Etablierung von ES-Zelllinien zur vorhersagbaren autoregulierten ...

Etablierung von ES-Zelllinien zur vorhersagbaren
autoregulierten Expression von Transgenen in Mäusen
Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
D i s s e r t a t i o n
von Claas Wodarczyk
aus Eisleben

1. Referent: Prof. Dr. Jürgen Bode
2. Referent: Prof. Dr. Leopold Flohé
eingereicht am: 18.09.2003
mündliche Prüfung (Disputation) am: 23.01.2004

I
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
IV
1 Einleitung ..................................................................................................................................................... 1
1.1 Regulierte Expressionssysteme ............................................................................................................ 1
1.1.1 Das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem................................................................................ 2
1.1.1.1 Das TetOff-System ................................................................................................................. 2
1.1.1.2 Das TetOn-System.................................................................................................................. 3
1.1.1.3 Modifizierung der Tetracyclin-abhängigen Transaktivatoren................................................. 3
1.1.1.4 Anwendungen des Tetracyclin-regulierten Expressionssystems............................................. 5
1.1.2 Das Streptogramin-regulierte Expressionssystem PIPOff............................................................... 6
1.1.3 Das Makrolid-regulierte Epxressionssystem E.REXOff ................................................................. 6
1.1.4 Autoregulierte Expressionssysteme ................................................................................................ 7
1.2 Rekombination ..................................................................................................................................... 8
1.2.1 Homologe Rekombination .............................................................................................................. 8
1.2.2 Sequenzspezifische Rekombination .............................................................................................. 10
1.2.2.1 Das Cre/loxP-System............................................................................................................ 12
1.2.2.2 Das Flp/FRT-System ............................................................................................................ 13
1.2.2.3 Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch..................................................................... 14
1.3 Embryonale Stammzellen und in vitro Differenzierung ..................................................................... 16
1.4 Aufgabenstellung................................................................................................................................ 17
2 Ergebnisse .................................................................................................................................................. 19
2.1 Strategie zum Auffinden und Wiederverwenden regulierbarer Genorte............................................ 19
2.1.1 Die autoregulierte Expressionskassette LUCTP zur Identifizierung von regulierbaren Genorten 19
2.1.2 Strategie zum Austausch der Reportergen-Kassette gegen beliebige biologisch aktive Gene ...... 19
2.2 Etablierung eines TetOff-Expressionssystems in ES-Zellen............................................................... 21
2.2.1 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität von LUCTP in NIH3T3-Zellen........... 21
2.2.2 Optimierung der Tkneo-Expression durch aktivere IRES-Elemente ............................................ 23
2.2.3 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität von LUCTN7 in NIH3T3-Zellen ........ 24
2.2.4 Stabile Expression von LUCTN7 in ES-Zellen............................................................................. 26
2.2.4.1 Die Expression von LUCTN7 ist in ES-Zellen niedrig......................................................... 26
2.2.4.2 Weniger toxische Transaktivatoren verbessern nicht die Expression des autoregulierten
TetOff-Systems in ES-Zellen................................................................................................ 27
2.2.5 Etablierung eines TetOff-Expressionssystems im ROSA26-Locus von ES-Zellen ...................... 31
2.2.5.1 Integration der autoregulierten Expressionskassette LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus... 31
2.2.5.2 In vitro Differenzierung ........................................................................................................ 34
2.2.5.3 Aktivierung der Luciferase-Expression durch konstitutiv exprimierte Transaktivatoren ..... 38
2.3 Etablierung eines TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Expressionssystems in ES-Zellen ....................... 39
2.3.1 Optimierung der Expressionsanalyse durch Einsatz einer aktiveren Luciferase........................... 39
2.3.2 Untersuchung der transienten Expression der autoregulierten TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-
Kassetten ....................................................................................................................................... 40
2.3.3 Untersuchung der stabilen Expression der autoregulierten TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-
Kassetten in ES-Zellen.................................................................................................................. 41
2.3.4 Squelching-Effekt von LUC3rTA2E............................................................................................. 44
2.4 Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie .................................................................................. 47
2.4.1 Kassettenaustausch in NIH3T3-Zellen.......................................................................................... 47
3 Diskussion................................................................................................................................................... 51
3.1 Autoregulierte Expressionssysteme in NIH3T3- und ES-Zellen......................................................... 51
3.1.1 Optimierung der Tkneo-Expression durch Austausch des IRES-Elements................................... 51
3.1.2 Das autoregulierte TetOff-System ist in ES-Zellen niedrig exprimierend ................................... 52
3.1.2.1 Das TetOff-System in ES-Zellen (publizierte Daten) ........................................................... 53
3.1.2.2 TetOff-Transaktivatoren können in ES-Zellen Squelching hervorrufen............................... 53

II
3.1.2.3 Durch weniger toxische TetOff-Transaktivatoren kann die Expression des TetOff-Systems in
ES-Zellen nicht erhöht werden ............................................................................................. 54
3.1.2.4 Die niedrige Expression des TetOff-Systems ist begründet durch eine niedrige Aktivität des
TetOff-Transaktivators in ES-Zellen, nicht aber durch Squelching...................................... 55
3.1.2.5 Die Expression des TetOff-Systems ist nach in vitro Differenzierung von ES-Zellen deutlich
erhöht .................................................................................................................................... 55
3.1.3 Das TetOn-System ist in ES-Zellen hoch exprimierend................................................................ 56
3.1.3.1 Das TetOn-System führt zu hohen Expressionen in ES-Zellen ............................................ 56
3.1.3.2 Der TetOn-Transaktivator induziert Squelching in ES-Zellen.............................................. 57
3.1.4 Das E.REXOff- und das PIPOff-System führen zu geringeren Expressionen, aber auch
geringerem Squelching in ES-Zellen als das TetOn-System........................................................ 57
3.1.5 Vergleich der autoregulierten Expressionssysteme in ES-Zellen.................................................. 58
3.2 Flp-vermittelter Kassettenaustausch.................................................................................................. 59
3.2.1 Die Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion ist funktional, jedoch wenig effizient.... 60
3.2.2 Der Kassettenaustausch führt zu einem hohen Anteil an Austauschklonen mit zusätzlich
integrierten Austauschkonstrukten ................................................................................................ 61
3.2.3 Die Expression des integrierten Austauschkonstruktes ist vorhersagbar ...................................... 62
3.2.4 Anwendung der Kassettenaustauschstrategie in ES-Zellen.......................................................... 63
3.2.5 Ein Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion ist effizienter als mit Negativ-Selektion .............. 63
3.2.6 Das neo-Gen kann die Expression benachbarter Gene negativ beeinflussen ................................ 63
3.3 Perspektiven....................................................................................................................................... 64
3.3.1 Optimierung der autoregulierten Expression in ES-Zellen ........................................................... 64
3.3.1.1 Reduktion der autoregulierten Expression durch Modifikation des Promotors .................... 64
3.3.1.2 Verwendung weniger toxischer Transaktivatoren................................................................. 65
3.3.2 Optimierung der Kassettenaustauschstrategie............................................................................... 67
3.3.2.1 Positiv-Selektion statt Negativ-Selektion beim Kassettenaustausch..................................... 67
3.3.2.2 Alternative Negativ-Selektion des Kassettenaustausches ..................................................... 69
3.3.2.3 Thymidinkinase-Expression in männlichen Mäusen führt zur Infertilität............................. 70
3.4 Ausblick.............................................................................................................................................. 70
4 Material und Methoden ............................................................................................................................ 72
4.1 Geräte ................................................................................................................................................ 72
4.2 Material ............................................................................................................................................. 73
4.3 Allgemeine Grundtechniken............................................................................................................... 74
4.3.1 Sterilisieren durch Hitze................................................................................................................ 74
4.3.2 Sterilisieren durch Filtration.......................................................................................................... 74
4.3.3 Phenolisieren von DNA ................................................................................................................ 74
4.3.4 Fällung von DNA.......................................................................................................................... 74
4.4 DNA-Modifizierung............................................................................................................................ 75
4.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen ............................................................................... 75
4.4.2 Auffüllen von 5’-überstehenden Enden......................................................................................... 75
4.4.3 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten ................................................................................. 75
4.4.4 Oligohybridisierung ...................................................................................................................... 75
4.4.5 Ligation von DNA-Fragmenten .................................................................................................... 76
4.4.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ................................................................................................ 76
4.4.7 Agarose-Gelelektrophorese........................................................................................................... 77
4.4.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen (QIAquick-Kit, Quiagen)................................................ 77
4.5 Radioaktive Detektionsmethoden....................................................................................................... 77
4.5.1 Random priming mit „Rediprime DNA Labelling System” (Amersham Life Science)................ 77
4.5.2 Klenow-Markierung...................................................................................................................... 78
4.5.3 Southern-Blot Analyse .................................................................................................................. 78
4.5.3.1 Isolierung von hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen .............................. 78
4.5.3.2 Enzymatischer Verdau der hochmolekularen DNA (HMW-DNA) ...................................... 78
4.5.3.3 DNA-Transfer....................................................................................................................... 79
4.5.3.4 Hybridisierung der restriktierten HMW-DNA...................................................................... 79
4.5.3.5 Rehybridisierung der restriktierten HMW-DNA .................................................................. 79

III
4.6 Arbeiten mit E.coli ............................................................................................................................. 80
4.6.1 Verwendete Bakterienstämme....................................................................................................... 80
4.6.2 Medien .......................................................................................................................................... 80
4.6.3 Herstellung von Agarplatten ......................................................................................................... 80
4.6.4 Herstellung elektrokompetenter Bakterien.................................................................................... 80
4.6.5 Elektrotransformation kompetenter Bakterien .............................................................................. 81
4.6.6 Konservierung von Bakterien........................................................................................................ 81
4.6.7 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im analytischen Maßstab ........................................ 81
4.6.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im präparativen Maßstab (QUIAGEN)................... 82
4.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen.................................................................................................. 83
4.7.1 Verwendete Zelllinien................................................................................................................... 83
4.7.2 Grundmedien................................................................................................................................. 83
4.7.3 Kulturmedien................................................................................................................................. 84
4.7.4 Gelatinierung von Zellkulturgefäßen ............................................................................................ 84
4.7.5 Präparation von Zellkulturgefäßen mit Feeder-Zellen .................................................................. 84
4.7.6 Zählung von Zellen ....................................................................................................................... 84
4.7.7 Kultivierung von Zellen ................................................................................................................ 84
4.7.8 Passagieren von Zellen.................................................................................................................. 85
4.7.9 Langzeitlagerung von Zellen......................................................................................................... 85
4.7.10 Gentransfer-Methoden.............................................................................................................. 85
4.7.10.1 Transfektion mittels Calciumphosphat/DNA-Präzipitation .................................................. 85
4.7.10.2 Transfektion mittels Elektroporation .................................................................................... 86
4.7.10.3 Stabile Expression – Selektion von G418-resistenten Zellklonen ........................................ 86
4.7.10.4 Transiente Expression...........................................................................................................87
4.7.11 In vitro Differenzierung............................................................................................................ 87
4.8 Proteinanalytik................................................................................................................................... 87
4.8.1 Aufschluss von Zellen................................................................................................................... 87
4.8.2 Nachweis von β-Galactosidase ..................................................................................................... 88
4.8.2.1 Färbung von Zellen............................................................................................................... 88
4.8.2.2 Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivtät ........................................................................... 88
4.8.3 Bestimmung der Luciferase-Aktivität ........................................................................................... 89
4.8.4 Proteinbestimmung nach Bradford................................................................................................ 89
5 Vektoren und Oligonukleotide ................................................................................................................. 90
5.1 Vektoren............................................................................................................................................. 90
5.1.1 Verwendete Vektoren.................................................................................................................... 90
5.1.2 Hergestellte Vektoren.................................................................................................................... 91
5.2 Primer/Oligomere .............................................................................................................................. 95
6 Abkürzungen ............................................................................................................................................. 97
7 Literatur................................................................................................................................................... 100

IV
Zusammenfassung
Eine etablierte Methode zur Generierung transgener Mauslinien ist die Injektion genetisch
veränderter ES-Zellen in Mausblastozysten. Die Expression im Tier ist jedoch vom
Integrationsort des Transgens in der ES-Zelle abhängig und variiert daher stark. Diese ist
nicht vorhersagbar und erfordert daher ein aufwendiges Screening transgener Tiere. Eine
Strategie zur Wiederverwendung von chromosomalen Genorten in ES-Zellen erscheint daher
sinnvoll.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von hoch exprimierenden, regulierbaren
ES-Zelllinien mittels einer autoregulierten Reportergen-Kassette, die zur Generierung von
Mäusen mit regulierbarer Expression eingesetzt werden können. Die Markierung der Genorte
mit heterospezifischen FRT-Sites sollte außerdem die Integration von Expressionskassetten
zur autoregulierten Expression eines beliebigen Transgens in diese charakterisierten Loci
durch Flp-vermittelte sequenzspezifische Rekombination ermöglichen.
Nach Integration einer autoregulierten TetOff-Kassette in zufällige Genorte konnten wenige
ES-Zelllinien generiert werden. Diese wiesen jedoch keine signifikante Reportergen-
Expression auf. Auch nach spezifischer Integration einer TetOff-Kassette in einen definierten
Genort, dem ROSA26-Locus, wurden nur niedrige Expressionen festgestellt. Dagegen
konnten nach in vitro Differenzierung von ES-Zellen mit integrierter TetOff-Kassette
deutliche Expressionssteigerungen festgestellt werden. Auch in NIH3T3-Zellen zeigten
TetOff-Kassetten hohe, regulierbare Expressionen. Daraus wurde geschlussfolgert, dass in
ES-Zellen das TetOff-System unabhängig vom Integrationsort niedrig, in differenzierten
Zellen jedoch hoch exprimierend ist. In transienten Expressionsstudien konnte die im
Vergleich zu NIH3T3-Zellen niedrige Expressionskapazität des TetOff-Systems in ES-Zellen
bestätigt werden. Daher wurden weitere autoregulierte Expressionssysteme auf ihre
Verwendbarkeit in ES-Zellen untersucht. Das E.REXOff-System führte transient zu ähnlichen
Expressionen wie das TetOff-System. Dagegen zeigte das PIPOff-System transient vielfach
höhere Expressionskapazitäten. Mit dem TetOn-System wurden transient jedoch die höchsten
Expressionen erzielt. Mit diesem System konnten schließlich ES-Zelllinien generiert werden,
die eine hohe, regulierbare Expression aufwiesen. Jedoch war die Zahl der selektierten Klone
gering. Es konnte gezeigt werden, dass durch den hoch exprimierten TetOn-Transaktivator
hohes Squelching in ES-Zellen auftritt, was die Etablierung transgener ES-Zelllinien
beeinträchtigt.
Die in dieser Arbeit aufgestellte Kassettenaustauschstrategie wurde in NIH3T3-Zellen mit
integrierter TetOff-Kassette überprüft. Der mit Integration einer autoregulierten
Austauschkassette in den markierten Genort verbundene Verlust des Negativ-
Selektionsmarkers Thymidinkinase ließ die Selektion von Austauschklonen mit korrekter
Integration des Austauschkonstruktes zu. Diese wiesen eine homogene, vorhersagbare
Reportergen-Expression auf.
In der vorliegenden Arbeit konnte die Etablierung regulierbarer ES-Zelllinien gezeigt werden.
Aufgrund der hohen Expressionskapazität ist das TetOn-System das einzige System, das für
die Identifizierung hoch exprimierender, gut regulierbarer Genorte in ES-Zellen geeignet ist.
Durch Anwendung der Kassettenaustauschstrategie sollte es möglich sein, markierte Genorte
in den ES-Zellen wiederverwenden zu können. Dadurch können ES-Zelllinien generiert
werden, die eine definierte Expression eines beliebigen Transgens erlauben. Aus diesen ES-
Zellen können Mäuse mit vorhersagbarer Transgenexpression etabliert werden, wodurch
aufwendige Screenings vermieden werden.

1 Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Regulierte Expressionssysteme
Zur Beantwortung vieler Fragestellungen in Biologie und Medizin, zur Aufklärung von
Signalkaskaden, Genregulationen und Genfunktionen, zur Untersuchung des Einflusses
bestimmter Gene oder Toxine auf Entwicklung und Metabolismus eines Organismus, aber
auch für gentherapeutische Anwendungen sind Expressionssysteme, die eine gezielte
Regulation der Expression eines bestimmten Transgens zulassen, ein wichtiges Hilfsmittel.
Ein regulierbares System sollte folgende Eigenschaften aufweisen (Fussenegger, 2001):
(1) Spezifität: Das System darf nicht mit endogenen Regulationssystemen interferieren und
nur durch exogene, nicht-toxische Faktoren aktiviert werden. (2) Induzierbarkeit: Es sollte
eine niedrige Basalexpression im reprimierten Zustand und eine hohe Expression im
induzierten Zustand aufweisen. (3) Verfügbarkeit der Regulationsfaktoren: Exogene
Regulationsfaktoren sollten in alle Gewebe und Zellen gelangen und die Planzenta und die
Blut-Hirn-Schranke durchdringen können. (4) Reversibilität: Das System sollte jederzeit in
allen Geweben durch Regulation den Ausgangszustand erreichen können. (5) Immunogenität:
Komponenten des Systems und Regulationsfaktoren sollten keine Immunantwort hervorrufen.
(6) Dosis-Abhängigkeit: Die Expression des Systems sollte durch exogene Faktoren
modulierbar sein.
Eine Vielzahl verschiedener Regulationssysteme wurde bis heute etabliert (Übersicht:
Fussenegger, 2001). Die ersten Systeme basierten auf endogene Komponenten (Promotoren
und Enhancer). Die Regulation erfolgte durch exogene Signale oder Stress (Hitze, Hormone,
Sauerstoff, Cytokine, Metallionen). Die Installation dieser Systeme in Zellen führte jedoch zu
pleiotropen Interferenzen mit bestehenden, endogenen Regulationssystemen. Aus diesem
Grund wurden Systeme entwickelt, die nicht auf endogene sondern auf heterologe, mutierte
endogene oder synthetische Komponenten beruhen. In diesen Systemen regulieren exogene
Faktoren wie IPTG, Ecdyson, Östrogen oder RU486 die Aktivität bzw. das DNA-
Bindungspotenzial eines Transaktivators, der wiederum die, von einem Transaktivatorabhängigen
heterologen Promotor induzierte Expression kontrolliert. Im Östrogen-induzierten
System bindet im reprimierten Zustand Hsp90 (Heat shock protein 90 complex) an einen
Transaktivator, der aus DNA-Bindungsdomäne wie Gal4, Östrogen-Bindungsdomäne und
Transaktivierungsdomäne wie VP16 aufgebaut ist. Durch Östrogen wird die Hsp90-
Transaktivator-Interaktion aufgehoben, so dass der Transaktivator an regulatorische DNA-
Sequenzen binden und die Expression induzieren kann. Im RU486/Mifipriston-induzierten
System enthält der Transaktivator statt der Bindungsdomäne des Östrogen-Rezeptors die des
Progesteron-Rezeptors. Einige Regulationssysteme werden durch chemisch-induzierte
Dimerisierung kontrolliert. Dazu zählen das FK506/Rapamycin- und das Cyclosporininduzierbare
System. Diese Immunsupressiva binden an FKBP (FK506 binding protein 12)
bzw. Cyp (Cyclophilin), die entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne wie Gal4 oder einer
transkriptionsaktivierenden Domäne wie VP16 fusioniert sind. Es kommt zur
Heterodimerisierung der Fusionsproteine und damit zur Bildung eines funktionalen
Transaktivators, der an definierte DNA-Sequenzen binden und die Expression initiieren kann.
In anderen Systemen regulieren exogene Faktoren die Dimerisierung von vorhandenen
Transaktivatoren bzw. die Konformation dieser Dimere. Dadurch kann die Interaktion der
Transaktivatoren mit regulatorischen DNA-Bereichen und somit die Expression kontrolliert
werden. Dazu zählen das Tetracyclin-regulierte (Gossen und Bujard, 1992), das

1 Einleitung 2
Streptogramin-regulierte (Fussenegger et al., 2000) und das Makrolid-regulierte
Expressionssystem (Weber et al., 2002a).
1.1.1 Das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem
Das Antibiotikum Tetracyclin und dessen Derivate wie Doxycyclin können in Bakterien
durch Bindung an die 30S-Untereinheit der 70S-Ribosomen die Bindung von AminoacetyltRNAs
an die Ribosomen blockieren und dadurch die Proteinbiosynthese inhibieren. Eine
Vielzahl von Bakterien besitzt jedoch eine natürliche bzw. erworbene Resistenz gegenüber
Tetracyclinen. Das Tetracyclin-Resistenzsystem (Abb.1) besteht aus dem membranassoziierten
Protein TetA, welches den aktiven Transport von Tetracyclin aus den Bakterien
durch einen H + /[Tetracyclin+Mg] + -Antiport-Mechanismus ermöglicht und dadurch die
Akkumulation von Tetracyclin im Bakterium verhindert, und dem Repressor TetR (Postle et
al., 1984), der die Expression von TetA in Abhängigkeit von Tetracyclin kontrolliert. Gelangt
Tetracyclin in die Bakterien, wird dieses von TetR-Dimeren gebunden, was zu einer
Konformationsänderung der TetR-Dimere führt (Müller et al., 1995). Dadurch dissoziieren
diese von den Operator-Sequenzen tetO ab, und die Transkription von TetA und TetR wird
ermöglicht (Hillen et al., 1983; Hillen und Berens, 1994; Postle et al., 1984).
Tetracyclin
F
1
3
TetA-Protein
TetR-Protein
TetR
TetA
TetR
2
TetA
Operatoren
Abb. 1 Schematische Darstellung des Tetracyclin-Resistenz Operons
(1) Tetracyclin-Moleküle gelangen in das Bakterium und interagieren mit TetR-Proteinen, die an Operatoren des Operons gebunden sind.
(2) Die Interaktion von Tetracyclin mit TetR induziert eine Konformationsänderung in TetR, worauf dieses von der DNA dissoziiert und die
Operatoren demaskiert. (3) Es kommt zur Expression von TetR- und TetA-Proteinen. TetA ist ein membranständiges Porenprotein, das
Tetracyclin-Moleküle aus dem Bakterium entfernt.
1.1.1.1 Das TetOff-System
In Pflanzen wurde gezeigt, dass Teile des Tetracyclin-Resistenz Operons aus E.coli, welches
auf dem Transposon Tn10 lokalisiert ist, die Expression eukaryontischer Gene regulieren
können (Frohberg et al., 1991; Gatz und Quail, 1988; Gatz et al., 1991). Von Gossen und
Bujard (1992) wurde aus Komponenten dieses Operons ein Tetracyclin-regulierbares
Expressionssystem in Säugerzellen entwickelt (Abb.2). Dieses besteht aus dem Transaktivator
tTA, eine Fusion aus TetR und transkriptionsaktivierender Domäne VP16 des Herpes Simplex
Virus (Triezenberg et al., 1988, Sadowski et al., 1988), und dem Transaktivator-abhängigen
Promotor P hCMV*-1 , eine Fusion aus sieben tetO-Sequenzwiederholungen und dem humanen
CMV-Minimalpromotor P hCMVmin (Boshart et al., 1985). Mittels der TetR-Domäne kann der
Transaktivator an die Operator-Sequenzen des Promotors binden. Die VP16-Domäne
interagiert direkt mit Transkriptionsfaktoren wie TFIIB (Lin et al., 1991), TBP (TATA

1 Einleitung 3
binding protein; Ingles et al., 1991) und TAFII 40 (TBP associated factor; Goodrich et al.,
1993), was zur Bildung eines Transkriptionsinitiationskomplexes und damit zur Aktivierung
der Transkription eines beliebigen, 3’-gelegenen Gens führt (Abb.2A). Tetracyclin bzw.
Derivate können durch Bindung an die TetR-Domäne eine Konformationsumwandlung der
Transaktivatoren induzieren und somit deren hochaffine Bindung an die Operatoren im
P hCMV*-1 -Promotor unterbrechen. Die Transkription wird dadurch deaktiviert (Abb.2B).
A Induktion
B Repression
tTA
P
Pmin
Pmin
Repressor-
Domäne
Transaktivierungsdomäne
VP16
7x tetO
Minimaler Transgen
Promotor P hCMVmin
Tetracyclin
Abb. 2 Schematische Darstellung des TetOff-Systems
(A) Induktion der Expression: Der exprimierte Transaktivator bindet mit seiner tet-Repressor-Domäne TetR an Operator-Sequenzen tetO im
Transaktivator-abhängigen Promotor P hCMV*-1 . Die Transaktivierungsdomäne VP16 bewirkt eine Transkriptionsaktivierung. Der minimale
Promotor P hCMVmin kontrolliert die Expression eines Transgens. (B) Repression: Tetracyclin-Moleküle oder Derivate binden an die TetR-
Domäne des Transaktivators und induzieren dadurch eine Konformationsänderung, die zur Dissoziation des Transaktivators vom Operator
führt. Die Expression wird deaktiviert.
1.1.1.2 Das TetOn-System
Von Gossen et al. (1995) wurde die Repressor-Domäne TetR des ursprünglichen
Transaktivators tTA (Kap.1.1.1.1) in vier Aminosäuren verändert, was den Phenotyp des
Transaktivators invertierte. Ohne Tetracyclin oder eines Derivates nimmt dieser reverse
Transaktivator, rtTA genannt, eine Konformation ein, die eine Interaktion mit Operator-
Sequenzen des Transaktivator-abhängigen Promotors P hCMV*-1 verhindert. Erst nach Bindung
von Tetracyclinen, insbesondere Doxycyclin, an die TetR-Domäne kann rtTA mit den
Operatoren interagieren und dadurch die Transkription induzieren.
1.1.1.3 Modifizierung der Tetracyclin-abhängigen Transaktivatoren
Die transkriptionsaktivierende Domäne von VP16 kann mit einer Vielzahl von
Transkriptionsfaktoren interagieren (Lin et al., 1991; Ingles et al., 1991; Goodrich et al., 1993;
Flint und Shenk, 1997), was jedoch bei hohen Konzentrationen von VP16 zu einer Reduktion
freier Transkriptionsfaktoren in den Zellen führt. Dadurch wird die RNA-Transkription
eingeschränkt, was letzlich den Tod der Zellen bewirken kann. Dieser Prozess wird auch
transkriptionelles Squelching genannt und wurde erstmals bei der Überexpression von Gal4 in
Hefe beobachtet (Gill und Ptashne, 1988). Da die Transaktivatoren tTA und rtTA
(Kap.1.1.1.1 und 1.1.1.2) eine VP16-Domäne besitzen, können hohe Konzentrationen dieser
Transaktivatoren in Zellen Squelching-Effekte induzieren (Gossen und Bujard, 1992; Damke
et al., 1995; Saez et al., 1997; Gallia und Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Von Baron et
al. (1997) wurden durch Fusion verschiedener, durch Aminosäureaustausch modifizierter
minimaler Transaktivierungsdomänen von VP16 mit der TetR-Domäne Transaktivatoren mit
reduzierter Toxizität generiert (Abb.3). Diese werden von Zellen in höheren Konzentrationen

1 Einleitung 4
toleriert, da Bindungsstellen für bestimmte Transkriptionsfaktoren wie für Oct1 (Hayes und
O’Hare, 1993), TAFII 40 (Goodrich et al., 1993) und ADA2 (Silverman et al., 1994) fehlen. In
Abhängigkeit von Anzahl und Typ der fusionierten minimalen VP16-Domänen können die
Transaktivatoren allerdings eine reduzierte Aktivität aufweisen (Abb.3).
Aktivität Toxizität
tTA tetR
C-term. VP16 100% 100%
tTA2
tetR F F F
98% 33%
tTA3
tTA4
tetR
tetR
F F
G F Y
39%
14%
20%
11%
Modifizierte minimale VP16-Domänen
(Aminosäure-Sequenz)
F
G
Y
PADALDDFDLDML
PADALDDGDLDML
PADALDDYDLDML
Abb. 3 TetOff-Transaktivatoren mit modifizierter Transaktivierungsdomäne
Die modifizierten minimalen VP16-Domänen des Typs F, G und Y wurden an die TetR-Domäne fusioniert, was zu den Transaktivatoren
tTA2, tTA3 und tTA4 führte. Diese zeigen bei gleicher bzw. abnehmender Aktivität reduziertes Squelching (Baron et al., 1997).
Neben Transaktivatoren des TetOff-Systems gibt es ebenfalls TetOn-Transaktivatoren mit
modifizierten minimalen VP16-Domänen. Von Kämper et al. (2002) wurden bis zu 8
Domänen des F-Typs (Baron et al., 1997) und bis zu 20 Domänen des L-Typs, eine
Modifikation des F-Typ, die durch Entfernung von zwei Aminosäuren generiert wurde, an
reverse TetR-Domänen fusioniert. Die Aktivität der meisten dieser Transaktivatoren lag
unterhalb der Aktivität der VP16-Varianten. Weiterhin existieren reverse Transaktivatoren
mit synthetischen minimalen VP16-Domänen, in denen u.a. potentielle Splice-Donor- und
Splice-Akzeptor-Stellen, potentielle Schnittstellen für Endonukleasen und Sequenzen, die für
die Ausbildung von Haarnadelstrukturen verantwortlich sind, entfernt wurden (Urlinger et al.,
2000b). Diese besitzen ein höheres Induktionspotenzial als die ursprünglichen reversen
Transaktivatoren.
Eine andere Möglichkeit, das durch die VP16-Domäne der Transaktivatoren vermittelte
Squelching zu reduzieren, bieten nicht-virale Transaktivierungsdomänen wie p65 (Schmitz
und Bäuerle, 1991) und E2F4 (Ginsberg et al., 1994). Diese wurden an verschiedene TetR-
Domänen fusioniert (Urlinger et al., 2000a; Akagi et al., 2001). Die Transaktivatoren mit p65-
Domäne sind ähnlich aktiv wie die Transaktivatoren mit VP16-Domäne. Transaktivatoren mit
E2F4-Domän haben dagegen ein niedrigeres transkriptionsinduzierendes Potenzial als die
VP16-Varianten. Die Fusion der Tet-Repressor Domäne mit der KRAB (Krüppel-associated
box)-Repressor Domäne des humanen Zinkfinger-Proteins Kox1 (Margolin et al., 1994) zeigt
dagegen kein Induktions- sondern ein Repressionsverhalten (Deuschle et al., 1995). Die
Bindung dieses Transrepressors (tTS: Transcriptional Silencer) an die Operatoren verhindert
die Transkription eines Gens. Durch Tetracyclin kann diese Bindung jedoch aufgehoben
werden, was die Transkription wieder ermöglicht.
Das Induktionspotenzial von Transaktivatoren wird nicht allein durch die
Transaktivierungsdomäne, sonderen auch durch das Bindungsverhalten der Repressor-
Domäne an die Operator-Sequenzen des Promotors (Hinrichs et al., 1994; Orth et al., 1998;
Baron et al., 1999) und durch Sequenzen, die den Eintritt des Transaktivator-Proteins in den
Zellkern bzw. die Translation der Transaktivator-mRNA (Shockett et al., 1995; Kozak, 1984)
beeinflussen, bestimmt. Durch Mutagenese und daraus resultierenden, zufälligen
Aminosäureaustauschen im TetR wurden reverse Transaktivatoren generiert, die aufgrund
eines höheren DNA-Bindungspotenzials höhere Expression ermöglichten (Urlinger et al.,
2000b). Die Fusion einer nls-Sequenz (nuclear localization signal) an tTA (Yoshida und
Hamada, 1997) bzw. an rtTA (Gossen et al., 1995) erhöhte die Transferrate der
Transaktivatoren in den Kern, was ebenfalls zu höheren Induktionen führte.

1 Einleitung 5
1.1.1.4 Anwendungen des Tetracyclin-regulierten Expressionssystems
Tetracyclin-regulierte Expressionssysteme wurden in verschiedenen Säugerzelllinien wie
HeLa, 293T, CHO, PC12 etabliert, wobei festgestellt wurde, dass das Regulations- und
Expressionspotenzial der Systeme zwischen den Zelllinien variiert (Howe et al., 1995;
Leuchtenberger et al., 2001). Es wurden auch embryonale Stammzellen mit regulierbarer
Transgen-Expression generiert. So integrierten Wutz und Jänisch (2000) das Gen des reversen
Transaktivators (Gossen et al., 1995) in den ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991)
unter Kontrolle des endogenen Promotors, um das in zufälligen Genorten integrierte Transgen
Xist reguliert exprimieren zu können (TetOn-System). Von Kyba et al. (2002) wurde
ebenfalls ein TetOn-Expressionssystem in ES-Zellen etabliert. Im ROSA26-Locus befand
sich das Transaktivator-Gen und im HPRT-Locus eine Expressionseinheit aus Transaktivatorabhängigem
Promotor und dem Transgen HoxB4. Era und Witte (2000) generierten ES-
Zelllinien, die eine regulierte Expression des Oncogens P210 Bcr-Abl zuließen, kontrolliert
durch den konstitutiv exprimierten Transaktivator tTA2 des TetOff-Systems (Baron et al.,
1997). In anderen Arbeiten wurden ES-Zelllinien mit ausschließlich Transaktivator- oder
Transgen-Expressionskassetten etabliert (Böger und Gruss, 1999; Shin et al., 1999; Fedorov
et al., 20001a, b). Aus diesen ES-Zellen bzw. durch pronukleäre Injektion von Transaktivatorexprimierenden
Konstrukten wurden transgene Mäuse generiert. In Abhängigkeit vom
Integrationsort bzw. Promotor exprimieren diese ubiquitär oder gewebespezifisch den
Transaktivator (Tab.1). Auf gleiche Weise wurden Mäuse generiert, die eine
Expressionseinheit aus Transaktivator-abhängigen Promotor und Transgen in ihrem Genom
besitzen. Die Kreuzung dieser Mäuse mit Transaktivator-exprimierenden Mäusen führte zu
Mauslinien, die in Abhängigkeit vom Expressionsprofil der Transaktivator-Maus eine
regulierbarer Expression eines Transgens aufwiesen (Tab.1).
Promotor Transaktivator Transgen
P hCMV tTA Luciferase,
Furth et al. (1994)
β-Galactosidase
P hCMV tTA Cre-Rekombinase St-Onge et al. (1996)
P hCMV tTA/rtTA Luciferase Kistner et al. (1996)
Promotor-Trap tTA Alkalische Phosphatase Böger und Gruss (1999)
P hCMV*-1 tTA Luciferase (autoreguliert) Shockett et al. (1995)
Gewebespezif. Transaktivator Transgen Expressionsort
Promotor
LAP tTA Luciferase Leber Kistner et al. (1996)
MMTV-LTR tTA Bcr-Abl1 hämatopoetische Hüttner et al. (2000)
Zellen
NSE tTA Luciferase, tTA, ∆FosB Gehirn Chen et al. (1998)
PrP tTA PrP Gehirn Tremblay et al. (1998)
CaMKIIa tTA/rtTA Calcineurin-Mutante
Calcineurin-Inhibitor
Hdh
Luciferase,
Gehirn Mayford et al. (1996)
Mansuy et al. (1998)
Yamamoto et al. (2000)
Krestel et al. (2001)
β-Galactosidase
Ednrb tTA/rtTA Ednrb Melanocyten Shin et al. (1999)
Neuronen
Tyr rtTA H-ras Melanocyten Chin et al. (1999)
Wap rtTA Cre-Rekombinase Brustepithelzellen Utomo et al. (1999)
RB rtTA Cre-Rekombinase Retina, Monocyten,
Cerebellum
Utomo et al. (1999)
Tab. 1 Transaktivator-exprimierende Mauslinien
Ausgewählte Mauslinien mit allgemeiner oder gewebespezifischer tTA/rtTA-Expression und Transaktivator-abhängiger Expression eines
Transgens.

1 Einleitung 6
1.1.2 Das Streptogramin-regulierte Expressionssystem PIPOff
Um selbst produzierte Antibiotika tolerieren zu können, besitzen Streptomyces-Arten
verschiedene Schutzmechanismen, die zusammen mit der Antibiotika-Produktion reguliert
werden (Cundliffe, 1989). Eine wichtige Schutzkomponente stellt das Pristinamycin-
Resistenzgen ptr dar (Blanc et al., 1995; Salah-Bey et al., 1995; Salah-Bey und Thompson,
1995). Dessen Expression wird durch Streptogramine wie Pristinamycin, welche an das 28
kDa Repressor-Protein Pip (Pristinamycin induced protein, Folcher et al. 2001) binden und
dadurch die Interaktion von Pip mit dem Promotor P PTR aufheben kann, induziert.
Von Fussenegger et al. (2000) wurde auf Basis des Pristinamycin-Resistenz Operons aus
S.pristinaespiralis ein in Eukaryonten regulierbares Expressionssystem entwickelt (PIP-
System). Dieses besteht aus einem Pristinamycin-abhängigen Transaktivator PIT und einem
PIT-kontrollierten Promotor P PIR . Der Transaktivator PIT ist eine Fusion aus Pip und der
Transaktivierungsdomäne VP16 (Triezenberg et al., 1988, Sadowski et al., 1988), der
Promotor P PIR eine Fusion aus Pip-Bindungstellen des ptr-Promotors und der minimalen
Variante des hsp70-Promotors (Corces und Pellicer, 1984). Durch Interaktion des
Transaktivators PIT mit dem Promotor P PIR kann die Transkription eines beliebigen Gens
induziert werden. Die Bindung von Pristinamycin an die Repressor-Domäne Pip von PIT
führt zu einer Aufhebung der Interaktion PIT-P PIR und somit zu einer Reprimierung der vom
Promotor P PIR kontrollierten Transkription (PIPOff-System). Durch zusätzliche Pip-
Bindungsstellen im PIT-abhängigen Promotor (Fussenegger et al., 2000) und durch
Baseninsertionen zwischen Pip-Bindungsstelle und minimalem Promotor (Weber et al.,
2002b; Fux und Fussenegger, 2003a) kann die Transkriptionsinduktion verstärkt werden.
Weiterhin wurden alternative PIT-Transaktivatoren mit verschiedenen, nicht-viralen (p65-,
E2F4-Domäne) bzw. minimalen VP16-Transaktivierungsdomänen konstruiert (Weber et al.,
2002b). Das Induktionspotenzial dieser Transaktivatoren weicht jedoch von dem des
Transaktivators mit VP16-Domäne ab.
1.1.3 Das Makrolid-regulierte Epxressionssystem E.REXOff
Makrolid-Antibiotika können durch Bindung an die 50S-Untereinheit der bakteriellen 70S-
Ribosomen die Proteinbiosynthese in Bakterien wie Heliobacter, Bordetella und Legionella
ssp blockieren (Williams und Sefton, 1993; Guay, 1996). Von Noguchi et al. (1995) wurde
aus dem E.coli-Stamm Tf481A das Gen mph(A) (macrolide-inactivating 2’-
phosphotransferase I) isoliert, welches Resistenz gegenüber Makrolid-Antibiotika vermittelt.
Die Expression dieses Resistenzgens wird durch den Repressor MphR(A) reguliert. Dieser
kann an die 35 bp lange Operator-Sequenz ETR des mph(A)-Promotors binden und dadurch
die Expression von mph(A) inhibieren (Noguchi et al., 2000). Durch Makrolid-Antibiotika
wird die Interaktion MphR(A)-ETR aufgehoben, was zur Expression des Resistenzgens
mph(A) führt.
Von Weber et al. (2002a) wurden die Komponenten dieses Resistenz-vermittelnden Systems
in ein eukaryontisches Expressionssystem adaptiert (E.REX-System). Dieses besteht aus dem
Transaktivator ET und dem Transaktivator-abhängigen Promotor P ETR . Im Transaktivator ET
ist der Repressor MphR(A) mit der Transaktivierungsdomäne VP16 (Triezenberg et al., 1988,
Sadowski et al., 1988) fusioniert. Der ET-abhängige Promotor besteht aus einer ETR
Operator-Sequenz und einem minimalen Promotor wie dem humanen CMV-Promotor
P hCMVmin (Boshart et al., 1985; Gossen und Bujard, 1992) oder dem hsp70-Promotor P hsp70min
(Corces und Pellicer, 1984). Durch Bindung von ET an die Operator-Sequenzen von P ETR
kann die Expression eines beliebigen Gens induziert werden. Die Interaktion von Makrolid-
Antibiotika wie Erythromycin mit der Repressor-Domäne des Transaktivators führt zu einer

1 Einleitung 7
Aufhebung der Bindung ET-P ETR , so dass die P ETR -vermittelte Expression zum Erliegen
kommt (E.REXOff-System). Es existieren auch Transaktivatoren mit nicht-viralen (p65-,
E2F4-Domäne) bzw. verschiedenen minimalen VP16-Transaktivierungsdomänen
(Kap.1.1.1.3), die jedoch weniger aktiv als der ursprüngliche Transaktivator ET mit VP16-
Domäne sind (Weber et al., 2002b).
1.1.4 Autoregulierte Expressionssysteme
In einem autoregulierten System kontrolliert der Transaktivator-abhängige Promotor die
Expression des Transaktivators (Abb.4). Wenige Transaktivator-Proteine initiieren durch
Aktivierung des Transaktivator-abhängigen Promotors die Transkription von weiteren
Transaktivatoren, was in einer positiven Rückkopplung letztlich zu einer hohen,
intrazellulären Transaktivator-Konzentration und einer maximalen Transaktivator-abhängigen
Expression eines beliebigen Gens führt (Shockett et al., 1995).
A
Transaktivator
2 1 3
Transgen
Pmin
Pmin
Transaktivatorabhängiger
Promotor
B
2
1
3
Pmin
IRES
C
3
2
1
Pmin
Pmin
Abb. 4 Schematische Darstellung autoregulierter Expressionssysteme
(1) Der Transaktivator-abhängige Promotor kontrolliert die Expression des Transaktivators. (2) Dieser bindet an die Operator-Sequenzen
des Promotors und induziert wiederum die Transaktivator-Expression. (3) Gleichzeitig kommt es zur Induktion der Expression eines
Transgens. (A) Dual-Promotor System: Transaktivator- und Transgen-Expressionseinheit befinden sich auf zwei getrennten oder einem
Plasmid. (B) Der Promotor kontrolliert autoreguliert die Transkription einer bicistronischen mRNA, welche die Translation des
Transaktivators und des Transgens erlaubt. (C) Ein bidirektionaler Promotor steuert die Transkription des Transaktivators und parallel die
des Transgens.
In der Arbeit von Shockett et al. (1995) wurde ein autoreguliertes TetOff-Expressionssystem
in Zellen etabliert, das auf zwei getrennten Expressionseinheiten, die auf zwei unabhängigen
Plasmiden positioniert sind, basierte (Abb.4A). Dies hat jedoch den Nachteil, dass zwei
Transfektionsschritte für die Generierung regulierbarer Zelllininen erforderlich sind. Eine
Alternative stellt die Positionierung der Expressionseinheiten in einem Plasmid dar (O’Brien
et al., 1997). Jedoch können dabei durch mögliche Interferenzen zwischen den Promotoren
(Cullen et al., 1984) die Expression und die Regulation des Systems beeinflusst werden.
Durch bicistronische Anordnung der Gene kann dies verhindert werden (Abb. 4B). Auf diese

