian für die vielen<br />
gemeinsamen musikalischen und nicht-musikalischen Aktivitäten, aus denen ich Kraft für die<br />
Arbeit gewinnen konnte.<br />
Ich danke Jacqueline für ihre Ratschläge in allen Lebenslagen und für die Spaziergänge an<br />
traurigen Herbsttagen. Ich danke Dirk für die gemeinsamen Nachtarbeiten innerhalb und<br />
außerhalb des Labors.<br />
Ich danke ganz besonders Martina, die mir ein guter Freund war, mich mit meinen Sorgen nie<br />
allein ließ, mich oft genug aufgefangen hat und mir in vielen Vater-Fragen weiterhelfen<br />
konnte.<br />
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mit mir alle Höhen und Tiefen während des<br />
Studiums und der Doktorarbeit durchlebten, die sich mit mir gefreut und mit mir gelitten<br />
haben, mir Mut machten und es letztlich mit ihrer fortwährenden Unterstützung und ihrem<br />
Verständnis ermöglichten, dass ich im Leben stehe, wo ich jetzt bin.