1 Einleitung 8
Weise wurden autoregulierte TetOff- (Hofmann et al., 1996; Fussenegger et al., 1997; Moser
et al., 2001), E.REXOff- (Weber et al., 2002c) und PIPOff-Expressionssysteme (Moser et al.,
2000, 2001; Fux und Fussenegger, 2003b) generiert. Eine weitere Möglichkeit, mittels eines
Plasmides ein autoreguliertes Expressionssystem in Zellen zu etablieren, bietet ein
bidrektionaler Promotor. In einem autoregulierten Tet-System (Abb.4C) besteht dieser aus
sieben tetO-Sequenzen, die von zwei minimalen Promotoren flankiert werden (Baron et al.,
1995), die einerseits die Expression eines beliebigen Gens, anderseits die Expression eines
Transaktivators wie tTA oder rtTA kontrollieren (Strathdee et al., 1999; Block et al., 2003;
Chtarto et al., 2003).
1.2 Rekombination
Der Austausch von DNA-Sequenzen zwischen zwei Chromosomen oder DNA-Molekülen
wird allgemein als Rekombination bezeichnet. Mittels Rekombination ist es möglich,
genomische Bereiche in einer Zelle gezielt zu verändern. So können DNA-Sequenzen in das
Genom von Zielzellen eingebracht (Targeting) bzw. entfernt (Exzision) oder invertiert
(Inversion) werden. Man unterscheidet die homologe und die sequenzspezifische
Rekombination. Integriert die DNA-Sequenz unspezifisch in einen zufälligen Genort, wird
dies als illegitime oder nicht-homologe Rekombination bezeichnet (Übersicht: Roth und
Wilson, 1986).
1.2.1 Homologe Rekombination
Homologe Rekombination ist ein in allen Organismen vorkommender, natürlicher Prozess,
der zur Entstehung von genetischer Diversität und der Reparatur geschädigter DNA dient. Das
erste Modell der homologen Rekombination wurde von Holliday (1968) aufgestellt und von
Meselson und Radding (1975) erweitert. Letztlich wurde von Szostak et al. (1983) das
Doppelstrangbruch-Modell entwickelt. Der Initiationsschritt der homologen Rekombination
in diesem Modell ist ein Doppelstrang-Bruch in einer der DNA-Sequenzen (Shinohara und
Ogawa, 1995; Haber, 1997), dem sich ein DNA-Processing durch eine 5’-Exonuklease
anschließt, wodurch lange 3’-terminale, einzelsträngige DNA-Überhänge entstehen (Abb.5A
und B). Diese interagieren mit homologen Bereichen einer doppelsträngigen DNA
(Heteroduplex, Abb.5C). Anschließend werden die Sequenzlücken aufgefüllt, und die Hybrid-
DNA nimmt eine sogenannte Holliday-Struktur ein (Holliday, 1968; Abb.5D). Die Struktur
kann sich vergrößern oder verkleinern bzw. „wandern“ bis eine DNA-Resolvase diese auf
zwei gleichwertigen Wegen auflöst (Abb.5E).
Homologe Rekombination ist ein häufig auftretender Prozess in Bakterien und Hefen. In
Säugerzellen findet dieser Prozess jedoch nur selten statt. In Hefen kommt homologe
Rekombination mit einer 10fach höheren Häufigkeit vor als die nicht-homologe
Rekombination (Hinnen et al., 1978; Scherer und Davis, 1979; Rothstein, 1983). Dagegen ist
die Wahrscheinlichkeit für homologe Rekombination in Säugerzellen mit ca. 1/1000 sehr
gering (Folger et al., 1984; Lin et al., 1984, 1985; Smith und Berg, 1984; Smithies et al.,
1984, 1985; Jasin et al., 1985; Thomas et al., 1986; Thomas und Capecchi, 1986, 1987;
Doetschman et al., 1987; Zhang et al., 1994). Es wurde vermutet, dass dies möglicherweise
mit der Größe des Säugergenoms zusammenhängt (bp Mensch : bp Hefe ≈ 340:1). Untersuchungen
der Rekombination in anderen Organismen wie Dictyostelium discoideum (De Lozanne und
Spudich, 1987), Schizosaccharomyces pombe (Wright et al., 1986) und Neurospora crassa
(Case, 1986) zeigten jedoch keine eindeutige Korrelation zwischen Genomgröße und

1 Einleitung 9
Frequenz der homologen bzw. nicht-homologen Rekombination. Auch die Anzahl homologer
Zielsequenzen scheint die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination nicht zu
beeinflussen (Thomas et al., 1986; Steele et al., 1984; Wallenburg et al., 1987). Allerdings
konnte Kucherlapati et al. (1984) zeigen, dass homologe Rekombination mit hoher
Wahrscheinlichkeit zwischen zwei transfizierten, nicht integrierten Plasmiden in Säugerzellen
stattfindet. Dies kann einerseits mit einer hohen Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens
der Plasmide, anderseits mit einer freien Zugänglichkeit der homologen Sequenzen in den
Plasmiden, die im Gegensatz zur chromosomalen DNA nicht mit Proteinen assoziiert sind,
erklärt werden.
A
Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA
B
DNA-Processing (5‘-Exonuklease)
C
Homologe Paarung der DNA
D
Auffüllen der Sequenzlücken
E
Modifikation und Auflösung der Holliday-Struktur
DNA-Resolvase
Abb. 5 Schematische Darstellung der homologen Rekombination
(A) Nach einem Doppelstrangbruch in einer der DNA-Sequenzen kommt es zu (B) einem DNA-Processing durch eine 5’-Exonuklease. (C)
Die entstandenen 3’-terminalen, einzelsträngigen DNA-Überhänge interagieren mit homologen Sequenzen des anderen DNA-Stranges
(Heteroduplex-Struktur). (D) Die Sequenzlücken werden aufgefüllt (Holliday-Struktur). (E) Die Holliday-Struktur kann sich in ihrer Größe
verändern bzw. verschieben. Eine DNA-Resolvase löst die Struktur letztlich auf.
Mittels homologer Rekombination können Transgene in bekannte Genorte von murinen
embryonalen Stammzellen integriert bzw. Mutationen bzw. Modifikationen in endogene Gene
dieser Zellen eingefügt werden. Aus den ES-Zellen können anschließend durch
Mikroinjektion in Mausblastozysten transgene Mauslinien generiert werden (Kap.1.3), die das
Transgen (knock-in Mauslinie) bzw. ein verändertes endogenes Gen exprimieren oder
aufgrund einer Mutation (Verlust von Exon-Bereichen, Verschiebung des Leserasters u.s.w.)
ein endogenes Gen nicht exprimieren (knock-out Mauslinie). Die Häufigkeit der homologen
Rekombination in ES-Zellen beträgt 10 -6 bis 10 -5 (Reid et al., 1991). Templeton et al. (1997)
konnte durch veränderte Zellkultivierung und Selektion die Frequenz der homologen
Rekombination auf 10 -1 erhöhen. Die Effizienz der Rekombination wird durch die Länge der
homologen Bereiche bestimmt. Zwischen 2 bis 10 kbp nimmt die Frequenz der homologen
Rekombination proportional zu (bis 100fach) und erreicht das Maximum bei 14 kbp. Längere
homologe Bereiche führen zu keiner Verbesserung der Rekombinationseffizienz (Thomas et
al., 1992). Auch das Ausmaß der Homologie zwischen Donor- und Akzeptor-DNA
beeinflusst entscheidend die Rekombination. Sequenzen aus isogener DNA erhöhen die
Effizienz der Rekombination um das 4- bis 5-fache im Vergleich zu Sequenzen aus nichtisogener
DNA (Thomas et al., 1992). Die Rekombination zwischen nicht-isogenen DNA-
Sequenzen führt zu einer Vielzahl von falschen Basenpaarungen in der Heteroduplex-Region.
Durch Exonucleasen des Reparatur-Systems der Zelle werden beide DNA-Stränge dieser
Hybrid-DNA abgebaut, was zu einer Degradation der gesamten DNA und damit zum Tod der

1 Einleitung 10
Zelle führt (Rayssiguier et al., 1989; Selva et al., 1995; de Wind et al., 1995; Waldman und
Liskay, 1988).
1.2.2 Sequenzspezifische Rekombination
Für die Manipulation eukaryontischer Genome kann neben der homologen Rekombination
auch die sequenzspezifische Rekombination eingesetzt werden. Die am häufigsten
verwendeten sequenzspezifischen Rekombinationssysteme sind das Cre/loxP- (Kap.1.2.2.1)
und das Flp/FRT-System (Kap.1.2.2.2). Diese sind unabhängig von endogenen Faktoren, die
für homologe Rekombination benötigt werden, und bestehen aus zwei Komponenten, der
Rekombinase Cre bzw. Flp und den Rekombinase-Erkennungsstellen loxP bzw. FRT. Diese
sogenannten „Sites“ enthalten eine Spacer-Region, die von entgegengesetzt orientierten
Sequenzen flankiert wird. Die Rekombinase erkennt diese Sequenzen und katalysiert letztlich
die reversible Rekombination zwischen den Erkennungsstellen. Aufgrund der Asymetrie des
Spacers besitzen die Erkennungsstellen eine definierte Ausrichtung. Je nach Lage und
Orientierung der Rekombinase-Erkennungsstellen zueinander ergeben sich unterschiedliche
Rekombinationsereignisse. Befinden sich auf einem DNA-Abschnitt Erkennungsstellen mit
inverser Orientierung (‚head-to-head’), führt die Rekombinase-vermittelte Rekombination zu
einer Inversion der dazwischenliegenden DNA-Sequenz (Abb.6A). Bei gleicher Orientierung
der Erkennungsstellen (‚head-to-tail’) findet eine Exzision der DNA statt (Abb.6B). Sind die
Erkennungsstellen auf unterschiedlichen DNA-Molekülen lokalisiert, kommt es zu einer
Integration, der Rückreaktion der Exzision (Abb.6B), oder zu einer Translokation (Abb.6C).
Inversion und Exzision sind als monomolekulare Rekationen thermodynamisch begünstigt.
Dagegen ist die Integration ein intermolekularer Prozess und deshalb vielfach ineffizienter als
die Exzision.
A
Inversion
B
Exzision/Integration
C
Translokation
Exzision
Integration
Rekombinase-Erkennungsstellen
Abb. 6 Schematische Darstellung verschiedener, sequenzspezifischer Rekombinationsvorgänge
(A) Die intramolekulare Rekombination zwischen invers orientierten Rekombinase-Erkennungsstellen führt zu einer Inversion der
dazwischenliegenden DNA-Sequenz. (B) Bei gleicher Orientierung der Erkennungsstellen kommt es zur Exzision der dazwischenliegenden
DNA-Sequenz und zur Bildung eines zirkulären DNA-Produktes. Der umgekehrte Weg, die Integration, verläuft weniger effizient als die
Exzision. (C) Bei Lokalisierung der Erkennungsstellen auf unterschiedlichen DNA-Sequenzen kommt es zur Translokation. (Metzger und
Feil, 1999)
Die Rekombinasen Cre und Flp dieser Systeme gehören zur Integrase-Familie, die nach der
Integrase des Bakteriophagen λ benannt ist, die die Integration des λ-Phagengenoms in das
Genom von E.coli als auch dessen Exzision katalysiert. Bisher sind mehr als 30 verschiedene
Integrasen aus unterschiedlichen Organismen isoliert und charakterisiert worden (Übersicht:
Craig, 1988; Sadowski, 1993). Obwohl keine gemeinsamen DNA-Bindungsmotive existieren,

1 Einleitung 11
scheint die Arbeitsweise der Integrasen konserviert zu sein. Im katalytischen Zentrum
befinden sich die Aminosäuren Tyrosin, Histidin und Arginin (Argos et al., 1986). Tyrosin ist
am Strangbruch, Histidin und Arginin an der Verknüpfung der rekombinierten DNA-Stränge
beteiligt.
Der Reaktionsmechanismus der Rekombinasen Cre und Flp ist ähnlich jedoch nicht identisch
(Ringrose et al., 1998; Tribble et al., 2000; Übersicht: Van Duyne, 2001). Die
sequenzspezifische Rekombination läuft in vier Stufen ab (Abb.7). Im ersten Schritt lagern
sich Rekombinasen als Monomere an die Bindungsstellen der Erkennungssequenzen an
(Andrews et al., 1987; Hoess und Abremski, 1984; Mack et al., 1992). Durch Protein-Protein-
Interaktion kommt es zur Paarung der Rekombinasen (Beatty et al., 1986; Abremski und
Hoess, 1985; Adams et al., 1992; Guo et al., 1997). Anschließend findet die Rekombination
zwischen den Erkennungsstellen, eine Neuverknüpfung von DNA-Strängen statt (Stark et al.,
1992), und im letzten Schritt dissoziieren die Rekombinasen von den Erkennungsstellen ab
(Gates und Cox, 1988; Waite und Cox, 1995). Der Mechanismus der DNA-Neuverknüpfung
wird allgemein als „konservative“ sequenzspezifische Rekombination bezeichnet. Während
des Rekombinationsverlaufes werden zwei DNA-Stränge an definierten Stellen geschnitten
und diese Stränge unverändert, d.h. ohne Abbau und Neusynthese von DNA, wieder
verknüpft. Das bedeutet, dass keine genetischen Informationen zufällig, unspezifisch
verändert oder verloren gehen. Für die sequenzspezifische Rekombination sind keine weiteren
Faktoren notwendig (Stark et al., 1992).
Da die Rekombinasen des Cre/loxP- und Flp/FRT-Systems sowohl Hin- als auch
Rückreaktion der Rekombination katalysieren können (bidirektionale Reaktion), die
Reaktionsrichtung bzw. das Reaktionsgleichgewicht jedoch nach thermodynamischen
Stabilitätsbedingungen definiert wird, ist die Effizienz der Integrationsreaktion gering,
während die Exzision bevorzugt wird. Sequenzspezifisch integrierte DNA-Bereiche im
Genom sind deshalb in Gegenwart der Rekombinasen instabil. Aus diesem Grund sind
stringente Selektionssysteme (O’Gorman et al., 1991; Schübeler et al., 1998; Francastel et al.,
1999) oder Strategien, die nur ein temporäres Vorhandensein der Rekombinase ermöglichen
(O’Gorman et al., 1991; Logie und Stewart, 1995; Metzger et al., 1995; Kellendonk et al.
1996; Kühn et al., 1995), erforderlich.
A Anlagerung der Rekombinasen
an Erkennungsstellen
B
Paarung der Rekombinasen und Neuverknüpfung der DNA-Stränge
Spacer
C Dissoziation
Abb. 7 Mechanismus der Rekombinase-vermittelten Exzision
(A) Rekombinase-Monomere lagern sich an die Erkennungsstellen an. (B) Es kommt zur Paarung der Rekombinasen und zur
Neuverknüpfung der DNA-Stränge. (C) Die Rekombinasen dissoziieren von den Erkennungsstellen ab.

1 Einleitung 12
Es existieren weitere Rekombinationssysteme wie das λ-Integrase- (Landy, 1989; Christ und
Dröge, 2002; Christ et al., 2002) und das ΦC31-Integrase-System (Kuhstoss und Rao, 1991;
Rausch und Lehmann, 1991; Thorpe und Smith, 1998). In beiden Systemen katalysiert die
Integrase die Rekombination zwischen zwei unterschiedlichen Erkennungsstellen, attP und
attB. Dies führt zur Bildung neuer Erkennungsstellen, attL und attR. Im ΦC31-Integrase-
System können diese nicht mehr miteinander rekombinieren, so dass die Integration einer
Sequenz irreversibel ist (Thorpe et al., 2000). Im λ-Integrase-System ist dagegen eine
Rekombination zwischen diesen Erkennungsstellen möglich. Jedoch werden dafür andere
exogene Kofaktoren benötigt als für die Rekombination zwischen attB und attP.
1.2.2.1 Das Cre/loxP-System
Um die bei der Replikation entstandenen Phagendimere in Monomere zerlegen zu können,
besitzt der Bakterienphage P1 ein sequenzspezifisches Rekombinationssystem. Dieses besteht
aus einer loxP-Site (locus of X-over), die sich singulär auf jedem zirkulären Phagenplasmid
befindet, und einer 38 kDa großen Rekombinase Cre (Cyclization recombination), die loxP-
Sites erkennt und die Rekombination zwischen zwei loxP-Sites katalysiert (Übersicht: Nagy,
2000). Die Wildtyp loxP-Site besteht aus einem 8 bp langem Spacer, der von zwei 13 bp
langen invertierten Sequenzen flankiert wird (Abb.8). An diese binden Cre-Rekombinasen
(Hoess und Abremski, 1985) und katalysieren die Rekombination.
Da das Cre/loxP-Rekombinationssystem keine Kofaktoren benötigt, konnte es in anderen
Organismen wie E.coli, Hefe (Sauer und Henderson, 1990) und Maus (Lakso et al., 1992) und
in Säugerzellen (Übersicht: Kilby et al., 1993; Sauer, 1994), so auch in ES-Zellen (Gu et al.,
1993), etabliert werden.
Insbesondere zur Generierung von knock-out Mauslinien findet das Cre/loxP-System
weitreichende Anwendung. Mittels homologer Rekombination können Gene konstitutiv
abgeschaltet werden (Kap.1.2.1), was jedoch letal sein kann, da bestimmte Gene für die
Embryogenese essentiell sind. Dieses Problem kann durch Kreuzung einer Mauslinie, in
denen das Gen bzw. ein Exon durch loxP-Sites flankiert ist, mit einer Mauslinie, die gewebeoder
entwicklungsspezifisch bzw. induzierbar die Rekombinase Cre exprimiert, umgangen
werden. Durch Cre-vermittelte Exzision bestimmter Genabschnitte kann die Expression des
Gens konditional statt konstitutiv reprimiert werden, was auch die Untersuchung der Funktion
von Genen in bestimmten Entwicklungsstadien oder Zelltypen erlaubt (Übersicht: Orban et
al., 1992; Kühn et al., 1995; Sauer, 1998; Metzger und Feil, 1999; Nagy, 2000).
Mit dem Cre/loxP-Rekombinationssystem können jedoch nicht nur kurze DNA-Abschnitte
aus dem Genom exzisiert werden (Gu et al., 1993). Die Cre-Rekombinase kann auch
Rekombinationen zwischen loxP-Sites katalysieren, die mehrere Centimorgan auseinander,
auf unterschiedlichen Chromosomen-Armen liegen (Ramirez-Solis et al., 1995; Li et al.,
1996; Herault et al., 1998; Zheng et al., 2000). Neben Exzision genetischer Elemente können
mittels des Cre/loxP-Systems auch DNA-Sequenzen in mit loxP-Sites markierte Genorte
inseriert werden (Fukushige und Sauer, 1992; Baubonis und Sauer, 1993; Schübeler, 1998).
Durch sogenannte „Pseudo-loxP“-Sites, die eine ähnliche Nukleotidsequenz wie das loxP-
Element des Bakteriophagen P1 aufweisen und im Mammaliagenom vorkommen
(Thyagarajan et al., 2000), kann es zu illegitimen Cre-vermittelten Rekombinationen
kommen. Von Schmidt et al. (2000) wurde gezeigt, dass die Expression von Cre in Maus-
Spermatiden zu Chromosomen-Rearrangements führt. Dieser, bei Cre-vermittelter
Rekombination auftretende negative Effekt kann jedoch durch eine temporäre Expression von
Cre minimiert werden (Choulika et al., 1996; Silver und Livingston, 2001). „Pseudo-loxP“-
Sites können auch gezielt zur Integration von endogenen DNA-Sequenzen benutzt werden

1 Einleitung 13
(Sauer, 1996). Dafür bedarf es jedoch Cre-Rekombinasen, die spezifisch „Pseudo-loxP“-Sites
erkennen (Buchholz und Stewart, 2001).
loxP
Spacer
ATAACTTCGTATA
GCATACAT
TATACGAAGTTAT
Abb. 8 Sequenz und Aufbau der Wildtyp loxP-Site
1.2.2.2 Das Flp/FRT-System
Viele Stämme der Hefe Saccaromyces cerevisia besitzen das sogenannte 2µ-Plasmid (Hartley
und Donelson, 1980). Dieses enthält zwei komplementäre DNA-Sequenzen, die das Plasmid
in zwei Bereiche abgrenzen. Diese Sequenzen sind Erkennungsstellen für die Rekombinase
Flp, die ebenfalls auf dem Plamid kodiert vorliegt und die Rekombination zwischen diesen
sogenannten FRT-Sites (Flp-recombinase Recognition Target) katalysiert. Da die im 2µ-
Plasmid vorkommenden FRT-Sites invers orientiert sind, führt die Flp-vermittelte
Rekombination zwischen den Sites zu einer Inversion eines Teils des Plasmides.
Die FRT-Site besteht ähnlich wie die loxP-Site aus einer asymetrischen, 8 bp langen Spacer-
Region (Abb.9), die für die Orientierung verantwortlich ist (Jayaram, 1985; Senecoff und
Cox, 1986; Senecoff et al., 1985; McLeod et al., 1986). Flankiert wird diese Region von
invers angeordenten, 13 bp langen Sequenzwiederholungen und einer zusätzlichen
Sequenzwiederholung, die jedoch für Rekombinationen entbehrlich ist (Senecoff und Cox,
1986; Lyznik et al., 1993; Sadowski, 1995). Die den Spacer flankierenden Sequenzen stellen
die Bindungsstellen für die 43 kDa große Flp-Rekombinase dar (Senecoff et al., 1988).
Da das Flp/FRT-System wie das Cre/loxP-System nicht von weiteren Faktoren abhängig ist,
konnte es auf Organismen wie E.coli (Huang et al., 1991), Drosophila (Golic und Lindquist,
1989; Golic, 1991) und Maus (Dymecki, 1996; Dymecki und Tomasiewicz, 1998; Vooijs et
al., 1998; Farley et al., 2000) und auf Planzen- und Säugerzellen (O’Gorman et al., 1991,
Lyznik et al., 1993, Übersicht: Kilby et al., 1993) adaptiert werden. Das
Rekombinationssystem dient der Exzision FRT-Sites flankierter Genbereiche und damit der
Abschaltung bestimmter Gene z.B. Selektionsmarker (Fiering et al., 1993; Farley et al., 2000;
Rodriguez et al., 2000; Schaft et al., 2001). Auch die Integration von DNA-Sequenzen über
singuläre FRT-Sites ist mittels des FRT/Flp-Systems möglich (O’Gorman et al., 1991; Koch
et al., 2000), es bedarf jedoch Selektionsfallen, da die Integration gegenüber der Exzision
thermodynamisch benachteiligt ist (Schübeler et al., 1998; Verhoeyen et al., 1998). Im
Gegensatz zur Cre-Rekombinase mit einem Temperatur-Optimum bei 37-39°C hat die
Wildtyp Flp-Rekombinase ihre höchste Aktivität bei 25-30°C. Bei 37°C ist die Aktivität
signifikant reduziert (Buchholz et al., 1996). Aufgrund der geringen Rekombinationseffizienz
ist die Wildtyp Flp-Rekombinase daher für gezielte sequenzspezifische Rekombinationen in
Zellkultur und transgenen Mäusen (Dymecki, 1996; Vooijs et al., 1998) weniger geeignet.
Von Buchholz et al. (1998) wurde jedoch die thermostabilere Flp-Rekombinase Flpe (Flp-
Recombinase enhanced) generiert. Mit dieser Rekombinase stellt das Flp/FRT-System eine
Alternative zum etablierten Cre/loxP-Rekombinationssystem dar (Farley et al., 2000;
Rodriguez et al., 2000).

1 Einleitung 14
FRT
Spacer
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAA
GTATAGGAACTTC
Abb. 9 Sequenz und Aufbau der Wildtyp FRT-Site
1.2.2.3 Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch
Die Cre- bzw. Flp-vermittelte Integration von DNA-Sequenzen in mit loxP- bzw. FRT-Sites
markierte Genorte von Zellen ist thermodynamisch benachteiligt, da dieser Vorgang im
Gegensatz zur Exzision ein monomolekularer Prozess ist. Eine weitaus effizientere Methode,
eine beliebige DNA-Sequenz in einen Genort zu inserieren, stellt der Rekombinasevermittelte
Kassettenaustausch, RMCE genannt (Recombinase-mediated Cassette Exchange),
dar, der auf die Verwendung heterospezifischer Rekombinase-Erkennungsstellen beruht. Das
Flp-basierte RMCE-Verfahren wurde erstmals von Schlake und Bode (1994), das Cre-basierte
Verfahren von Bouhassira er al. (1997) vorgestellt.
Durch verschiedene Mutationen, in erster Linie in der Spacer-Region, wurden FRT-Sites
generiert (Tab.2), die ebenfalls von der Flp-Rekombinase erkannt werden, jedoch nicht mit
der Wildtyp FRT-Site bzw. anderen mutierten FRT-Sites rekombinieren können (Senecoff
und Cox, 1986; Umlauf und Cox, 1988; McLeod et al., 1986; Schlake und Bode, 1994).
Zwischen homospezifischen FRT-Mutanten ist die Rekombination allerdings weiterhin
möglich, ähnlich effizient wie zwischen Wildtyp FRT-Sites (Schlake und Bode, 1994).
Spacer
Wildtyp FRT
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAA
GTATAGGAACTTC
min. FRT
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAA
GTATAGGAACTTC
M1 1
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAA_
GTATAGGAACTTC
M2 1
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TTCTAGAAAA
GTATAGGAACTTC
M3 2
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAT
GTATAGGAACTTC
M4 2
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGATA
GTATAGGAACTTC
M5 2
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAAC
GTATAGGAACTTC
M6 3
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TTCTAGAA_
GTATAGGAACTTC
M7 4
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTACTTA
GTATAGGAACTTC
M8 4
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TTCAAATA
GTATAGGAACTTC
M9 4
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TCTAGAAG
GTATAGGAACTTC
M10 (F5) 4
GAAGTTCCTATTCC
GAAGTTCCTATTC
TTCAAAAG
GTATAGGAACTTC
Tab. 2 Wildtyp FRT-Sites und verschiedene FRT-Mutanten
Sequenz der Wildtyp FRT-Site im Vergleich zu diversen FRT-Mutanten (Veränderungen in der Sequenz der Spacer-Region sind
unterstrichen): 1 veränderte Spacer-Länge, 2 Punktmutationen, 3 symetrischer Spacer, 4 mehrere Mutationen
Der Kassettenaustausch beruht auf zwei sequenzspezifischen Rekombinationen zwischen
homospezifischen FRT-Sites, die einerseits genomisch verankert, anderseits im sogenannten
Austauschplasmid vorliegen. Da die FRT-Sites im Genom bzw. im Austauschplasmid
heterospezifisch sind, kann die im Genom von den unterschiedlichen FRT-Sites
eingeschlossenene DNA-Sequenz durch die, mit den selben FRT-Sites flankierte Sequenz im

1 Einleitung 15
Austauschplasmid ersetzt werden (Abb.10). Eine Flp-vermittelte Integration des
Austauschplasmids in eine der FRT-Sites oder eine Exzision der mit FRT-Sites flankierten
DNA-Sequenzen findet nicht statt. Um unspezifische Integrationsereignisse zu vermeiden und
Zellen mit ausgetauschter DNA-Sequenz zu selektieren, muss das Austauschereignis
angereichert werden, entweder durch Wegfall eines Selektionsmarkers (Negativ-Selektion)
oder Integration bzw. Aktivierung eines Selektionsmarkers (Positiv-Selektion). Zur Negativ-
Selektion eignet sich Thymidinkinase aus HSV (Herpes Simplex Virus). Durch den Verlust
dieses Gens können Zellen eine Gancyclovir-Selektion überleben. Dagegen kann
Thymidinkinase in Zellen, in denen kein Austausch stattgefunden hat, Gancyclovir in ein
toxisches Triphosphat umwandeln, was zum Tod der Zellen führt (Seibler und Bode, 1997).
Bei Positiv-Selektion wird mit dem Austausch ein vollständiger Positiv-Selektionsmarker
integriert (Schübeler et al., 1998) oder ein ATG-defizienter, bereits genomisch verankerter
Positiv-Selektionsmarker wie Neomycinphosphotransferase durch Integration eines
Startcodons aktiviert (Verhoeyen et al., 1998, 2001).
Durch Mutationen der Wildtyp loxP-Site in der Spacer-Region konnten auch loxP-Mutanten
generiert werden, die nicht mit anderen loxP-Sites rekombinieren (Hoess et al., 1986;
Bouhassira et al., 1997; Bethke und Sauer, 1997; Lee und Saito, 1998; Lee et al., 2000;
Langer et al., 2002) und somit für RMCE-Verfahren einsetzbar sind (Bethke und Sauer, 1997;
Soukharev et al., 1999; Langer et al., 2002). Eine weitere Möglichkeit zur effizienten
Integration von DNA-Sequenzen bieten die loxP-Sites lox66 und lox71, die Mutationen in
ihren flankierenden Sequenzen, nicht jedoch in der Spacer-Region aufweisen (Albert et al.,
1995; Araki et al., 1997). Die Rekombination zwischen diesen loxP-Sites führt zur
Ausbildung einer Wildtyp loxP-Site und einer loxP-Mutante, welche die flankierenden
Sequenzen der lox66- und lox71-Site aufweisen.
chromosomal integrierte
DNA-Sequenz
F1
F2
F1
F2
Rekombinase
+
F1
Austauschplasmid
F2
F1
F2
Abb. 10 Schematische Darstellung des Kassettenaustausches (RMCE) am Beispiel des Flp/FRT-Systems
Die heterospezifischen Rekombinase-Erkennungsstellen F1 und F2 (FRT-Sites) rekombinieren nicht miteinander sondern nur untereinander.
Dadurch kann eine DNA-Sequenz, die auf dem Austauschplasmid mit den Erkennungsstellen F1 und F2 flankiert ist, in einen Genort, der die
gleichen Erkennungsstellen aufweist, sequenzspezifisch integriert werden.
Ein Problem beim Kassettenaustausch besteht darin, dass das Austauschkonstrukt nicht nur
sequenzspezifisch in den markierten Genort sondern zusätzlich in zufällige Loci durch
illegitime Rekombination integrieren kann. Dies reduziert die Austauscheffizienz, da nicht
nur Klone selektiert werden, die einzig im markierten Genort die Austauschkassette inseriert
haben (Seibler, 1999). Da die Integration zirkulärer Plasmide in das Genom von ES-Zellen
sehr ineffizient ist, kann erwartet werden, dass ein Kassettenaustausch in ES-Zellen
vorwiegend zu Austauschklonen mit ausschließlich im markierten Genort integrierter
Austauschkassette führt. In anderen Zellen wie NIH3T3 können dagegen zirkuläre Plasmide
effizient in zufällige Genorte integrieren. Ein Kassettenaustausch in diesen Zellen ist deshalb
häufig verbunden mit zusätzlichen Integrationen des Austauschplasmides. Dadurch erhöht
sich der Screening-Aufwand nach Klonen, bei denen allein im markierten Genort das
Austauschkonstrukt inseriert vorliegt.

1 Einleitung 16
1.3 Embryonale Stammzellen und in vitro Differenzierung
Von Evans und Kaufman (1981) als auch von Martin (1981) wurden undifferenzierte ES-
Zellen (embryonic stem cells) aus der inneren Zellmasse (ICM: inner cell mass) von 3.5 Tage
alten Blastozysten isoliert, die nach Reimplantation in Mausblastozysten wieder zur
Generierung von Mäusen beitrugen (Gossler et al., 1986; Robertson et al., 1986; Mansour et
al., 1988; Thomas und Capecchi, 1987). Dies eröffnete die Möglichkeit, ES-Zellen in vitro zu
manipulieren und mit diesen Zellen transgene Mauslinien zu etablieren. Für die
Gewährleistung der Pluripotenz der ES-Zellen müssen diese in LIF (Leukemia inhibitory
factor)-haltigem Medium kultiviert werden, da dieser Faktor die Differenzierung der Zellen
verhindert (Smith und Hooper, 1987; Williams et al., 1988; Niwa et al., 1998; Matsuda et al.,
1999). Ähnliche Wirkung zeigen auch andere Faktoren wie CNF (Ciliary neurotrphic factor)
und OSM (Oncostatin M) (Conover et al., 1993; Piquet-Pellorce et al., 1994; Rose et al.,
1994). Durch verschiedene Techniken wie homologe oder sequenzspezifische Rekombination
(Kap.1.2) können in ES-Zellen Transgene integriert oder endogene Gene manipuliert oder
deletiert werden (Smithies et al., 1985; Thomas und Capecchi, 1987; Doetschman et al.,
1988). Diese transgenen ES-Zellen kann man anschließend zur Generierung von knock-in
bzw. knock-out Mauslinien einsetzen.
Embryonale Stammzellen besitzen die Fähigkeit, in vitro spontan zu differenzieren. In
Suspension schließen sich diese zu Embryo-ähnlichen Aggregaten, sogenannten Embryonic
Bodies (EB) zusammen (Doetschman et al., 1985). Innerhalb von 5 Tagen bilden diese eine
äußere endodermale Zellschicht, die von einer Basallamina umgeben ist, und eine innere
Schicht aus Zellen ektodermalen und mesodermalen Ursprungs aus, strukturell vergleichbar
mit einem 5-Tage alten Mausembryo. Diese Aggregate entwickeln sich dann weiter zu
cystischen Emryonic Bodies, die durch typische Strukturen wie Microvilli und typische
Genexpressionen wie alpha-Foetoprotein und Transferrin-Expression charakterisiert sind, und
einem 8- bis 10-Tage alten visceralen Dottersack ähneln. Auf Zellkulturplatten ausplattiert
wachsen aus den Aggregaten differenzierte Zellen endodermaler, ektodermaler und
mesenchymaler Abstammung. Diese komplexen, multizellulären Zellrasen werden auch als
Outgrowths bezeichnet und bestehen aus Skelettmuskelzellen und glatten Muskelzellen
(Miller-Hance et al., 1993, Rohwedel et al., 1994), vaskulären glatten Muskelzellen (Risau et
al., 1988, Drab et al., 1997), Kardiomyocyten (Miller-Hance et al., 1993), neuronalen Zellen
mit synaptischen Verbindungen (Bain et al., 1995, Rohwedel et al., 1998b, Strübing et al.,
1995), Glial-Zellen (Fraichard et al., 1995, Brüstle et al., 1999, Liu et al., 2000), Adipocyten
(Dani et al., 1997), Chondrocyten (Wobus et al., 2000), Epithelzellen (Bagutti et al., 1996),
Endothelzellen (Risau et al., 1988, Wang et al., 1992) und hematopoetischen Zellen (Schmitt
et al., 1991, Keller et al., 1993, Choi et al., 1998).
Durch Zugabe bestimmter Faktoren zu definierten Zeitpunkten der Kultivierung können
bestimmte Differenzierungen forciert werden. So wird zum Beispiel durch BMP-2/-4
Chondrogenese induziert (Kramer et al., 2000) und Neurogenese inhibiert (Finley et al.,
1999, Wiles und Johansson, 1999). Die Differenzierung zu mesodermalen Zellen kann durch
die Faktoren Activin A, EGF (Epidermal Growth Factor) und bFGF/FGF-2 (basic Fibroblast
Growth Factor/Fibroblast Growth Factor 2) stimuliert werden, wobei letztere auch eine
ektodermale Differenzierung induzieren (Brüstle et al., 1999, Schuldiner, M. et al., 2000). Der
wichtigste Faktor für eine zielgerichtete Differenzierung von ES-Zellen zu mesodermalen und
ektodermalen Zellen ist jedoch all-trans-Retinsäure. Dabei beeinflussen die eingesetzte
Konzentration und der Zeitpunkt der Induktion entscheidend die Differenzierungsrichtung.
So induziert 10 -7 M Retinsäure zwischen Tag 0 und 2 (Strübing et al., 1995, Fraichard et al.,
1995) bzw. 5⋅10 -7 M Retinsäure zwischen Tag 4 und 8 der Differenzierung (Bain et al., 1995,
Liu et al., 2000) die Neurogenese. Dagegen verhindert eine Retinsäure-Induktion in der
Konzentration von 10 -7 M zwischen Tag 0 und 2 (Rohwedel et al., 1998a) bzw. von 10 -8 M bis

1 Einleitung 17
10 -6 M zwischen Tag 2 und 5 (Dani et al., 1997) die Bildung von Kardiomyocyten. Mit 10 -8 M
Retinsäure ab Tag 5 kann die Kardiogenese jedoch stimuliert werden (Wobus et al., 1997).
Gleichzeitig kommt es dabei zur Induktion der Vaskulogenese (Drab et al., 1997) und
Inhibierung von Myogenese und Adipogenese (Wobus et al., 1997). Eine 10 -8 M Retinsäure-
Induktion zwischen Tag 2 und 5 kann eine Differenzierung zu Skelettmuskelzellen (Wobus et
al., 1994) und Adipocyten (Dani et al., 1997) bewirken. In Tabelle 3 sind terminale
Retinsäure-Induktionen und resultierende Differenzierungsrichtungen zusammengefasst.
Retinsäure-Induktion an Tag:
Retinsäure induziert: 0-2 2-5 >5
Neurogenese ++ (1⋅10-7M RA) + * (5⋅10 -7 M RA) ±
Kardiogenese −− (1⋅10 -7 M RA) −− (1⋅10 -8 M RA) +
(1⋅10 -8 M RA)
Myogenese ± ++ (1⋅10 -8 M RA) −
(1⋅10 -8 M RA)
Adipogenese − ++ (1⋅10 -8 M RA) −
(1⋅10 -8 M RA)
Vaskulogenese ± +
(1⋅10 -8 M RA)
Tab. 3 Terminale Retinsäure-Induktion und Folgen auf die in vitro Differenzierung
Neurogenese, Kardiogenese, Myogenese, Adipogenese, Vaskulogenese werden in Abhängigkeit von einer zeitlich begrenzter Induktion mit
Retinsäure (RA) am Tag 0-2, Tag 2-5 oder ab dem 5. Tag der in vitro Differenzierung unterschiedlich beeinflusst: ++ starke Induktion,
+ Induktion, ± keine Induktion/Inhibition, − Inhibition, −− starke Inhibition (*: 4 Tage ohne, 4 Tage mit Retinsäure)
Durch die in vitro Differenzierung von ES-Zellen ist es möglich, die in vivo Differenzierung
im Embryo nachzuahmen. Während der ES-Zelldifferenzierung werden in ähnlicher Weise
wie bei der Embryogenese der Maus gewebespezifische Gene, Proteine, Ionenkanäle und
Rezeptoren in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium exprimiert (Übersicht: Rohwedel et
al., 1999, Guan et al., 1999). Somit eignet sich dieses Modell, um in der Zellkultur die
Embryogenese und den Einfluss verschiedener Faktoren wie Wachstumsfaktoren (Übersicht:
Schuldiner et al., 2000), aber auch den Effekt von Genabschaltung, Überexpression
bestimmter Gene und Expression von Transgenen auf und während der Differenzierung
untersuchen zu können.
1.4 Aufgabenstellung
Die meisten derzeit angewandten Verfahren zur Etablierung transgener Mäuse erfordern ein
weitläufiges Screening von Tieren, da die zufällige Integration eines Transgens zu einer, vom
Integrationsort abhängigen und daher nicht vorhersagbaren Expression des Transgens führt.
Da die Möglichkeit besteht, aus ES-Zellen transgene Mäuse zu generieren, sollten im Rahmen
dieser Arbeit transgene ES-Zelllinien etabliert werden, in denen chromosomale Loci mit
unterschiedlichen FRT-Sites markiert sind, so dass durch Flp-vermittelte Rekombination ein
beliebiges Transgens in diese Loci über Kassettenaustausch integriert werden kann. Da bei
diesem Verfahren bereits charakterisierte Genorte wiederverwendet werden, sollte es möglich
sein, die Expression des Transgens vorherzusagen. Um die Expression eines Transgens
exogen beeinflussen zu können, sollte eine Tetracyclin-abhängige, autoregulierbare
Expressionskassette für die Markierung und Charakterisierung der Genorte in ES-Zellen
Verwendung finden.
Im ersten Teil der Arbeit sollte überprüft werden, ob durch Integration einer autoregulierten
TetOff-Expressionskassette in unbekannte chromosomale Genorte durch illegitime
Rekombination und in bekannte Genorte mittels homologer Rekombination ES-Zelllinien
generiert werden können, die eine hohe, strikt regulierbare Reportergen-Expression
aufweisen. Zu Vergleichszwecken sollte das autoregulierte Expressionssystem außerdem in
NIH3T3-Zellen etabliert werden, da in mehreren Publikationen bereits erfolgreich gezeigt

1 Einleitung 18
werden konnte, dass in differenzierten Zellen das TetOff-System funktional ist. Im zweiten
Teil der Arbeit sollte ein Kassettenaustausch durchgeführt werden. Dazu sollte eine
genomisch integrierte, autoregulierte Kassette Flp-vermittelt durch eine ähnlich aufgebaute,
autoregulierte Austauschkassette ersetzt und deren Expression mit der der parentalen Kassette
im selben Genort verglichen werden.
Weiterhin sollten die Expressionseigenschaften eines autoregulierten Konstruktes in in vitro
differenzierten Zellen im Vergleich zu undifferenzierten ES-Zellen beurteilt werden, um
mögliche Rückschlüsse auf die Expression der Kassette in transgenen Mäusen ziehen zu
können.

2 Ergebnisse 19
2 Ergebnisse
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines autoregulierbaren Expressionssystems zur
Markierung hoch exprimierender und regulierbarer Genorte in murinen embryonalen
Stammzellen. Dabei sollte gewährleistet werden, dass nachträglich in diese Genorte durch
sequenzspezifische, Flp-Rekombinase vermittelte Rekombination andere Expressionskassetten
inseriert werden können.
2.1 Strategie zum Auffinden und Wiederverwenden regulierbarer Genorte
2.1.1 Die autoregulierte Expressionskassette LUCTP zur Identifizierung von
regulierbaren Genorten
Zur Identifizierung von wiederverwendbaren, chromosomalen Loci in Zellen wurde der auf
dem TetOff-System basierende, autoregulierte Expressionsvektor LUCTP konstruiert
(Abb.11A). Dieser enthält einen bidirektionalen, Transaktivator-abhängigen Promotor P bi
(Baron et al., 1995), der die Transkription einer bicistronischen mRNA erlaubt, die einerseits
zu einer cap-abhängigen Expression des für eine Autoregulation notwendigen Transaktivators
tTA (1. Cistron) und zu einer Polio-IRES vermittelten, cap-unabhängigen Expression des
Positiv-Negativ-Selektionsmarkers Tkneo (2. Cistron) führt (Abb.11A). Außerdem wird durch
den Promotor die Expression der Firefly-Luciferase aus Photinus pyralis (Leuchtkäfer)
gewährleistet, welche die Oxidation von Luciferin in Oxyluciferin katalysiert. Bei dieser
Reaktion werden Photonen freigesetzt, die durch photodetektorische Messung Auskunft über
die Höhe der Expression des Enzyms in untersuchten Zellen geben. Im Tkneo-Gen ist das
Neomycinphosphotransferase-Gen (neo) aus dem bakteriellen Transposon Tn5 im Leseraster
mit dem Thymidinkinase-Gen (Tk) aus dem Herpes Simplex Virus fusioniert. Durch die
Neomycinphosphotransferase-Aktivität des exprimierten Fusionsproteins Tkneo wird
Resistenz gegen das Gentamycin-Derivat G418 (Aminoglycosid-Antibiotikum), welches die
Translation hemmt, vermittelt. Dadurch können die Zellen, die nach chromosomaler
Integration der Expressionskassette Tkneo exprimieren, selektiert werden (Positiv-Selektion).
Durch die Thymidinkinase-Aktivität von Tkneo werden die Zellen gegen Gancyclovir, ein
Guanosin-Antimetabolit, sensitiv. Zur Wiederverwendung markierter Genorte ist die Kassette
am 5’-Ende durch eine Wildtyp FRT-Site F und im 3’-Bereich im Fusionsgen zwischen
Thymidinkinase- und Neomycinphosphotransferase-Gen durch die FRT-Mutante F5 (Tab.2)
flankiert.
2.1.2 Strategie zum Austausch der Reportergen-Kassette gegen beliebige biologisch
aktive Gene
Über die heterospezifischen FRT-Sites F und F5 der im Genort verankerten Kassette LUCTP
kann ein Austauschplasmid, das ebenfalls von den FRT-Sites F und F5 flankiert wird, mittels
sequenzspezifischer, Flp-vermittelter Rekombination in den markierten Locus integriert
werden (Kap.1.2.2.3). In Abbildung 11B ist schematisch der Kassettenaustausch dargestellt.
Eine Exzision der integierten Kassette kann nicht stattfinden, da die FRT-Sites F und F5 nicht
miteinander rekombinieren können. Die Zellen, bei denen ein Kassettenaustausch
stattgefunden hat, können anhand des Verlustes des Thymidinkinase-Gens selektiert werden
(Negativ-Selektion). Durch die fehlende Thymidinkinase-Aktivität wird Gancyclovir nicht in

2 Ergebnisse 20
ein, für die Zellen toxisches Triphosphat umgewandelt. Dagegen sollten die Zellen, bei denen
die DNA-Kassette nicht ausgetauscht wurde, absterben. Nach Kassettenaustausch befindet
sich an der Stelle des Thymidinkinase-Gens ein Startcodon im Leseraster zum verbliebenen
neo-Gen. Dadurch können die Zellen aufgrund ihrer Neomycinphosphotransferase-Aktivität
weiterhin mit G418 selektiert werden (G418-Resistenz).
A
Markierung von Genorten in Zellen mit dem Vektor LUCTP
Autoregulierter Vektor LUCTP
F
P bi
F5 loxP loxP
5‘ pA Luciferase tTA Polio TK- neo pA 3‘
Transkription
(mRNA):
Luciferase
tTA
TK
neo
Translation
(Protein):
Luciferin
Firefly-Luciferase
Oxyluciferin
+ Lichtenergie
Transaktivator
tTA
Fusionsprotein Tkneo:
Thymidinkinase-/Neomycinphosphotransferase-Aktivität
B
Kassettenaustauschstrategie
Markierter Genort
P bi
F5 loxP loxP
5‘ pA Luciferase tTA Polio TK- neo pA 3‘
Austauschkonstrukt
F
P bi
F5
Flp-Rekombinase
(Flipase)
pA
Gen X
tTA
IRES
pA
ATG
RMCE
Genort nach Kassettenaustausch
F
P bi
F5 loxP loxP
5‘ pA Gen X
tTA IRES neo pA 3‘
ATG
Genort nach Exzision von
Neomycinphosphotransferase
Cre-Rekombinase
F
P bi
F5 loxP
5‘
pA
Gen X
tTA
IRES
pA 3‘
ATG
Abb. 11 Schematische Darstellung der Markierungs- und Kassettenaustauschstrategie
(A) Schematische Darstellung des Aufbaus der autoregulierten Expressionskassette LUCTP: Der bidirektionale Promotor Pbi vermittelt die
Transaktivator-abhängige Bildung zweier mRNAs, die einerseits der Expression des Reporters Luciferase, anderseits der Expression des
Transaktivators tTA (TA) und der Polio-IRES vermittelten Expression des Selektionsmarkers Tkneo, ein Fusionsprotein aus Thymidinkinase
(Tk) und Neomycinphosphotransferase (neo), dienen. (B) Schematische Darstellung des Kassettenaustausches: Nach Integration der
autoregulierten Kassette in das Genom von Zellen kann diese über die heterospezifischen FRT-Sites F und F5 durch sequenzspezifische, Flp-
Rekombinase vermittelte Rekombination gegen eine Austauschkassette, die mit gleichen FRT-Sites versehen ist, ausgetauscht werden
(RMCE: Recombinase mediated cassette exchange). Dabei kommt es zum selektierbaren Verlust des Thymidinkinase-Gens. Durch ein
inseriertes Startcodon ATG im 5’-Bereich des neo-Gens wird die Neomycinphosphotransferase-Aktivität der Zellen aufrechterhalten. Das
neo-Gen kann anschließend über die flankierenden loxP-Sites mittels Cre-Rekombinase vermittelter Rekombination exzisiert werden.

2 Ergebnisse 21
Das neo-Gen kann einen negativen Einfluss auf die Expression benachbarter Gene ausüben
(Artelt et al., 1991). Daher ist es von zwei loxP-Sites flankiert, wodurch es Cre-vermittelt
exzisiert werden kann (Kap.1.2.2.1). Insbesondere nach Etablierung von parentalen ES-
Zelllinien bzw. von ES-Zellen mit Austauschkonstrukt und folgender Generierung transgener
Mauslinien ist angedacht, diese Mäuse mit Cre-exprimierenden Mäusen zu kreuzen, was zum
Verlust des Gens in den Nachkommen führt.
2.2 Etablierung eines TetOff-Expressionssystems in ES-Zellen
2.2.1 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität von LUCTP in
NIH3T3-Zellen
Das Expressionsverhalten und die Regulationskapazität des Vektors LUCTP wurden zunächst
in Zellen der Mausfibroblasten-Zelllinie NIH3T3 überprüft. Dazu wurde der linearisierte
Vektor in die Zellen elektroporiert und die Zellen anschließend mit G418-haltigem Medium
selektiert. Zehn G418-resistente Klone wurden hinsichtlich Kopienzahl im Southern-Blot
analysiert. Dazu wurden die genomischen DNAs der Klone mit dem Restriktionsenzym PvuII
geschnitten und mit der Tkneo-Sonde, welche gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet
ist, hybridisiert (Abb.12A). Dadurch konnten Randfragmente nachgewiesen werden, deren
Größe von der Entfernung zwischen der PvuII-Schnittstelle im 3’-Bereich der inserierten
Kassette und der nächstgelegenen PvuII-Schnittstelle im Genom abhängig und für jeden
genomischen Integrationsort spezifisch ist (Randfragment-Detektion).
Die Southern-Blot Analyse zeigte, dass die Klone 4 und 8 eine singuläre Kopie der
Expressionskassette besitzen (Abb.12B). Die ähnliche Größe des detektierten DNA-
Fragmentes lässt jedoch nicht ausschließen, dass diese beiden Klone Subklone eines
gemeinsamen parentalen Klons sind. In den restlichen Klonen wurden mehrfache genomische
Integrationen der LUCTP-Kassette nachgewiesen.
A LUCTP
F
F5
5‘ pA Luciferase tTA POLIO TKneo
PvuII
PvuII
pA 3‘
B
1 kb
> 0.8 kb
Tkneo-Sonde
M 1 2 3 4 5 6
7
8 9 10
K
21.2 kb
5.0 kb
3.5 kb
2.0 kb
1.4 kb
Abb. 12 Southern-Blot Analyse der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTP-Kassette
(A) Schematische Darstellung des Konstruktes LUCTP nach Integration in das Genom von NIH3T3-Zellen. Tkneo-Sonde: DNA-Sonde
gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens, Fragment des HindIII/PvuII geschnittenen Vektors pSBC2TKneoLML (B) Nach Elektroporation von
10 µg des mit den Restriktionsenzymen Bst1107I/XmnI linearisierten Vektors LUCTP in 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen wurden 10 Klone selektiert.
Die HMW-DNAs der NIH3T3-Klone wurden mit PvuII geschnitten. Zum Nachweis der Kopienzahl wurde die DNA mit der Tkneo-Sonde
hybridisiert: Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf mehrfache Integrationen der jeweiligen Kassette
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert, Spur K: parentale NIH3T3-Zellen

2 Ergebnisse 22
Zur Bestimmung des Expressions- und Regulationspotenzials der Klone wurde die relative
Luciferase-Expression der Klone im induzierten als auch reprimierten Zustand untersucht und
daraus der Regulationsfaktor RF berechnet (Abb.13). Die Klone zeigten teilweise hohe
Luciferase-Expressionen im induzierten Zustand, insbesondere die Klone 4 und 8 mit
singulärer Integration der Kassette LUCTP (∼40000 bzw. ∼44000 rlu), und niedrige
Basalexpressionen im reprimierten Zustand (∼12 bis ∼290 rlu), was sich in hohen
Regulationsfaktoren widerspiegelt. Die Unterschiede zwischen den Expressionshöhen der
verschiedenen Klone (∼2500 bis ∼44000 rlu) lassen sich damit erklären, dass die den
Integrationsort der Kassette im Genom umgebenen Sequenzen die Expression von LUCTP
sowohl negativ als auch positiv beeinflussen können (Positionseffekt).
Luciferase-Expression [rlu]
100000
10000
1000
100
10
10492
19709 21173
39758
7186
10958
24575
43647
9261
induziert
reprimiert
2522
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RF 130 130 116 160 117 296 85 222 281 215
Abb. 13 Luciferase-Expression der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTP-Kassette
Zellen der isolierten LUCTP-Klone wurden unter induzierenden (-Doxycyclin) und –reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen kultiviert
und abschließend hinsichtlich der Luciferase-Aktivität untersucht. Die relative Luciferase-Expression [rlu] wird durch den Quotienten aus
der gemessenen Luciferase-Aktivität und der Proteinmenge des bei der Messung eingesetzten Zelllysats dargestellt. Der Regulationsfaktor
RF wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten (•) und reprimierten () Zustand gebildet.
Um die Kassettenaustauschstrategie (Abb.11B) zu überprüfen, wurde beabsichtigt, in
NIH3T3-Zellklonen das singulär integrierte Expressionskonstrukt gegen eine andere
autoregulierte Kassette auszutauschen. Entsprechend dem Konzept findet die Anreicherung
von Zellen, in denen ein Austausch stattgefunden hat, über den Verlust der Thymidinkinase-
Expression statt (Kap.2.1.2). Dies setzt jedoch eine ausreichende Thymidinkinase-Aktivität in
den parentalen Zellklonen voraus, die durch die Höhe der Expression von Tkneo bestimmt
wird. Bei der Kultivierung der Zellen der Klone mit Gancyclovir-haltigem bzw. -freiem
Selektionsmedium konnten jedoch keine Unterschiede im Wachstum der Zellen festgestellt
werden. Die Zellen waren gegen Gancyclovir resistent und starben nicht ab.
Es wurde vermutet, dass das Tkneo-Fusionsprotein in den Zellen zu gering exprimiert wird.
Es ist bekannt, dass für die Vermittlung von G418-Resistenz eine niedrige
Neomycinphosphotransferase-Aktivität in den Zellen ausreicht. Die Thymidinkinase-
Aktivitäten sind jedoch möglicherweise zu niedrig, damit die Zellen sensitiv auf Gancyclovir
reagieren. Es wurde vermutet, dass die Ursache für die niedrige Expression von Tkneo in der
geringen Aktivität des Polio-IRES Elements begründet ist, welches die cap-unabhängige
Translation von Tkneo im Cytoplasma vermittelt. Daher wurde versucht, durch aktivere
IRES-Elemente die Expression und damit die Konzentration des Fusionsproteins Tkneo zu
erhöhen. Dies wird im Folgenden erläutert.

2 Ergebnisse 23
2.2.2 Optimierung der Tkneo-Expression durch aktivere IRES-Elemente
Neben dem Polio-IRES Element existieren weitere Strukturelemente, die ebenfalls eine capunabhängige
mRNA-Translation vermitteln, wie das EMCV-IRES Element aus dem
Encephalomyocarditis Virus (Jang et al., 1988) und der 5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NFκB
repressing factor), der im Folgenden auch als NRF-IRES bezeichnet wird. Es wurde
gezeigt, dass das vollständige humane und murine NRF-IRES sowie im 5’-Bereich verkürzte
Varianten höhere cap-unabhängige Translationen als das Polio-IRES vermitteln können
(Oumard et al., 2000, Oumard, 2001).
Daher wurde das Polio-IRES Element im Vektor LUCTP durch das EMCV-IRES, durch das
murine NRF-IRES Element (1-857bp) sowie durch die verkürzten Varianten des murinen
NRF-IRES (608-857 bp, 708-857 bp) ersetzt, was zu den Konstrukten LUCTE, LUCTN,
LUCTN6 und LUCTN7 führte. Die Funktionalität und die Tkneo-Expression dieser Vektoren
wurden im Vergleich zum Konstrukt LUCTP in NIH3T3-Zellen untersucht. Nach
Transfektion der Konstrukte in die Zellen wurden diese bis zur Klonbildung in
Selektionsmedium kultiviert. Zur Abschätzung der Höhe der Tkneo-Expression und somit der
translationsvermittelnden Aktivität der IRES-Elemente wurde die Anzahl resistenter
Zellklone bestimmt und diese auf die Zahl der nach Transfektion mit LUCTP erhaltenen
Klone normiert (Abb.14). Das Expressions- und Regulationspotenzial der Konstrukte wurde
anhand der Luciferase-Expression der selektierten Zellen im Gemisch im induzierten und
reprimierten Zustand überprüft, wobei die Luciferase-Expressionen der einzelnen
Zellgemische auf die der LUCTP-transfizierten Zellen abgeglichen wurde (Abb.14). Der
Regulationsfaktor RF beschreibt das Regulationspotenzial der Konstrukte (Abb.14).
Vektor
IRES-Element
relative Klonzahl
relative Luciferase-
0 1 2 3 4 5 6 0
Expression
1
RF
LUCTP
Polio
1,0
115
LUCTE
EMCV
1,7
121
LUCTN
NRF (murin)
1-857 bp
4,9
81
LUCTN6
NRF608 (murin)
608-857 bp
5,2
85
LUCTN7
NRF708 (murin)
708-857 bp
5,4
95
Abb. 14 Anzahl G418-resistenter Klone und Luciferase-Expression in Abhängigkeit vom IRES-Element
Es wurden 5 µg der mit unterschiedlichen IRES-Elementen ausgestatteten autoregulierten Koanstrukte in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen transfiziert
und nach G418-Selektion die reltative Klonzahl bestimmt. Die Luciferase-Expression unter induzierenden (-Doxycyclin) und
reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen wurde in Zellgemischen aus selektierten Zellen gemessen. Der Regulationsfaktor RF wurde
durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten und reprimierten Zustand berechnet.
Die Daten zeigen, dass die verschiedenen IRES-Elemente die cap-unabhängige Translation
von Tkneo unterschiedlich stark vermitteln. Im Vergleich zum Ausgangskonstrukt LUCTP
konnte die Anzahl resistenter Klone mit dem Konstrukt LUCTE annähernd verdoppelt
werden. Mit den Konstrukten LUCTN, LUCTN6 und LUCTN7 wurde die Zahl resistenter
Klone sogar verfünffacht. Die Luciferase-Expression und Regulierbarkeit der Konstrukte
waren ähnlich. Das bedeutet, dass die Expression des ersten Cistrons, des Transaktivators
tTA, vom inserierten IRES-Element wie erwartet weitestgehend unabhängig ist. Betrachtet
man demzufolge die Klonzahlen als Maßstab für die Höhe der Expression von Tkneo, kann
geschlussfolgert werden, dass die murinen NRF-IRES Elemente die höchste
translationsvermittelnde Aktivität besitzen, gefolgt vom EMCV-IRES und letztlich vom
Polio-IRES Element.
Zur Beantwortung der Frage, ob die Tkneo-Expression der Konstrukte auch zu ausreichender
Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen führt, so dass diese bei Gancyclovir-Selektion

2 Ergebnisse 24
absterben, wurden die Konstrukte LUCTE, LUCTN, LUCTN6 und LUCTN7 in NIH3T3-
Zellen transfiziert und in Gegegnwart von G418 bzw. G418 und Gancyclovir kultiviert. Nach
Abschluss der Selektion zeigte sich, dass erwartungsgemäß bei Kultivierung in Gancyclovirfreiem
Medium mit allen Konstrukten eine Vielzahl G418-resistenter Zellklone selektiert
werden konnten. Dagegen führte die Kultivierung der mit LUCTN, LUCTN6 bzw. LUCTN7
transfizierten Zellen in Gancyclovir-haltigem Selektionsmedium zu keinem
Gancyclovir/G418-resistenten Klon. Die Selektion der mit LUCTE transfizierten Zellen ergab
einen Gancyclovir-/G418-resistenten Klon auf 50 G418-resistente Klone. Dies bedeutet, dass
insbesondere durch die NRF-IRES vermittelte Tkneo-Expression die Konzentration des
Tkneo-Fusionsproteins und damit die Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen soweit erhöht
werden kann, dass die Zellen Gancyclovir-sensitiv sind.
2.2.3 Überprüfung der Expressions- und Regulationskapazität von LUCTN7 in
NIH3T3-Zellen
Um einerseits das Expressions- und Regulationspotenzial des Konstruktes LUCTN7 in
Zellklonen untersuchen zu können, anderseits um Zellklone mit singulärer Intergration zu
erhalten, die zur Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie einsetzbar sind, wurde der
linearisierte Vektor LUCTN7 in NIH3T3-Zellen elektroporiert. Nach Kultivierung in
Selektionsmedium wurde eine Vielzahl G418-resistenter Klonen selektiert. Bei 17 Klonen
wurde die Kopienzahl des Konstruktes im Genom der Zellen bestimmt. Dazu wurde die
genomische DNA der Klone mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und im Southern-
Blot mit einer Luc-Sonde, welche zum Luciferase-Gen homolog ist, hybridisiert
(Randfragment-Detektion, Abb.15).
A
LUCTN7
EcoRI
EcoRI EcoRI EcoRI
F
F5
5‘ pA Luciferase TA N TKneo
pA 3‘
B
21.2 kb
> 1.4 kb
1 kb
Luc-Sonde
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 K
5.0 kb
3.5 kb
2.0 kb
Abb. 15 Southern Blot Analyse der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTN7-Kassette
(A) Schematische Darstellung des Konstruktes LUCTN7 nach Integration in das Genom von NIH3T3-Zellen. Luc-Sonde: DNA-Sonde
gegen das Luciferase-Gen, Fragment des BglII/XcmI geschnittenen Vektors LUCTP (B) Nach Elektroporation von 10 µg des mit den
Restriktionsenzymen Bst1107I/XmnI linearisierten Vektors LUCTN7 in 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen wurden 17 G418-resistente Klone isoliert.
Die HMW-DNAs dieser Klone wurden mit EcoRI geschnitten. Zum Nachweis der Kopienzahl wurde die DNA mit der Luc-Sonde
hybridisiert. Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf mehrfache Integrationen der LUCTN7-Kassette
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert, Spur K: parentale NIH3T3-Zellen.

2 Ergebnisse 25
In den Klonen 1, 6, 7, 10, 12, 14 und 18 konnte eine singuläre Integration von LUCTN7
nachgewiesen werden (Abb.15B). In den restlichen Klonen lag die Kassette mehrfach
integriert vor (Abb.15B). Durch die Hybridisierung der EcoRI geschnittenen DNA mit einer
neo-Sonde, welche gegen 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet ist, konnte die Vollständigkeit
der inserierten Kassette in den Klonen mit singulärer Integration festgestellt werden (Daten
nicht gezeigt).
Für die Bestimmung des Expressions- und Regulationspotenzials wurden die Zellen der Klone
in Doxycyclin-freiem bzw. -haltigem Medium kultiviert. Anschließend wurde die Luciferase-
Aktivität bestimmt und der Regulationsfaktor RF berechnet (Abb.16).
induziert
reprimiert
Luciferase-Expression [rlu]
1000000
100000
10000
1000
100
10
10102
74582
366467
134516 102825 139800
75732 69753 103454 45952
33781
46749
57496
31252
19223
2154
66
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18
RF 31 75 89 209 207 375 5 66 97 131 448 73 160 59 482 434 397
Kopienzahl
1
5
2
2
4
Abb. 16 Luciferase-Expression der NIH3T3-Klone mit integrierter LUCTN7-Kassette
1
1
Zellen der LUCTN7-Klone wurden unter induzierenden (-Doxycyclin) und reprimierenden (+Doxycyclin) Bedingungen kultiviert und
abschließend hinsichtlich der Luciferase-Aktivität untersucht. Die relative Luciferase-Expression [rlu] wird durch den Quotienten aus der
gemessenen Luciferase-Aktivität und der Proteinmenge des bei der Messung eingesetzten Zelllysats dargestellt. Der Regulationsfaktor RF
wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten (•) und reprimierten () Zustand gebildet. Weiterhin ist die Anzahl der
integrierten Kopien des Konstruktes LUCTN7 im Genom der einzelnen Klone aufgelistet.
In den meisten Klonen war eine hohe bis sehr hohe Luciferase-Expression festzustellen
(Abb.16, ∼10000 bis ∼366000 rlu). Durch Doxycyclin-Zugabe konnte diese stark reprimiert
werden (Abb.16, ∼100 bis ∼1000 rlu), was sich in teilweise sehr hohen Regulationsfaktoren
RF widerspiegelte (Abb.16). Ein Zusammenhang zwischen Anzahl der Kopien der
Expressionskassette im Genom und der Höhe der Expression der Klone (Abb.16) war jedoch
nicht zu erkennen. Vielmehr bedingen offensichtlich Positionseffekte des Integrationsortes
der Kassette(n) die unterschiedlichen Expressionshöhen und Regulationsfaktoren.
Zur Untersuchung der Gancyclovir-Sensitivität wurden die Zellen der Klone mit Gancyclovirfreiem
bzw. -haltigem Medium kultiviert. Es zeigte sich, dass alle Klone bis auf die Klone 7
und 8, die nur eine geringe Expression zeigten (Abb.16), unter Gancyclovir-Druck abstarben.
Das bestätigt, dass das Konstrukt LUCTN7 aufgrund einer hohen translationsinitiierenden
Aktivität des NRF708-IRES zu hohen Tkneo-Expressionen und damit für eine Negativ-
Selektion ausreichenden Thymidinkinase-Aktivitäten in diesen Zellen führt.
Klone mit singulärer Integration der Reportergen-Kassette stellen Kandidaten für einen
Kassettenaustausch dar. Da die Klone 1, 6, 10, 12, 14 und 18 eine singulär integrierte Kassette
aufweisen (Abb.15B) und außerdem Gancyclovir-sensitiv sind, können diese Klone für einen
Kassettenaustausch eingesetzt werden.
3
1
2
1
4
1
3
3
1

2 Ergebnisse 26
2.2.4 Stabile Expression von LUCTN7 in ES-Zellen
Da mit dem Vektor LUCTN7 viele stabile, hoch exprimierende NIH3T3-Zellklone etabliert
werden konnten, die aufgrund der hohen Aktivität des NRF708-IRES Elementes auch eine
hohe, für Gancyclovir-Selektion ausreichende Tkneo-Expression zeigten (Kap.2.2.3), wurde
dieses Konstrukt auch zur Generierung von stabil autoreguliert exprimierenden ES-Zelllinien
eingesetzt.
In mehreren Ansätzen wurde der linearisierte Vektor LUCTN7 bzw. als Kontrolle das
linearisierte Konstrukt pSBC2Tkneo, welches eine konstitutive Expression des Selektionsgens
Tkneo ermöglicht, in ES-Zellen der Zelllinie D3 elektroporiert. Die Zellen wurden
anschließend bis zur Klonbildung in Selektionsmedium kultiviert. Mit dem Kontroll-Vektor
pSBC2Tkneo konnten sehr viele (>100 Klone), mit dem Konstrukt LUCTN7 dagegen nur
wenige G418-resistente Zelllinien generiert werden (

2 Ergebnisse 27
A
Luciferase-Expression [rlu]
1000000
100000
10000
1000
100
10
136080
67476
526
3003
LUCTN7
pSBC1Luc
11705
8674
1882 1781
B
relative Luciferase-Expression
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
2,0
0,2 0,2 0,2
1
0,0
NIH3T3
D3
IB10
CCE
NIH3T3
D3
IB10
CCE
Abb. 17 Vergleich der autoregulierten und konstitutiven Luciferase-Expression in NIH3T3- und ES-
Zellen
Es wurden jeweils 5 µg des Vektors LUCTN7 bzw. pSBC1Luc in je 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen bzw. 5 bis 7.5⋅10 5 ES-Zellen der Linien D3, IB10
und CCE transfiziert. Nach 2 Tagen Kultivierung wurde die Luciferase-Expression bestimmt und auf die Proteinmenge normiert [rlu].
(A) Luciferase-Expression von LUCTN7 und pSBC1Luc in NIH3T3-, ES- und CCE-Zellen. (B) Die Luciferase-Expression von LUCTN7
wurde gegen die konstitutive Luciferase-Expression von pSBC1Luc der jeweiligen Zelllinie abgeglichen.
Die Daten verdeutlichen, dass die Expression der autoregulierten Kassette LUCTN7 in ES-
Zellen niedrig ist. Möglicherweise führt eine geringe Aktivität des Transaktivator-abhängigen
Promotors oder/und des Transaktivators in ES-Zellen zu diesen niedrigen Expressionen. Da
die VP16-Domäne des Transaktivators tTA des Konstruktes LUCTN7 als transkriptioneller
Aktivator eine Vielzahl von Proteinen, die für die Regulation der Transkription verantwortlich
sind, binden kann (Lin et al., 1991; Ingles et al., 1991; Goodrich et al., 1993; Flint und Shenk,
1997), wäre es auch denkbar, dass es durch den exprimierten Transaktivator zu einer
Reduktion des zellulären Pools solcher Faktoren und damit zu einer Inhibition der
Transkription in den Zellen, zum sogenannten transkriptionelles Squelching kommt (Gill und
Ptashne, 1988; Gossen und Bujard, 1992; Damke et al., 1995; Saez et al., 1997; Gallia und
Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Einerseits könnte dies die Expression des
autoregulierten Konstruktes negativ beeinflussen, was die niedrigen transienten Luciferase-
Aktiväten in ES-Zellen erklären würde. Anderseits könnten die Zellen absterben, die eine zu
hohe Expression des autoregulierten Konstruktes aufweisen. Es sollten demzufolge nur die
Zellen überleben, die eine niedrige und damit weniger toxische Transaktivator-Expression
aufweisen. Dies würde die niedrige Zahl resistenter Klone nach Elektroporation des
autoregulierten Konstruktes in ES-Zellen und die nicht signifikante Luciferase-Expression
dieser Klone erklären.
Im Folgenden wurde untersucht, ob durch Einsatz weniger toxischer Transaktivator-Mutanten
anstelle des Wildtyp-Transaktivators im Konstrukt LUCTN7 die Expression des
autoregulierten Konstruktes in ES-Zellen gesteigert werden kann, so dass die Etablierung
höher exprimierender ES-Zelllinien ermöglicht wird.
2.2.4.2 Weniger toxische Transaktivatoren verbessern nicht die Expression des
autoregulierten TetOff-Systems in ES-Zellen
Da möglicherweise die Expressionshöhe der autoregulierten Kassette LUCTN7 in ES-Zellen
durch Squelching des exprimierten Wildtyp-Transaktivators limitiert wird, wurde dieser
gegen die weniger toxischen Varianten tTA2, tTA3 und tTA4 (Baron et al., 1997)
ausgetauscht, was zu den Vektoren LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 führte.

2 Ergebnisse 28
Die Transaktivatoren besitzen anstelle der VP16-Domäne nur minimale Aktivierungsdomänen,
die an die TetR-Domäne fusioniert sind. Durch das Fehlen von Bindungsstellen für
bestimmte Transkriptionsfaktoren sind diese Transaktivatoren weniger toxisch als der
Wildtyp-Transaktivator und können daher in höheren Konzentrationen von Zellen toleriert
werden (Baron et al., 1997). Allerdings weisen die Transaktivatoren tTA3 und tTA4 eine
niedrigere Aktivität als der Wildtyp-Transaktivator tTA auf.
Die Funktionalität der verschiedenen autoregulierten Konstrukte wurde zunächst transient und
stabil in NIH3T3-Zellen untersucht.
2.2.4.2.1 Transiente und stabile Expression autoregulierter TetOff- Konstrukte in
NIH3T3-Zellen
Die Konstrukte LUCTA2N7, LUCTA3N7, LUCTA4N7 sowie das ursprüngliche Konstrukt
LUCTN7 wurden in NIH3T3-Zellen transfiziert. Anschließend wurden die transienten
Luciferase-Expressionen gemessen und diese auf die Luciferase-Aktivität der mit LUCTN7
transfizierten Zellen normiert (Abb.18). Die Expressionsfaktoren EF verdeutlichen die
Aktivität der verschiedenen Transaktivatoren der autoregulierten Konstrukte in Bezug zur
Aktivität des Wildtyp-Transaktivators tTA des Konstruktes LUCTN7.
1,2
relative Luciferase-Expression
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7
EF 1.0
1.0
0.5
0.3
Abb. 18 Vergleich der transienten Luciferase-Expression der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7,
LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in NIH3T3-Zellen
Es wurden 5 µg der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen transfiziert und die transiente
Expression nach 2 Tagen bestimmt. Die Luciferase-Aktivitäten wurden auf die mit LUCTN7 transfizierten Zellen normiert.
EF: Expressionsfaktor.
Die Daten zeigen, dass die Expression der autoregulierten Konstrukte durch die Aktivität des
integrierten Transaktivators bestimmt wird (Abb.18). Erwartungsgemäß wird mit dem
Konstrukt LUCTA2N7 (EF: 1.0) eine ähnliche Expression erreicht wie mit dem Konstrukt
LUCTN7 (EF: 1.0), da entsprechend publizierter Daten (Baron et al., 1997) der Wildtyp-
Transaktivator tTA und der Transaktivator tTA2 ähnlich aktiv sind (Abb.3). Dagegen fällt die
Expression des Konstruktes LUCTA3N7 geringer aus (EF: 0.5). Die niedrigste Expression
zeigen die mit LUCTA4N7 transfizierten Zellen (EF: 0.3). Dies entspricht ebenfalls den
Erwartungen, da gezeigt wurde, dass die Aktivitäten von tTA3 bzw. tTA4 niedriger sind als
die der Transaktivatoren tTA bzw. tTA2 (Baron et al., 1997).
Weiterhin wurde die stabile Expression der autoregulierten Konstrukte in NIH3T3-Zellen
untersucht. Nach Elektroporation der linearisierten Vektoren LUCTA2N7, LUCTA3N7 und
LUCTA4N7 und Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium konnte eine Vielzahl

2 Ergebnisse 29
resistenter Klone selektiert werden. Es wurden jeweils 8 Klone isoliert und hinsichtlich ihrer
Luciferase-Expression und Regulation untersucht. Der Regulationsfaktor RF ergibt sich aus
den gemessenen Luciferase-Expressionen im induzierten und reprimierten Zustand (Abb.19).
induziert
reprimiert
1000000
∅ 217771
∅ 87017
∅ 174982
Luciferase-Expression [rlu]
100000
10000
1000
100
10
∅ 1834
∅ 2112
∅ 3286
1
1 2 3 4 5 6 7 8 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8
LUCTA2N7
LUCTA3N7
LUCTA4N7
RF
132 194
124 91
50
86
127
193
50
42
26
27
55
39
71
31
41
45
41
55
51
53
95
87
Abb. 19 Luciferase-Expression von NIH3T3-Klonen mit genomisch integrierter LUCTA2N7-, LUCTA3N7
bzw. LUCTA4N7-Kassette
Es wurden jeweils 2 µg der linearisierten Konstrukte LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in je 1⋅10 6 NIH3T3-Zellen elektroporiert.
Nach Selektion wurden jeweils 8 G418-resistente Klone hinsichtlich ihrer Luciferase-Expression und Regulation untersucht.
RF: Regulationsfaktor
Bei allen Klonen konnte sowohl eine deutliche Luciferase-Expression als auch Regulation
festgestellt werden. Die Zellklone mit dem Konstrukt LUCTA2N7 zeigten erwartungsgemäß
die höchste durchschnittliche Luciferase-Expression und die höchste Regulierbarkeit
(Abb.19). Die Regulationsfaktoren dieser Zellklone waren zwei- bis dreimal höher als bei
Zellklonen, die mit den Konstrukten LUCTA3N7 und LUCTA4N7 generiert wurden
(Abb.19). Hierbei wird wiederum deutlich, dass die Expression des autoregulierten
Konstruktes von der Aktivität des Transaktivators bestimmt wird.
Im Folgenden wurde die Expression der verschiedenen autoregulierten Konstrukte in ES-
Zellen untersucht.
2.2.4.2.2 Transiente Expression der autoregulierter TetOff-Konstrukte in ES-Zellen
Die Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 wurden in ES-Zellen
der Linie D3, IB10 und CCE transfiziert. Anschließend wurden die transienten Luciferase-
Expressionen gemessen und auf die Luciferase-Aktivität der mit LUCTN7-transfizierten
Zellen abgeglichen, was zu den Expressionsfaktoren EF führte (Abb.20).

2 Ergebnisse 30
D3-Zellen
1,4
IB10-Zellen
1,2
relative Luciferase-Expression
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
relative Luciferase-Expression
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7
0
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7
EF 1.0 0.9
0.2
0.1
EF 1.0
0.8
0.4
0.3
CCE-Zellen
relative Luciferase-Expression
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
LUCTN7 LUCTA2N7 LUCTA3N7 LUCTA4N7
Abb. 20 Vergleich der transienten
Luciferase-Expression der Konstrukte
LUCTN7, LUCTA2N7, LUCTA3N7 und
LUCTA4N7 in ES-Zellen
Es wurden 5 µg der Konstrukte LUCTN7, LUCTA2N7,
LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in 5 bis 7.5⋅10 5 ES-Zellen
der Linien D3, IB10 und CCE transfiziert. Nach 2 Tagen
wurde die transiente Luciferase-Expression bestimmt.
Die Luciferase-Aktivitäten wurden auf die mit LUCTN7
transfizierten Zellen normiert. EF: Expressionsfaktor.
EF 1.0
1.1
0.5
0.4
Die autoregulierten Konstrukte zeigen in ES-Zellen wie bereits in NIH3T3-Zellen beobachtet
(Kap.2.2.4.2.1) eine entsprechend von der Aktivität der Transaktivatoren abhängige
Expression (Abb.20). Die Expression der Konstrukte LUCTN7 und LUCTA2N7 ist
annähernd identisch, während die Konstrukte LUCTA3N7 und LUCTA4N7 ca. ⅓ bzw. ¼
der Expression des Konstruktes LUCTN7 aufweisen (Abb.20). Es wurde erwartet, dass
insbesondere durch den Transaktivator tTA2 im Konstrukt LUCTA2N7, der die gleiche
Aktivität wie der Wildtyp-Transaktivator, allerdings nach Baron et al. (1997) eine dreifach
geringere Toxizität aufweist, die Expression des autoregulierten Konstruktes in ES-Zellen
signifikant erhöht werden kann. Dies war jedoch nicht der Fall. Daraus ist zu schlussfolgern,
dass die in ES-Zellen beobachtete niedrige Expression des autoregulierten Vektors LUCTN7
sowohl transient (Abb.17) als auch in stabilen Zellklonen wahrscheinlich nicht auf Squelching
beruht. Vielmehr scheint die niedrige Expression des TetOff-Systems durch eine geringe
Aktivität der TetOff-Transaktivatoren begründet zu sein.
Da mit den Konstrukten LUCTA2N7, LUCTA3N7 und LUCTA4N7 in ES-Zellen transient
keine Verbesserung der Expression erzielt werden konnte, wurde auf eine Etablierung von
stabilen ES-Zelllinien mit diesen Konstrukten verzichtet.
Allerdings wurde die Kassette LUCTA2N7 mit dem weniger toxischen Transaktivator tTA2
in den ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991) mittels homologer Rekombination
integriert (Kap.2.2.5). Da nach zufälliger Integration der LUCTN7-Expressionskassette in das
Genom von ES-Zellen nur Klone mit nicht signifikanter Expression selektiert werden konnten
(Kap.2.2.4), sollte dies die Untersuchung der Expression und Regulation einer TetOff-
Kassette in einem definierten Genort ermöglichen.

2 Ergebnisse 31
2.2.5 Etablierung eines TetOff-Expressionssystems im ROSA26-Locus von ES-Zellen
Ein Genort, der möglicherweise signifikante Expressionen autoregulierter Kassetten in ES-
Zellen erlaubt, ist der mittels Promoter-Trap-Methode identifizierte ROSA26-Locus
(Friedrich und Soriano, 1991). Insertionen von Reportergenen in diesen Locus zeigten, dass
diese sowohl während der Embryogenese als auch in der adulten Maus (Zambrowicz et al.,
1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano, 1999, Srinivas et al., 2001) ubiquitär
exprimiert werden, wodurch sich dieser Locus ideal für die Generierung transgener knock-in
Mauslinien eignet (Rideout et al., 2000; Farley et al., 2000). Untersuchungen des für die
Expression notwendigen ROSA26-Promotors verdeutlichten, dass dieser für die ubiquitäre
Expression verantwortlich ist (Kisseberth et al.1999). Daher ist nicht vorhersagbar, ob in den
Locus inserierte, mit eigenen Promotoren versehene Expressionssysteme wie die in dieser
Arbeit konstruierten autoregulierten Kassetten ebenfalls signifikant oder gar ubiquitär
exprimierend sind. Weiterhin stellt sich die Frage, ob dieser Integrationsort eine strikte
Regulation der Expressionskassette ermöglicht. Da offenbar dieser Genort von
reprimierenden Einflüssen abgegrenzt zu sein scheint, was sich anhand der kontinuierlichen
Reportergenexpression während der gesamten Mausentwicklung erkennen lässt (Zambrowicz
et al., 1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano, 1999, Srinivas et al., 2001),
könnte dies für inserierte, eigenständige Expressionskassetten vom Vorteil sein.
Im Folgenden wurde die Expressions- und Regulationskapazität der Expressionskassette
LUCTA2N7 im ROSA26-Locus untersucht.
2.2.5.1 Integration der autoregulierten Expressionskassette LUCTA2N7 in den
ROSA26-Locus
Durch Insertion der autoregulierten Expressionseinheit des Plasmids LUCTA2N7 in den
Vektor ROSA26-1 (Soriano, 1999), welcher die für die Rekombination erforderlichen
homologen Genbereiche ROSA5’ und ROSA3’ besitzt, wurden die Vektoren RLUC und
RLUC-R konstruiert, wobei im Vektor RLUC-R die inserierte Expressionseinheit in konträrer
Orientierung vorliegt (Abb.21). Die Funktionalität der Konstrukte wurde in NIH3T3-Zellen
überprüft. Dazu wurden die Konstrukte RLUC und RLUC-R sowie zur Kontrolle der
Ausgangsvektor LUCTA2N7 mit dem Plasmid pEFLacZ, welches eine konstitutive β-
Galactosidase-Expression ermöglicht, in die Zellen kotransfiziert. Anschließend wurden die
transienten Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten der Zellen gemessen und daraus die
relative Luciferase-Expression bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Expression der
Konstrukte RLUC und RLUC-R vergleichbar mit der des Ausgangskonstruktes LUCTA2N7
war (Daten nicht gezeigt).
RLUC
F
ROSA5‘
pA
N
Luciferase TA2 TKneo
F5
pA
ROSA3‘
RLUC-R
ROSA5‘
pA
F5
TKneo
N
TA2
Luciferase
F
pA
ROSA3‘
1 kb
Abb. 21 Schematische Darstellung der Konstrukte RLUC und RLUC-R
Die Expressionseinheit des Konstruktes LUCTA2N7 wurde in den Vektor ROSA26-1 inseriert. Dadurch entstanden die Konstrukte RLUC
und RLUC-R. Die homologen Sequenzen des ROSA26-Locus ROSA5’/ROSA3’ flankieren die autoregulierte Kassette.

2 Ergebnisse 32
Zur Generierung von ES-Zelllinien mit integrierter LUCTA2N7-Expressionskassette im
ROSA26-Locus wurde zunächst der linearisierte Vektor RLUC in ES-Zellen der Linie D3
elektroporiert. Die anschließende Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium führte zu 27
G418-resistenten Zellklonen, von denen 6 Klone für weitere Untersuchungen isoliert wurden.
Um die korrekte Integration der autoregulierten Kassette in den ROSA26-Locus
nachzuweisen, wurden die genomischen DNAs der Klone mit dem Restriktionsenzym
EcoRV, welches in Randbereichen vom Insertionsort im ROSA26-Locus und innerhalb der
inserierten Kassette schneidet, verdaut (Abb.22A). Mit der RP-Sonde, die zum ROSA26-
Promotor homolog ist, konnte in allen isolierten RLUC-Klonen die Integration von
LUCTA2N7 im ROSA26-Locus gezeigt werden (Abb.22B, 3.1kb Fragment). Die
Untersuchung der Luciferase-Aktivität offenbarte jedoch, dass trotz Integration der
Expressionskassette die Klone keine nachweisbare Luciferase-Expression besaßen.
A
ROSA26-Locus
EcoRV
EcoRV
EcoRV
Pro.
ROSA5‘
ROSA3‘
E1 E2 E3
11.5 kb
1 kb
RP-Sonde
ROSA26-Locus nach Integration von LUCTA2N7 mittels des Vektors RLUC
EcoRV
EcoRV
EcoRV
EcoRV
EcoRV
F
F5
ROSA5‘
Pro. Luciferase TA2 TKneo
ROSA3‘
3.1 kb
B
RP-Sonde
1 2 3 4 5 6 K
21.2 kb
11.5kb
5.0 kb
3.5 kb
3.1kb
2.0 kb
RP-Sonde
Abb. 22 Schematische Darstellung des ROSA26-Locus vor und nach homologer homologer Rekombination mit
RLUC und Nachweis der Integration von LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus von D3 ES-Zellen mittels Southern
Blot Analyse
(A) Schematische Darstellung des Wildtyp ROSA26-Locus und des ROSA26-Locus nach homologer Rekombination mit den Targeting-Vektor
RLUC. Fragmente von EcoRV geschnittener genomischer DNA der Klone wurden im Southern-Blot mit der RP-Sonde, welche ein Fragment des
EcoRI/HindIII-geschnittenen Vektors ROSA26-5’ und gegen den ROSA26-Promotor gerichtet ist, detektiert. E1/E2/E3: Exons, ROSA5’/ROSA3’:
homologe Sequenzen des ROSA26-Locus (B) Die HMW-DNAs von 6 RLUC-Klonen wurden mit EcoRV geschnitten und im Southern-Blot mit der
zum ROSA26-Promotor homologen RP-Sonde hybridisiert, K: negativ Kontrolle, wildtyp D3 ES-Zellen
Zur Verifizierung dieses Ergebnisses wurden RLUC-Klone basierend auf der ES-Zelllinie
IB10 generiert. Um ausschließen zu können, dass die niedrige Expression von LUCTA2N7
nach Integration im ROSA26-Locus in D3-Zellen durch die Orientierung der Kassette zur

2 Ergebnisse 33
Umgebung des Integrationsortes bestimmt wird, wurden außerdem mit dem Vektor RLUC-R
transgene ES-Zelllinien etabliert.
Nach Elektroporation der linearisierten Vektoren RLUC und RLUC-R in IB10-Zellen und
Kultivierung der Zellen in Selektionsmedium konnten 28 RLUC-Klone und 6 RLUC-R Klone
selektiert werden. Für Southern-Blot Analysen wurden die genomischen DNAs von 6 RLUCbzw.
allen RLUC-R Klonen mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut (Abb.22A und 23A).
Mit der RP-Sonde konnte in den RLUC-Klonen 2 und 4 die Integration von LUCTA2N7 in
den ROSA26-Locus gezeigt werden (Abb.23B, 3.1kb Fragment). In den restlichen Klonen
wurde nur das parentale, 11.5kb grosse Fragment des ROSA26-Locus detektiert, was darauf
hindeutet, dass in diesen Klonen vermutlich eine Integration der Expressionskassette in
zufällige Genorte stattgefunden hat. Durch Hybridisierung der EcoRV-geschnittenen DNAs
der RLUC-Klone mit einer neo-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Fusionsgens Tkneo
gerichtet ist, konnte in den Klonen 2 und 4 die Vollständigkeit der Integration von
LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Bei den
restlichen Klonen bestätigte sich die Vermutung, dass die Expressionskassette in zufällige
Genorte integriert wurde. Aus der Analyse der genomischen DNAs der RLUC-R Klone mit
der RP-Sonde (Abb.23A) konnte geschlußfolgert werden, dass in den RLUC-R Klonen 2, 4
und 6 die Kassette LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus integriert wurde (Abb.23C, 4.8kb
Fragment). Mittels der Luc-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Luciferase-Gens gerichtet ist
(Abb.23A), konnte jedoch die korrekte Integration der Expressionskassette in den ROSA26-
Locus bzw. die Vollständigkeit der Integration nur im Klon 6 bestätigt werden (Abb.23D,
3.2kb und 10kb Fragment). Bei den restlichen Klonen wurde die Integration der
Expressionskassette in zufällige Genorte nachgewiesen (Abb.23D).
A
ROSA26-Locus nach Integration von LUCTA2N7 mittels des Vektors RLUC-R
EcoRV EcoRV
EcoRV EcoRV
F5
F
Pro.
ROSA5‘
TKneo
TA2
Luciferase
ROSA3‘
EcoRV
4.8 kb 3.2 kb
10.0 kb
RP-Sonde
Luc-Sonde
B RLUC
C RLUC-R
D
RLUC-R
21.2 kb
M 1 2 3 4 5 6 K
21.2 kb
M 1 2 3 4 5 6 K
21.2 kb
M 1 2 3 4 5 6
K
11.5kb
11.5kb
10.0kb
5.0 kb
3.5 kb
3.1kb
5.0 kb
3.5 kb
4.8kb
5.0 kb
3.5 kb
3.2kb
2.0 kb
2.0 kb
2.0 kb
RP-Sonde
RP-Sonde
Luc-Sonde
Abb. 23 Nachweis der Integration von LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus von IB10 ES-Zellen mittels
Southern Blot Analyse
(A) Schematische Darstellung des ROSA26-Locus nach homologer Rekombination mit den Targeting-Vektor RLUC-R. Fragmente von
EcoRV geschnittener genomischer DNA der Klone wurden im Southern Blot mit der RP-Sonde, welche ein Fragment des EcoRI/HindIIIgeschnittenen
Vektors ROSA26-5’ und gegen den ROSA26-Promotor gerichtet ist, detektiert. E1/E2/E3: Exons, ROSA5’/ROSA3’: homologe
Sequenzen des ROSA26-Locus (B) Die HMW-DNAs von 6 RLUC-Klonen wurden mit EcoRV geschnitten und im Southern-Blot mit der
zum ROSA26-Promotor homologen RP-Sonde hybridisiert. Die korrekte Integration der LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus liefert
eine Bande von 3.1kb, der Wildtyp ROSA26-Locus eine Bande von 11.5kb (vergleiche Abb.22A). (C) Die HMW-DNAs der 6 RLUC-R
Klone wurden mit EcoRV geschnitten und mit der RP-Sonde hybridisiert. Die korrekte Integration von LUCTA2N7 in den ROSA26-Locus
liefert eine Bande von 4.8kb. (D) Die EcoRV-geschnittenen HMW-DNAs der RLUC-R Klone wurden mit der Luc-Sonde, die gegen das
Luciferase-Gen gerichtet ist, hybridisert. Banden der Größe 3.2kb und 10.0kb zeigen die Vollständigkeit der intergierter LUCTA2N7-
Kassette. K: wildtyp IB10 ES-Zellen

2 Ergebnisse 34
Die RLUC- bzw. RLUC-R Klone mit vollständig integrierter LUCTA2N7-
Expressionskassette im ROSA26-Locus wurden hinsichtlich ihrer Luciferase-Expression
untersucht. In den RLUC-Klonen 2 und 4 wurde keine, im RLUC-R Klon 6 nur eine niedrige
Luciferase-Aktivität (∼240 rlu) detektiert.
Die Untersuchungen der D3- und IB10-Klone mit integrierter LUCTA2N7-Kassette im
ROSA26-Locus als auch die Untersuchung von ES-Zellklonen mit integrierter LUCTN7-
Kassette in zufälligen Genorten (Kap.2.2.4) lassen die Schlussfolgerung zu, dass das TetOff-
System unabhängig vom Genort in ES-Zellen niedrig exprimierend ist. Da die autoregulierte
Expression der TetOff-Kassetten in NIH3T3-Zellen jedoch sehr hoch war, wurde im
Folgenden untersucht, ob nach in vitro Differenzierung von ES-Zellen mit integrierter TetOff-
Expressionkassette im ROSA26-Locus erhöhte Luciferase-Expressionen zu messen sein
werden.
2.2.5.2 In vitro Differenzierung
Aufgrund des Unterschiedes in der Expression des autoregulierten TetOff-Systems in ES-
Zellen und in den Maus-Fibroblastenzellen NIH3T3 wurde angenommen, dass die Expression
des Systems vom Differenzierungsstand der Zellen abhängt. Um dies zu überprüfen, wurden
ES-Zellen mit intergierter LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus der Zelllinie D3 (RLUC-
Klon Kl. 3) in vitro differenziert (Kap.1.3). Durch verschiedene terminale Retinsäure-
Induktionen wurden unterschiedlich differenzierte Zellen generiert und diese hinsichtlich ihrer
Luciferase-Expression im Vergleich zu undifferenzierten Zellen des parentalen RLUC-Klons
untersucht.
Der erste Schritt der Differenzierung war die Bildung von sogenannten Embryonic Bodies.
Dazu wurde eine bestimmte Anzahl von ES-Zellen in einem definierten Volumen des
Differenzierungsmediums in Form eines Tropfens hängend an den Deckel einer
Bakterienplatte kultiviert (Hanging-Drop Methode). Dies führt zur spontanen Aggregation der
Zellen, der sich die primäre Strukturierung und die Entwicklung zum cystischen Embryonic
Body anschließt. Die dadurch gebildeten Zellaggregate wurden dann auf Bakterienplatten,
danach auf gelatinierte Mehrloch-Platten zur weiteren Entwicklung ausgesät (Wobus, 2001).
Für die Differenzierung wurden verschiedene Protokolle aufgestellt, die sich hinsichtlich des
Zeitpunktes und der Dauer einer Retinsäure-Induktion unterscheiden und in Abbildung 24
zusammengefasst sind (vergleiche Kap.1.3).
+RA
[-/+/+]
+RA
[+/+/+]
-RA
+RA
-RA
[-/+/-]
+RA
+RA
-RA
[+/+/-]
-RA
+RA
-RA
[-/-/+]
[-/-/-]
-RA
-RA
[+/-/-]
0 2
7
19 [Tag]
Hanging
Drops
Bakterienplatten
gelatinierte 24-Loch bzw.
12-Loch Zellkulturplatten
0 2
6
19 [Tag]
Hanging
Drops
Bakterienplatten
gelatinierte 24-Loch bzw.
12-Loch Zellkulturplatten
Kultivierung mit Retinsäure
Kultivierung ohne Retinsäure
Abb. 24 Übersicht: Differenzierungsstrategien (Protokolle)
Die ES-Zellen wurden 2 Tage mit bzw. ohne Retinsäure (RA) als Hangings Drops, dann 4 oder 5 Tage mit bzw. ohne Retinsäure auf
Bakterienplatten und anschließend bis zur Luciferase-Messung mit bzw. ohne Retinsäure auf gelatinierten 24- bzw. 12-Loch-Platten
kultiviert.

2 Ergebnisse 35
Aus den Zellaggregaten (Abb.26A1) wuchsen nach Aussaat auf gelatinierten Zellkulturplatten
in kurzer Zeit differenzierte Zellen aus (Abb.26A2, Outgrowths). Es wurden vereinfacht die
Outgrowths hinsichtlich ihrer Morphologie, A: langgezogenen (Abb.26A) und B:
fibroblasten-ähnliche Zellen (Abb.26B), unterschieden. Bei einer Vielzahl von Outgrowths
war jedoch eine Zuordnung zu einer der Zelltypen nicht möglich, da zuerst fibroblastoide
Zellen aus den Aggregaten auswuchsen, aber im Laufe der Kultivierung sich an den Rändern
der Outgrowths langgezogene Zellen entwickelten. Die Outgrowths konnten in zwei eindeutig
unterscheidbare Kompartimente unterteilt werden (Abb.26D, Morphologie AB).
Es konnte festgestellt werden, dass Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-Induktion den
Differenzierungvorgang, sichtbar durch die Zellmorphologie der Outgrowths, stark
beeinflussen. Findet während der Kultivierung in Hanging-Drops und auf den
Bakterienplatten keine Retinsäure-Stimulation statt (Protokoll [-/-/+] und [-/-/-]), bestehen die
Outgrowths der Aggregate ausschließlich aus fibroblasten-ähnlichen Zellen (Abb.26B und
26C, Morphologie B), unabhängig, ob die darauffolgende Kultivierung auf gelatinierten
Platten mit Retinsäure-haltigem Medium durchgeführt wird. Dagegen kommt es durch
Retinsäure-Induktion während der Kultivierung auf den Bakterienplatten (Tag 2-7) zu einer
Entwicklung sowohl fibroblastoider als auch langgezogener Zellen (Abb.26D und 26E,
Protokoll [-/+/+] und [-/+/-]). Hier kann man vorwiegend Outgrowths der Morphologie A und
AB finden. Ein Retinsäure-Stimulation über den gesamten Kultivierungszeitraum lenkt die
Differenzierung hin zu ausschließlich langgezogenen Zellen (Abb.26F, Protokoll [+/+/+]).
Wird die Retinsäure-Induktion dagegen vorzeitig abgebrochen (Protokoll [+/+/-] und [+/-/-]),
findet man nur noch teilweise Outgrowths mit langgezogenen Zellen (Abb.26A, Morphologie
A). Hier kann man mehr Outgrowths mit ausschließlich fibroblastoiden Zellen (Abb.26G,
Morphologie B) oder mit Kompartimenten aus fibroblastoiden und langgezogenen Zellen
(Abb.26G, Morphologie AB) finden. Die Folgen der Retinsäure-Induktion auf die
Differenzierung sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Nach Abschluß der in vitro Differenzierung wurden die Luciferase-Expressionen der
differenzierten Zellen bestimmt. Die Luciferase-Aktivität undifferenzierter Zellen des
Ausgangsklons (RLUC-Klon Kl. 3) und der differenzierter Zellen wurden prozentual
zueinander in Bezug gebracht (Abb.25). Die Regulation der Expression wurde nicht
untersucht.
relative Luciferase-Expression [%]
100000
10000
1000
100
10
1
K [-/+/+] [-/+/-] [-/-/+] [-/-/-] [+/+/+] [+/+/-] [+/-/-]
Morphologie A/AB A/AB B B A B/AB B/AB
Abb. 25 Relative Luciferase-Expression der differenzierten Zellen
Die Luciferase-Expressionen der nach entsprechenden Protokollen differenzierten Zellen mehrerer Outgrowths aus einem oder mehreren 12-
Loch wurden bestimmt und auf die Expression undifferenzierter Zellen des Parentalklons RLUC Kl.3 der ES-Zelllinie D3 (K: 100%)
normiert. Auf der x-Achse des Diagramms sind die verschiedenen Differenzierungsprotokolle (vergleiche Abb.24) und die beobachtet
Morphologie der Outgrowths aufgelistet

2 Ergebnisse 36
Interessanterweise zeigen die meisten der differenzierten Zellen eine deutliche Steigerung der
Luciferase-Expression. Die differenzierten Zellen, die sich durch Retinsäure-Induktion über
den gesamten Differenzierungszeitraum entwickelten (Morphologie A), zeigen eine ca.
45fach erhöhte Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll [+/+/+]). Findet dagegen die
Retinsäure-Induktion nur innerhalb der ersten 2 Tage statt, differenzieren die Zellen verstärkt
in eine andere Richtung (Morphologie B und AB). Die durchschnittliche Expression der
Zellen ist 7fach, maximal 20fach erhöht (Abb.25, Protokoll [+/-/-]). Die Retinsäure-
Stimulation für 7 Tage führt dagegen zu differnzierten Zellen (Morphologie B und AB) mit
nicht signifikanter Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll [+/+/-]). Eine durchschnittlich
26fache, maximal 100fache Erhöhung der Luciferase-Aktivität ist in differenzierten Zellen
(Morphologie A und AB) messbar, die sich nach Retinsäure-Stimulation zwischen Tag 2 und
7 entwickelt haben (Abb.25, Protokoll [-/+/-]). Wird die Retinsäure-Stimulation auch an den
darauffolgenen Tagen (Tag 7-19) aufrechterhalten, entstehen zwar morphologisch ähnliche
Outgrowths (Morphologie A und AB), allerdings zeigen die Zellen dieser Outgrowths nur
noch eine im Durchschnitt 3fache, maximal 6fache Luciferase-Expression (Abb.25, Protokoll
[-/+/+]). Findet die Kultivierung mit Retinsäure erst ab Tag 7 statt, wird eine andere
Differenzierungsrichtung induziert (Morphologie B). Die Luciferase-Expression der
differenzierten Zellen ist im Durchschnitt 3fach, maximal 13fach erhöht (Abb.25, Protokoll
[-/-/+]). Keine signifikante Luciferase-Expression zeigen differenzierte Zellen (Morphologie
B), die sich ohne Retinsäure-Induktion entwickelt haben (Abb.25, Protokoll [-/-/-]).
Die relativen Luciferase-Expressionen der differenzierten Zellen sind in Tabelle 4
vergleichend zusammengefasst.
Retinsäure-Stimulation
1 3
7/8 [Tag] 20
- + +
- + -
- - +
- - -
+ + +
+ + -
+ - -
Morphologie der Outgrowths
A AB B
•••
••••
-
-
••••
••
•
•••
••••
-
-
-
•••
••••
••
•
••••
••••
-
•••
••••
Luciferase
Expression
Faktor
•• 3
•••• 26
•• 3
• 1
•••• 45
• 1
••• 7
Tab. 4 Übersicht: terminale Retinsäure-Induktion und resultierende Differenzierung und Luciferase-
Expression
In Abhängigkeit vom Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-Induktion waren in: •••• sehr vielen, ••• vielen, •• wenigen, • sehr wenigen
Outgrowths der Aggregate langgezogene (Morphologie A), fibroblastoide Zellen (Morphologie B) oder beide Zelltypen zu finden
(Morphologie AB). Die Luciferase-Expression mehrerer Outgrowths eines oder mehrerer 12-Loch wurde bestimmt und mit der Expression
des parentalen ES-Zellklons verglichen. Der Faktor ergibt sich aus den Mittelwerten der Expressionen der Outhrowths im Vergleich zur
Expression des parentalen RLUC Klon Kl.3 der ES-Zelllinie D3. Es konnten: •••• sehr hohe, ••• hohe, •• niedrige, • keine signifikanten
Luciferase-Expressionen detektiert werden.
Die Expressionsanalysen der in vitro differenzierten Zellen beweisen, dass ein autoreguliertes
TetOff-System in differenzierten Zellen zu hohen Expressionen führen kann, während in
undifferenzierten ES-Zellen die Expression niedrig ist. Die Daten bestätigen, dass die
Expression von dem Differenzierungsstatus der Zelle abhängt. Die Expression der TetOff-
Kassette variiert jedoch in Abhängigkeit von der Differenzierungsrichtung. Es kann
geschlussfolgert werden, dass in transgenen Mäusen das autoregulierte TetOff-System
funktional sein sollte. Zur Überprüfung dieser Vermutung bedarf es jedoch der Etablierung
einer transgenen Maus, was im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt werden konnte.

2 Ergebnisse 37
A [+/+/-]
Embryonic
Body
1 2
3 4
Embryonic
Body
A
Outgrowth
Tag 8 Tag 11 Tag 14 Tag 14
B [-/-/+]
C [-/-/-]
1 2
1 2
B
B
D [-/+/+] E [-/+/-]
1 2
1 2
A
B
A
B
A
B
A
B
F [+/+/+]
A
G [+/-/-]
B
A
Abb. 26 Morphologie der Outgrowths in
Abhängigkeit von der terminalen Retinsäure-
Induktion
Die ES-Zellen wurden 2 Tage mit bzw. ohne Retinsäure in
Hanging Drops, dann 4 bzw. 5 Tage mit bzw. ohne Retinsäure
auf Bakterienplatten und abschließend mit bzw. ohne
Retinsäure auf gelatinierten Zellkulturplatten kultiviert.
A: Outgrowth eines Embryonic Body [+/+/-] zwischen Tag 8
und 14, Morphologie A. B: (1) Outgrowths [-/-/+], Tag 11,
(2) 4fache Vergößerung, Morphologie B. C: (1) Outgrowths
[-/-/+], Tag 11, (2) 4fache Vergrößerung, Morphologie B. D:
(1) Outgrowths [-/+/+], Tag 14, (2) 2fache Vergößerung,
Morphologie AB. E: (1) Outgrowths [-/-/-], Tag 14, (2) 2fache
Vergößerung, Morphologie AB. F: Outgrowths [+/+/+], Tag
14, Morphologie A. G: Outgrowths [+/-/-], Tag 14,
Morphologie AB

2 Ergebnisse 38
2.2.5.3 Aktivierung der Luciferase-Expression durch konstitutiv exprimierte
Transaktivatoren
Es wird vermutet, dass die Expression von TetOff-Kassetten in ES-Zellen niedrig ist
(Kap.2.2.4). Daher wurde untersucht, inwieweit die Expression einer genomisch integrierten
autoregulierten TetOff-Kassette in ES-Zellen durch konstitutiv exprimierte Transaktivatoren
induziert werden kann.
In Zellen eines Klons mit integrierter LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus der Zelllinie
D3 (RLUC-Klon Kl. 3) (Kap.2.2.5) wurden unterschiedliche Mengen der Expressionsvektoren
pUHrT62-1 und ptTA2 transfiziert. Der Vektor pUHrT62-1 exprimiert konstitutiv
den reversen Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b), der Vektor ptTA2 den
Transaktivator tTA2 (Baron et al., 1997). Nach Kultivierung der transfizierten Zellen in
Induktionsmedium wurde die Luciferase-Aktivität bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die
Expression des autoregulierten Konstruktes durch die Expression der Transaktivatoren in
Abhängigkeit vom Transaktivator und von der Transaktivator-Menge beeinflusst werden
kann. Mit Zunahme der Transaktivator-Konzentration steigt die Luciferase-Expression an.
Während mit Transaktivator tTA2 scheinbar eine Sättigung erreicht wird, kann mittels des
reversen Transaktivators rtTA2-M2 die Luciferase-Expression im gleichen
Konzentrationsbereich weiter gesteigert werden (Abb.27, 6µg, 10µg).
Luciferase-Expression [rlu]
2500
2000
1500
1000
500
0
1831
1221
985
576
198
24
85
144
0 0.5 2 6 10 0.5 2 6 10 µg
ptTA2 [µg]
prtTA2-M2 [µg]
Abb. 27 Induktion der Expression der LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus von ES-Zellen durch
konstitutiv exprimierte Transaktivatoren
Es wurden 0.5, 2, 6 bzw. 10 µg der Vektoren ptTA2 bzw. pUHrT62-1 in je 2⋅10 5 Zellen des RLUC-Klons Kl.3 der Linie D3 mit integrierter
LUCTA2N7-Kassette im ROSA26-Locus transfiziert. Nach zweitägiger Kultivierung der Zellen unter induzierenden Bedingungen (ptTA2: -
Doxycyclin, pUHrT62-1: +Doxycyclin) wurde die transiente Luciferase-Expression der Zellen bestimmt.
Der Versuch zeigt, dass die im ROSA26-Locus integrierte Kassette funktional ist und
aktiviert werden kann. Der reverse Transaktivator rtTA2-M2 besitzt ein deutlich höheres
Induktionspotenzial als der Transaktivator tTA2. Daraus ist zu schlussfolgern, dass die
niedrige Expression autoregulierter TetOff-Expressionskassetten in ES-Zellen sowohl
transient als auch nach Integration in zufällige Genorte (Kap.2.2.4) bzw. in den ROSA26-
Locus (Kap.2.2.5) auf ein allgemein niedriges Expressionspotenzial des TetOff-Systems in
ES-Zellen aufgrund einer niedrigen Aktivität der in diesem System verwendeten
Transaktivatoren zurückzuführen ist. Es scheint, dass dagegen ein autoreguliertes TetOn-
System mit dem reversen Transaktivator rtTA2-M2 zu einer Verbesserung der Expression
führen kann.

2 Ergebnisse 39
Im Folgenden wurde deshalb der Transaktivator einer autoregulierten TetOff-
Expressionskassette gegen den reversen Transaktivators rtTA2-M2 ausgetauscht und die
Expression der resultierenden TetOn-Kassette in ES-Zellen analysiert.
2.3 Etablierung eines TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Expressionssystems
in ES-Zellen
Es wurde gezeigt, dass die Expression von TetOff-Kassetten in ES-Zellen sehr niedrig ist, was
erklärt, dass mit dem TetOff-System nur stabile ES-Zelllinien mit nicht signifikanter
Reportergen-Expression etabliert werden konnten (Kap.2.2.4 und 2.2.5). Deshalb wurden
alternative autoregulierte Expressionskassetten, basierend auf dem TetOn- (Kap.1.1.1.2),
E.REXOff- (Kap.1.1.3) und PIPOff-System (Kap.1.1.2), konstruiert. Außerdem wurde zur
Verbesserung der Detektierbarkeit der Expression statt der Wildtyp-Luciferase eine aktivere
Luciferase als Reportergen eingesetzt.
2.3.1 Optimierung der Expressionsanalyse durch Einsatz einer aktiveren Luciferase
Durch Austausch der Wildtyp-Luciferase im Konstrukt LUCTA2N7 gegen die aktivere
Luciferase luc + aus dem Vektor pGL3basic (Promega), hier als Luicferase-3 bezeichnet,
wurde der Vektor LUC3TA2N7 konstruiert. Zur Überprüfung der Luciferase-Expression
wurde dieses Konstrukt in NIH3T3- als auch in ES-Zellen der Linien D3, IB10 und CCE
transfiziert. Als Kontrolle wurde der Ausgangsvektor LUCTA2N7 verwendet. Anschließend
wurden die transienten Luciferase-Expressionen der Zellen bestimmt. Die Luciferase-
Aktivität des Konstruktes LUC3TA2N7 wurde auf die des Konstruktes LUCTA2N7 der
jeweiligen Zelllinie abgeglichen. Da die Konstrukte sich nur durch das Luciferase-Gen
unterscheiden, beschreibt dieser Abgleich den Aktivitätsunterschied der Luciferasen
(Abb.28).
relative Luciferase-Expression
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
NIH3T3-Zellen
D3-Zellen
IB10-Zellen
CCE-Zellen
LUCTA2N7
LUC3TA2N7
AF 1.0 4.9
1.0 7.5 1.0 7.0 1.0 3.2
Abb. 28 Vergleich der Luciferase-Aktivitäten der Konstrukte LUCTA2N7 und LUC3TA2N7
Es wurden jeweis 5 µg der Konstrukte LUCTA2N7 und LUC3TA2N7 in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen und in je 5⋅10 5 ES-Zellen der Linien D3,
IB10 und CCE transfiziert. Die transiente Luciferase-Expression wurde nach 2 Tagen bestimmt. Die Expression von LUC3TA2N7 wurde auf
die des Konstruktes LUCTA2N7 der jeweiligen Zelllinie abgeglichen. Die Aktivität der Luciferase-3 wird durch den Aktivitätsfaktor AF
beschrieben.
Aus den Daten ist zu entnehmen, dass in allen getesteten Zelllinien die Luciferase-3
funktional und deutlich aktiver als die ursprüngliche Luciferase ist. In D3- und IB10-Zellen
zeigt die Luciferase-3 eine um den Faktor 7 bis 7.5, in NIH3T3-Zellen um den Faktor 5 und

2 Ergebnisse 40
in CCE-Zellen um den Faktor 3 erhöhte Aktivität gegenüber der Wildtyp-Luciferase
(Abb.28). Auch in stabil exprimierenden NIH3T3-Klonen, die durch Elektroporation des
linearisierten Konstruktes LUC3TA2N7 generiert wurden, konnte ein hohe Luciferase-
Aktivität (∼127.000 bis ∼4.500.000 rlu, ∅ 1.800.000 rlu) nachgewiesen werden (Einzeldaten
nicht gezeigt), die im Vergleich zu den LUCTA2N7-Klonen (Abb.19, ∼61.000 bis ∼500.000
rlu, ∅ 218.000 rlu) durchschnittlich um den Faktor 9 erhöht war.
Es wurde außerdem der Vektor LUC3TA2E generiert, der anstelle des NRF708-IRES ein
EMCV-IRES trägt und für die Klonierung des autoregulierten TetOn-Expressionsvektors
eingesetzt werden sollte. Die transiente Expression dieses Konstruktes in NIH3T3- und ES-
Zellen war ähnlich hoch wie die des Konstruktes LUC3TA2N7 (Daten nicht gezeigt).
2.3.2 Untersuchung der transienten Expression der autoregulierten TetOn-,
E.REXOff- und PIPOff-Kassetten
Auf Basis der Vektoren LUC3TA2N7 und LUC3TA2E wurden die autoregulierten TetOn-,
E.REXOff- und PIPOff-Expressionsvektoren mit Luciferase-3 als Reportergen konstruiert.
Durch Austausch des Transaktivators tTA2 im Konstrukt LUC3TA2E gegen den reversen
Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) wurde der Vektor LUC3rTA2E generiert
(Abb.30). Die Insertion des bidirektionalen Promotors P biET und des Transaktivators ET
(Kap.1.1.3) an die Stelle des bidrektionalen Promotors P bi und des Transaktivators tTA2 im
Konstrukt LUC3TA2N7 führte zum Vektor LUC3REX (Abb.30) bzw. die Insertion des
bidirektionalen Promotors P biPIT und des Transaktivators PIT (Kap.1.1.2) zum Konstrukt
LUC3PIP (Abb.30).
Die Funktionalität der Konstrukte LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP wurde in NIH3T3-
Zellen und in den ES-Zelllinien D3, IB10 und CCE untersucht. Nach Transfektion der
verschiedenen Konstrukte in die Zellen wurden diese unter induzierenden sowie
reprimierenden Bedingungen kultiviert. Anschließend wurden die transienten Luciferase-
Expressionen bestimmt und auf die Expression des Vektors LUC3TA2E in der jeweiligen
Zelllinie im induzierten Zustand normiert (Abb.29). Daraus ergaben sich die
Expressionsfaktoren EF, die das Expressionspotenzial der autoregulierten Konstrukte
LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP im Vergleich zum Konstrukt LUC3TA2E in den
Zellen verdeutlichen (Abb.29). Die Regulationsfaktoren RF wurden durch den Quotienten aus
relativer Luciferase-Expression der Konstrukte im induzierten und reprimierten Zustand
gebildet und beschreiben das Regulationspotenzial der Konstrukte.
Aus den Expressions- und Regulationsdaten kann geschlussfolgert werden, dass mit dem
TetOn-System (LUC3rTA2E) im Vergleich zum TetOff-System (LUC3TA2E) höhere
Expressionen im induzierten, als auch sehr niedrige Expressionen im reprimierten Zustand in
ES-Zellen erreicht werden können, was sich letztlich auch in hohen Regulationsfaktoren
widerspiegelt. Deshalb scheint dieses Expressionssystem eine gute Möglichkeit zu bieten, um
autoreguliert exprimierende ES-Zelllinien zu etablieren. Durch das PIPOff-System
(LUC3PIP) können im Vergleich zum TetOff-System insbesondere in D3- und CCE-Zellen
im induzierten Zustand hohe Luciferase-Expressionen erreicht werden. Allerdings ist die
Expression weniger gut regulierbar. Das E.REXOff-System (LUC3REX) ist nur niedrig
exprimierend, jedoch, wenn auch nur minimal, aktiver als das TetOff-System (LUC3TA2E).
Da die autoregulierten TetOn-, E.REXOff- und PIPOff-Systeme in ES-Zellen transient höhere
Expressionen als das TetOff-System erlauben, wurden im Folgenden mit den Kassetten
LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP versucht, stabil exprimierende ES-Zellklone zu
generieren.

2 Ergebnisse 41
A
1,4
NIH3T3-Zellen
B
30
D3-Zellen
relative Luciferase-Expression [rlu]
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
relative Luciferase-Expression [rlu]
25
20
15
10
5
0
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP
0
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP
EF
1.0
1.1
0.1
1.1
EF
1.0
27
2.4
13
RF
12
24
7
24
RF
4.7
68
3.4
6.2
C
6,0
IB10-Zellen
D
50
CCE-Zellen
relative Luciferase-Expression [rlu]
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
EF
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP
1.0
4.2
1.4
1.6
relative Luciferase-Expression [rlu]
40
30
20
10
0
EF
LUC3TA2E LUC3rTA2E LUC3REX LUC3PIP
1.0
39
3.7
17
RF
1.4
37
7.0
1.5
RF
1.4
135
11
38
induziert
reprimiert
Abb. 29 Vergleich der transienten Luciferase-Expressionen der Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E,
LUC3REX und LUC3PIP in NIH3T3-, D3-, IB10- und CCE-Zellen
Es wurden jeweis 5 µg der Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in 1⋅10 5 NIH3T3-Zellen und in je 5⋅10 5 ES-
Zellen der Linien D3, IB10 und CCE transfiziert. Die transiente Luciferase-Expression im induzierten (•) und reprimierten Zustand ()
wurde nach 2 Tagen bestimmt. Die Expression der Konstrukte wurde auf die des Konstruktes LUC3TA2E der jeweiligen Zelllinie
abgeglichen. Das Expressionspotenzial der Konstrukte wird durch den Expressionsfaktor EF, das Regulationskapazität durch den
Regulationsfaktor RF beschrieben.
2.3.3 Untersuchung der stabilen Expression der autoregulierten TetOn-, E.REXOffund
PIPOff-Kassetten in ES-Zellen
Die linearisierten Konstrukte LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP wurden in CCE- und
IB10-Zellen elektroporiert und diese mit Selektionsmedium bis zur Klonbildung kultiviert. Es
konnten jeweils 10 CCE-Klone mit den Konstrukten LUC3REX und LUC3PIP und 5 CCE-
Klone mit LUC3rTA2E sowie 13 IB10-Klone mit dem Konstrukt LUC3REX, 5 IB10-Klone
mit LUC3PIP und 4 IB10-Klone mit dem Konstrukt LUC3rTA2E selektiert werden. Diese
wurden im Southern-Blot analysiert. Dazu wurden die genomischen DNAs der Klone mit
EcoRV verdaut und mit der neo-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet
ist (Abb.30, Randfragment-Detektion), bzw. mit der Luc3-Sonde, welche zum 3’-Bereich des
Luciferase-3-Gens homolog und zum Nachweis der Vollständigkeit der Integration der
Kassetten in das Genom der Zellen dient (Abb.30), hybridisiert.

2 Ergebnisse 42
LUC3rTA2E
5‘
EcoRV
F
pA pA Luc 3
P bi
rTA2
EMCV
EcoRV
TKneo
F5
EcoRV
pA 3‘
> 4.6 kb
Luc3-Sonde
> 2.2 kb
neo-Sonde
LUC3REX
5‘
EcoRV
EcoRV
F
P biETR
F5
pA pA Luc 3 ET N TKneo
pA
EcoRV
3‘
> 4.1 kb
Luc3-Sonde
> 2.2 kb
neo-Sonde
LUC3PIP
5‘
EcoRV
F
pA pA Luc 3
P biPIT
PIT
EcoRV
F5
N TKneo
pA
EcoRV
3‘
1 kb
> 4.4 kb
> 2.2 kb
Luc3-Sonde
neo-Sonde
Abb. 30 Schematische Darstellung der Vektoren LUC3rTA2, LUC3REX und LUC3PIP nach Integration
in das Genom der Zielzellen
Darstellung der Vektoren LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP sowie der im Southern Blot detektierbaren Fragmente nach Restriktion
der genomischen DNA von selektierten Klonen mit dem Restriktionsenzym EcoRV und Hybridisierung mit einer neo-Sonde, die gegen den
3’-Bereich des Tkneo-Gens gerichtet ist (Randfragmentgröße min. 2.2 kb), und mit einer Luc3-Sonde, die gegen den 3’-Bereich des
Luciferase-3 Gens gerichtet ist (Randfragmentgröße min. 4.1, 4.4 bzw. 4.6 kb).
CCE-Klone
A
21.2 kb
LUC3rTA2E
B
LUC3REX
LUC3PIP
1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
21.2 kb
C
21.2 kb
5.0 kb
3.5 kb
5.0 kb
3.5 kb
5.0 kb
3.5 kb
2.0 kb
2.0 kb
2.0 kb
IB10-Klone
D
LUC3rTA2E
E
LUC3REX
1 2 3 4 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 M
F
LUC3PIP
21.2 kb
21.2 kb
5.0 kb
3.5 kb
5.0 kb
3.5 kb
2.0 kb
2.0 kb
Abb. 31 Southern Blot Analyse von CCE- und IB10-Klonen mit integrierter LUC3rTA2E-, LUC3REXund
LUC3PIP-Kassette
Es wurden 5 µg der linearisierten Vektoren LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in 5⋅10 6 CCE-Zellen bzw. IB10-Zellen elektroporiert.
Nach Selektion von G418-resistenten Klonen wurden die genomischen DNAs isoliert, mit EcoRV geschnittenen und mit der neo-Sonde
hybridisiert (Detektion des Tkneo-Gens, Fragment > 2.2 kb): Eine Bande pro Spur deutet auf eine singuläre Integration, mehrere Banden auf
mehrfache Integrationen der jeweiligen Kassette hin. Zum Nachweis der kompletten Integration der Kassetten wurden die DNAs mit der
Luc3-Sonde hybridisiert (Detektion von Luciferase-3). Klone mit einer oder mehreren vollständig integrierten Kassetten sind mit
gekennzeichnet. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert.

2 Ergebnisse 43
Es zeigte sich, dass die Mehrzahl der selektierten CCE-Klone eine singuläre Kopie der
Kassette besitzen (Abb.31, Fragment >2.2 kb). Weiterhin wurde festgestellt, dass das
Konstrukt LUC3rTA2E in 3 von 5 (Abb.31A), LUC3REX in 7 von 8 (Abb.31B) und
LUC3PIP in 6 von 8 Klonen (Abb.31C) mit singulärer Kopie vollständig integriert wurde.
Bei den IB10-Klonen mit LUC3rTA2E-Kassette zeigte sich, dass Klon 2 eine singuläre,
jedoch unvollständige Kopie der Kassette besitzt (Abb.31D, Fragment >2.2 kb). In den
Klonen 3 und 4 wurden zweifache, allerdings vollständige Integrationen festgestellt
(Abb.31D). Dagegen wurde in der Mehrzahl der LUC3REX-Klone singuläre und vollständige
Integrationen detektiert (Abb.31E). Bei den LUC3PIP-Klonen konnte nur in den Klonen mit
mehrfacher Integration die Vollständigkeit wenigstens einer Kassette nachgewiesen werden
(Abb.31F).
Für die Untersuchung der Luciferase-Expression und Regulation wurden die Zellen der Klone
mit vollständig integrierten Expressionskassetten unter induzierenden bzw. reprimierenden
Bedingungen kultiviert. Von den beiden CCE-Klonen mit LUC3rTA2E-Kassette zeigte Klon
2 eine hohe Luciferase-Aktivität (Abb.32A). In den CCE-Klonen mit LUC3REX-Konstrukt,
Klon 1, 7 und 9, wurden ebenfalls hohe Luciferase-Aktivitäten detektiert (Abb.32A). Dagegen
wurde in keinem der LUC3PIP-Klone eine signifikante Expression nachgewiesen. Die
Expression des LUC3rTA2E-Klons konnte nicht reguliert werden (Abb.32A). Dagegen waren
die Expressionen der drei LUC3REX-Klone regulierbar (Abb.32A).
Bei den IB10-Klonen mit vollständig integrierten Expressionskassetten konnte nur in dem
LUC3rTA2E-Klon 4 eine sehr hohe, regulierbare Expression festgestellt werden (Abb.32B).
In dem LUC3REX-Klon 9 wurde ebenfalls Luciferase-Aktivität nachgewiesen. Jedoch war
diese niedrig und wenig regulierbar (Abb.32B). Die restlichen LUC3rTA2E- und LUC3REX-
Klone bzw. alle LUC3PIP-Klone zeigten keine Expression.
A
CCE-Klone
B
IB10-Klone
50000
47642
50000
45845
Luciferase-Expression [rlu]
40000
30000
20000
10000
19799
24242
14950
Luciferase-Expression [rlu]
40000
30000
20000
10000
3370
0
2 1 7 9
0
4 9
LUC3rTA2E
LUC3REX
LUC3rTA2E
LUC3REX
RF
1.1 2.5
13 3.4 RF 141
2.5
induziert
reprimiert
Abb. 32 Luciferase-Expression von CCE- und IB10-Klonen mit integrierter LUCrTA2E bzw. LUC3REX-
Kassette
Zellen der CCE-Klone bzw. IB10-Klone mit vollständig integrierter LUC3rTA2E- und LUC3REX- und LUC3PIP-Kassette wurden unter
expressionsinduzierenden bzw. reprimierenden Bedingungen kultiviert und anschließend hinsichtlich der Luciferase-Expression [rlu]
untersucht. Der Regulationsfaktor RF wird durch den Quotienten der Luciferase-Aktivitäten im induzierten und reprimierten Zustand
gebildet. In (A) ist die Luciferase-Aktivität exprimierender CCE-Klone, in (B) die von exprimierenden IB10-Klonen mit LUC3rTA2E bzw.
LUC3REX-Kassette dargestellt. Die restlichen, im Southern-Blot identifizierten Klone mit vollständig integrierter LUC3rTA2E-,
LUC3REX- bzw. LUC3PIP-Kassette zeigten keine Luciferase-Aktivität.

2 Ergebnisse 44
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass im Gegensatz zum Vektor LUC3PIP die autoregulierten
Kassetten LUC3rTA2E und LUC3REX die Etablierung autoreguliert exprimierender ES-
Zellen prinzipiell ermöglichen. Die Expression des Reportergens ist signifikant, wobei die
Kassette LUC3rTA2E das höchste Expressionspotenzial besitzt. Außerdem kann die
Expression in der Mehrzahl der exprimierenden Klone in unterschiedlichem Ausmaß reguliert
werden, wobei dies wie auch die Höhe der Expression durch den für die Expression
notwendigen Transaktivator und durch die Umgebung des Integrationsort der Kassette
bestimmt wird.
Die Untersuchung der transienten Expression des Konstruktes LUC3rTA2E zeigt, dass mit
einem autoregulierten TetOn-System die höchsten Expressionen im Vergleich zu anderen
autoregulierten Expressionssystemen in ES-Zellen erreicht werden (Kap.2.3.2). Deshalb war
vermutet worden, dass mit diesem Expressionssystem viele ES-Zellklone mit hohen
Luciferase-Expressionen generiert werden können. Jedoch führte die Elektroporation der
LUC3rTA2E-Kassette in IB10- und CCE-Zellen zu einer nicht erwarteten niedrigen Zahl von
G418-resistenten Zellklonen. Nur wenige dieser Klone zeigten eine hohe Expression
(Abb.32). Ähnliches wurde bei der Etablierung von ES-Zelllinien mit dem TetOff-System
festgestellt (Kap.2.2.4). Die geringe Zahl selektierter Klone nach Elektroporation und die
nicht signifikante Expression dieser Klone wurden mit einem niedrigen Expressionspotenzial
des TetOff-Systems aufgrund einer niedrigen Aktivität des Transaktivators in den ES-Zellen
begründet. Das TetOn-System ist dagegen hoch exprimierend (Kap.2.3.2), was zu der
Erwartung führte, dass dieses System im Gegensatz zum TetOff-System die Etablierung von
ES-Zelllinien erleichtern würde. Möglicherweise kommt es aufgrund des hohen
Induktionspotenzials des reversen Transaktivators rTA2-M2 jedoch zu toxischen
Transaktivator-Konzentrationen in den ES-Zellen, die Squelching bewirken und zum Tod der
Zellen führen können (Kap.1.1.1.3). Das würde bedeuten, dass nur die Zellen mit genomisch
integrierter TetOn-Kassette überleben, die eine für die Aufrechterhaltung der G418-Resistenz
ausreichende Expression aufweisen. Diese muss jedoch niedrig genug sein, dass keine
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen erreicht werden.
Im Folgenden wurde untersucht, inwieweit das autoregulierte TetOn-System in ES-Zellen
Squelching induzieren kann.
2.3.4 Squelching-Effekt von LUC3rTA2E
Zur Überprüfung der Squelching-Kapazität des reversen Transaktivators rtTA2-M2 wurde die
Auswirkung der Transaktivator-Expression auf die konstitutive Expression eines
unabhängigen Reportergens in ES-Zellen untersucht. Dazu wurde das autoregulierte
Konstrukt LUC3rTA2E und zum Vergleich die Konstrukte LUC3TA2E, LUC3REX und
LUC3PIP mit dem Vektor pEFlacZ, welcher eine durch einen EF1α-Promotor vermittelte,
konstitutive β-Galactosidase-Expression ermöglicht, in ES-Zellen der Linie D3, IB10 und
CCE kotransfiziert. Die Zellen wurden unter induzierenden und reprimierenden Bedingungen
kultiviert. Anschließend wurden die transienten β-Galactosidase-Expressionen der Zellen
untersucht. Das Verhältnis der β-Galactosidase-Expression bei Repression und Induktion der
Expression des autoregulierten Konstruktes beschreibt den Einfluß des exprimierten
Transaktivators auf die konstitutive Expression des Konstruktes pEFLacZ und ist ein Maß für
das Squelching-Potenzial des jeweiligen Transaktivators (Abb.33).

2 Ergebnisse 45
1,2
LUC3TA2E
1,2
LUC3rTA2E
1,2
LUC3REX
1,2
LUC3PIP
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
D3
IB10
CCE
relative beta-Galactosidase-Expression
relative beta-Galactosidase-Expression
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
D3
IB10
CCE
D3
IB10
CCE
relative beta-Galactosidase-Expression
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
D3
IB10
CCE
relative beta-Galactosidase-Expression
7
5
E 0.77 1.1 0.74
E 0.33 0.37 0.4
E 0.88 0.78 0.56
E 0.74 0.36 0.5
induziert
reprimiert
Abb. 33 Relative β-Galactosidase-Expression von pEFLacZ in Abhängigkeit von der Expression der
Konstrukte LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in D3-, IB10- und CCE-Zellen
Es wurde die relative β-Galactosidase-Expression des Konstruktes pEFLacZ bei (•) induzierter Expression der autoregulierten Konstrukte
LUC3TA2E, LUC3rTA2E, LUC3REX und LUC3PIP in D3-, IB10- und CCE-Zellen auf die β-Galactosidase-Expression bei ()
reprimierter Expression der autoregulierten Konstrukte normiert. E: normierte Expression von pEFLacZ bei induzierter Expression der
autoregulierten Konstrukte.
Die Daten zeigen, dass die Induktion der autoregulierten Expression in Abhängigkeit vom
exprimierten Transaktivator die β-Galactosidase-Expression beeinflusst. Der rtTA2-M2-
Transaktivator des Konstruktes LUC3rTA2E bewirkt im Vergleich zu den Transaktivatoren
tTA2 (LUC3TA2E), ET (LUC3REX) und PIT (LUC3PIP) in den drei ES-Zelllinien die
stärkste Abnahme der β-Galactosidase-Expression (Abb.33). Die Expression von PIT
resultiert ebenfalls in einer Reduktion der β-Galactosidase-Expression, jedoch ist der Effekt
geringer als bei Expression von rtTA2-M2. Die Transaktivatoren tTA2 und ET beeinflussen
am wenigsten die Expression von β-Galactosidase. Allerdings werden diese im Vergleich zu
rtTA2-M2 und PIT in den ES-Zellen nur wenig exprimiert, was sich anhand der geringen
Luciferase-Expression der Vektoren LUC3TA2E und LUC3REX in diesen Zellen zeigte
(Abb.29). Da jeder Transaktivator der hier verwendeten Konstrukte eine vollständige (ET,
PIT) bzw. minimale (tTA2, rtTA2-M2) transkriptionsaktivierende VP16-Domäne enthält, die
für das Squelching verantwortlich gemacht wird, ist der Einfluss auf die β-Galactosidase-
Expression direkt durch die Aktivität des Transaktivators bestimmt: Je aktiver dieser ist, desto
höhere Transaktivator-Konzentrationen werden in den Zellen erreicht und desto stärker wird
die β-Galactosidase-Expression von pEFLacZ reprimiert.
Um das Squelching des Transaktivators rtTA2-M2 bei der Generierung von ES-Zellklonen
näher beschreiben zu können, wurde die Auswirkung unterschiedlicher Transaktivator-
Expressionen, reguliert durch Doxycyclin während der Selektion, auf die Bildung von Klonen
untersucht. Es wurde basierend auf die Versuche zur Generierung von ES-Zelllinien mit dem
TetOn-System (Kap.2.3.3) vermutet, dass bei hoher Induktion der Expression die
Transaktivator-Konzentrationen zum Squelching führen, was die Selektion von Klonen
limitiert, während bei niedrigerer Induktion durch die veringerten Transaktivator-Mengen die
Etablierung von Klonen verbessert werden kann.
Das linearisierte Konstrukt LUC3rTA2E wurde in CCE-Zellen elektroporiert und diese zu
gleichen Teilen auf Zellkulturplatten ausgesät. Die Zellen wurden in Selektionsmedium mit
unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentrationen (0 bis 2000 ng/ml Doxycyclin) kultiviert.
Dadurch kommt es in unterschiedlichem Ausmaß in den Zellen zur Expression des

2 Ergebnisse 46
Transaktivators. Nach Abschluss der Selektion wurden die G418-resistenten Zellklone gezählt
und zu Zellgemischen zusammengeführt, die nach weiterer Kultivierung in entsprechenden
Doxycyclin-haltigem bzw. freiem Selektionsmedium hinsichtlich der Luciferase-Expression
untersucht wurden. In der Abbildung 34 sind die ermittelten Klonzahlen pro 500.000
elektroporierten Zellen und die Luciferase-Expressionen der Zellgemische in Bezug zur
Doxycyclin-Konzentration des für die Kultivierung jeweils verwendeten Mediums gestellt.
10
9
8
100000
10000
Anzahl G418-
resistenter Klone
relative Luciferase-
Expression
Anzahl G418-resistenter Zellklone
7
6
5
4
3
1000
100
Luciferase-Expression [rlu]
2
10
1
0
0 1 10 50 100 1000 2000
Doxycyclin-Konzentration [ng/ml]
1
Abb. 34 Etablierung von CCE-Klonen mit integrierter LUC3rTA2E-Kassette in Abhängigkeit von der
Doxycyclin-Konzentration
Es wurden 7.5 µg des linearisierten Konstruktes LUC3rTA2E in 7.5⋅10 6 CCE-Zellen elektroporiert. Jeweils 5⋅10 5 elektroporierte Zellen
wurden auf einzelne Kulturplatten ausgesät und in Medien mit G418 und unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentration kultiviert. Nach
Selektion wurde die Zahl der G418-resistenten Zellen pro 5⋅10 5 ausgesäter Zellen bestimmt und aus den Klongemischen die Luciferase-
Expression ermittelt. In der Abbildung sind die Zahl der G418-resistenten Klone und die Luciferase-Expression der Klongemische gegen die
Doxycyclin-Konzentration des Kultivierungsmediums aufgetragen.
Wie erwartet, bewirken ansteigende Doxycyclin-Konzentrationen im Kultivierungsmedium
zunächst eine verstärkte Induktion der Expression der autoregulierten Kassette LUC3rTA2E,
was eine Zunahme G418-resistenter Zellklone zur Folge hat (Abb.34, 0 bis 100 ng/ml
Doxycyclin). Die weitere Zunahme der Doxycyclin-Konzentration führt dann jedoch zu einer
Abnahme der Klonzahlen (Abb.34, 1000-2000 ng/ml). Vermutlich kommt es durch die
maximale Induktion der Expression des Transaktivators in den Zellen zum Squelching. Die
Luciferase-Expression zeigt eine direkte Abhängigkeit zur Doxycylin-Konzentration. Mit
ansteigender Doxyclin-Konzentration steigt die Luciferase-Aktivität in den Zellgemischen an
und erreicht bei 1000 ng/ml Doxycyclin ihr Maximum (Abb.34).
Aus den bisherigen Daten kann geschlussfolgert werden, dass das TetOn-System zu hohen
Expressionen in ES-Zellen führt, jedoch durch hohe Expressionen des TetOn-Transaktivators
verstärkt Squelching in ES-Zellen auftritt, was die Etablierung von transgenen ES-Zelllinien
limitiert. Die Expression des TetOn-Systems kann jedoch während der Selektion durch

2 Ergebnisse 47
gezielte Doxycyclin-Zugabe eingestellt werden (Abb.34, 100 ng/ml), was zu mehr ES-
Zellklonen führt, die eine ausreichende Lucifease-Expression aufweisen.
2.4 Überprüfung der Kassettenaustauschstrategie
Die Markierung von Genorten in Zellen mit heterospezifischen FRT-Sites ermöglicht die
anschließende Integration jeder beliebigen Expressionskassette in diese Genorte. Dadurch
können die Expressionen von autoregulierten Kassetten im identischen chromosmalen
Hintergrund verglichen werden. Es wird erwartet, dass das Expressions- und
Regulationsverhalten der integrierten Austauschkonstrukte vorhersagbar ist (Verhoeyen et al.,
2001).
In den Arbeiten von Verhoeyen et al. (1998, 2001) wurde der Kassettenaustausch mittels einer
sogenannten Selektionsfalle selektiert. Durch Integration eines Promotors und eines
Startcodons in einen, mit heterospezifischen FRT-Sites markierten Genort in NIH3T3-Zellen
konnte die Expression des ATG-defizienten, bereits genomisch verankerten Selektionsgens
Neomycinphosphotransferase aktiviert werden, was die Anreicherung G418-resistenter
Austauschklone ermöglichte. Diese Positiv-Selektion ermöglichte eine Austauscheffizienz
von 100%. Im Gegensatz dazu sollte bei der in dieser Arbeit angewandten
Kassettenaustauschstrategie der Austausch mittels Negativ-Selektion durch Wegfall des
Selektionsmarkers Thymidinkinase in Austauschklonen angereichert werden. Allerdings kann
durch spontane Reduktion der Transkription des Tkneo-Gen und damit einer Reduktion der
Thymidinkinase-Aktivität (Askew et al., 1993, Wu et al., 1994, Seibler et al., 1998) oder
durch Deletionen und/oder Rearrangements des Parentalkonstruktes mit resultierendem
Thymidinkinase-Verlust die Gancyclovir-Sensitivität aufgehoben werden, was zu
sogenannten falsch positiven Zellklonen führt. Um die Zahl dieser Zellklone zu minimieren,
wird bei der in dieser Arbeit angewandten Austauschstrategie durch Integration eines
Startcodons im Leseraster zum bereits verankerten neo-Gen die
Neomycinphosphotransferase-Expression aufrechterhalten. Daduch wird außerdem einer
spontanen Abschaltung der autoregulierten Expression des Austauschkonstruktes in
Austauschklonen entgegengewirkt.
Die aufgestellte Austauschstrategie (Kap.2.1.2) wurde in NIH3T3-Zellen mit integrierter
autoregulierter TetOff-Kassette überprüft.
2.4.1 Kassettenaustausch in NIH3T3-Zellen
Basierend auf den autoregulierten TefOff-Expressionskassetten wurde der ähnlich aufgebaute
Austauschvektor TGALTA2E generiert (Abb.35). Dieser erlaubt die autoregulierte
Expression des Reportergens β-Galactosidase. Nach Integration der Austauschkassette in den
markierten Genlocus werden die Austauschklone anhand des Verlustes des Thymidinkinase-
Gens mittels Gancylovir-Selektion angereichert. Dagegen bleiben die parentalen Zellen
aufgrund ihrer Thymidinkinase-Aktivität Gancyclovir sensitiv und sterben letztlich ab. Die
sequenzspezifische Rekombination wird durch die Flipase Flpe (flp enhanced, Buchholz et
al., 1998), einer thermostabileren Variante der ursprünglichen Flipase Flp (Broach und Hicks,
1980) am effizientesten vermittelt. Diese kann durch das Konstrukt pFGFUS als
Fusionsprotein mit eGFP (enhanced green fluorescent protein) in transfizierten Zellen
exprimiert werden. Durch die eGFP-Expression können die Zellen, in denen das
Fusionsprotein Flpe-eGFP exprimiert wird, im FACS-Gerät sortiert werden. Somit können
bereits frühzeitig Zellen angereichert werden, in denen aufgrund der Flipase-Expression
Kassettenaustausch möglich ist.

2 Ergebnisse 48
TGALTA2E
(Austauschkonstrukt)
F
F5
1 kb
β-Galactosidase
TA2
EMCV
ATG
+ pFGFUS
Genlocus mit
LUCTN7-Kassette
F H F5
H
5‘ Luciferase TA N TK - neo
3‘
Genlocus nach
Kassettenaustausch
2.5 kb
neo-Sonde
H
F
H
H F5
H
5‘ β-Galactosidase
TA2 EMCV neo
3‘
ATG
> 5.1 kb 1.5 kb
Gal-Sonde
neo-Sonde
Abb. 35 Schematische Darstellung des Kassettenaustausches
Das Austauschkonstrukt TGALTA2E erlaubt die autoregulierte Expression von β-Galactosidase. Das Konstrukte pFGFUS dient der
Expression von Flpe-Rekombinase, die die Integration des Austauschkonstruktes in den mit dem Konstrukt LUCTN7 versehenen Genort
katalysiert. Durch den Austausch kommt es zum Verlust des Thymidinkinase-Gens. Gleichzeitig wird ein ATG im Leseraster zum neo-Gen
inseriert, so dass die EMCV-vermittelte Expression von neo aufrechterhalten wird (Genlocus nach Kassettenaustausch). Nach Restriktion der
HMW-DNA von Austauschklonen mit HindIII (H) kann im Southern-Blot mit einer neo-Sonde der Austausch nachgewiesen werden
(Fragement 1.5kb). Mit der Gal-Sonde kann die spezifische Integration von zufälligen Integrationen unterschieden werden.
Für den Kassettenaustausch wurden Zellen des NIH3T3-Klons 18 mit singulär integrierter
LUCTN7-Kassette eingesetzt (Kap.2.2.3). Die Konstrukte TGALTA2E und pFGFUS wurden
in die Zellen kotransfiziert. Nach FACS-Sortierung wurden die eGFP-positiven Zellen in
Kulturmedium mit Gancyclovir und G418 kultiviert. Es wurden 30 Gancyclovir-/G418-
resistente Klone isoliert. Der Kassettenaustausch wurde anschließend durch Untersuchung der
β-Galactosidase-Expression der selektierten Klone und im Southern-Blot analysiert. Dazu
wurden die genomischen DNAs der Klone mit HindIII verdaut und mit der neo-Sonde, die
gegen das Neomycinphosphotransferase-Gen gerichtet ist, hybridisiert (Abb.35).
In den Klonen 11, 12, 21, 23, 27 und 30 konnte ein Kassettenaustausch nachgewiesen werden
(Abb.36A, Fragment 1.5kb). In den restlichen Klonen wurden das Parentalkonstrukt
(Abb.36A, Fragment 2.5kb) bzw. Fragmente abweichender Größe detektiert (Daten nicht
gezeigt). Da diese Klone Gancyclovir-resistent waren, wurde angenommen, dass diese
aufgrund unspezifischer Deletionen und/oder Rearrangements des parentalen Konstruktes
oder durch Reduktion der Expression des parentalen Tkneo-Gens keine oder eine nicht
ausreichende Thymidinkinase-Aktivität aufwiesen. Die G418-Resistenz dieser Klone ist
möglicherweise damit zu erklären, dass die Neomycinphosphotransferase-Aktivität für die
G418-Selektion ausreicht. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass das prokaryrontische
Vektorrückgrat des Flipase-exprimierenden Konstruktes pFGFUS mit dem Kanamycin-
Resistenzgen in das Genom dieser Zellen zufällig integriert wurde, was ebenfalls zu einer
G418-Resistenz führen kann.
Um die spezifische bzw. zufällige Integration des Austauschkonstruktes in das Genom der
Austauschklone nachzuweisen, wurden die HindIII-verdauten, genomischen DNAs im

2 Ergebnisse 49
Southern-Blot mit einer gegen das β-Galacosidase-Gen gerichteten Gal-Sonde hybridisiert
(Abb.35). Dabei konnte die spezifische Integration des Austauschkonstruktes in den
Austauschklonen 27 und 30 gezeigt werden (Abb.36B, Fragment >5.1 kb). In den restlichen
Austauschklonen wurden neben der spezifischen Integration in den markierten Genort
zufällige Integrationen des Austauschkonstruktes in das Genom der Zellen nachgewiesen
(Abb.36B)
A
TGALTA2E
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 K M
5.0 kb
3.5 kb
2.0 kb
1.4 kb
2.5kb
1.5kb
0.9 kb
neo-Sonde
B
M 11 12 21 23 27 30
21.2 kb
5.0 kb
>5.1kb
3.5 kb
2.0 kb
Gal-Sonde
Abb. 36 Southern-Blot Analyse von Austauschklonen
Es wurden 36 µg des Vektors TGALTA2E und 12 µg des Vektors pFGFUS in 6⋅10 5 NIH3T3-Zellen des Klons 18 mit singulär integrierter
LUCTN7-Kassette transfiziert. Nach Sortierung eGFP-positiver Zellen im FACS und Selektion mit Gancyclovir/G418 wurden die HWM-
DNAs resistenter Klone isoliert und mit HindIII geschnitten. (A) Mit der neo-Sonde wurde der Kassettenaustausch detektiert (Fragment
1.5kb). Falsch-positive Klone besitzen entweder die Parentalkassette (Fragment 2.5kb) bzw. ein deletiertes und/oder rearrangiertes
Parentalkonstrukt (Fragment >2.5kb, Daten nicht gezeigt). (B) Zum Nachweis zusätzlicher Integrationen des Austauschkonstruktes in
Austauschklonen wurden die HindIII-geschnittenen HMW-DNAs mit der Gal-Sonde hybridisiert. Eine Bande pro Spur (Fragement >5.1)
bedeutet die Integration von TGALTA2 im markierten Genort, mehrere Banden deuten auf zusätzliche Integrationen der Austauschkassette
hin. Spur M: λDNA, EcoRI/HindIII verdaut, S 35 markiert. K: NIH3T3-Zellen mit integrierter LUCTN7-Kassette, Kl.18
Die Austauschklone wurden hinsichtlich ihrer β-Galactosidase-Expression untersucht. In allen
Austauschklonen konnte eine β-Galactosidase-Aktivität gemessen werden. Die
Austauschklone 27 und 30 ohne zusätzliche Integrationen der Kassette TGALTA2E zeigen
erwartungsgemäß eine übereinstimmende β-Galactosidase-Aktivität und spiegeln somit die
tatsächliche β-Galactosidase-Expression in dem definierten Genort wieder. Dagegen werden
die Expressionen der anderen Austauschklone durch zusätzliche Integrationen des
Austauschkonstruktes bestimmt und weichen deshalb von den homogenen Expressionswerten
der Klone 27 und 30 ab. Die Regulierbarkeit der β-Galactosidase-Expression wurde nicht
untersucht.

2 Ergebnisse 50
1,5
beta-Galactosidase-Expression [rlu]
1
0,5
0
1,2
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
11 12 21 23 27 30
Klon
Abb. 37 β-Galactosidase Expression der Austauschklone
Die Austauschklone wurden hinsichtlich ihrer β-Galactosidase-Expression untersucht. Die gemessenen β-Galactosidase-Aktivitäten wurden
auf die Proteinmengen abgeglichen
Der Versuch zeigt, dass ein Kassettenaustausch entsprechend der Austauschstrategie
(Kap.2.1.2) möglich ist. Es wurde jedoch eine Vielzahl falsch-positiver Klone selektiert.
Diese hatten entweder durch unspezifische Deletionen und/oder Rearrangements des
parentalen Konstruktes oder durch Reduktion der Transkription des Tkneo-Gens eine für
Gancyclovir-Selektion nicht ausreichende Thymidinkinase-Aktivität. Die gleichzeitige,
kontinuierliche Selektion mit G418 sollte verhindern, dass diese falsch-positven Klone
überleben, was jedoch nicht der Fall war. Möglicherweise kam es zur zufälligen Integration
des Vektors pFGFUS, der durch sein Kanamycin-Resistenzgen G418-Resistenz vermitteln
kann. Allerdings ist es auch denkbar, dass trotz reduzierter Transkription des parentalen
Tkneo-Gens in den Klonen die Neomycinphosphotransferase-Aktivität für die
Gewährleistung der G418-Resistenz ausreichte. Um die Effizienz des Kassettenaustausches
zu steigern, bedarf es daher einer Modifikation der Austauschstrategie hinsichtlich einer
stringenteren Selektion. Dies wird in der Diskussion weitläufig erörtert.

3 Diskussion 51
3 Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung von ES-Zelllinien mit hoher, strikt regulierbarer
Reportergen-Expression. Weiterhin sollten diese für die regulierbare Expressionen von
beliebigen Transgenen wiederverwendet werden können. Dazu sollten mittels eines
autoregulierten, Reportergen-exprimierenden Konstruktes Genorte in ES-Zellen mit
heterospezifischen FRT-Sites markiert werden, so dass in diese Loci nachträglich ein
autoreguliertes, Transgen-exprimierendes Austauschkonstrukt durch Flp-vermittelte
Rekombination integriert werden kann.
Im ersten Schritt der Arbeit wurde die Verwendbarkeit eines autoregulierten TetOff-
Konstruktes in ES-Zellen überprüft. Außerdem wurden autoregulierte TetOn-, E.REXOffund
PIPOff-Kassetten konstruiert und diese in ES-Zellen mit dem TetOff-System verglichen,
mit dem Ziel, das am besten exprimierende und regulierbare System in ES-Zellen zu finden.
Zu Vergleichszwecken wurden die verschiedenen Systeme auch in NIH3T3-Zellen getestet,
da in mehreren Publikationen die Funktionalität der Systeme in differenzierten Zellen
beschrieben wurde. Im letzten Schritt der Arbeit wurde die Austauschstrategie hinsichtlich
Funktionalität und Austauscheffizienz in NIH3T3-Zellen untersucht.
3.1 Autoregulierte Expressionssysteme in NIH3T3- und ES-Zellen
3.1.1 Optimierung der Tkneo-Expression durch Austausch des IRES-Elements
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der autoregulierte Expressionsvektor LUCTP, basierend
auf dem TetOff-Expressionssystem, entwickelt, welcher zur Etablierung transgener ES-
Zelllinien mit regulierbarer Expression eingesetzt werden sollte. Die Funktionalität dieses
Konstruktes wurde in NIH3T3-Zellen nach Elektroporation untersucht. Die isolierten
NIH3T3-Zellklone mit genomisch integrierter LUCTP-Kassette zeigten eine hohe,
regulierbare Expression (Abb.13). Jedoch waren die Zellen nicht Gancyclovir-sensitiv. Dies
wurde auf eine geringe Tkneo-Expression zurückgeführt. Da entsprechend der
Kassettenaustauschstrategie (Kap.2.1.2) die Zellen, in denen ein Kassettenaustausch
stattgefunden hat, durch den Verlust der Thymidinkinase-Aktivität selektiert werden sollen,
musste die Expression von Tkneo des autoregulierten Konstruktes erhöht werden. Deshalb
wurde das Polio-IRES des Vektors LUCTP gegen das aktivere EMCV-IRES (Borman et al.,
1997; Oumard et al., 2000), was in ES-Zellen als auch in transgenen Mäusen funktional ist
(Kim et al., 1992), und gegen den murinen 5’-UTR des NRF (NF-κB repressing factor)-Genes
(NRF-IRES) bzw. Deletionsmutanten (Oumard, 2001) ausgetauscht. Insbesondere die NRF-
IRES Elemente besitzen ein vielfach höheres translationsinitiierendes Potenzial als das Poliound
das EMCV-IRES (Oumard et al., 2000; Oumard, 2001; Hennecke et al., 2001). Während
die Polio- bzw. EMCV-IRES vermittelte Translation des zweiten Cistrons meist geringer
ausfällt als die cap-abhängige des ersten Cistrons (Dirks et al., 1994; Mizuguchi et al., 2000),
ist für bicistronische Konstrukte mit NRF-IRES ein umgekehrtes Expressionsverhältnis von
ersten und zweiten Cistron gezeigt worden. Allerdings hängen die Expressionshöhen von den
exprimierten Genen ab, so dass eine Umordnung der Gene im ersten und zweiten Cistron auch
zu gegenteiligen Effekten führen kann (Oumard, 2001, Hennecke et al., 2001). Da durch den
Austausch des IRES-Elements im autoregulierten Konstrukt LUCTP die Anordnung der
Cistrons tTA und Tkneo nicht verändert wurde, war die Translation und damit die

3 Diskussion 52
Expressionshöhe von Tkneo in erster Linie von der translationsinitiierenden Aktivität des
inserierten IRES abhängig.
Die Konstrukte mit den verschiedenen IRES-Elementen wurden hinsichtlich der IRESvermittelten
Translation von Tkneo in NIH3T3-Zellen anhand der Bildung von G418-
resistenten Klonen nach Transfektion untersucht (Abb.14). Dabei zeigte sich, dass durch das
EMCV-IRES, in größerem Ausmaß durch die verschiedenen NRF-IRES Elemente die
Translation des zweiten Cistrons Tkneo verstärkt werden konnte, was sich in der Zunahme
G418-resistenter Klone widerspiegelte. Die Translation des ersten Cistrons tTA wurde durch
die IRES-Elemente nur marginal beeinflusst, was sich in ähnlichen Luciferase-Expressionen
der G418-resistenten Klongemische zeigte. Durch die Zunahme der Expression von Tkneo
und damit verstärkte Thymidinkinase-Aktivität in den Zellen konnte auch die Gancyclovir-
Sensitivität der Zellen erhöht werden. Insbesondere durch die NRF-IRES Elemente wurde
eine Tkneo-Expression vermittelt, die in einer Gancyclovir-Sensitivität aller transfizierten
Zellen resultierte, während die schwächere EMCV-vermittelte Expression in einem geringen
Anteil auch zu Gancyclovir-resistenten Zellen führte. Mit dem Konstrukt LUCTN7, welches
eine NRF-IRES Deletionsmutante trägt, konnte das hohe translationsinitiierende Potenzial des
NRF-IRES auch in stabil exprimierenden NIH3T3-Zellklonen nach Elektroporation bestätigt
werden: ca. 90% der G418-resistenten Klone waren Gancyclovir-sensitiv. Diese Klone
zeigten ebenfalls eine hohe autoregulierte Expression, die stark reprimiert werden konnte
(Abb.16).
3.1.2 Das autoregulierte TetOff-System ist in ES-Zellen niedrig exprimierend
Bisherige Publikationen zeigen, dass TetOff-Systeme in differenzierten Zellen wie HeLa,
HEK293, CHO1, NIH3T3 und in Geweben transgener Mäuse funktional sind und zu hohen,
regulierbaren Expressionen eines Transgens führen (Kap.1.1.1). Dies konnte auch in dieser
Arbeit durch Expressionsanalysen des autoregulierten TetOff-Systems in der embryonalen
Mausfibroblasten-Zelllinie NIH3T3 bestätigt werden (Kap.2.2.3). Da das Konstrukt LUCTN7
in diesen Zellen ein hohes Expressions- und Regulationspotenzial besitzt, wurde es zur
Etablierung von autoregulierten, transgenen ES-Zelllinien eingesetzt. Nach Elektroporation in
ES-Zellen wurden jedoch sehr wenige G418-resistente Klone selektiert, die minimale, nicht
signifikante Luciferase-Expressionen aufwiesen (Kap.2.2.4). Auch nach Integration in einen
definierten Genort, dem ROSA26-Locus (Friedrich und Soriano, 1991), konnte keine
signifikante Expression der autoregulierten TetOff-Kassette festgestellt werden (Kap.2.2.5),
obwohl in diesen Locus inserierte Gene ab dem 8-Zell-/Blastozysten-Stadium ubiquitär
exprimiert werden (Zambrowicz et al., 1997, Kisseberth et al.1999, Mao et al. 1999, Soriano,
1999, Srinivas et al., 2001) und dieser Locus weitestgehend von reprimierenden Einflüssen
abgeschirmt zu sein scheint.
Es wurde vermutet, dass das autoregulierte TetOff-Expressionssystem unabhängig vom
Integrationsort in ES-Zellen niedrig exprimierend ist. Auch die Untersuchung der transienten
Expression des autoregulierten TetOff-System in ES-Zellen zeigte, dass dieses System in ES-
Zellen nur niedrige Expressionen erlaubt, während mit diesem System in NIH3T3-Zellen
hohe Expressionen erzielt wurden (Abb.17). Verantwortlich dafür könnten die Toxizität als
auch eine niedrige Aktivität des exprimierten Transaktivators in ES-Zellen sein.

3 Diskussion 53
3.1.2.1 Das TetOff-System in ES-Zellen (publizierte Daten)
In mehreren Publikationen wurde die Etablierung eines TetOff-Systems in ES-Zellen gezeigt.
Von Era und Witte (2000) wurde ein TetOff-System zur Expression des Oncogens P210 Bcr-
Abl in ES-Zellen etabliert. Das System basierte auf dem Transaktivator tTA2 (Baron et al.,
1997), dessen konstitutive Expression durch eine CAG-Promotor (β-Chicken-Actin-Promotor
mit CMV-Enhancer, Niwa et al., 1991) kontrolliert wurde. Von Shin et al. (1999) wurde eine
ES-Zelllinie generiert, die eine konstitutive Expression des Transaktivators tTA, kontrolliert
durch den endogenen Promotor Ednrb, aufwies und für die regulierte Expression des Ednrb-
Gens in transgenen Mäusen verwendet wurde. Fedorov et al. (2001a, 2001b) etablierte ES-
Zelllinien mit konstitutiver tTA-Expression durch Integration einer tTA-exprimierenden
Kassette mit humanen CMV-Promotor in zufällige Genorte. Diese ES-Zellen wurden zur
Generierung tTA-exprimierender Mäuse eingesetzt und mit transgenen Mäusen, die
Transaktivator-abhängig ein Reportergen exprimierten, gekreuzt. In den Nachkommen konnte
eine regulierte Reportergen-Expression in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden.
Interessanterweise wurde aber in keiner der Arbeiten die Transaktivator-Expression bzw. die
Transaktivator-abhängige Transgen-Expression in ES-Zellen genau quantifiziert. Somit
existieren bisher keine publizierten Daten, die das TetOff-System hinsichtlich
Expressionshöhe und Regulierbarkeit in ES-Zellen beschreiben.
3.1.2.2 TetOff-Transaktivatoren können in ES-Zellen Squelching hervorrufen
In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass das autoregulierte TetOff-System in ES-
Zellen nur zu niedrigen Expressionen führt. Dies kann möglicherweise mit einem toxischen
Effekt des exprimierten Transaktivators erklärt werden.
Der Transaktivator tTA ist eine Fusion aus der Tet-Repressor Domäne TetR und der
transkriptionsaktivierenden Domäne VP16 (Gossen und Bujard, 1992). In mehreren
Publikationen wurde gezeigt, dass VP16 toxisch für Zellen sein kann. Da VP16 mit einer
Vielzahl von Faktoren des Transkriptionsapparates interagiert (Chi et al., 1995, Jacob und
Luse, 1996; Flint und Shenk, 1997), kann es bei hohen Konzentrationen von VP16 bzw. des
Transaktivators tTA durch Reduktion des zellulären Pools der Transkriptionsfaktoren zur
Inhibition von RNA-Transkriptionsprozessen und letztlich zum Tod der Zellen kommen
(Sadowski et al., 1988, Triezenberg et al., 1988; Shockett et al., 1995, Saez et al., 1997; Gallia
und Khalili, 1998; Strathdee et al., 1999). Dieser sogenannte Squelching-Effekt wurde auch in
transgenen Mäusen beobachtet (Byrne und Ruddle, 1989; Böger und Gruss, 1999). Im 2- bzw.
4-Zell-Stadium der Embryogenese (Tag 1.5-2.5) ist eine hohe Expression von VP16 letal
(Yueh et al., 2000). Bei niedriger VP16-Expression wird dagegen die Embryonalentwicklung
nicht behindert. In späteren Stadien der Embryogenese scheinen dagegen höhere
Expressionen von VP16 bzw. von Transaktivatoren mit VP16-Domäne weniger toxische
Nebeneffekte zu bewirken (Byrne und Ruddle, 1989; Gardner et al., 1996; Yaworsky et al.,
1997; Yueh et al., 1998; Böger und Gruss, 1999; Shin et al., 1999; Fedorov et al., 2001a;
Fedorov et al., 2001b). Das bedeutet, dass Zellen der frühen Phase der Entwicklung sensitiver
für Squelching sind als Zellen der späten Phase. In ES-Zellen (Zellen der frühen Phase)
sollten deshalb nur niedrige Konzentrationen von VP16 bzw. des Transaktivators mit VP16-
Domäne toleriert werden. Es scheint, dass das TetOff-System daher in ES-Zellen nur niedrig
exprimierend sein darf, um in ES-Zellen stabil etabliert werden zu können.

3 Diskussion 54
Basierend auf den bisher publizierten Daten können deshalb folgende Hypothesen aufgestellt
werden, die die beobachtete niedrige Expression des autoregulierten TetOff-Systems aufgrund
von Squelching erklären könnten:
(A) Es ist vorstellbar, dass bei einem hohen Expressionspotenzial des Konstruktes LUCTN7
und daraus resultierenden, hohen Transaktivator-Konzentrationen in ES-Zellen Squelching-
Effekte auftreten, die zum Absterben hoch exprimierender Zellen führen (heterologes
Squelching). Die Selektion wäre daher auf ausschließlich niedrig exprimierende Zellklone
limitiert, die eine geringe und damit verträgliche Transaktivator-Expression, jedoch eine
ausreichende Tkneo-Expression bzw. Neomycinphosphotransferase-Aktivität besitzen.
(B) Squelching-Effekte könnten allerdings auch direkt das Expressionspotenzial der
autoregulierten Kassette in ES-Zellen beeinflussen. Hohe Mengen an Transaktivator-
Proteinen könnten direkt die Transaktivator-abhängige Expression des Reporter- bzw.
Selektionsgens negativ beeinflussen (homologes Squelching). Die Folge wäre, dass die
Expression der autoregulierten Kassette soweit angepasst, soweit reduziert wird, dass keine
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen erreicht werden. Auch hier würde das
reduzierte Expressionspotenzial der Kassette nur noch die Selektion von Zellen mit niedriger
Expression erlauben.
In einer transienten Expressionsanalyse wurde das Squelching-Potenzial des TetOff-
Transaktivators bestätigt (Kap.2.3.4). Dazu wurde der Einfluß eines autoreguliert
exprimierten TetOff-Transaktivators auf die konstitutive Expression eines zweiten
Reportergens in verschiedenen ES-Zellen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass durch die
Expression des Transaktivators die Expression des zweiten Reportergens um durchschnittlich
13% reduziert wurde (Abb.33).
Eine Möglichkeit, das Squelching des TetOff-Systems zu verringern, könnte der Einsatz von
TetOff-Transaktivatoren, die weniger toxisch sind, bieten (Baron et al., 1997). Es ist denkbar,
dass diese in ES-Zellen in höheren Konzentrationen toleriert werden können, was die
Etablierung von stabilen ES-Zelllinien mit signifikanter Expression erlauben könnte.
3.1.2.3 Durch weniger toxische TetOff-Transaktivatoren kann die Expression des
TetOff-Systems in ES-Zellen nicht erhöht werden
Um die möglicherweise toxischen Nebenwirkungen des Konstruktes LUCTN7 in ES-Zellen
zu vermindern, wurde der Wildtyp-Transaktivator u.a. gegen die TetOff-
Transaktivatormutante tTA2 ausgetauscht (LUCTA2N7). Dieser Transaktivator wird laut
Literatur bei ähnlicher Aktivität in dreifach höheren Konzentrationen als der Wildtyp-
Transaktivator in Zellen toleriert (Baron et al., 1997). Es wurde erwartet, dass durch
Reduktion des Squelchings die Expression des autoregulierten Konstruktes in ES-Zellen
gesteigert werden kann, was zu erhöhten Klonzahlen nach Elektroporation und höheren
Luciferase-Expressionen führen könnte.
In NIH3T3-Zellen zeigte der Vektor LUCTA2N7 eine ähnliche Expression wie das parentale
Konstrukt LUCTN7 mit dem Wildtyp-Transaktivator, sowohl transient (Abb.18) als auch
stabil nach genomischer Integration (Abb.19). Die Expressionspotenziale der autoregulierten
Konstrukte schienen allein durch die ähnlichen Aktivitäten der Transaktivatoren tTA und
tTA2 definiert zu werden. Ein durch niedrigere Toxizität des Transaktivators tTA2
hervorgerufener, positiver Einfluss auf die Expression konnte nicht beobachtet werden.
In der Untersuchung der transienten Expression der autoregulierten Konstrukte in ES-Zellen
konnten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (Abb.18). Die
verminderte Toxizität des Transaktivators tTA2 des Vektors LUCTA2N7 führte entgegen der
Vermutung nicht zu einer Steigerung der Expression. Deshalb wird angenommen, dass
weniger durch den Transaktivator induziertes Squelching als eine allgemein in ES-Zellen

3 Diskussion 55
niedrige Aktivität der Transaktivatoren für die niedrige Expression der autoregulierten
Konstrukte in diesen Zellen verantwortlich ist.
3.1.2.4 Die niedrige Expression des TetOff-Systems ist begründet durch eine niedrige
Aktivität des TetOff-Transaktivators in ES-Zellen, nicht aber durch Squelching
Es ist anzunehmen, dass aufgrund der niedrigen Aktivität des TetOff-Transaktivators das
TetOff-System in ES-Zellen niedrig exprimierend ist. Dies bestätigte der Vergleich der
Aktivität des TetOff-Transaktivators tTA2 (Baron et al., 1997) und des TetOn-Transaktivators
rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) in ES-Zellen. Es wurde versucht, die niedrige Expression
der TetOff-Kassette im ROSA26-Locus durch Übertransfektion des TetOff-Transaktivators
tTA2 bzw. des TetOn-Transaktivators rtTA2-M2 zu aktivieren. Abhängig vom
übertransfizierten Transaktivator konnte die geringe Reportergen-Expression der transgenen
ES-Zellen erhöht werden: mit dem Transaktivator tTA2 um das ca. 50fache, mit dem reversen
Transaktivator rtTA2-M2 um das ca. 500fache (Abb.27). Der Versuch zeigte, dass der
TetOff-Transaktivator weniger aktiv als der TetOn-Transaktivator ist, und lässt die
Vermutung zu, dass die niedrige Expression der autoregulierten TetOff-Systeme in erster
Linie durch eine niedrige Aktivität des TetOff-Transaktivators in ES-Zellen bestimmt wird.
3.1.2.5 Die Expression des TetOff-Systems ist nach in vitro Differenzierung von ES-
Zellen deutlich erhöht
Die Beobachtungen in dieser Arbeit hinsichtlich des Expressionspotenzials des TetOff-
Systems in ES-Zellen und NIH3T3-Zellen verdeutlichten, dass in ES-Zellen das System
niedrig, in NIH3T3-Zellen jedoch hoch exprimierend ist. In NIH3T3-Zellen führte das
TetOff-System transient wie auch nach stabiler Integration in das Genom der Zellen zu hohen
Expressionen. In ES-Zellen war dagegen die Expression dieses System sehr gering (Kap.2.2.4
und 2.2.5). Um das unterschiedliche Expressionsverhalten des TetOff-Systems in ES-Zellen
und differenzierten Zellen an einem definierten Genort zu untersuchen, wurden transgene ES-
Zellen mit einer TetOff-Kassette im ROSA26-Locus in vitro differenziert. Anschließend
wurde die Expression der differenzierten Zellen bestimmt. Daraus konnten direkte
Rückschlüsse auf die Aktivtität des TetOff-Systems in beiden Zelltypen gezogen werden.
Während in undifferenzierten ES-Zellen eine Reportergen-Expression nicht nachzuweisen
war, zeigten die in vitro differenzierten Zellen bis zu 100fach erhöhte Expressionen (Abb.25),
abhängig von der Differenzierungsrichtung, die durch Zeitpunkt und Dauer der Retinsäure-
Stimulation bestimmt wurde (Tab.4). Die höhere Expression des TetOff-Systems nach in vitro
Differenzierung kann mit einer höheren Toleranz der differenzierten Zellen gegenüber hohen
Transaktivator-Konzentrationen oder aber mit einer höheren Aktivität des Transaktivators in
diesen Zellen erklärt werden.
Da ein genomisch integriertes TetOff-System in ES-Zellen zu keinen signifikanten
Expressionen führt, besteht durch die in vitro Differenzierung der ES-Zellen die Möglichkeit,
den Integrationsort hinsichtlich Expressions- und Regulationskapazität zu beurteilen.

3 Diskussion 56
3.1.3 Das TetOn-System ist in ES-Zellen hoch exprimierend
Die Integration von autoregulierten Expressionsvektoren des TetOff-Systems sowohl in
zufällige Genorte als auch in den ROSA26-Locus von ES-Zellen führte zu ES-Zelllinien mit
sehr niedriger Transgen-Expression (Kap.2.2.4 und 2.2.5). Begründet wurde dies mit einem
niedrigen Expressionspotenzial des TetOff-Systems in ES-Zellen. Deshalb wurden weitere
autoregulierte Expressionskassetten konstruiert, die nicht auf dem TetOff-System beruhen. Es
wurde das TetOn- (Kap.1.1.1.2), sowie das E.REXOff- (Kap.1.1.3) und das PIPOff-System
(Kap.1.1.2) auf das in dieser Arbeit eingesetzte autoregulierte Expressionssystem adaptiert,
was den Austausch von Transaktivatoren (Abb.38) und teilweise von bidirektionalen
Promotoren beinhaltete. Dadurch war es möglich, verschiedene autoregulierte
Expressionssysteme hinsichtlich ihrer Verwendung zur Etablierung autoregulierter ES-
Zelllinien zu beurteilen.
System
Transaktivator
TetOff
tTA2
F F F
TetOn
E.REXOff
PIPOff
rtTA2-M2
ET
PIT
tetR
tetR*
MphR(A)
Pip
F* F* F* (*mutiert)
VP16
VP16
Abb. 38 Schematische Darstellung der Transaktivtoren tTA2, rtTA2-M2, ET und PIT
Die Transaktivatoren bestehen aus einer 5’-Repressor-Domäne und einer 3’-gelegenen transkriptionsaktivierenden Domäne. Der
Transaktivator tTA2 (TetOff-System) besitzt eine Tet-Repressor-Domäne und 3 minimale, modifizierte, transkriptionsaktivierende Domänen
aus VP16 (F-Domäne, Kap.1.1.1.3). Der Transaktivator rtTA2-M2 (TetOn-System) besitzt eine in 4 Aminosäuren modifizierte Tet-
Repressor-Domäne und minimale, modifizierte, transkriptionsaktivierende Domänen von VP16, basierend auf den F-Domänen. Der
Transaktivator ET (E.REXOff-System) besitzt eine MphR(A)-Domäne und die nicht modifizierte Transaktivierungsdomäne von VP16 (C-
Terminus). Der Transaktivator PIT (PIPOff-System) besitzt einen Pip-Repressor und ebenfalls die nicht modifizierte
Transaktivierungsdomäne von VP16 (C-Terminus). Die C-terminale Transaktivierungsdomäne von VP16 enthält eine zur F-Domäne
ähnliche minimale Sequenz.
3.1.3.1 Das TetOn-System führt zu hohen Expressionen in ES-Zellen
Mit dem reversen Transaktivator rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000b) wurde basierend auf dem
TetOff-Konstrukt LUC3TA2E der autoregulierte TetOn-Expressionsvektor LUC3rTA2E
entwickelt. Da die TetOn- und TetOff-Kassetten sich nur hinsichtlich des Transaktivators
unterscheiden, konnte das Expressionsverhalten des TetOn-Systems direkt mit dem TetOff-
System bzw. die Aktivität des TetOn-Transaktivators mit der des TetOff-Transaktivators
verglichen werden.
In NIH3T3-Zellen zeigte das TetOn-System transient eine marginal erhöhte Expression im
Vergleich zum TetOff-System (Abb.29A). Dagegen konnten in D3- und CCE-Zellen mit der
TetOn-Kassette vielfach höhere Expressionen als mit dem TetOff-Konstrukt erzielt werden
(Abb.29B und 29D). Das bedeutet, dass in ES-Zellen das TetOn-System ein höheres
Expressionspotenzial besitzt als das TetOff-System. Auch das Regulationspotenzial des
TetOn-Systems war in NIH3T3-Zellen, insbesondere in ES-Zellen höher als beim TetOff-
System. Da die Expressionen der beiden Systeme im reprimierten Zustand ähnlich waren, ist
die niedrigere Regulierbarkeit des TetOff-Systems auf die niedrigere Expression nach
Induktion zurückzuführen. Die Expressionsdifferenz zwischen TetOff- und TetOn-System in
ES-Zellen konnte durch einen weiteren Versuch bestätigt werden, in welchem der konstitutiv
exprimierte, reverse Transaktivator rtTA2-M2 die Transaktivator-abhängige Expression der
im ROSA26-Locus von ES-Zellen integrierten autoregulierten TetOff-Kassette LUCTA2N7
in größeren Umfang induzieren konnte als der TetOff-Transaktivator tTA2 (Abb.27).

3 Diskussion 57
Der beobachtete Expressionsunterschied der beiden Systeme in ES-Zellen kann
möglicherweise mit einem Aktivitätsunterschied der Transaktivatoren tTA2 und rtTA2-M2 in
diesen Zellen erklärt werden. So wurde gezeigt, dass bestimmte Aminosäureveränderungen in
der ursprünglichen Repressor-Domäne für eine Erhöhung des Aktivierungspotenzials des
Transaktivators rtTA2-M2 verantwortlich sind (Urlinger et al., 2000b). Die modifizierten
minimalen Transaktivierungsdomänen im reversen Transaktivator rtTA2-M2 könnten zu einer
verbesserten Stabilität der rtTA2-M2-mRNA bzw. des Proteins und somit zu einer höheren
Translationsrate bzw. Konzentration des reversen Transaktivators in Zellen führen. So besitzt
der Transaktivator rtTA2-M2 u.a. keine potentiellen Splice-Donor- und Splice-
Akzeptorstellen, keine potentiellen Schnittstellen für Endonukleasen und keine
Basenabfolgen, die die Ausbildung von Haarnadelstrukturen bewirken können (Urlinger et al.,
2000b).
3.1.3.2 Der TetOn-Transaktivator induziert Squelching in ES-Zellen
Das erhöhte transiente Expressionsniveau der TetOn-Kassette LUC3rTA2E in ES-Zellen im
Vergleich zu TetOff-Konstrukten suggerierte, dass mit diesem System die Etablierung einer
Vielzahl hoch exprimierender, transgener ES-Zelllinien möglich wäre. Jedoch wurden nur
wenige Klone selektiert, von denen nur einige eine hohe, teilweise regulierbare Expression
aufwiesen (Abb.32). Der Grund dafür wird in einer, durch hohe Expression erreichten hohen
Konzentration des reversen Transaktivators gesehen, die toxisch für ES-Zellen ist (Kap.2.3.4).
Es konnte gezeigt werden, dass durch die transiente, autoregulierte Expression des reversen
Transaktivators in ES-Zellen die konstitutive Expression eines zweiten Reportergens im
Durchschnitt um 63% reduziert wurde (Abb.33). In einem weiteren Versuch konnte gezeigt
werden, das bei niedrigen Expressionen des reversen Transaktivators, eingestellt durch
definierte Doxycyclin-Mengen, ein direkter Zusammenhang zwischen Konzentration des
Transaktivators und Induktion der autoregulierten Expression zu erkennen ist (Abb.34).
Übersteigt die Transaktivator-Konzentration in den ES-Zellen jedoch einen bestimmten Wert,
scheint die Induktion durch Squelching-Effekte überlagert zu werden, die zum Tod der Zellen
führen können (Abb.34). Bei maximaler Induktion der Expression sollten daher nur wenige
ES-Zellklone mit genomisch integrierter LUC3rTA2E-Kassette selektiert werden können.
3.1.4 Das E.REXOff- und das PIPOff-System führen zu geringeren Expressionen,
aber auch geringerem Squelching in ES-Zellen als das TetOn-System
Das TetOn-System zeigte zwar ein hohes Expressionspotenzial in ES-Zellen, jedoch konnten
mit diesem System nur wenige ES-Zelllinien mit hoher Expression generiert werden. Dies
wurde auf die Toxizität des reversen Transaktivators rtTA2-M2 zurückgeführt. Da Squelching
mit der Aktivität des Transaktivators, die autoregulierte Expression zu induzieren, korreliert,
wurden die Aktivitäten von alternativen Transaktivatoren im autoregulierten System
untersucht. Mit dem Transaktivator ET (Weber et al., 2002a) und einem ET-abhängigen
bidirektionalen Promotor des E.REXOff-Systems wurde die Expressionskassette LUC3REX,
mit dem Transaktivator PIP (Fussenegger et al., 2000) und dem dazugehörigen bidrektionalen
Promotor des PIPOff-Systems der Expressionsvektor LUC3PIP generiert. Diese
Transaktivatoren besitzen wie die in dieser Arbeit verwendeten TetOff-Transaktivatoren bzw.
der TetOn-Transaktivator rtTA2-M2 eine auf VP16 basierende, transkriptionsaktivierende
Domäne (Abb.38). Es wurde erhofft, dass die Transaktivatoren dieser Systeme aktiver als die
TetOff-Transaktivatoren sind, so dass höhere Expressionen als mit dem TetOff-System in ES-
Zellen erreicht werden können. Allerdings sollte die Aktivität der Transaktivatoren niedriger

3 Diskussion 58
sein als die des reversen Transaktivator rtTA2-M2, so dass durch die exprimierten
Transaktivatoren weniger Squelching als mit dem TetOn-Transaktivator in ES-Zellen
induziert wird.
In NIH3T3-Zellen zeigte das E.REXOff-System nur eine sehr niedrige transiente Expression,
die ca. 10% des TetOff-Systems entsprach (Abb.29A). Dagegen konnte mit dem PIPOff-
System eine ähnlich hohe transiente Expression wie mit dem TetOff- und dem TetOn-System
erzielt werden. In ES-Zellen war die transiente Expression des E.REXOff-Systems nur wenig
höher als die des TetOff-Systems. Dagegen zeigte das PIPOff-System Expressionen, die
zwischen denen des E.REXOff- und des TetOn-Systems lagen. Insbesondere in D3- und
CCE-Zellen waren diese vielfach höher als die des E.REXOff- bzw. TetOff-Systems
(Abb.29B und 29D). Die Regulationspotenziale beider Systeme waren gering. Beim
E.REXOff-System ist dies mit einer niedrigen Expression im induzierten Zustand, beim
PIPOff-System mit einer hohen Basalexpression zu erklären.
Nach diesen Ergebnissen wurde erwartet, dass insbesondere mit dem PIPOff-System
autoregulierte ES-Zelllinien etablierbar sind. Jedoch konnten nur wenige ES-Zellklone
selektiert werden, die, obwohl in den meisten Klonen die vollständige Integrationen der
Kassette in das Genom der Zellen nachgewiesen wurde, keine bzw. eine sehr geringe
Expression aufwiesen (Kap.2.3.3). Dies wurde mit einem, durch hohe Expression des
Transaktivators PIP verursachtem Squelching erklärt, begründet mit der Beobachtung, dass
die Expression des Transaktivators PIT die Expression eines konstitutiv exprimierten
Reportergens um durchschnittlich 46% inhibierte (Abb.33).
Da das E.REXOff-System eine niedrigere transiente Expression als das TetOff-System in ES-
Zellen aufwies, wurde nicht erwartet, dass mit diesem System ES-Zelllinien mit
autoregulierter Expression etabliert werden könnten. Jedoch wurden ES-Zellklone selektiert,
von denen einige eine signifikante Expression zeigten. Diese war niedriger als bei den
Zellklonen mit integrierter TetOn-Kassette (Abb.32). Da es durch den transient exprimierten
Transaktivator ET zu einer Reduktion der Expression eines konstitutiv exprimierten
Reportergens um durchschnittlich 29% kam (Abb.33), ist es denkbar, dass Squelching die
Selektion der wenigen exprimierenden ES-Zellklonen beeinflusst hat. Aufgrund der
beobachteten, niedrigen transienten Expression des autoregulierten E.REXOff-System in ES-
Zellen ist jedoch eher davonauszugehen, dass das niedrige Expressionspotenzial in ES-Zellen
der Grund für die geringe Zahl an selektierten Zellklonen war.
3.1.5 Vergleich der autoregulierten Expressionssysteme in ES-Zellen
Die Untersuchungen der transienten Expression des autoregulierten TetOff-, TetOn-,
E.REXOff- und PIPOff-Systems in ES-Zellen verdeutlichten die Unterschiede der Systeme
hinsichtlich ihrer Expressionspotenziale. Das TetOn- und PIPOff-System zeigten hohe
Expressionen (Abb.29), die allerdings einhergingen mit starken Squelching-Effekten
(Abb.33). Dagegen war das TetOff-System niedrig exprimierend (Abb.29), was sich auch in
einem geringen Squelching widerspiegelte (Abb.33). Das E.REXOff-System führte dagegen
zu höheren autoregulierten Expressionen (Abb.29), die jedoch auch ein verstärktes
Squelching bewirkten (Abb.33). Das bedeutet, dass mit ansteigender Expression des Systems
zunehmend Squelching-Effekte durch den exprimierten Transaktivator auftreten. Da die
Transaktivatoren VP16- bzw. minimale VP16-Transaktivierungsdomänen aufweisen, die für
Squelching verantwortlich sind, wird daher die Toxizität der Transaktivatoren durch die Höhe
ihrer Expression bestimmt, die von ihrer Aktivität, die Expression autoreguliert zu induzieren,
abhängt. Je aktiver das Expressionssystem ist, desto stärker kann durch den autoreguliert
exprimierten Transaktivator Squelching induziert werden. Dies kann einerseits zum Zelltod
führen (heterologes Squelching), anderseits auch die Expression des autoregulierten Systems

3 Diskussion 59
negativ beeinflussen (homologes Squelching). In Tabelle 5 sind die Systeme hinsichtlich ihrer
Expressionskapazität und resultierendem Squelching-Potenzial geordnet.
Expression EF (%) Squelching SF (%)
TetOff • 4 14
E.REXOff • 11 29
PIPOff ••• 45 46
TetOn ••••• 100 63
Expressionsfaktor EF: • 0-20%, ••• 41-60%, ••••• 81-100%
Squelching-Faktor SF: 0-20%, 21-40%, 41-60%, 61-80%
Tab. 5 Vergleich von Expression und Squelching der autoregulierten Konstrukte in ES-Zellen
Es sind die gemittelten, transienten Expressionen der verschiedenen autoregulierten Systeme in ES-Zellen, beschrieben durch den
Expressionsfaktor EF in % (normiert auf die Expression des TetOn-Systems), zusammengefasst. Das Squelching-Potenzial der Systeme
wurde durch Bestimmung der transienten, konstitutiven Expression eines zweiten Reportergens nach Induktion der Expression der
kotransfizierten autoregulierten Expressionskassetten in verschiedenen ES-Zellen bestimmt und gemittelt. Der Squelching-Faktor SF [%]
beschreibt den Einfluß des exprimierten Transaktivator auf die Expression dieses Reportergens.
Das autoregulierte TetOn-System besitzt von den untersuchten Expressionssystemen das
höchste Expressionspotenzial, was die Etablierung hoch exprimierender, autoregulierbarer
ES-Zelllinien ermöglichte. Mit den anderen Systemen wurden ES-Zelllinien mit nicht
nachweisbarer oder niedrigerer Expression generiert. Wie jedoch die Untersuchung in vitro
differenzierter Zellen mit integriertem TetOff-System zeigte (Kap.2.2.5.2), kann es nach in
vitro Differenzierung von ES-Zellen zu deutlichen Expressionenssteigerungen kommen.
Daher besteht die Möglichkeit, die Expressions- und Regulationskapazität von niedrig
exprimierenden ES-Zelllinien auf Ebene in vitro differenzierter Zellen zu bewerten.
Da aufgrund der Toxizität des exprimierten Transaktivators rtTA2-M2 die Generierung von
ES-Zelllinien mit integriertem TetOn-System eingeschränkt wird, was sich in der geringen
Zahl selektierter Klone nach Elektroporation widerspiegelte, bedarf es zur Etablierung von
ES-Zelllinien mit regulierbarer, hoher Expression eines größeren Screening-Aufwandes.
Durch Reduktion der Expression mittels Doxycyclin, was zu niedrigeren und damit weniger
toxischen Transaktivator-Konzentrationen führt, wäre es möglich, die Zahl stabiler Klone zu
erhöhen. Es wäre auch denkbar, durch Einsatz anderer Transaktivierungsdomänen wie p65
oder E2F4 die Toxizität des reversen Transaktivators zu reduzieren (Kap.3.3.1.2).
3.2 Flp-vermittelter Kassettenaustausch
Die Kassettenaustauschstrategie (Kap.2.1.2) wurde an dem parentalen NIH3T3-Klon 18 mit
singulär integrierter, autoregulierter Expressionskassette LUCTN7 überprüft (Kap.2.4). Als
Austauschvektor diente das autoregulierte Konstrukt TGALTA2E. Der Kassettenaustausch ist
mit dem Verlust der Thymidinkinase-Aktivität verbunden, weshalb nach Kotransfektion des
Austauschkonstruktes und des Flipase-exprimierenden Vektors pFGFUS Gancyclovirresistente
Zellen selektiert wurden (Negativ-Selektion). Es besteht die Möglichkeit, dass
Zellen durch spontane, positionsabhängige Inaktivierung die Thymidinkinase-Expression
verlieren (Askew et al., 1993; Wu et al., 1994), was bei alleiniger Selektion mit Gancyclovir
zu falsch-positiven Klonen führen kann. Um diese Zellen, in denen die Expression von Tkneo
reduziert bzw. inaktiviert ist, zu eliminieren, wurden die transfizierten Zellen nicht nur mit
Gancyclovir sondern auch mit G418 kultiviert. Austauschklone werden dagegen durch die
G418-Selektion nicht eliminiert, da nach Kassettenaustausch die Expression des bereits
verankerten neo-Gens in den Zellen aufrechterhalten wird.

3 Diskussion 60
3.2.1 Die Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion ist funktional, jedoch
wenig effizient
Nach Kotransfektion des Austauschkonstruktes und des Flipase-exprimierenden Vektors in
die Zellen konnten Gancyclovir-/G418-resistente Zellklone selektiert werden (Kap.2.4). In
20% der Zellklone konnte ein Kassettenaustausch, in 23% das Vorhandensein der parentalen
Expressionskassette und in 57% weder ein Kassettenaustausch noch das vollständige
Parentalkonstrukt detektiert werden.
Bei den Klonen, in denen weder der Kassettenaustausch noch das Parentalkonstrukt
nachweisbar war (57%), wurde angenommen, dass unspezifische Deletionen oder
Rearrangements des Parentalkonstruktes zum Verlust der Tkneo-Expression führten, was die
Resistenz dieser Klone gegenüber Gancyclovir erklären könnte. Da in permanenten Zelllinien
wie NIH3T3 zirkuläre Plasmide effizient in zufällige Genorte integrieren können, wurde
vermutet, dass diese Klone durch zufällige, genomische Integration des Kanamycin-
Resistenzgens des Flp-exprimierenden Konstruktes pFGFUS G418-Resistenz erlangten.
Dieses auf dem Vektorrückgrat befindliche prokaryontische Gen könnte in eukaryotischen
Zellen durch einen endogenen Promotor exprimiert worden sein. Zufällige Integrationen eines
Flp-exprimierenden Konstruktes während eines Kassettenaustauschversuches wurden bereits
in der Arbeit von Seibler (1999) beobachtet. Bei einem ähnlichen Ansatz mit ausschließlich
Negativ-Selektion wurde eine 14%ige Integrationshäufigkeit eines Flp-exprimierenden
Konstruktes festgestellt. Diese Integrationen hatten jedoch keine Bedeutung bei der Selektion
von Austauschklonen.
Die Gancyclovir-/G418-resistenten Klone, in denen ausschließlich die vollständige parentale
Expressionskassette nachgewiesen wurde (23%), könnten aufgrund einer positionsabhängigen
Inaktivierung des Tkneo-Gens Resistenz gegenüber Gancyclovir erlangt haben (Askew et al.,
1993; Wu et al., 1994). Diese Klone waren jedoch weiterhin G418-resistent, so dass von einer
vollständigen transkriptionellen Inaktivierung der Tkneo-Expression nicht ausgegangen
werden kann. Durch Methylierung regulatorischer Sequenzen (Feng et al., 2001), durch
Verlust von DNAseI hypersensitiver Stellen im Genom oder Reduktion der Zugänglichkeit
des Chromatins (Francastel et al., 1999) kann die Expression eines Transgenes reduziert bzw.
inaktiviert werden. Möglicherweise sind dies Gründe für eine verminderte autoregulierte
Expression der parentalen Kassette. Die Expression von Tkneo bleibt dadurch bestehen, was
zur Aufrechterhaltung der G418-Resistenz in diesen Zellen ausreichte, jedoch für eine
Gancyclovir-Sensitivität zu gering war.
In 20% der Gancyclovir-/G418-resistenten Klone wurde der Kassettenaustausch gezeigt. In
der Mehrzahl dieser Klone wurden jedoch weitere Integrationen des Austauschkonstruktes in
zufälligen Genorten nachgewiesen. Dies wird in Kapitel 3.2.2 näher diskutiert. In 7% aller
Gancyclovir-/G418-resistenten Klone, wurde schließlich das Austauschkonstrukt einzig im
markierten Genlocus detektiert. In der Arbeit von Seibler (1999) wurde bei der Untersuchung
des Kassettenaustausches in verschiedenen Genorten Austauschraten abzügliche
unspezifischer Integrationen des Austauschkonstruktes von 7-56% erreicht. Daraus kann
geschlussfolgert werden, dass die in dieser Arbeit berechnete Austauschfrequenz für den
Integrationsort im LUCTN7-Klon 18 mit 7% im unteren Bereich liegt. Wie Seibler (1999)
zeigte, sind die Austauschraten vom Genort des integrierten Parentalkonstruktes abhängig.
Vermutlich werden diese durch die Zugänglichkeit der Rekombinase zum Genort bestimmt.
Es wurde festgestellt, dass Rekombinationen in transkriptionell inaktiven Loci sehr ineffizient
verlaufen (Schübeler et al., 1997). Dies würde bedeuten, dass in niedrig exprimierenden
Genorten die Möglichkeiten für einen Kassettenaustausch geringer wären als in hoch
exprimierenden. Eine Korrelation zwischen Austauscheffizienz und Expressionshöhe konnte
jedoch in diesem Fall nicht beobachtet werden. Trotz hoher Expression des in dieser Arbeit

3 Diskussion 61
eingesetzten parentalen Zellklons (Abb.16, Klon 18) konnten nur wenige Klone mit
Kassettenaustausch isoliert werden.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die aufgestellte Kassettenaustauschstrategie funktional
ist. Jedoch ist die Austauscheffizienz gering: In 80% der isolierten Klone fand kein
Kassettenaustausch statt. Es wurde erwartet, dass durch die Aufrechterhaltung der
Neomycinphosphotransferase-Aktivität in Austauschklonen verhindert werden kann, dass
falsch-positive Klone mit reduzierter bzw. abgeschalteter Tkneo-Expression selektiert
werden. Allerdings wurde eine Vielzahl dieser Klone, die eine vollständige Parentalkassette
aufwiesen, isoliert (23%). Das bedeutet, dass Neomycinphosphotransferase als
Selektionsmarker für die Eleminierung solcher Klone nicht sensitiv genug ist. Für diesen
Zweck ist es daher empfehlenswert, ein sensitiveres Positiv-Selektionsgen einzusetzen. Die
Mehrzahl der falsch-positiven Klone, die möglicherweise durch Deletion oder
Rearrangements der Parentalkassette Gancyclovir-resistent waren, könnte durch zufällige
Integration des Kanamycin-Resistenzgens des Flp-exprimierenden Vektors G418-Resistenz
erlangt haben (57%). Aufgrund der hohen Effizienz illegetimer Rekombination in permanten
Zelllinien ist es deshalb empfehlenswert, für den Kassettenaustausch einen Flipaseexprimierenden
Vektor zu verwenden, der keine G418-Resistenz vermitteln kann.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Kassettenaustausch auf Basis der vorgestellten
Austauschstrategie mit Negativ-Selektion zu niedrigeren Austauschraten als ein
Kassettenaustausch mit stringenter Positiv-Selektion (Verhoeyen et al., 1998) führt. So
konnten in der Arbeit von Verhoeyen et al. (1998) mit der Positiv-Selektion unter
Verwendung einer Selektionsfalle Austauscheffizienzen von 100% erreicht werden. Um die
hohe Zahl falsch-positiver Klone zu reduzieren, die bei Negativ-Selektion des
Austauschereignisses unter Verwendung des Negativ-Selektionsmarkers Thymidinkinase
selektiert werden, bedarf es daher einer Modifikation der Austauchstrategie. Möglichkeiten
zur Optimierung des Kassettenaustausches sind in Kapitel 3.3.2 beschrieben.
3.2.2 Der Kassettenaustausch führt zu einem hohen Anteil an Austauschklonen mit
zusätzlich integrierten Austauschkonstrukten
In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass in der Mehrzahl der Klone mit integriertem
Austauschkonstrukt im markierten Genort auch Integrationen des Austauschkonstruktes in
zufällige Genorte stattgefunden hatten. Dies wurde auch in der Arbeit von Seibler (1999), in
der in NIH3T3-Zellen in ähnlicher Weise der Flp-vermittelte Kassettenaustausch mit
ausschließlich Negativ-Selektion untersucht wurde, festgestellt. Es wurden in Abhängigkeit
vom Genort Austauschraten von 43-100% beobachtetet. In der Mehrzahl der Austauschklone
lagen zusätzliche Integrationen des Austauschkonstruktes vor, so dass die Austauschraten
abzüglich dieser unspezifischen Integrationen letztlich 7-56% betrugen. Die Integrationen
sind damit zu begründen, dass in permanenten Zelllinien durch illegitme Rekombination
zirkuläre Plasmide effizient in zufällige Genorte integrieren können. In der Arbeit von Seibler
betrug der Anteil von Austauschklonen mit zusätzlicher Integration des Austauschkonstruktes
gegenüber Austauschklonen mit singulärer Integration 44-88%. In der vorliegenden Arbeit
lag der Anteil der Klone mit zusätzlicher Integration für einen untersuchten parentalen Klon
bei 65% und damit im Bereich der in Seibler’s Arbeit (1999) festgestellten Rate. Die
Wahrscheinlichkeit für illegitime Rekombination in permanenten Zelllinien hängt von der bei
der Transfektion eingesetzten Menge an DNA ab. Da jedoch auch die Wahrscheinlichkeit des
Kassettenaustausches durch die transfizierte Menge an Austauschkonstrukt bestimmt wird,
scheint die Optimierung des Transfektionsprotokolls zur Senkung des Anteils an
Austauschklonen mit zufälliger Integration wenig erfolgversprechend. In bisherigen Ansätzen
wurde ein hoher Überschuss an Austauschkonstrukt gegenüber Flp-exprimierenden Konstrukt

3 Diskussion 62
in Transfektionen eingesetzt. Dies bedeutet, dass nach Transfektion in Flipase-exprimierenden
Zellen eine hohe Konzentration an Austauschkonstrukt vorliegen sollte. Dadurch wird die
Wahrscheinlichkeit einerseits für den Kassettenaustausch, anderseits auch für die illegitime
Rekombination erhöht. Eine Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems wäre, den Anteil
des Austauschkonstruktes gegenüber dem des Flp-exprimierenden Vektors im
Transfektionsansatz drastisch zu senken. Dadurch würden in Zellen, die Flipase exprimieren,
nur wenige Austauschkonstrukte vorliegen. Möglicherweise könnte damit trotz verringerter
Wahrscheinlichkeit für einen Kassettenaustausch die Wahrscheinlichkeit für illegitime
Rekombination reduziert werden. Die Kassettenaustauscheffizienz wäre zwar niedrig, der
Anteil an Austauschklonen mit zusätzlichen Integrationen des Austauschkonstruktes sollte
jedoch minimiert werden können.
In der Arbeit von Verhoeyen et al. (1998) wurde der Kassettenaustausch durch
Komplementierung eines bereits verankerten, ATG-defizienten neo-Gens über Positiv-
Selektion angereichert. Dabei wurden keine Austauschklone mit zusätzlichen Integrationen
des Austauschkonstruktes selektiert. Obwohl das Austauschkonstrukt im Vektorrückgrat ein
HygTk-Gen aufwies, welches in den transfizierten Zellen eine Thymidinkinase-Expression
ermöglicht und somit eine Negativ-Selektion mit Gancyclovir erlaubt, war diese zusätzliche
Selektion nicht notwendig, um Austauschklone mit zufällig integriertem Austauschkonstrukt
zu eliminieren. Eine mögliche Erklärung liegt jedoch nicht vor.
3.2.3 Die Expression des integrierten Austauschkonstruktes ist vorhersagbar
Die β-Galactosidase-Expressionen der isogenen Austauschklone ohne unspezifische
Integrationen des Austauschkonstruktes waren erwartungsgemäß identisch (Abb.37).
In den Arbeiten von Verhoeyen et al. (2001) und Schübeler (1998) wurde gezeigt, dass,
soweit die Expression eines Parentalkonstruktes in einen markierten Genort bekannt ist, die
Expression eines Austauschkonstruktes nach Integration in den gleichen Locus vorhersagbar
ist. Das bedeutet, dass ein hoch exprimierender Genort eine hohe Expression eines beliebigen
Gens nach Kassettenaustausch ermöglicht, ein niedrig exprimierender Genort dagegen nur
niedrige Expressionen eines integrierten Austauschkonstruktes erlaubt. Seibler (1999) stellte
fest, dass es nach Austausch eines genomisch integrierten Konstruktes mit TK-Promotor
gegen ein Konstrukt mit PGK-Promotor zur Verschiebung der Expressionshöhen kam, die
zwischen den verschiedenen Klonen und somit in Abhängigkeit vom markierten
Integrationsort variierte. Die Expressionen der Austauschklone waren nicht vorhersagbar.
Dies wurde mit unterschiedlichen, durch die chromosomale Umgebung festgelegten,
transkriptionellen Aktivitäten des TK- bzw. PGK-Promotors begründet, d.h. der
Positionseffekt eines Locus wirkt sich unterschiedlich auf verschiedene Promotoren aus. Für
eine Vorhersagbarkeit der Expression ist es daher notwendig, dass das Austauschkonstrukt
ähnlich aufgebaut ist wie das Parentalkonstrukt im markierten Genort bzw. den gleichen
Promotor trägt.
Das entsprechend der Austauschstrategie (Kap.2.1.2) in dieser Arbeit eingesetzte
Austauschkonstrukt war ähnlich konstruiert wie das autoregulierte TetOff-Konstrukt, das zur
Markierung von Genorten in NIH3T3-Zellen eingesetzt wurde. Da der Kassettenaustausch
keine Veränderung des Promotors nachsichzog, die autoregulierte Expression weiterhin vom
gleichen bidirektionalen, Transaktivator-abhängigen Promotor kontrolliert wurde, war
erwarten worden, dass die Expression des Reportergens β-Galactosidase vorhersagbar ist.

3 Diskussion 63
3.2.4 Anwendung der Kassettenaustauschstrategie in ES-Zellen
Die in dieser Arbeit aufgestellte Kassettenaustauschstrategie mit Negativ-Selektion wurde so
konzipiert, dass sie prinzipiell auch in ES-Zellen anwendbar ist. Da in ES-Zellen im
Gegensatz zu permanenten Zelllinien wie NIH3T3 zirkuläre Plasmide sehr ineffizient in das
Genom integrieren, sollte ein Kassettenaustausch in ES-Zellen vorwiegend zu
Austauschklonen mit ausschließlich im markierten Genort integrierter Austauschkassette
führen. Daher sollte die Effizienz des Kassettenaustausches in ES-Zellen höher sein als in
NIH3T3-Zellen. In der Arbeit von Seibler et al. (1998) wurde in verschiedenen ES-Zellklonen
ein Kassettenaustausch mit Negativ-Selektion durchgeführt. Es wurde ein
Neomycinphosphotransferase-exprimierendes Austauschkonstrukt durch Flp-vermittelte
Rekombination in verschiedene Loci von ES-Zellen, die mit einer HygTk-exprimierenden
Kassette markiert waren, integriert. Die Selektion mittels Gancyclovir führte zu
Austauschraten zwischen 21-38%, abhängig vom Integrationsort. Durch zusätzliche Selektion
auf Neomycinphosphotransferase-Expression mit G418 (Positiv-Selektion) konnte die
durchschnittliche Austauscheffizienz von 27% auf 85% gesteigert werden.
3.2.5 Ein Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion ist effizienter als mit Negativ-
Selektion
Ein Kassettenaustausch kann wie in dieser Arbeit über Negativ-Selektion oder mittels
sogenannter Selektionsfallen angereichert werden. Bei letzterer Methode, der Positiv-
Selektion, wird der Kassettenaustausch entweder durch Integration eines Promotors bzw.
IRES-Elements und eines Startcodons in den markierten Locus und resultierender
Aktivierung der Expression eines ATG-defizienten, bereits genomisch verankerten
Selektionsgens (Verhoeyen et al., 1998, 2001) oder durch Integration eines vollständigen
Selektionsmarkers in einen Genort mit Promotor, selektiert (Schübeler et al., 1998).
Die Negativ-Selektion mit Gancyclovir führt für viele Integrationsorte zu spontan resistenten
Zellklonen, in denen die Expression der Thymidinkinase entweder inaktiviert, reduziert oder
aufgrund unspezifischer Deletion oder Rearrangements der parentalen Expressionskassette
aufgehoben ist. Die Rate der Spontanresistenz und die Austauscheffizienz variieren dabei
zwischen verschiedenen Loci (Karreman et al., 1996; Schübeler et al., 1997; Seibler et al.,
1998; Seibler, 1999).
In der Arbeit von Verhoeyen et al. (1998) wurde in mehreren parentalen NIH3T3-Zellklonen
mit retroviral integrierter Expressionskassette, die von Wildtyp FRT- und FRT-Mutante F5
flankiert wird, der Kassettenaustausch mit Positiv-Selektion durchgeführt. Durch
Komplementierung eines ATG-defizienten Neomycinphosphotransferase-Gens im markierten
Genlocus wurden G418-resistente Austauschklone selektiert. Dabei zeigte sich, dass durch
Positiv-Selektion Austauscheffizienzen von 100% erreicht werden. Die Verwendung eines
Positiv-Selektionsmarkers hat jedoch den Nachteil, dass dieser die Expression anderer Gene
beeinflussen kann (Kim et al., 1992; Fiering et al., 1993; Pham et al., 1996, Wildner et al.,
1998; Mei et al., 2000). Insbesondere der Selektionsmarker Neomycinphosphotransferase
kann die Expression benachbarter Gene reprimieren (Artelt et al., 1991).
3.2.6 Das neo-Gen kann die Expression benachbarter Gene negativ beeinflussen
Von Artelt et al. (1991) wurde gezeigt, dass das neo-Gen die Expression eines benachbarten
Gens durch supressiven Einfluss auf den zugehörigen Promotor reduziert. Dieser cisagierende,
negative Effekt tritt auch auf, wenn das neo-Gen nicht transkribiert wird, und ist

3 Diskussion 64
unabhängig von der Insertion und Orientierung des neo-Gens zum Promotor. Andere
Selektionsmarker wie das Puromycin-Resistenzgen zeigen dagegen keine Auswirkungen auf
die Expression von beachbarten Genen. Auch Wildner et al. (1998) konnte den negativen
Einfluss des neo-Gens beobachten. So führte die Exzision von neo, welches im zweiten
Cistron eines bicistronischen retroviralen Konstruktes lokalisiert war, zu einer signifikanten
Erhöhung der LTR-vermittelten Expression von GFP im ersten Cistron. Fiering et al. (1993)
zeigte, dass die Integration einer mit FRT-Sites flankierten neo-Kassette in den LCR des β-
Globin-Locus mittels homologer Rekombination zum Abbruch der β-Globin-Expression und
zur Reduktion der DNAseI-Sensitivität einer 3’gelegenen hypersensitiven Site führte. Nach
Flp-vermittelter Exzision der neo-Sequenz konnte der ursprüngliche Phenotyp, β-Globin-
Expression und hohe Sensitivität der DNAseI-hypersensitven Site, jedoch wiederhergestellt
werden. Die Repression der β-Globin-Expression wurde nicht durch die Deletion im LCR,
sondern durch die neo-Sequenz verursacht. Daher ist es notwendig, das neo-Gen zu entfernen.
Durch Flankierung des neo-Gens mit loxP-Site kann, wie in dieser Arbeit angedacht, dieses
durch Cre-Rekombinase exzisiert werden (Kap.2.1.2).
3.3 Perspektiven
3.3.1 Optimierung der autoregulierten Expression in ES-Zellen
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass von den untersuchten autoregulierten
Systemen das TetOn-System zu den höchsten Expressionen in ES-Zellen führte, gefolgt vom
PIPOff-, E.REXOff- und TetOff-System. Jedoch konnte auch festgestellt werden, dass in
Abhängigkeit von der Expressionshöhe des System, die durch die jeweilige Aktivität des
Transaktivators bestimmt wird, Squelching-Effekte durch den exprimierten Transaktivator in
ES-Zellen auftraten (Kap.2.3.4).
Durch Verwendung schwächerer Promotoren, insbesondere in den hoch exprimierenden
autoregulierten TetOn- und PIPOff-Systemen, oder durch gezielten Einsatz endogener
Faktoren wie Doxycyclin (TetOn) bzw. Pristinamycin (PIPOff) besteht die Möglichkeit, die
Transaktivator-Expression soweit zu reduzieren, so dass keine toxischen Transaktivtor-
Konzentrationen in den Zellen erreicht werden. Dabei wird die Expression des
Transaktivators so eingestellt, dass einerseits Squelching minimiert wird, anderseit dabei eine
maximale Induktion erreicht werden kann (Kap.2.3.4). Die Transaktivatoren der untersuchten
Expressionssysteme enthalten minimale oder vollständige transkriptionsaktivierende
Domänen des viralen VP16-Proteins. Diese werden für das Squelching verantwortlich
gemacht. Daher ist es auch denkbar, durch Austausch der VP16-basierenden
Transaktivierungsdomänen in den Transaktivatoren gegen alternative transkriptionsaktivierende
Domänen die Toxizität der Transaktivatoren zu verringern. Dies wird im
Folgenden diskutiert.
3.3.1.1 Reduktion der autoregulierten Expression durch Modifikation des Promotors
Durch den Einsatz schwacher Promotoren besteht die Möglichkeit, die Transaktivator-
Expression zu reduzieren. Der auf einem minimalen CMV-Promotor basierende
Transaktivator-abhängige Promotor P hCMV*-1 (Gossen und Bujard, 1992) ist einer der stärksten
bekannten Promotoren. Expressionen, die mit diesem Promotor erreicht werden, übertreffen
Expressionen mit dem Wildtyp CMV-Promotor um das 35fache (Yin et al, 1996; Freundlieb
et al., 1999). Ein minimaler Thymidinkinase-Promotor führt dagegen zu einer um Faktor 10

3 Diskussion 65
reduzierten Basalexpression und um Faktor 100 verringerten Expression nach Induktion
(Gossen und Bujard, 1992), was in autoregulierten Systemen in einer niedrigeren
Transaktivator-Expression mit weniger Squelching resultiert (Strathdee et al., 1999). Auch die
Anzahl der Operator-Sequenzen im Transaktivator-abhängigen Promotor kann die Expression
beeinflussen. In der Arbeit von Fussenegger et al. (2000) wurde gezeigt, das ein bzw. zwei
statt drei Operatoren im Promotor P PIR (PIPOff-System) zu einer ca. 70%igen- bzw. 45%igen
Reduktion der Expression führen. Durch Insertionen von Nukleotiden zwischen Operator-
Sequenz und Minimal-Promotor kann ebenfalls die Expression beeinflusst werden. Von
Weber et al. (2002b) wurde die Auswirkung von Linker-Sequenzen mit 0 bis 10 bp Länge im
Promotor P PIR untersucht. Bei 8 bp wurden im Durschnitt die höchsten Expressionen erzielt,
während die Linker 10 bp und 6 bp zu einer Reduktion der Expression führten. Die niedrigste
Expression zeigte der Linker-freie Promotor mit einer 100fach geringeren Expression als der
Promotor mit 8 bp Linker.
Durch Modifikation des Promotors im autoregulierten Expressionssystem kann die
Expression des Transaktivators verringert werden, was zu niedrigeren und damit weniger
toxischen Transaktivator-Konzentrationen in den Zellen führt. Allerdings sinkt dadurch auch
die Expression des Transgens und des Selektionsgens. Daher muss experimentell untersucht
werden, inwieweit veränderte Promotoren die autoregulierte Expression beeinflussen, so dass
die Transaktivator-Expression nur minimales Squelching bewirkt bei gleichzeitig
ausreichender Expression des Selektionsmarkers. Es ist durchaus möglich, dass die Reduktion
der autoregulierten Expression zu einer niedrigen Expression des Selektionsgen führt, so daß
eine Positiv-Selektion von Zellen nach Integration der autoregulierten Kassette in das Genom
beeinträchtigt wird.
3.3.1.2 Verwendung weniger toxischer Transaktivatoren
Die verwendeten Transaktivatoren der verschiedenen autoregulierten Systeme enthalten
minimale bzw. vollständige VP16-Transaktivierungsdomänen. Wie bereits in Kap. 3.1.5
diskutiert wurde, kann bei hoher Expression der Transaktivatoren mit VP16-Domäne durch
Interaktion der transakriptionsaktivierenden Domäne von VP16 mit verschiedenen
Transkriptionsfaktoren die Konzentration dieser Faktoren in den Zellen reduziert werden
(Squelching), was zum Tod der Zellen führen kann. Dabei besteht ein Zusammenhang
zwischen der Aktivität des Transaktivators, die autoregulierte Expression zu induzieren, und
dem Auftreten von Squelching. Durch die weniger aktiven Transaktivatoren des TetOff- und
E.REXOff-System werden in ES-Zellen nur niedrigen Expressionen und daher weniger
toxische Transaktivator-Konzentrationen erzielt, was sich in geringem Squelching
widerspiegelt. Dagegen führen die aktiveren Transaktivatoren des TetOn- und PIPOff-
Systems zu hohen Expressionen, die einhergehen mit starken Squelching-Effekten. Dies
beeinträchtigte die Etablierung von autoregulierten ES-Zelllinien. Daher scheint es sinnvoll,
die transkriptionsaktivierende Domäne von VP16 in diesen Transaktivatoren durch alternative
Transaktivierungsdomänen, die weniger Squelching verursachen, zu ersetzen und auf ihre
Verwendbarkeit im autoregulierten System in ES-Zellen zu testen. Folgende
Transaktivierungsdomänen kommen dafür in Frage.

3 Diskussion 66
3.3.1.2.1 Die Transaktivierungsdomäne p65
Von Urlinger et al. (2000a) wurden verschiedene nicht-virale, humane Aktivierungsdomänen
an Tet-Repressor-Domänen, die auch Bestandteil des Transaktivators tTA (TetOff-System,
Gossen und Bujard, 1992) bzw. des Transaktivators rtTA-S2 (TetOn-System, Urlinger et al.,
2000b) sind, fusioniert und hinsichtlich ihres transkriptionsaktivierenden Potenzials
untersucht. Insbesondere die p65-Domäne aus NF-κB (Schmitz und Bäuerle, 1991) zeigte in
verschiedenen Zellen eine zu VP16 vergleichbare Aktivität. Die Expressions- und
Regulationsfaktoren der Transaktivatoren tTA-p65 (TetOff) und rtTA-S2-p65 (TetOn) waren
im Vergleich zu den VP16-Transaktivatoren tTA und rtTA-S2 als auch untereinander
ähnlich. In der Arbeit von Weber et al. (2002b) wurde die Fusion der p65-Domäne mit der
MphR(A)-Domäne des ET-Transaktivators (E.REXOff-System, Weber et al., 2000a) bzw. mit
der Pip-Domäne des Transaktivators PIT (PIPOff-System, Fussenegger et al., 2000)
untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Fusion MphR(A)-p65 in geringerem Ausmaß als der
Transaktivator ET mit VP16-Domäne in verschiedenen permanenten Zelllinien die
Transaktivator-abhängige Expression induzieren kann. Dagegen führte der PIT-Transaktivator
mit p65-Domäne in NIH3T3- und HT1080 zu höheren Expressionen als der ursprüngliche
Transaktivator PIT mit VP16-Domäne. In K562-Zellen ist das Expressionspotenzial von PIT
jedoch höher als das des Transaktivators mit p65-Domäne. Auffallend ist, dass die Induktion
bzw. Repression der Pip-p65 Fusion in den verschiedenen Zellen variiert. In NIH3T3-Zellen
führte Pristinamycin zu Induktion, in HT1080-Zellen zur Repression der Expression. In
K562-Zellen wurde kein Einfluss von Pristinamycin auf die Expression festgestellt. Anhand
der bisherigen Erkenntnisse scheinen daher Fusionen aus p65-Aktivierungsdomäne und Tet-
Repressor-Domäne (Tet-System) bzw. MphR(A)-Domäne (E.REX-System) potentielle
Transaktivatoren für autoregulierte Expressionssysteme darzustellen und sollten deshalb in
ES-Zellen getestet werden.
3.3.1.2.2 Die Transaktivierungsdomäne E2F4
In der Arbeit von Akagi et al. (2001) wurde die modifizierte Aktivierungsdomäne des
humanen Transkriptionsfaktors E2F4 an die Tet-Repressor-Domäne des Tetracyclinabhängigen,
reversen Transaktivators rtTA (Gossen et al., 1995) fusioniert. Das
Induktionspotenzial des Transaktivators wurde mit dem von rtTA in verschiedenen Zellen
verglichen. Dabei zeigte sich, dass der Transaktivator rtTA höhere transiente Expressionen
erlaubt als der Transaktivator mit E2F4-Domäne. Mit diesem konnten dagegen mehr stabil
exprimierende Zelllininen generiert werden. Die Fusionen von E2F4 mit MphR(A) bzw. Pip
(Weber et al., 2002b) waren ebenfalls weniger aktiv als die jeweiligen VP16-Varianten. Der
Transaktivator Pip-E2F4 zeigte in ähnlicher Weise wie die Fusion Pip-p65 eine von der
Zelllinie abhängige Varianz in der Pristinamycin-bedingten Induktion/Repression der
Expression. Da die Fusionen der Aktivierungsdomäne E2F4 mit der Tet-Repressor- als auch
MphR(A)-Domäne nur geringere Expressionen als die jeweiligen VP16-Varianten
ermöglichen (Akagi et al., 2001, Weber et al., 2002b), könnte es sein, dass mit einem
Transaktivator mit E2F4-Domäne keine Expressionssteigerung im autoregulierten
Expressionssystem in ES-Zellen erreicht werden kann. Trotzdem scheint es sinnvoll,
Transaktivatoren mit der Aktivierungsdomäne E2F4 in ES-Zellen zu testen, da nicht
sichergestellt ist, ob Transaktivatoren mit E2F4-Domäne weniger toxisch in ES-Zellen sind
als Transaktivatoren mit VP16-Domäne.

3 Diskussion 67
3.3.1.2.3 Beurteilung der Transaktivatoren mit p65- bzw. E2F4-
Transaktivierungsdomäne hinsichtlich ihres Einsatzes zur Etablierung
autoregulierter ES-Zelllinien
In den zitierten Publikationen wurden mögliche Squelching-Effekte der Transaktivatoren mit
p65- bzw. E2F4-Aktivierungsdomäne nicht beobachtet bzw. untersucht. Da jedoch die p65-
Domäne ähnliche Strukturen und Sequenzmotive wie die VP16-Domäne aufweist (Cress und
Triezenberg, 1991; Regier et al., 1993; Blair et al., 1994), besteht die Möglichkeit, dass diese
mit den selben Transkriptionsfaktoren wie die Aktivierungsdomäne von VP16 interagiert, was
transkriptionelles Squelching bewirken kann (Schmitz et al., 1994). Von der E2F4-Domäne
werden dagegen keine negativen Auswirkungen erwartet (Ginsberg et al., 1994; Akagi et al.,
2001), jedoch sind Transaktivatoren mit dieser Domäne wenig aktiv. Das Induktionspotenzial
von Transaktivatoren mit p65-Aktivierungsdomäne wurde bisher nur in den Zelllinien
NIH3T3-, HT1080-, CHOK1-, HeLa und in B- und T-Lymphozyten (Urlinger et al., 2000a;
Weber et al., 2002b), das des Transaktivators mit E2F4-Aktivierungsdomäne in NIH3T3-,
HT1080-, K562-, COS7-, SaOs2- und HeLa-Zellen (Akagi et al., 2001; Weber et al., 2002b),
jedoch nicht in embryonalen Stammzellen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde
gezeigt, dass die verschiedenen autoregulierten Expressionssysteme in differenzierten Zellen
eine vielfach höhere Expression als in ES-Zellen ermöglichen. Dies wurde mit einer höheren
Toleranz der differenzierten Zellen gegenüber toxischen Transaktivator-Konzentrationen und
einem höheren Induktionspotenzial der Transaktivatoren in differenzierten Zellen begründet
(Kap. 3.1.5). Urlinger et al. (2000a) zeigte, das die Expressionen der p65-Transaktivatoren in
differenzierten Zellen ähnlich aktiv waren wie die VP16-Varianten. Deshalb ist zu vermuten,
dass die p65-Transaktivatoren auch in ES-Zellen ein ähnlichens Induktionspotenzial wie die
VP16-Transaktivatoren besitzen. Die Expressionshöhe würde dann durch das Squelching-
Potenzial der Transaktivatoren definiert. Ist die p65-Domäne weniger toxisch als die VP16-
Domäne, könnte dies zu einer verstärkten Expression führen, was sich in einer höheren Zahl
selektierbarer ES-Zellklone widerspiegeln könnte.
3.3.2 Optimierung der Kassettenaustauschstrategie
3.3.2.1 Positiv-Selektion statt Negativ-Selektion beim Kassettenaustausch
Da ein Kassettenaustausch vielfach effizienter mit einem Positiv-Selektionsmarker als mit
einem Negativ-Selektionsmarker selektiert werden kann, wäre es sinnvoll, die
Austauschstrategie von Verhoeyen et al. (1998, 2001) auf die in dieser Arbeit verwendeten
Strategie zu adaptieren. In Abbildung 39 ist eine mögliche Austauschstrategie, basierend auf
Positiv-Selektion durch Komplementierung eines ATG-defizienten neo-Gens (∆neo)
dargestellt.
Die Generierung parentaler Zellklone mit integrierter, autoregulierter Kassette erfolgt mittels
eines autoregulierten Konstruktes, welches den Selektionsmarker Hygromycin-B-
Phosphotransferase exprimiert (Positiv-Selektion). Für den Kassettenaustausch können
Austauschplasmide eingesetzt werden, die auf dem in dieser Arbeit konstruierten Vektor
beruhen (Kap.2.4). Austauschklone werden mit G418 selektiert (Positiv-Selektion). Wird wie
in der Arbeit von Verhoeyen et al. (1998) eine parentale Kassette mit HygTk-Gen zur
Selektion parentaler Zellklone eingesetzt, wäre es auch möglich, aufgrund der
Thymidinkinase-Aktivität von HygTk die Positiv-Selektion mit einer Negativ-Selektion unter
Verwendung von Gancyclovir zu kombinieren. Allerdings wurde gezeigt, dass bereits die
Positiv-Selektion allein ausreicht, um eine hohe Austauscheffizienz zu erreichen (Verhoeyen

3 Diskussion 68
et al., 1998). Durch eine zusätzliche Negativ-Selektion konnte die Austauschrate nicht weiter
gesteigert werden.
Statt Hyg bzw. HygTk könnte auch das Puromycin-Resistenzgen bzw. die Fusion aus
Puromycinacetyltransferase und Thymidinkinase PACTK bzw. Pu∆Tk als Positiv- bzw.
Positiv-/Negativ-Selektionsmarkers (Karreman, 1998; Chen und Bradley, 2000) zur Selektion
von parentalen Zellklonen eingesetzt werden.
Genlocus mit autoregulierter Expressionskassette
F
P bi
5‘ pA Luciferase TA IRES Hyg
+ Flp-Rekombinase
F5 loxP loxP
pA ∆neo pA 3‘
• Hygromycin-Resistenz
• keine G418-Resistenz
→ Positiv-Selektion
Austauschkonstrukt
F
P bi
F5
Gen X
TA
IRES
ATG
Genlocus nach Kassettenaustausch
F
P bi
F5 loxP loxP
5‘ pA Gen X
TA IRES ∆neo pA 3‘
ATG
• keine Hygromycin-Resistenz
• G418-Resistenz
→ Positiv-Selektion
Abb. 39 Alternativer Kassettenaustausch mit Positiv- Selektion
Die autoregulierte Kassette enthält den Positiv-Selektionsmarker Hyg (Hygromycin-B-Phosphotransferase) und ein ein ATG-freies neo-Gen.
Es können Hygromycin-resistente Zellen selektiert werden (Positiv-Selektion). Durch den Kassettenaustausch wird das Hyg-Gen durch ein
Startcodon im markierten Genlocus ersetzt, so dass die Austauschzellen durch G418-Selektion selektiert werden können (Positiv- Selektion).
Eine ähnliche Strategie, „Plug-and-Socket“-Strategie genannt, wurde von Detloff et al. (1994)
zur Markierung bekannter Genorte und zur nachfolgenden Integration eines Transgens in
diese Loci entwickelt. Statt den Genort mit einem ATG-defizienten Positiv-Selektionsmarker
zu versehen, wurde ein 5’-verkürztes HPRT-Minigen (Hypoxanthinphosphoribosyltransferase)
∆HPRT integriert. Nach Selektion von parentalen Klonen, die das Selektionsgen
neo exprimierten (Positiv-Selektion), wurde ein Austauschkonstrukt, welches den HPRT-
Promotor und den 5’-Bereich des HPRT-Minigens (Exon 1) HPRT∆ trägt, in den markierten
Genlocus mittels homologer Rekombination integriert, was zur Komplementierung des
Selektionsgens HPRT führte. Austauschklone wurden mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-
Thymidin) selektiert (Positiv-Selektion).
Wie in Kapitel 3.2.6 beschrieben wird, kann das neo-Gen, wie in der Arbeit von Verhoeyen et
al. (1998) als Positiv-Selektionsmarkers des Kassettenaustausches verwendet, die Expression
benachbarter Gene negativ beeinflussen (Artelt et al., 1991). Deshalb empfiehlt es sich,
alternative Positiv-Selektionsmarker wie HPRT oder Puromycinacetyltransferase einzusetzen.
Es ist auch möglich, dass neo-Gen durch loxP-Sites zu flankieren, so dass dieses durch Cre-
Rekombinase exzisiert werden kann. Dieser Schritt bedeutet jedoch eine weitere Modifikation
der transgenen Zellen, was zeitaufwendig ist und bei transgenen ES-Zellen die
Keimbahngängigkeit dieser Zellen beeinträchtigen könnte.

3 Diskussion 69
3.3.2.2 Alternative Negativ-Selektion des Kassettenaustausches
Der Selektionsmarker HPRT kann nicht nur zur Positiv- sondern auch zur Negativ-Selektion
verwendet werden. Mittels HAT können Zellen selektiert werden, die eine HPRT-Expression
aufweisen, dagegen führt 6-TG (6-Thioguanin) zum Tod dieser Zellen (Melton et al., 1984;
Reid et al., 1990; Valancius und Smithies, 1991). Eine Bedingung für die Verwendung von
HPRT als Positiv-Selektionsmarker bei der Generierung trangener Zelllinien und als Negativ-
Selektionsmarker beim Kassettenaustausch ist, dass die parentalen Zellen HPRT-defizient
sind. In den ES-Zelllinien E14TG2a (Hooper et al., 1987), HM-1 (Magin et al., 1992) und
E14.1TG3B1 (Tsuda et al., 1997) liegt das „house-keeping-gene“ HPRT partiell deletiert vor
und wird daher nicht exprimiert. In verschiedenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mit
dem Positiv-/Negativ-Selektionsmarker HPRT stabile, HAT-resistente ES-Zelllinien generiert
werden können, die eine hohe Sensitivität gegenüber 6-TG besitzen und zur Generierung von
transgenen Mäusen geeignet sind (Stacey et al., 1994; Melton et al.,1997). Deshalb sollte es
möglich sein, die Markierung von Genorten in ES-Zellen als auch einen Austausch der
integrierten Kassetten mit HPRT zu selektieren. Das bedeutet, dass an die Position des Tkneo-
Gens im autoregulierten Expressionsvektor das HPRT-Minigen gesetzt wird (Abb.40). Die
Integration des Konstruktes in das Genom HPRT-defizienter ES-Zellen nach Elektroporation
wird mittels HAT selektiert. Basierend auf dem bisherigen Austauschkonstrukt (Kap.2.4)
kann eine Selektionsmarker-freie Expressionskassette für den Kassettenaustausch verwendet
werden. Austauschklone werden durch den Verlust des HPRT-Gens mittels 6-TG selektiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass bei Verwendung von Thymidinkinase als
Negativ-Selektionsmarker des Kassettenaustausches eine Vielzahl falsch-positiver Klone, die
gegen Gancyclovir spontan resistent waren, selektiert wurde. Dies wurde mit einer
positionsabhängigen Inaktivierung des Tk-Gens erklärt (Askew et al., 1993; Wu et al., 1994).
In der Arbeit von Melton et al. (1997) wurde die Stabilität der Expression des HPRT-Gens in
verschiedenen Loci in ES-Zellen untersucht. Die Frequenz der Spontanresistenz gegenüber 6-
TG variierte in Abhängigkeit vom Genort bzw. von der Expressionshöhe (Positionseffekt)
und lag in fünf von sechs untersuchten Loci zwischen

3 Diskussion 70
Statt eines HPRT-Minigens kann auch der Positiv-/Negativ-Selektionsmarker GPT
(Guaninphosphoribosyltransferase) verwendet werden. Für die Positiv-Selektion wird MPA/X
(Mycophenolsäure/Xanthin), für die Negativ-Selektion 6-TG eingesetzt. Dabei ist es
wiederum notwendig, dass die Ausgangszelllinie HPRT-defizient ist. In der Arbeit von
Sullivan et al. (2001) wurden mit einem GPT-exprimierenden Konstrukt Genorte in HPRTdefizienten
HT1080-Zellen markiert. Die Kultivierung der Zellen mit 6-TG führte zu ca. 4%
spontan resistenten Klonen. Die Frequenz der Spontanresistenz ist damit niedriger als die
Spontanresistenzrate bei Verwendung von Thyimidinkinase als Negativ-Selektionsmarker.
Deshalb könnte zur Selektion des Kassettenaustausches auch der Marker GPT Verwendung
finden.
3.3.2.3 Thymidinkinase-Expression in männlichen Mäusen führt zur Infertilität
In einigen Publikationen wurde gezeigt, dass bei männlichen Mäuse, die ein Thymidinkinase-
Gen (Tk) aus dem Herpes Simplex Virus tragen, Infertilität auftreten kann (Al-Shawi et al.,
1988, 1991; Braun et al., 1990; Ellison et al., 1995, 2000). Begründet wurde dies mit einer
ektopischen Expression von Tk im Hoden dieser Mäuse, die zur Unterbrechung der
Spermatogenese führt. Das Ausmaß der Unfruchtbarkeit ist dabei von der Höhe der
testikularen Thymidinkinase-Expression abhängig (Al-Shawi et al., 1991). Während höhere
Expressionen die Spermatogenese in frühen Stadien unterbrechen, beeinträchtigen niedrigere
Expressionen die Spermatogenese nur in geringem Umfang, so dass die männlichen Mäuse
fertil bleiben. Jedoch zeigten auch die Spermien dieser Tiere entweder eine veränderte
Motilität (Al-Shawi et al., 1991) oder eine veränderte Morphologie (Hüttner et al., 1993). Die
weiblichen transgenen Mäuse exprimierten dagegen Thymidinkinase nicht ektopisch und
blieben deshalb fertil.
Es ist angedacht, aus autoregulierten ES-Zelllinien transgene Mäuse zu etablieren. Da die
bisher eingesetzten Konstrukte im induzierten Zustand in ES-Zellen und letztlich in Mäusen
zur Expression von Thymidinkinase führen, wäre es sinnvoll, dass die Generierung transgener
Mauslinien unter reprimierenden Bedingungen stattfindet. So kann durch Doxycyclin im
Trinkwasser die Expressionen von TetOff-Systemen in transgenen Mäusen endogen
reprimiert werden (Fedorov et al., 2001a). Weiterhin können auch ES-Zellen nach
Kassettenaustausch für die Generierung transgener Mäuse eingesetzt werden, da diese keine
Thymidinkinase exprimieren. Dies erlaubt gleichzeitig die Überprüfung, ob die ES-Zellen
nach Kassettenaustausch noch keimbahnfähig sind.
3.4 Ausblick
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expressionspotenziale
autoregulierter Expressionssysteme in differenzierten Zellen und embryonalen Stammzellen
unterschiedlich sind. In transienten Expressionsstudien wurde festgestellt, dass in NIH3T3-
Zellen vielfach höhere Expressionen mit den verschiedenen, autoregulierten Systemen
erreicht werden können als in ES-Zellen (Kap.2.2 und 2.3). Auch nach in vitro
Differenzierung von ES-Zellen mit einer TetOff-Expressionskassette im ROSA26-Locus
wurden vielfach höhere Expressionen des Reportergens gemessen (Kap.2.2.5.2). Dies
begründet die Erwartung, dass in Mäusen, die aus transgenen ES-Zellen mit autoregulierter
Expressionskassette generiert werden, eine regulierbare Reportergen-Expression zu
beobachten sein wird. Daher wird beabsichtigt, die im Rahmen dieser Arbeit etablierte ES-
Zelllinie mit integrierter TetOff-Kassette im ROSA26-Locus zur Etablierung von transgenen
Mäusen einzusetzen. Die Expression in der Maus kann durch Doxycylin im Trinkwasser

3 Diskussion 71
(Fedorov et al., 2001a) reguliert werden. Die Bestimmung der Transgen-Expression soll nach
Isolation einzelner Organproben z.B. durch Messung einer Reporter-Aktivität, durch RT-PCR
bzw. Northern-Analyse erfolgen. Wird eine ES-Zelllinie mit autoregulierter Luciferase-
Expression für die Etablierung transgener Mäuse eingesetzt, kann die Expression von
Luciferase im lebenden Organismus mittels hochempfindlicher CCD-Kameras, die nach
Injektion des Luciferins in die Maus die Umsetzung dieses Substrates durch die Luciferase,
begleitet durch eine Emission von Photonen, detektieren können (Thompson et al., 1995;
Honigman et al., 2001; Bhaumik und Gambhir, 2002), beobachtet werden.
Nach der Charakterisierung der autoregulierten Expression in einer transgenen Maus ist
angedacht, die Expressionskassette der parentalen, transgenen ES-Zelllinie gegen eine
autoregulierte Kassette zu ersetzen, die ein anderes als das ursprüngliche Transgen exprimiert.
Aus den Zellen eines Austauschklons soll wiederum eine transgene Mauslinie etabliert
werden. Es wird erwartet, dass diese Mäuse das gleiche Expressionsprofil aufweisen wie die
zuvor generierte transgene Maus. Trifft dies zu, sollte es möglich sein, jedes beliebige Gen in
der Maus vorhersagbar reguliert zu exprimieren. Dies setzt lediglich die Integration einer
autoregulierten Austauschkassette mit beliebigem Transgen in den markierten Genlocus der
charakterisierten ES-Zelllinie voraus. Dadurch können in wenigen Schritten transgene Mäuse
mit gewünschtem Expressionsprofil generiert und die Auswirkungen des Transgens auf den
Organismus untersucht werden.

4 Material und Methoden 72
4 Material und Methoden
4.1 Geräte
Tischzentrifugen
Kühlzentrifugen
Eppendorf 5417C
Heraeus Biofuge 13
Heraeus Christ Minifuge GL
Hettich Rontana/S
Sorval Superspeed RC5
Minifuge Heraeus-Christ
Biofuge fresco
Festwinkelrotoren: GSA, GS3, SS34
Schwingbecherrotor: HB4
Photometer Hitachi U-1100
Fluorometer Hoefer Dyna Quant 200
Fluoreszenz-Elisa-Reader Wallace Victor 2 1420 Multilabel counter
Labsystems Multiskan
Gelelektrophoresekammer BRL Horizon 58
BRL Horizon 1114
BRL Horizon 2025
Owl Separation System, Model: A2
Mikroskop
UV-Kammer
Leitz Labovert FS
Leica DMIL
Hanau
Phosphoimager Molecular Dynamics Storm 860
Videograph
Biotec Fischer Video Densitometer
Mitsubishi Thermodrucker und Personal Computer
Netzgeräte Desaga Mains Power Supply Unit 1200/200
Biorad Power Pac 300
Durchflusscytometer & Software
FACScan von Becton Dickinson
FACSCalibur von Becton Dickinson
Macintosh Quadra 650
Luminometer Berthold Lumat LB 9501
Zellzähler
Schärfe System Casy 1 DT
Zellkultur-Inkubatoren Forma Scientific Water-jacketed Incubator Modell 3336

4 Material und Methoden 73
Cleanbenches
pH-Meter
PCR-Maschine
Mecaplex, Sterilcard Hood VBM600 und SG400
Heraeus, HLB 2448
Heraeus, HSP 18
M 50, Beckmann
M 340, Beckmann
Biometra T3 Thermocycler
Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480
Thermomixer Eppendorf Thermomixer 5436
Vortex Scientific Industries Vortex Genie 2
Elektroporator
Biorad Gene Pulser und Pulse Controller
Hybridisierungsofen Robbins Scientific Hybridization Incubator Model 310
Stuart Scientific Hybridization Incubator
Laborschüttler
Wasseraufbereitung
Heidolph
Millipore Milli-Q
4.2 Material
Es wurden Chemikalien der Firmen Amersham, Bayer, Biolabs, Boehringer, Difco, Flow,
Fluka, Gibco, Hoechst, Invitek, Macherey-Nagel, Merck, Peqlab, Pharmacia, Promega,
Qiagen, Serva, Sigma, Stratagene und USB. Die Enzyme lieferten Amersham-Buchler, BRL,
Biolabs, Boehringer, Pharmacia, Roche Pharma und USB. Oligonukleotidsynthesen und
DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma MWG durchgeführt.
Das Plastik-Zellkulturmaterial für die eukaryontischen Zellen wurde von den Firmen Costar,
Gibco, Greiner, Nunc und Seromed bezogen.
Die Texte, Grafiken und Tabellen in dieser Arbeit wurden mit den Programmen Word,
Powerpoint und Excel der Firma Microsoft erstellt. Die Bearbeitung von Bilddateien erfolgte
mit dem Programm Photoshop 5.0 der Firma Adobe. Zur Auswertung von Autoradiographien
wurde das Programm Image Quant Version 5.0 von Molecular Dynamics benutzt. Zur
Entwicklung von Klonierungsschritten, zum Auffinden von PCR-Primern-Sequenzen und zur
Restriktionskartierung wurde das Programm Vector NTI 4.0 und 5.0 der Firma ATCC
verwendet. Zur Literaturrecherge dienten die Internet-Portale Medline
(www.ncbi.nlm.nih.gov) und Current Contents (isi1.newisiknowledge.com).

4 Material und Methoden 74
4.3 Allgemeine Grundtechniken
4.3.1 Sterilisieren durch Hitze
Glasgeräte werden 4 h bei 180°C im Trockenschrank sterilisiert. Jegliche Materialen aus
Plastik wie Eppendorffgefäße und Pipettenspitzen, Lösungen und Holzstäbe werden 25 min
bei 121°C autoklaviert. Andere Utensilien wie Pipetten, Filter, Säulen sind vom Hersteller
steril verpackt.
4.3.2 Sterilisieren durch Filtration
Lösungen, die nicht autoklaviert werden können, werden mit Filtern mit einer Porengröße von
2 µm (Sartorius) sterilisiert.
4.3.3 Phenolisieren von DNA
Phenol (Fa. Roth): redestilliertes, in TE-Puffer äquilibriertes Phenol (pH 7.8 bis 8.0),
0.1% (w/v) 8-Hydroxychinolin
TE-Puffer: 0.1 mM EDTA, 10mM Tris/HCl in H 2 O, pH 8.0
Zur Entfernung von Proteinen und zur Entsalzung einer wässrigen DNA-haltigen Lösung wird
diese mit Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (24:1) im gleichen Verhältnis
versetzt und auf dem Vortexer vorsichtig vermischt. Durch einminütige Zentrifugation bei
13.000 rpm werden wässrige und Phenol-haltige Phase getrennt. Die obere wässrige Phase
enthält die DNA und wird daher bis zur Interphase abgenommen. Die untere Phase wird mit
gleichem Volumen TE-Puffer versetzt, wieder gevortext und ein weiteres Mal für 1 min bei
13.000 rpm zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase der ersten
Extraktion vereint. Zur Entfernung von Phenolresten kann die wässrige Phase mit
Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung behandelt werden. Anschließend kann die DNA gefällt
werden.
4.3.4 Fällung von DNA
LiCl/Ethanol:
0.6 M LiCl in Ethanol (Lagerung bei -20°C)
Die DNA-haltige Lösung wird mit 2fachem Volumen LiCl/Ethanol-Lösung versetzt und für
mindestens 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die DNA durch 30 minütige
Zentrifugation bei 15.000 rpm und 4°C abgetrennt. Zur Entsalzung wird die DNA mit
70%igem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknung wird die DNA in TE-
Puffer aufgenommen.

4 Material und Methoden 75
4.4 DNA-Modifizierung
4.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Zur Spaltung von DNA wird diese mit einer Konzentration von maximal 1 µg/µl unter den,
vom Hersteller der Enzyme angegebenden Reaktionsbedingungen wie zu verwendender
Puffer, Reaktionstemperatur, Reaktionszeit mit dem Restriktionsenzym kultiviert. Die
Reaktion kann in den meisten Fällen durch 10 minütiges Erhitzen bei 65°C, Zugabe von 1:20
0.5 M EDTA zum Restriktionsansatz oder Phenolisierung abgestoppt werden.
4.4.2 Auffüllen von 5’-überstehenden Enden
10x Klenow-Puffer:
dNTP-Mix:
50 mM Tris/HCl in H 2 O, pH7.2, 10 mM MgSO 4 , 0.1 mM DTT
je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Es werden maximal 1 µg DNA mit 5’-überstehenden Enden mit 4 µl des dNTP-Mixes und
1-2 U Klenow-Enzym (Gesamtvolumen 30 µl) bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Reaktion
wird durch Phenolisierung gestoppt und die DNA durch Fällung isoliert.
4.4.3 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
10x Phosphatase-
Puffer:
Stopp-Lösung:
500 mM Tris/HCl, pH9.0, 10 mM MgCl 2 , 1 mM ZnCl 2 ,
1 mM Spermidin
125 mM EDTA, 1% SDS
Zur Verhinderung der Religation eines gespaltenen Vektors werden die 5- oder 3’-
überstehenden Enden mit alkalischer Phosphatase („calf intestine phosphatase“:CIP)
dephosphoryliert. Dazu werden 20-100 pmol überstehende Enden mit 10x Phosphatase-Puffer
und 1-2 U alkalischer Phosphatase (Gesamtvolumen 50 µl) bei 37°C für 15 min und
anschließend bei 56°C für weitere 15 min inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 µl
Stopp-Lösung und durch Inkubation bei 65°C für 10 min abgebrochen. Die DNA wird durch
Phenolisierung gereinigt und durch Fällung isoliert.
4.4.4 Oligohybridisierung
Kurze Nukleotidfragmente mit bekannter Sequenz, die in Vektoren eingefügt werden sollen,
können durch Oligohybridisierung geschaffen werden. Dazu werden jeweils 5 µg
komplementäre Nukleotidstränge mit maximal 150 bp in deionisiertem H 2 O (Gesamtvolumen
25 µl) bei 80-90°C für 5 min inkubiert. Der Ansatz wird langsam auf RT abgekühlt und kann
direkt in einer Ligation eingesetzt werden.

4 Material und Methoden 76
4.4.5 Ligation von DNA-Fragmenten
5x Ligase-Puffer:
250 mM Tris/HCl, pH7.6, 50 mM MgCl 2 , 25% (w/v) PEG8000,
5 mM ATP, 5 mM DTT
In einem 10 µl Ansatz mit 2 µl 5x Ligase-Puffer 2 U T4-DNA-Ligase werden ca. 20 fmol
eines zuvor gegebenenfalls dephosphorylierten Vektors und ca. 60 fmol eines zu
inserierenden DNA-Fragmentes bei RT für mindestens 4 h oder bei 4°C über Nacht inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 µl 0.5 M EDTA abgestoppt. Überstehende,
komplementäre DNA-Enden werden schnell und vollständig verknüpft. Glatte DNA-Enden
(blunt) erfordern höhere Enzymkonzentrationen.
4.4.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
(Saiki et al., 1988)
Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Verfahren zur Vermehrung bestimmter DNA-
Sequenzen. Dabei wird der natürliche Replikationszyklus der Zelle nachgeahmt. Die Zahl der
DNA-Moleküle verdoppelt sich bei jedem Zyklus, so dass eine DNA-Sequenz bis zu 10 9 -fach
vermehrt wird (exponentieller Anstieg).
Für dieses Verfahren muss die zu amplifizierende Sequenz bekannt sein, so dass geeignete,
sogenannte Oligonukleotid-Primer hergestellt werden können. Der Amplifikationsprozess
besteht aus drei, sich wiederholenden Stufen. Zunächst wird die doppelsträngige DNA bei
hoher Temperatur (94-96°C) in zwei Einzelstränge zerlegt (Denaturierung). Anschließend
binden bei niedriger Temperatur die Oligonukleotid-Primer an komplementäre Sequenzen an
3’-Grenzen der jeweiligender DNA-Einzelstränge (Annealing). Durch eine DNA-Polymerase
werden die Primer verlängert (Primer-Extension). Danach kann der Zyklus von neuem
beginnen. Da der erste Schritt der PCR eine hohe Temperatur erfordert, können nur
thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden. In den meisten Fällen wird daher die
sogenannte Taq-Polymerase aus Thermophilus aquaticus verwendet, die bei höheren
Temperaturen (ca. 70°C) aktiv ist. Oft werden zusätzliche Polymerasen mit sogenannter
„proof reading“-Aktivität in der PCR eingesetzt. Diese verhindern Fehler bei der
Extensionsreaktion, indem sie durch die Taq-Polymerase eingebaute Fehler in den
synthetisierten Sequenzen korregieren. Die Fehlerquote wird dadurch auf 1/10 verringert.
Dies erlaubt die Amplifikation von Sequenzen mit einer Länge von bis zu 15 kbp.
Expand TM Long Template PCR (Roche Pharma)
10x PCR-Puffer: 13-22.5 mM MgCl 2 , 500 mM Tris/HCl, pH9.2, 160 mM (NH 4 ) 2 SO 4
Polymerase-Mix:
10x dNTP-Mix
Taq-Polymerase,
Pwo-Polymerase aus Pyrococcus woesei (Korrekturenzym)
jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Es werden 4.5 µl des 10x PCR-Puffers mit 4 µl 10x dNTP-Mix, 5 µl Primer A (10 pmol/µl), 5
µl Primer B (10 pmol/µl) und 5 µl DNA-Templat (100 pg Plasmid oder 100 ng HMW-DNA)
in einem Gesamtvolumen von 45 µl in einem sterilen PCR-Reaktionsgefäß vermischt. Der
Ansatz wird in eine PCR-Maschine auf 95°C für 4-6 min erhitzt. Dann wird der Ansatz bei
68°C für 10 min inkubiert. In dieser Zeit erfolgt die Zugabe der Polymerasen (0.7 µl
Polymerase-Mix, 0.5 µl 10x PCR-Puffer, 3.8 µl H 2 O). Anschließend beginnt die eigentliche

4 Material und Methoden 77
PCR in den beschriebenen drei Stufen, hier als Beispiel: Denaturierung bei 95°C für 30-60
sec, Annealing der Primer bei 40-60°C für 60 sec, Extension bei 68°C. Die Dauer des
letzteren Schrittes hängt von der Länge der zu amplifizierenden Sequenz ab (ca. 1000 bp pro
60 sec). Die Annealing-Zeit wird durch die Primer-Länge (15-30 bp) und den GC-Gehalt
(Optimum bei ca. 50%) bestimmt. Der Zyklus wird 25- bis 35-mal wiederholt. In den meisten
Fällen wird anschließend ein einzelner Elongationsschritt bei 68°C für 7-10 min durchgeführt.
4.4.7 Agarose-Gelelektrophorese
TAE-Puffer:
5x Probenpuffer:
40 mM Tris/Acetat, pH7.5, 20 mM NaOAc, 1 mM EDTA
15% Ficoll, 50 mM EDTA, 1x TAE, 0.05% Bromphenolblau,
0.05% Xylencyanol
Zur Anfertigung eines 1%igen Gels wird 1 g Agarose in 100 ml kochendem TAE-Puffer
gelöst. Die flüssige Agarose wird mit 1 µl Ethidiumbromid-Lösung (5 mg/ml) versetzt und in
eine Gelkammer mit Kämmen zur Formung von Geltaschen gegossen. Nach dem Abkühlen
und gleichzeitigem Erstarren der Agarose wird die Gelkammer in eine mit TAE-Puffer
gefüllte Elektrophorese-Kammer gesetzt. Vor dem Auftragen der Proben werden diese mit 1/5
Volumen des 5x Probenpuffer vermischt und bei 65°C für 10 min inkubiert. Zur Abschätzung
der Größe von DNA-Fragmenten wird neben den Proben ein Größenmarker aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgt bei ca. 100 V und 30 mA. Anschließend können die aufgetrennten
DNA-Fragmente unter UV-Licht (360 nm) betrachtet werden. Zur präparativen Gewinnung
von DNA-Fragmenten werden diese aus dem Gel geschnitten und unter Zuhilfenahme des
„QIAquick“-Kits isoliert.
4.4.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen (QIAquick-Kit, Quiagen)
Die zu isolierende DNA wird aus dem Agarose-Gel geschnitten. Das Gelstück wird unter
Hochsalzbedingungen bei 50°C für 10 min geschmolzen. Die Lösung wird auf eine Silica-
Membran gegeben und bei 13.000 rpm für 1 min abzentrifugiert. Dabei bindet die DNA an
die Säulenmatrix, während die Agarose-Salz-Lösung sedimentiert. Nach Waschen der Säule
mit einem Ethanol-haltigem Puffer kann die DNA mittels TE-Puffer oder H 2 O durch
Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min eluiert werden.
4.5 Radioaktive Detektionsmethoden
4.5.1 Random priming mit „Rediprime DNA Labelling System” (Amersham Life
Science)
Labelling-Mix:
dATP, dGTP, dTTP, exonukleasefreies Klenow-Enzym,
Oligonukleotidprimer (9mer)
Es werden 2.5-100 ng DNA (z.B. Probe für Southern Blot Analyse) in einem Gesamtvolumen
von 45 µl sterilem H 2 O aufgenommen und bei 95°C im Wasserbad für 5 min erhitzt. Die
Lösung wird in einem Eisbad abgekühlt und anschließend zum Labelling-Mix gegeben. Nach

4 Material und Methoden 78
Zugabe von 5 µl α- 32 P-dCTP wird der Ansatz bei 37°C für 10-30 min inkubiert. Die Reaktion
wird durch 2 µl 0.5 M EDTA abgestoppt. Die markierte DNA wird über Micro-Spin TM G50-
Säulen (Pharmacia Biotech) von nicht eingebauten Nukleotiden abgetrennt. Dazu wird der
Reaktionsansatz auf die Säule gegeben und bei 2800 rpm für 2 min zentrifugiert. Für den
Einsatz in Southern Blot Analysen wird die DNA durch Erhitzen bei 95°C im Wasserbad für
5 min und anschließender Abkühlung im Eisbad denaturiert.
4.5.2 Klenow-Markierung
10x dNTP-Mix
jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Zur Größenbestimmung von Fragmenten im Southern Blot wird eine mit 35 S-dATP markierte,
HindIII/EcoRI-verdaute λ-DNA eingesetzt. Dieser Größenmarker wird durch eine
Auffüllreaktion mit dem Klenow-Enzym hergestellt. Dazu werden ca. 1 µg λ-DNA in einem
Gesamtvolumen von 20 µl mit 2 µl 10x dNTP-Mix, 4 µl α- 35 S-dATP (>1000 Ci/mmol) und 2
U Klenow-Enzym versetzt. Nach Inkubation bei 37°C für 1 h wird die Reaktion mit 20 µl
Stop-Lösung (0.5 M EDTA) abgebrochen und die DNA über eine Sephadex G50-Säule
aufgereinigt.
4.5.3 Southern-Blot Analyse
4.5.3.1 Isolierung von hochmolekularer DNA (HMW-DNA) aus Säugerzellen
„Modified Bradleys“-
Lösung:
Natriumacetat-Lösung:
10 mM Tris/HCl, pH/.5, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5% SDS,
1 mg/ml Proteinase K
75 mM Natriumacetat in Ethanol
Die Zellen einer konfluent bewachsenen 9.1 cm 2 Kulturplatte werden mit PBS gewaschen und
in 0.5 ml „Modified Bradleys“-Lösung aufgenommen. Die Lösung wird in ein Eppendorf-
Gefäß überführt und bei 55°C über Nacht inkubiert. Anschließend wird die DNA der Zellen
durch Inkubation mit 1 ml Natriumacetat-Lösung für 2-3 h bei RT gefällt und durch
Zentrifugation bei 5000 rpm für 5 min pelletiert. Die DNA wird durch Zugabe von 0.5 ml
70%igem Ethanol für 30 min gewaschen und anschließend erneut bei 5000 rpm für 5 min
abzentrifugiert. Der Waschschritt wird wiederholt, bevor die DNA nach Trocknen bei RT für
10 min in 30 µl TE-Puffer aufgenommen werden kann. Die isolierte HMW-DNA kann direkt
in Southern-Blot Analysen oder für andere Untersuchungen (z.B. RT-PCR) eingesetzt
werden.
4.5.3.2 Enzymatischer Verdau der hochmolekularen DNA (HMW-DNA)
Es werden 8-10 µg der aufgereinigten HMW-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 2
µl 10x Restriktionspuffer, 0.5 µl RNase (10 µg/ml), 0.5 µl BSA (100x) und 20-40 U
Restriktionsenzym versetzt. Anschließend erfolgt die Inkubation des Reaktionsansatzen bei
entsprechender, vom Restriktionsenzym abhängiger Reaktionstemperatur über Nacht. Die
restriktierte DNA wird mit 8 µl 6x Probenpuffer versetzt und auf einem 0.8%igem Agarose-

4 Material und Methoden 79
Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Als Größenmarker wird eine
HindIII/EcoRI-verdaute λ-DNA eingesetzt.
35 S-markierte, mit
4.5.3.3 DNA-Transfer
Die elektrophoretisch aufgetrennte DNA wird auf eine positiv geladene Nylonmembran
(Hybond-XL oder -N + , Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Dazu wird das Agarose-
Gel zuerst in 0.4 M NaOH-Lösung neutralisiert. Für den Transfer langer DNA-Fragmente (>5
kb) empfiehlt sich eine vorherige Depurinierung mittels 0.25 M HCl für ca. 30 min, da die
DNA-Fragmente während des alkalischen Transfers in Teilfragmente zerfallen und somit aus
dem Gel austreten können. Das Gel wird mit der Oberseite auf exakt zugeschnittene, feuchte
Filterpapierstreifen (Whatman 3MM), dessen Ränder in 0.4 M NaOH eintauchen, gelegt. Die
Unterseite des Gels wird mit der Nylonmembran bedeckt. Auf diese werden zwei Lagen
weiteres, feuchtes Filterpapier, eine Lage trockenes Filterpapier und ein Stapel mit
saugfähigem Papier gelegt. Die Apparatur wird mit ca. 500 g Gewicht beschwert.
Nach ca. 6 h ist der DNA-Transfer vom Gel auf die Nylonmembran abgeschlossen. Die
Nylonmembran wird in 2x SSC neutralisiert und bei 80°C für 2 h inkubiert.
4.5.3.4 Hybridisierung der restriktierten HMW-DNA
Hybridisierungslösung:
Waschlösung A:
Waschlösung B:
1 M NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH7.5, 10% Dextransulfat, 1% SDS, 250
µg/ml Salmon Sperm DNA (sonifiziert) (Lagerung bei -20°C)
2x SSC, 0.5% SDS
1x SSC, 0.1% SDS
Es werden 20 ml der Hybridisierungslösung bei 65°C im Wasserbad aufgetaut, bei 95°C im
Wasserbad für 10 min erhitzt und wieder auf 65°C abgekühlt. Die Lösung wird in eine
Glasröhre für den Hybridisierungsofen überführt. Außerdem wird die Nylonmembran mit
restriktierter HMW-DNA mit der DNA-freien Seite an die Innenwand der Glasröhre gelegt.
Dann wird eine denaturierte, radioaktiv-markierte Probe in die Glasröhre gegeben. Die
Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 65°C im Hybridisierungsofen.
Anschließend wird die Nylonmembran bei RT für 5 min, bei 65°C für 30 min und bei 65°C
für 5 min mit Waschlösung A gewaschen. Bei hoher Strahlung der Membran empfiehlt sich
ein Waschschritt bei 65°C für 30 min mit Waschlösung B. Die Membran wird dann feucht in
Folie verpackt und in eine Expositionskassette (Phosphoimager) gelegt.
4.5.3.5 Rehybridisierung der restriktierten HMW-DNA
Die Nylonmenbran wird mit kochendem 0.5%igem SDS für ca. 30 min bis Erreichen von RT
gewaschen. Dabei wird die an DNA-Fragmenten auf der Membran gebundene radioaktivmarkierte
Probe abgelöst. Die Vollständigkeit dieses Prozesses wird durch Exposition
sichergestellt. Anschließend kann die Nylonmembran für eine weitere Hybridisierung
verwendet werden.

4 Material und Methoden 80
4.6 Arbeiten mit E.coli
4.6.1 Verwendete Bakterienstämme
XL1-Blue:
DH10B:
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,
lac [F´ proAB, lacI q Z)M15, Tn10, (tet r )], (Bullock, 1987)
F’, mcrA )-(mrr hsdRMS-mcrBC), N80dlacZ)M15, )lacX74, deoR,
recA1, ara)139, )(ara, leu)7697, galU, galK, λ - , rpsL, end A1, nupG
(Gibco BRL)
4.6.2 Medien
LB-Medium:
Ampicillin:
Kanamycin:
SOG-Medium:
10 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl
50 mg/ml Ampicillin in Ethanol, sterilfiltriert
100 mg/ml Kanamycin in H 2 O, sterilfiltriert
20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl,
2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM Glucose
(MgSO 4 und Glucose werden vor Gebrauch zugesetzt)
4.6.3 Herstellung von Agarplatten
Es werden 15 g Agar (Difco) zu 1 l LB-Medium gegeben und aufgekocht. Nach Abkühlen der
Agar-Lösung werden für Ampicillin-haltige Agarplatten 1 ml Ampicillin-Lösung (50 mg/ml),
für Kanamycin-haltige Platten 0.5 ml Kanamycin-Lösung (100 mg/ml) zur Agar-Lösung
gegeben und diese auf Bakterienplatten verteilt.
4.6.4 Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Die Bakterien werden in 5 bis 10 ml LB-Medium unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C über
Nacht vorkultiviert. Am nächsten Tag wird die Bakterienkultur zu 1 l LB-Medium gegeben
und abermals unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C kultiviert. Zwischenzeitlich wird von der
Bakteriensuspension der O.D.-Wert bei 600 nm im Photometer bestimmt. Wird ein O.D.-Wert
von ca. 0.6 bis 0.8 erreicht, hat die exponentielle Wachstumsphase ihr Ende erreicht. Die
Inkubation wird beendet, indem die Bakteriensuspension in vorgekühlten Zentrifugenbecher
gegeben und die Bakterien durch 10 minütige Zentrifugation bei 3000 rpm (GS3-Rotor) und
4°C als Pellet abgetrennt werden. Nach Resuspension in kaltem, sterilem Wasser und
wiederholter Zentrifugation werden die Bakterien in 20 ml kalter, 10%iger Glycerin-Lösung
aufgenommen und 15 min bei 3500 rpm (SS34-Rotor) und 4°C zentrifugiert. Die Bakterien
werden anschließend in 2 bis 3 ml kalter, 10%iger Glycerin-Lösung resuspendiert, in Aliquots
zu 50 µl in Eppendorf-Gefäße überführt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
-70°C gelagert. Anschließend kann die Kompetenz der Bakterien bestimmt werden. Dazu
wird eine definierte Menge eines Standard-Plasmides in die Bakterien transformiert

4 Material und Methoden 81
(Kap.4.6.5) und anhand der nach Ausplattierung auf Agarplatten erhaltenen Klonzahlen die
Transformationseffizienz berechnet, die bei 10 9 bis 10 10 Transformanten pro µg
transformierter DNA liegen sollte.
4.6.5 Elektrotransformation kompetenter Bakterien
Durch ein elektrisches Feld, welches kurzfristig durch Anlegen einer hohen Spannung
entsteht und dessen Feldstärke dann exponentiell abnimmt, kann die Membran der Zielzellen
depolarisiert werden, so dass Löcher in der Membran entstehen. Durch diese können die
einzuschleusenden DNAs, aber auch andere Makromoleküle in das Zellinnere gelangen.
Es werden 50 µl kompetente Bakterien aufgetaut, auf Eis gestellt und mit ca. 1 µl verdünnter
DNA-Lösung oder Ligationsansatz versetzt, vermischt und in eine vorgekühlte
Transformationsküvette mit 0.2 cm Elektrodenabstand gegeben. Diese wird in der Gene-
Pulser-Apparatur einem elektrischen Feld (2.5 kV, 25 µF, 200 Ω) ausgesetzt. Die Impulsdauer
sollte bei 4 bis 5 ms liegen. Sofort nach Transformation werden die Bakterien in 1 ml SOG-
Medium aufgenommen und 30 min unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C inkubiert.
Anschließend werden Aliquots der Bakterienkultur auf Agarplatten mit Selektionsmedium
ausplattiert und diese über Nacht bei 37°C bis zur Klonbildung kultiviert.
4.6.6 Konservierung von Bakterien
Zur kurzfristigen Lagerung werden Bakterien mit einer Impföse auf Agarplatten
ausgestrichen. Nach Inkubation der Platte bei 37°C über Nacht wird diese bei 4°C
aufbewahrt. Für eine langfristige Lagerung werden Bakterien über Nacht in LB-Medium unter
Schütteln (180 rpm) bei 37°C kultiviert. Die Bakteriensuspension wird im Verhältnis 1:1 mit
87%iger Glycerin-Lösung vermischt und in Glasgefäßen bei -20°C oder -70°C aufbewahrt.
4.6.7 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im analytischen Maßstab
STET-Puffer:
80 g/l Sucrose, 0.5% Triton X100, 50 mM EDTA,
10 mM Tris/HCl (pH 8.0) in H 2 O
TE-Puffer: 0.1 mM EDTA, 10mM Tris/HCl in H 2 O, pH 8.0
0.2
Lysozym: 10 mg/ml Lysozym in TE-Puffer
Ammoniumacetat: 8 M NH 4 Oac in H 2 O
TE-RNase:
10 µg/ml RNase A in TE-Puffer
Es werden 2 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum mit den zu untersuchenden
Bakterien angeimpft und diese für 4 bis 16 Stunden unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C
kultiviert. Die Bakterien werden in Eppendorfgefäßen 1 min bei 5000 rpm abzentrifugiert und
anschließend in 500 µl STET-Puffer resuspendiert und mit 50 µl Lysozym-Lösung versetzt.
Nach 2 bis 3 minütiger Inkubation bei RT werden die Bakterien 90 s in einen 95°C heißen
Thermoblock erhitzt und anschließend 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Das zähflüssige
Pellet wird mit Hilfe eines Zahnstochers entfernt. Die klare Lösung wird mit 50 µl

4 Material und Methoden 82
Ammoniumacetat-Lösung und 500 µl Isopropanol vermischt und erneut 5 min bei 14.000 rpm
zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird nach kurzem Trocken bei RT in 50 bis 100 µl TE-RNase-
Lösung aufgenommen.
4.6.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im präparativen Maßstab
(QUIAGEN)
Resuspensionspuffer:
Lysepuffer:
Neutralisierungspuffer:
50 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A
200 mM NaOH, 1% (w/v) SDS
3.0 M Kaliumacetat, pH5.5
Äquilibrierungspuffer: 750 mM NaCl, 50 mM MOPS pH 7.0,
15% (v/v) Isopropanol, 0.15% TritonX100
Waschpuffer:
Elutionspuffer:
1.0 M NaCl, 50 mM MOPS pH 7.0, 15% (v/v) Isopropanol
1.25 M NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.5, 15% (v/v) Isopropanol
Es werden 200 ml (Midi-Präparation) bzw. 500 ml (Maxi-Präparation) Antibiotika-haltiges
LB-Medium mit den Bakterien angeimpft und über Nacht unter Schütteln (180 rpm) bei 37°C
inkubiert. Am nächsten Tag werden die Bakterien 10 min bei 6.000 x g und 4°C zentrifugiert
und in 4 ml bzw. 10 ml Resuspensionspuffer aufgenommen. Die Bakteriensuspension wird
vorsichtig bei RT mit 4 ml bzw. 10 ml Lysepuffer versetzt. Die Lysierung der Bakterien wird
nach 5 min durch Zugabe von 4 ml bzw. 10 ml Neutralisierungspuffer abgebrochen Nach
weiteren 20 min Inkubation auf Eis werden die bakteriellen Bestandteile durch 30 minütige
Zentrifugation bei 20.000 x g und 4°C abgetrennt. Der Überstand mit Plasmid-DNA wird
über Filter auf eine mit 4 ml bzw. 10 ml Äquilibrierungspuffer vorbehandelte
Anionenaustauschersäule gegeben, die Plasmid-DNA bei bestimmter Salzkonzentration und
pH-Wert binden kann. Zur Entfernung von RNA, Proteinen und niedermolekularen
Verbindungen wird die Säule zweimal mit 10 ml bzw. 30 ml Waschpuffer gewaschen.
Anschließend wird die gebundene Plasmid-DNA mit 5 ml bzw. 10 ml Elutionspuffer eluiert
und in3.5 ml bzw. 10.5 ml Isopropanol gefällt. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 15.000 x
g und 4°C wird die DNA mit 70%igem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach
Trocknung wird die Plasmid-DNA in TE oder H 2 O aufgenommen.

4 Material und Methoden 83
4.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen
4.7.1 Verwendete Zelllinien
NIH3T3
D3
IB10
embryonale Mausfibroblasten-Zelllinie (ATCC CRL-1658)
murine embryonale Stammzelllinie
murine embryonale Stammzelllinie, Subklon der Linie E14
CCE murine embryonale Stammzelllinie (Robertson et al., 1986)
MEF
embryonale Mausfibroblasten (Feeder-Zellen), G418-resistent
4.7.2 Grundmedien
DMEM-Grundmedium
(Dulbecco’s Modification of Eagle’s
Medium)
PBS
(Phosphate buffered saline)
13.63 g/l DMEM-Pulver; 3.67 g/l (44mM) NaHCO 3 ;
2.6 g/l (10mM) HEPES; pH 7.2
8 g/l (140mM) NaCl; 0.2
TEP
100x Pen/Strep
100x Glutamin
100x Natriumpyruvat
Gelatine-Lösung
FCS
ESGRO (Lif)
G418
Erythromycin
Pristinamycin
Doxycyclin
6 mM EDTA, 0.1-0.2% Trypsin (Gibco) in PBS
6.06 mg/ml Ampicillin (10000 U/ml), 10 mg/ml Streptomycin
(10mg/ml), zum Lösen mit NaOH auf pH7.4 einstellen
(Lagerung bei –20°C)
29,23 mg/ml Glutamin (Lagerung bei –20°C)
100 mM Natriumpyruvat
0.1% (w/v) Gelatine in PBS oder H 2 O, autoklaviert
JRH Bioscience
10 6 U/ml (Chemicon International, Inc.)
100 mg/ml G418 in H 2 O, sterilfiltriert
10 µg/µl Erythromycin in Ethanol
1.5 µg/µl Pristinamycin in DMSO
1 mg/ml Doxycyclin in 70% Ethanol, sterilfiltiriert
(Lagerung bei –20°C)
1000x β-Mercapthoethanol 100 mM Mercapthoethanol (7.014 µl pro 1 ml H 2 O)

4 Material und Methoden 84
4.7.3 Kulturmedien
für NIH3T3-Zellen:
für ES-Zellen:
für Feeder-Zellen:
1x Pen/Strep, 1x Glutamin, 10% (v/v) FCS (aktiv)
DMEM-Grundmedium
1x Pen/Strep, 1x Glutamin
1x nichtessentielle Aminosäuren
1x Natriumpyruvat, 15% (v/v) FCS (inaktiv*)
1x β-Mercaapthoethanol
DMEM-Grundmedium
0.1% (v/v) ESGRO
1x Pen/Strep, 1x Glutamin
1x nichtessentielle Aminosäuren
1x Natriumpyruvat, 10% (v/v) FCS (inaktiv*)
1x β-Mercaapthoethanol
DMEM-Grundmedium
4.7.4 Gelatinierung von Zellkulturgefäßen
*Das FCS wird durch Inkubation bei 56°C für 30 min inaktiviert.
Für die Anheftung von ES-Zellen in Kulturgefäßen muss der Boden der Gefäße mit Gelatine
beschichtet sein. Dazu werden die Kulturgefäße mit 0.1%iger Gelatine-Lösung bedeckt und
für mindestens 30 min im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Vor der Aussaat der ES-Zellen
wird die überschüssige Gelatine-Lösung entfernt.
4.7.5 Präparation von Zellkulturgefäßen mit Feeder-Zellen
ES-Zellen der Linie D3 und IB10 werden auf Zellkulturgefäßen, die mit Feeder-Zellen
beschichtet sind, kultiviert. Dafür muss jedoch die Teilungsfähigkeit der Feeder-Zellen
aufgehoben werden. Dazu werden die Zellen in der Strahlenquelle (204.6 Gy/h) für 520 s, was
einer Strahlendosis von ca. 3000 rad entspricht, bestrahlt. Die bestrahlten Feeder werden in
flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Für die Anheftung von ES-Zellen in Kulturgefäßen wird
der Zellgefäßbodens mit Feederzellen beschichtet (ca. 2.5⋅10 4 Zellen/cm 2 ).
4.7.6 Zählung von Zellen
NIH3T3- und Feeder-Zellen können mit dem automatischen Zellzähler CASY1 gezählt
werden. ES-Zellen lassen sich aufgrund ihrer geringeren Größe nur mit einer Neubauer- bzw.
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer zählen.
4.7.7 Kultivierung von Zellen
Die Zellen werden in geeigneten Kulturgefäßen bei 37°C und 5% CO 2 in einem nassbegasten
Brutschrank in entsprechendem Medium kultiviert. Je nach Zelldichte wird nach 2 bis 5
Tagen das Medium gewechselt. Spätestens nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen
passagiert.

4 Material und Methoden 85
4.7.8 Passagieren von Zellen
Nach Waschen der Zellen mit PBS werden diese mit TEP überschichtet und für wenige
Minuten inkubiert. Dadurch lösen sich die Zellen vom Boden des Kulturgefäßes ab. Zur
Inaktivierung des Trypsins wird die Zellsuspension mit mindestens der doppelten Menge an
serumhaltigen Kulturmedium versetzt und resuspendiert. Die Zellsuspension kann in
gewünschter Konzentration in Aliquots auf andere Kulturgefäße überführt werden.
4.7.9 Langzeitlagerung von Zellen
Logarithmisch wachsende Zellen einer kleinen Flasche (ca. 3⋅10 6 Zellen) werden mit PBS
gewaschen, trypsiniert und in Medium aufgenommen. Die Zellen werden 5 min bei 1000 rpm
zentrifugiert und anschließend in 2 ml kaltem FCS mit 0.5% DMSO resuspendiert. Verteilt in
Aliquots auf Kryo-Röhrchen (Bio-Freeze-Vials, Fa. Costar) werden die Zellen für maximal 60
min auf Eis, danach für 24 h bei -70°C und anschließend dauerhaft in flüssigem Stickstoff
gelagert. Das Auftauen der Zellen erfolgt im 37°C-Wasserbad. Zur Entfernung des DMSO
werden die Zellen in Kulturmedium aufgenommen, für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und
anschließend wiederum in Kulturmedium resuspendiert. Danach können die Zellen auf
Kulturgefäße ausgesät werden.
4.7.10 Gentransfer-Methoden
Zum Einbringen von Fremd-DNA in eukaryontische Zellen mit dem Ziel einer stabilen
Integration eines Transgens in das Genom der Zellen, für einen Kassettenaustausch bzw. zur
zeitweiligen Expression eines Transgens können unterschiedlichen Transfektionssysteme
angewendet werden.
4.7.10.1 Transfektion mittels Calciumphosphat/DNA-Präzipitation
Einen Tag vor Transfektion wird eine definierte Anzahl zu transfizierender Zellen in
Kulturflaschen oder Mehrlochplatten ausgesät, abhängig von der Art des Experimentes und
des Zelltyps. Am nächsten Tag wird mindestens 4 h vor Transfektion das Kulturmedium
gewechselt. In einem PP-Röhrchen werden 2fach konzentrierter HEBS-Puffer und in einem
weiteren PP-Röhrchen in gleicher Volumenmenge zirkuläre oder linearisierte DNA (bei
geringen DNA-Mengen gegebenenfalls zusätzlich hochmolekulare, sogenannter Carrier-
DNA), CaCl 2 -Lösung und H 2 O vorgelegt. Letzteres Gemisch wird unter Vortexen zum
HEBS-Puffer getropft. Es kommt zu einer sichtbaren Bildung von Präzipitaten aus DNA und
Calciumphosphat. Nach 5 bis 15 min bei Raumtemperatur wird die Präzipitat-Suspension in
das Kulturmedium der Zellen überführt. Am nächsten Tag werden überschüssige Präzipitate
durch Wechsel des Mediums entfernt.
HEBS-Puffer: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4 in H 2 O, pH 7.1
CaCl 2 -Lösung:
2.5 M CaCl 2 in H 2 O

4 Material und Methoden 86
Zelllinie für: Aussaat von: auf: Transfektion
(Zellen) 2xHEBS CaCl 2 Σ
stabile Expression 1⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl
NIH3T3 transiente Expression 1⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl
Kassettenaustausch 6⋅10 5 10cm-Platte 906 µl 90.6 µl 1812 µl
D3
IB10
CCE
transiente Expression 5 - 7.5⋅10 5 6Loch 150 µl 15 µl 300 µl
4.7.10.2 Transfektion mittels Elektroporation
Das zu transfizierende Plasmid wird mit geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert und
aufgereinigt. Die zu transfizierenden Zellen werden mit PBS gewaschen, mit TEP gelöst und
in Medium aufgenommen. Nach Bestimmung der Zellkonzentration wird eine definierte
Anzahl von Zellen 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und dann in maximal 700 µl PBS oder
serumfreien Medium aufgenommen. Nach Zugabe der DNA wird die Zellsuspension in eine 4
mm Elektroporationsküvette überführt und in der Elektroporationskammer (Biorad Gene
Pulser) elektroporiert. Anschließend werden die elektroporierten Zellen unverzüglich mit
Kulturmedium versetzt und auf 10cm-Kulturplatten ausgesät. Nach 24 h erfolgt der erste
Mediumwechsel.
Zelllinie Zellzahl: DNA-Menge Spannung Kapazität
NIH3T3 1⋅10 6 10 µg 250V/cm 500 µF
D3
IB10
CCE
5⋅10 6 - 1⋅10 7 5 - 10 µg 240V/cm 475 µF
4.7.10.3 Stabile Expression – Selektion von G418-resistenten Zellklonen
Zwei Tage nach Transfektion/Elektroporation beginnt die Selektion von stabil transfizierte
Zellen durch Verwendung eines Selektionsmediums. Die nach Calciumphosphat-Methode
transfizierten Zellen werden gleichzeitig in Aliquots auf großflächigere Kulturgefäße
passagiert. Die Selektion mit G418 ist nach 7 bis 12 Tagen abgeschlossen, und es können
resistente Klone isoliert werden. Diese werden zuvor unter dem Mikroskop markiert. Dann
werden die Klone mit PBS gewaschen und mit wenig PBS überschichtet. Mittels einer 20µl-
Pipette werden die Zellen der Klone vorsichtig abgelöst und auf 96-Loch-Platten mit 20 µl
TEP pro Loch passagiert. Anschließend werden die trypsinierten Zellen in 100 µl Medium
resuspendiert und auf eine weitere 96-Loch-Platte überführt. Kurz vor dem Erreichen der
Konfluenz werden die Zellen auf nächstgößeren Mehrlochplatten ausgesät.
Selektionsmedien zur Selektion G418-resistenter Zellklone:
NIH3T3-Zellen:
D3-Zellen:
IB10-Zellen:
CCE-Zellen:
Kulturmedium für NIH3T3-Zellen mit 1000 µg/ml G418
Kulturmedium für ES-Zellen mit 300 µg/ml
Kulturmedium für ES-Zellen mit 350 µg/ml G418
Kulturmedium für ES-Zellen mit 350 µg/ml G418

4 Material und Methoden 87
In Abhängigkeit vom elektroporierten Vektor ist die Kultivierung der Zellen mit
Selektionsmedium, welches Doxycyclin (2 µg/ml) enthält, erforderlich.
4.7.10.4 Transiente Expression
Zwei Tage nach Transfektion werden die Zellen mit PBS gewaschen und in 1 ml PBS gelöst.
TEP wird nicht verwendet. Bei Bedarf wird die Zellzahl bestimmt. Die Zellsuspension wird
anschliesend 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet kann bei -20°C gelagert oder
direkt zur Untersuchung der Transgen-Expression weiterverarbeitet werden.
In Abhängigkeit vom transfizierten Vektor und der Art des Experimentes ist die Kultivierung
der Zellen mit Medium, welches Doxycyclin (2 µg/ml), Erythromycin (10 µg/ml) oder
Pristinamycin (6 µg/ml) enthält, erforderlich.
4.7.11 In vitro Differenzierung
Differenzierungsmedium: 1x Pen/Strep, 1x Glutamin
1x nichtessentielle Aminosäuren
20% (v/v) FCS (aktiv)
DMEM-Grundmedium
Es werden ES-Zellen auf gelatinierten Zellkulturgefäßen ausgesät und wenigstens einen Tag
vor dem Versuch in LIF-freiem Medium kultiviert. Es wird eine Zellkonzentration von 20000
Zellen pro ml Differenzierungsmedium eingestellt. Für die in vitro Differenzierung von ES-
Zellen nach der sogenannten Hanging-Drop Methode (Übersicht: Wobus et al., 2001) werden
im ersten Schritt jeweils 20 µl (ca. 400 Zellen) dieser Zellsuspension als hängender Tropfen
an den Deckel einer Bakterienplatte ausgesät. Die dadurch gebildeten Zellaggregate werden
dann auf Bakterienplatten, danach auf gelatinierte Mehrloch-Platten zur weiteren Entwicklung
ausgesät. In Abhängigkeit von Zeitpunkt und Dauer einer Retinsäure-Induktion können
unterschiedliche Differenzierungsrichtungen induziert werden.
4.8 Proteinanalytik
4.8.1 Aufschluss von Zellen
Zur Bestimmung der Expressionshöhe von Reportergenen wie Luciferase und β-
Galactosidase und zur Normierung der gemessenen Reporter-Aktivitäten auf die
Proteinmenge müssen die wasserlöslichen Proteine der Zellen isoliert werden. Die meistens
von einer 6-Loch-Platte stammenden und als Pellet vorliegenden Zellen werden in maximal
150 µl 250 mM Tris-Puffer pH7.6 resuspendiert. Anschließend werden die Zellen unter
mehrmaligem Wechsel zwischen 37°C-Wasserbad und flüssigem Stickstoff-Bad
aufgeschlossen („Freeze & Thaw Lyse“). Nach Zentrifugation für mindestens 10 min bei
15.000 rpm und 4°C kann der Protein-haltige Zelllysatüberstand vermessen werden.

4 Material und Methoden 88
4.8.2 Nachweis von β-Galactosidase
4.8.2.1 Färbung von Zellen
Fixierlösung:
2% Formaldeyhd, 0.1% Glutaraldehyd in PBS
Färbelösung: 5 mM K 3 Fe(CN) 6 , 5 mM K 4 FE(CN) 6 , 2 mM MgCl 2 ,
100 µg/ml X-Gal (einzelne Komponenten als 100fach Stocklösung
in PBS bzw. X-Gal in Dimethylformamid, Lagerung bei -20°C, für
die Anwendung mit PBS verdünnen)
Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und mit Fixierlösung für 2 min versetzt.
Nach erneutem Waschen der Zellen mit PBS werden diese für 10 min in PBS inkubiert.
Anschließend wird die Färbelösung auf die Zellen gegeben. Bereits nach 30 min Inkubation
im Brutschrank bei 37°C kann die β-Galactosidase-Expression in Form von blaugefärbten
Zellen unter dem Mikroskop beobachtet werden.
4.8.2.2 Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivtät
Die bakterielle β-Galactosidase kann das 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosid in Galactose
und das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon spalten. Letzteres emittiert bei einer
Anregungswellenlänge von 365 nm Licht der Wellenlänge von 450 nm. Die gemessene
Lichtmenge ist direkt proportional zur β-Galactosidase-Aktivität und gibt daher die Höhe der
β-Galactosidase-Expression in den Zellen wieder.
Substratpuffer: 60 mM Na 2 H 2 PO 4 , 40 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM HCl, 1 mM MgSO 4 ,
50 mM β-Mercapthoethanol
MUG-Puffer:
Reaktionspuffer:
4-Methylbelliferryl-β-D-Galactosid in Dimethylformamid
(Lagerung in Dimthylformamid bei -20°C)
1/50 MUG-Puffer in Substratpuffer
In einer 96-Loch Platte für optische Tests werden in den Löchern der ersten Reihe 180 µl
bzw. 190 µl für die Messung der Aktivität des β-Galactosidase-Standards, in den restlichen
Löchern jeweils 100 µl Substrat-Puffer vorgelegt. In die Löcher der ersten Reihe werden
weiterhin 10 µl eines β-Galactosidase-Standards bzw. 20 µl des Zellüberstandes gegeben.
Anschließend werden aus den Löchern der ersten Reihe 100 µl der Suspension entnommen
und in je ein Loch der zweiten Reihe überführt. Diese 1:2 Verdünnung wird bis zur letzten
Reihe fortgesetzt. Die sich nun in jedem Loch befindende 100 µl Protein-Verdünnung wird
mit je 100 µl Reaktionspuffer versetzt. Anschließend wird nach Anregung mit 365 nm die
Lichtemission bei 450 nm automatisch zum Zeitpunkt 0, 6 und 12 min gemessen (Wallace
Victor 2 ). Die β-Galactosidase-Aktivität der Zellextrakte lässt sich anhand der
β-Galactosidase-Standardreihe berechnen.

4 Material und Methoden 89
4.8.3 Bestimmung der Luciferase-Aktivität
Die Firefly-Luciferase aus Photinus pyralis (Leuchtkäfer) katalysiert die Oxidation des
Luciferins in Oxyluciferin. Bei dieser Reaktion werden Photonen freigesetzt, die durch
photodetektorische Messung Auskunft über die Höhe der Expression des Enzyms in
untersuchten Zellen geben.
Luciferase-Puffer:
ATP-Lösung:
Luciferin-Lösung
Reaktionspuffer:
25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO 4 in H 2 O, pH7.8
5 mM ATP in H 2 O, pH7.5 (Lagerung bei -20°C)
0.3 mM Luciferin (synthetisches D-Luciferin),
25 mM Glycylglycin in H 2 O, pH7.8 (Lagerung bei -20°C)
1/5 ATP-Lösung in Luciferase-Puffer
Es werden 10 µl des Zelllysatüberstandes zu 400 µl Luciferase-Reaktionspuffers, vorgelegt in
einem Messröhrchen, gegeben und direkt im Luminometer durch automatische Zugabe von
50 µl Luciferin-Lösung vermessen (Messdauer 10 sec). Die Luciferase-Aktivität wird auf die
Proteinkonzentration oder die Zellzahl normiert (rlu).
4.8.4 Proteinbestimmung nach Bradford
Bradford-Lösung:
Protein-Standard:
0.07 mg/ml Coomassie Brilliantblau G250, 5% (v/v) Ethanol,
8.5% (w/v) Phosphorsäure in H 2 O
3 mg/ml Lysozym in H 2 0 (Lagerung bei -20°C)
In einer 96-Loch Platte für optische Tests werden in den Löchern der ersten Reihe 190 µl, in
den restlichen Löchern jeweils 100 µl H 2 O vorgelegt. In die Löcher der ersten Reihe werden
weiterhin 10 µl eines Proteinstandards und 10 µl des Zellüberstandes gegeben. Anschließend
werden aus den Löchern der ersten Reihe 100 µl der Suspension entnommen und in je ein
Loch der zweiten Reihe überführt. Diese 1:2 Verdünnung wird bis zur letzten Reihe
fortgesetzt. Die sich nun in jedem Loch befindende 100 µl Protein-Verdünnung wird mit je
100 µl Bradford-Lösung versetzt. Anschließend wird die Absorption bei 595 nm gemessen
(Labsystems Multiskan). Der Proteingehalt der Zellextrakte lässt sich anhand der Absorption
des Proteinstandards (Eichgerade) bestimmen.

5 Vektoren und Oligonukleotide 90
5 Vektoren und Oligonukleotide
5.1 Vektoren
5.1.1 Verwendete Vektoren
pAPTKNEF Karreman et al. (1996)
PLU Klehr et al. (1991)
pBSRlucEFluc Hennecke et al. (2001)
pBSRlucmuNFluc Oumard (2001)
pCF133
pCF138
pEFLacZ
pEGFP1
pFGFUS
pGL3basic
pMT7PLNL2
PRBT1
pRBTTTA
PSBC1Luc
Fussenegger, ETH-Zürich
Fux und Fussenegger (2003c)
Hafner, GBF-Braunschweig
Firma Clontech
Seibler, GBF-Braunschweig
Firma Promega
Unsinger, GBF-Braunschweig
Unsinger, GBF-Braunschweig
Unsinger, GBF-Braunschweig
W. Dirks, GBF-Braunschweig
PSBC2 Dirks et al. (1993)
pTARGET1
PtTA2
PtTA3
PtTA4
Verhoeyen, GBF-Braunschweig
Firma Clontech
Firma Clontech
Firma Clontech
PUHD15-1 Gossen und Bujard (1992)
pUHrT62-1
Urlinger et al. (2000b)

5 Vektoren und Oligonukleotide 91
pZeosvlacZ
Firma Invitrogen
ROSA26-1 Soriano (1999)
ROSA26-5’ Soriano (1999)
5.1.2 Hergestellte Vektoren
PSBC2Tkneo
Das Tkneo-Gen wurde aus dem Vektor pAPTKNEF durch Restriktion
mit EcoRI, gefolgt von einer Auffüllung der 5’-überstehenden Enden
und eine Restriktion mit BglII entnommen. Das Plasmid pSBC2 wurde
mit SalI linearisiert, gefolgt von einer Auffüllung der 5’-überstehenden
Enden und einer Restriktion mit BamHI. Ansschließend wurde das
Tkneo-Gen in den geöffneten Vektor inseriert.
[SV40-Promotor]-[Tkneo]-[SV40-PolyA]
PSBC2TkneoL Mittels der Primer Neo54/LoxP3H wurde aus dem Plasmid
pMT7PLNL2 eine Sequenz amplifiziert, die das neo-Gen und am
3’-Ende eine Wildtyp-loxP-Sequenz enthielt. Diese wurde mit PvuII
und HindIII geschnitten und in den mit PvuII/HindIII geöffneten Vektor
pSBC2Tkneo inseriert.
[SV40-Promotor]-[Tkneo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
PSBC2TkneoLML
Aus den Oligomeren MLNHEI5 und MLNHEI3 wurde mittels
Oligohybridisierung ein DNA-Fragment geschaffen, das die Sequenz
für die FRT-Mutante F5 und für die Wildtyp-LoxP-Site enthielt. Diese
wurde in den mit SpeI geöffneten Vektor pSBC2TkneoL inseriert.
[SV40-Promotor]-[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
pRBTTA
Das Gen des Transaktivators tTA wurde aus dem Vektor pRBTTTA
durch Restriktion mit EcoRI/HindIII entnommen und in den mit
EcoRI/HindIII geöffneten Vektor pRBT1 inseriert. Das Transaktivator-
Gen wurde somit unter Kontrolle des Tet-regulierbaren bidirektionalen
Promotors gestellt. Im 3’-Bereich des Transaktivator-Gen schließt sich
ein Polio-IRES an.
[Pbi]-[tTA]-[Polio-IRES]
pRBTTALucF
Mittels der Primer LucFRT/Luc3 wurde aus dem Plasmid pLU eine
Sequenz amplifiziert, die das Luciferase-Gen und am 3’-Ende eine
Wildtyp-FRT-Site enthielt. Diese wurde mit PvuII geschnitten und in
den mit SwaI geöffneten Vektor pRBTTA inseriert.
[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IRES]

5 Vektoren und Oligonukleotide 92
pRBTTALFTN Das Tkneo-Gen mit integrierter F5- und loxP-Seqeunz und 3’-
flankierter loxP-Sequenz wurde aus dem Vektor pSBC2TkneoLML
durch Restriktion mit NotI/XmnI entnommen und in den mit NotI/XmnI
geöffneten Vektor pRBTTALucF inseriert.
[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IRES]-[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-
[SV40-PolyA]
LUCTP
Mittels der Primer TKPolyA5/TKPolyA3 wurde aus dem Vektor
pEGFP1 das TK-PolyA amplifiziert. Das Amplifikat wurde mit AatII
geschnitten und in den mit AatII geöffneten Vektor pRBTTALFTN
inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[Polio-IRES]-[Tk]-[F5-loxP]-
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTE
Mittels der Primer EMCV5/EMCV3 wurde aus dem Vektor
pBSRlucEFluc das EMCV-IRES amplifiziert. Das Amplifikat wurde
mit PmeI/MluI geschnitten und in den mit PmaCI/MluI geöffneten
Vektor LUCTP inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[EMCV-IRES]-[Tk]-[F5-loxP]-
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTN Mittels der Primer MNRF/3MNRF wurde aus dem Vektor
pBSRlucmuNFluc das murine NRF-IRES amplifiziert. Das Amplifikat
wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden Enden
aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF-IRES wurde in den mit
PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende aufgefüllten
Vektor LUCTP inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF-IRES]-[Tk]-[F5-loxP]-
[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTN6
Mittels der Primer MNIA608/3MNRF wurde aus dem Vektor
pBCRLUCNLUC das NRF608-IRES (608-857bp) amplifiziert. Das
Amplifikat wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden
Enden aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF608-IRES wurde
in den mit PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende
aufgefüllten Vektor LUCTP inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF608-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]

5 Vektoren und Oligonukleotide 93
LUCTN7
Mittels der Primer MNIA708/3MNRF wurde aus dem Vektor
pBCRLUCNLUC das NRF708-IRES (708-857bp) amplifiziert. Das
Amplifikat wurde mit SalI/AscI geschnitten und die 5’-überstehenden
Enden aufgefüllt. Das modifizierte Amplifikat mit NRF608-IRES wurde
in den mit PmaCI/NotI geschnitten und am 5’-überstehende Ende
aufgefüllten Vektor LUCTP inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTA2N7
Aus dem Vektor ptTA2 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA2
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTA3N7
Aus dem Vektor ptTA3 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA3
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA3]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUCTA4N7
Aus dem Vektor ptTA4 wurde der 3’-Bereich des Transaktivators tTA4
mittels Restriktion mit NsiI/BamHI entnommen und in den mit
NsiI/BamHI geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA4]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUC3TA2N7
Das Luciferase-Gen Luc3 wurde aus dem Vektor pGL3basic durch
Restriktion mit NheI/BamHI entnommen und in den mit SpeI/BglII
geöffneten Vektor LUCTA2N7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF7-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUC3TA2E
LUC3rTA2E
Das Luciferase-Gen Luc3 wurde aus dem Vektor pGL3basic durch
Restriktion mit NheI/BamHI entnommen und in den mit SpeI/BglII
geöffneten Vektor GALTA2E inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[tTA2]-[EMCV-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
Der reverse Transaktivator rtTA2-M2 wurde aus dem Vektor
pUHDrtTA2S-M2 durch Restriktion mit PmeI/BamHI entnommen und
in den mit PmeI/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2E inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[Pbi]-[rtTA2-M2]-[EMCV-IRES]-[Tk]-[F5-
loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]

5 Vektoren und Oligonukleotide 94
LUC3REX
Mittels der Primer 5PCF133/138 und 3PCF133/138 wurde aus dem
Vektor pCF133 eine Sequenz amplifiziert, die den Erythromycinabhängigen
bidirektionalen Promotor und den Transaktivator ET
enthielt. Das mit BglII geschnittene Amplifikat wurde in den mit
BglII/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2N7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiREX]-[ET]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
LUC3PIP
Mittels der Primer 5PCF133/138 und 3PCF133/138 wurde aus dem
Vektor pCF138 eine Sequenz amplifiziert, die den Pristinamycinabhängigen
bidirektionalen Promotor und den Transaktivator PIT
enthielt. Das mit BglII geschnittene Amplifikat wurde in den mit
BglII/BamHI geöffneten Vektor LUC3TA2N7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiPIP]-[PIT]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
GALTN7
GALTA2E
Das β-Galactosidase-Gen wurde aus dem Vektor pZeosvlacZ durch
Restriktion mit SpeI/BglII entnommen und in den mit SpeI/BglII
geöffneten Vektor LUCTN7 inseriert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[Pbi]-[tTA]-[NRF708-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
Der Vektor GALTN7 wurde mit ScaI/StuI gespalten. Die isolierte
Sequenz enthielt das β-Galactosidase-Gen und den Tet-abhängigen
Promotor. Der Vektor LUCTA2N7 wurde mit StuI/BamHI gespalten.
Die isolierte Seqeunz enthielt den Transaktivator tTA2. Der Vektor
LUCTE wurde mit ScaI/BamHI gespalten. Die isolierte Sequenz
enthielt das EMCV-IRES, das Tkneo-Gen mit Rekombinase-
Erkennungsstellen sowie das Amp-Gen und OriC. Die 3 isolierten
Sequenzen wurden miteinander ligiert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[Pbi]-[tTA2]-[EMCV-IRES]-[Tk]-
[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]
TGALTA2E
Mittels der Primer 5ATGF5 und 3OriCAmp wurde aus dem Vektor
pTARGET1 eine Sequenz amplifiziert, die das Amp-Gen und OriC
sowie im 5’-Bereich eine F5-Sequenz aufwies. Das Amplifikat wurde
mit NcoI/XhoI geschnittenen. Der Vektor GALTA2E wurde mit
SpeI/XhoI gespalten. Die isolierte Sequenz enthielt das Galactosidase-
Gen und im 3’-Bereich die Wildtyp-FRT-Sequenz sowie das TK-PolyA.
Der Vektor GALTA2E wurde mit SpeI/NcoI gespalten. Die isolierte
Sequenz enthielt den Tet-abhängigen bidirektionalen Promotor, den
Transaktivator tTA2 und das EMCV-IRES. Die 3 isolierten Sequenzen
wurden miteinander ligiert.
[TK-PolyA]-[FRT]-[Gal]-[PbiPIP]-[tTA2]-[EMCV-IRES]-[F5]

5 Vektoren und Oligonukleotide 95
LUCTA2N7N
Mittels der Primer NHE5/NHE3 wurde aus dem Vektor LUCTA2N7
eine Sequenz amplifiziert, die das Ampicilin-Resistenz-Gen und den
OriC enthielt. Das Amplifikat wurde mit SspI/Bst1107I geschnitten und
in den mit SspI/Bst1107I geöffneten Vektor LUCTA2N7 inseriert. Die
autoregulierte Expressionskassette wurde dadurch mit 2 flankierenden
NheI-Restriktionsschnittstellen versehen.
[NheI]-[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc3]-[PbiPIP]-[PIT]-[NRF7-IRES]-
[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]-[NheI]
RLUC
Aus dem Vektor LUCTA2N7N wurde durch Restriktion mit NheI die
autoregulierte Expressionskassette entnommen und in den mit XbaI
geöffneten Vektor ROSA26-1 inseriert.
[ROSA5’]-[TK-PolyA]-[FRT]-[Luc]-[Pbi]-[tTA2]-[NRF708-IRES]-
[Tk]-[F5-loxP]-[neo]-[loxP]-[SV40-PolyA]-[ROSA3’]
RLUC-R
Aus dem Vektor LUCTA2N7N wurde durch Restriktion mit NheI die
autoregulierte Expressionskassette entnommen und in den mit XbaI
geöffneten Vektor ROSA26-1 inseriert. Die Orientierung der
autoregulierten Kassette ist invers zum Vektor RLUC.
[ROSA5’]-[SV-PolyA]-[loxP]-[neo]-[loxP-F5]-[Tk]-[NRF708-IRES]-
[tTA2]-[Pbi]-[Luc]-[FRT]-[TK-PolyA]-[ROSA3]
Abkürzungen: F5 FRT-Mutante F5
Gal β-Galactosidase-Gen
Luc3 Luciferase-3 Gen
neo Neomycinphosphotransferase-Gen
Pbi Tetracyclin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
PbiPIP Pristinamycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
PbiREX Erythromycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
ROSA3’ Homologe Sequenz zum ROSA26-Locus
ROSA5’ Homologe Sequenz zum ROSA26-Locus
Tk Thymidinkinase-Gen
Tkneo Fusionsgen aus Thymidinkinase- und Neomycinphosphotransferase-Gen
5.2 Primer/Oligomere
3MNRF
3OriCAmp
5’-AGT GGCGCGCC CAAGTGTGGGCTATACC-3’
AscI 3’-Bereich vom murinen NRF
5’-GGGGGGGGG CTCGAG ACCATATGTCGGGCCGCGTTG-3’
XhoI
3’-Bereich nach OriC
3PCF133/138 5’-GGGGGGCCCCCC AGATCT GGATCC CTACCCACCGTACTCGTCAATTC-3’
BglII BamHI 3’-Bereich nach Transaktivator ET bzw. PIT
(pCF133, pCF138)
5ATGF5
5’-CCCCCGGGGGG CCATGG GG AGATCT GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCC-3’
NcoI BglII FRT-Mutante F5
5PCF133/138 5’-GGGGGGCCCCCC AGATCT TCTAGA GGTGGGCGAATTCCACCACACTG-3’
BglII XbaI 5’-Bereich vor bidirektionalem Promotor
(pCF133, pCF138)

5 Vektoren und Oligonukleotide 96
EMCV3
EMCV5
LoxP3H
Luc3
LucFRT
MLNHEI3
MLNHEI5
MNIA608
MNIA708
MNRF
Neo54
NHE3
NHE5
TKPolyA3
TKPolyA5
5’- GGGGCCCCCAG ACGCGT GTTGATGGCCGGGGTACGAAGCCAT
MluI
3’-Bereich vom EMCV-IRES
GGTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3’
CCCCGGGGCTGCAGTTTAAAC GCGGCCGCGAAATTAATACG-3’
PmeI
5’-Bereich vom EMCV-IRES
5’-CCCGGGG AAGCTT CGTACTCTATAGGCTTCAGG-3’
HindIII 3’-Bereich nach loxP-Site- und neo-Gen
5’-CCCGGGG CAGCTG ACTAGT GGTACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’
PvuII SpeI 5’-Bereich des Luciferase-3 Gens (pGL3basic)
5’-CCCGGGG CAGCTG
PvuII
GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC AGATCT
Wildtyp FRT-Site
BglII
TTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3’
3’-Bereich des Luciferase-Gens
CTAGCG TATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
loxP-Site
GAAGTTCCTATACCTTTTGAAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCG
FRT-Mutante F5
CTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTTCAAAAGGTATAGGAACTTC
FRT-Mutante F5
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACG
loxP-Site
5’-AGCCT GTCGAC ATCTCTCCAGCCCCTGTG-3’
SalI 5’-Bereich im murinen NRF bei 608 bp
5’-AGCCT GTCGAC TGATTCTTTCTTTTCATCCA-3’
SalI 5’-Bereich im murinen NRF bei 708 bp
5’-GGCAGCCT GTCGAC CCTTTCATCCCCCAAAAGTTACC-3’
SalI 5’-Bereich vom murinen NRF-IRES
5’-GGCCGAGATCTATG TCTGATGCCGCCGTGTTCCGG-3’
neo-Gen (intern)
5’-CCCCGGGGG AATATT GCTAGC GAAAAAGGAAGAGTATG-3’
SspI NheI 5’-Bereich vor Amp-Gen
5’- CCCCGGGGG GTATAC GCTAGC TGGCTTAACTATGCGG-3’
Bst1107I NheI Bereich vor OriC
5’-GGGGGGCCCCC GACGTC CTCGAG GCTATGGCAGGGCCTGCCGC-3’
AatII XhoI 3’-Bereich Tk-PolyA
5’-GGGGGGCCCCC GACGTC ATTTAAAT GGGGGAGGCTAACTGAAACACG-3’
AatII SwaI 5’-Bereich Tk-PolyA

6 Abkürzungen 97
6 Abkürzungen
A
Abb.
ATCC
ATG
ATP
βgeo
bp
BSA
C
CIP
CMV
Cre
CTP
DME
DMSO
DNA
DNaseI
dNTP
DTT
E.coli
E.REXOff
EDTA
EF
eGFP
EMCV
ES
ET
ETR
F
F5
FACS
FCS
Flp
Flpe
FRT
G
G418
Gal
GFP
GTP
Adenosin
Abbildung
American Type Culture Collection
Translationsstart
Adenosintriphosphat
Fusion aus β-Galactosidase und Neomycinphosphotransferase
Basenpaar
Rinderserumalbumin
Cytosin
Alkalische Phosphatase
Cytomegalovirus
cyclization recombination (Cre-Rekombinase)
Cytidintriphosphat
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease I
Desoyxribonucleotidtriphosphat
Dithioreitol
Escherichia coli
Eryhtromycin-abhängiges Expressionssystem
Ethylendiamintetraessigsäure
Expressionsfaktor
enhanced green fluorescent protein
Encephalomyocarditis Virus
embryonale Stammzellen
Erythromycin-abhängiger Transaktivator
Operatorsequenz des mph(A)-Promotors
Wildtyp FRT-Site
Mutante der FRT-Site
fluorescence-activated cell sorting
fötales Kälberserum
Flp-Rekombinase
Flp enhanced
Flp recognition target (Erkennungssequenz der Flp-Rekombinase)
Guanin
Aminoglycosid-2’-Deoxystreptin (Gentamycin-Derivat)
β-Galactosidase
green fluorescent protein
Guanosintriphosphat

6 Abkürzungen 98
h
HEPES
HMW-DNA
HSV
Hyg
HygTk
IRES
Kap.
kb
kbp
kDa
kV
l
LacZ
loxP
Luc
Luc3
min
mph(A)
MphR(A)
mRNA
MUG
N
neo
NRF
NRF708
O.D.
ori
pA
P bi
P biPIT
P biREX
PBS
PCR
Pip
PIPOff
PIT
Polio
RA
RF
rlu
RMCE
RNA
Stunde
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure
High molecular weight DNA
herpes simplex virus
Hygromycin-B-Phosphotransferase
Fusion aus Hyg und Tk
internal ribosomal entry site
Kapitel
1000 Basen
1000 Basenpaare
1000 Dalton
1000 Volt
Liter
β-Galactosidase
Locus of X-over (Erkennungssequenz der Cre-Rekombinase)
Luciferase
Luciferase-3 (luc + , Promega)
Minute
macrolide-inactivating 2’-phosphotransferase I
Repressordomäne von mph(A)
messenger RNA
4-Methylumbelliferryl-β-D-Galactosid
NRF708-IRES
Neomycinphosphotransferase
5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NF-κB repressing factor), 1-857 bp
5’-UTR Bereich des NRF-Genes (NF-κB repressing factor), 708-857 bp
optische Dichte
origin of replication
polyA
Tetracyclin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
Pristinamycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
Erythromycin-abhängiger, bidirektionaler Promotor
phosphate buffer saline
Polymerase Kettenreaktion
Pristinamycin induced protein (Repressor-Domäne)
Pristinamycin-abhängiges Expressionssystem
Pristinamycin-abhängiger Transaktivator
Poliovirus
Retinsäure
Regulationsfaktor
relative light units
recombinase mediated cassette exchange
Ribonukleinsäure

6 Abkürzungen 99
RNase
RP
rpm
rtTA
rtTA2-M2
Ribonuklease
ROSA26-Promotor
Umdrehungen pro Minute
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
SDS Natriumdodecylsulfat
sec
Sekunde
SV40 Simian Virus 40
Tab.
Tet
tetO
TetOff
TetOn
TetR
Tk
Tris
tTA
tTA2
tTA3
tTA4
V
v/v
w/v
Tabelle
Tetracyclin
Operatorsequenz des Tetracyclin-Resistenzsystems
Tetracyclin-abhängiges Expressionssystem
Tetracyclin-abhängiges Expressionssystem
Tetracyclin Repressordomäne
Thymidinkinase
Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
Tetracyclin-abhängiger Transaktivator
Volt
Volumen/Volumen (Volumenprozent)
Gewicht/Volumen (Gewichtsprozent)

7 Literatur 100
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7 Literatur 120
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Jürgen Bode und Herrn Prof. Dr. Leopold Flohé danke ich dafür, dass sie
diese Arbeit vor der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität
Braunschweig vertreten. Herrn Prof. Dr. Jahn danke ich für seine Bereitschaft zur Teilnahme
an der Prüfungskommission.
Die vorliegende Arbeit wurde unter Anleitung von Frau Dr. Dagmar Wirth und Herrn Dr.
Hansjörg Hauser in der Arbeitsgruppe Regulation und Differenzierung an der Gesellschaft für
Biotechnologische Forschung mbH (GBF), Braunschweig angefertig.
Mein besonderer Dank gilt Dagmar Wirth, die mich motivierte, viele Denkanstöße gab und
sich stets mit meiner Arbeit konstruktiv auseinandersetzte. Hansjörg Hauser danke ich für
seinen unerschütterlichen Optimismus und für sein großes Interesse an meiner Arbeit.
Mein Dank geht an alle ehemaligen und derzeitigen Kollegen der Arbeitsgruppe „EUGEN“,
die mir viele Anregungen und Hilfen gaben und mir Spaß und Freude bei der täglichen Arbeit
und im Privatleben bereiteten.
Ich danke insbesondere Els Verhoeyen und Meike Tümmler für einen tollen Start in das
Laborleben, Jacqueline Unsinger und Dirk Spitzer für eine gute Zwischenzeit, Tobias May,
Roland Schucht, Alexander Jockwer, Sabrina Herrmann und Susann Herrmann für ein klasse
Finish. Weiterhin danke ich den Mitarbeiter des SAR-Labors wie Kristina Nehlsen, Sandra
Götze und Karin Maaß für die netten und witzigen Gespräche und für ihre stille Toleranz,
wenn ich ihnen auf die Nerven ging. An Maria Höxter geht mein Dank für ihre
Zellsortierungen. Alexandra Baer, Tobias May und Dagmar Wirth danke ich für die kritische
Durchsicht des Manuskripts.
Ich danke Alex für fast zwei Jahre gemeinsames Leben, für ihre Unterstützung und Hilfe, für
die Geborgenheit, die ich an ihrer Seite fand, für die schönen Momente in dieser Zeit, für ihr
Durchhalten in schweren Tagen, für die Träume, die wir hatten, für die Liebe, die Sie mir gab.
Ich danke Beate für alles, was mich bis hierher gebracht hat, für die vielen Jahre während des
Studiums, für die Anerkennung und den Glauben an mich.
Ich danke meinem Sohn Louis für seine grenzenlose Liebe, die mir am Ende den Halt und die
Hoffnung gab, den Weg zu beenden. Ich bin glücklich, dass es Dich gibt.
Ich danke meinen besten Freunden Markus, Börge, Sebastian und Christian für die vielen
gemeinsamen musikalischen und nicht-musikalischen Aktivitäten, aus denen ich Kraft für die
Arbeit gewinnen konnte.
Ich danke Jacqueline für ihre Ratschläge in allen Lebenslagen und für die Spaziergänge an
traurigen Herbsttagen. Ich danke Dirk für die gemeinsamen Nachtarbeiten innerhalb und
außerhalb des Labors.
Ich danke ganz besonders Martina, die mir ein guter Freund war, mich mit meinen Sorgen nie
allein ließ, mich oft genug aufgefangen hat und mir in vielen Vater-Fragen weiterhelfen
konnte.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mit mir alle Höhen und Tiefen während des
Studiums und der Doktorarbeit durchlebten, die sich mit mir gefreut und mit mir gelitten
haben, mir Mut machten und es letztlich mit ihrer fortwährenden Unterstützung und ihrem
Verständnis ermöglichten, dass ich im Leben stehe, wo ich jetzt bin.