G - RWTH Aachen University

Ergebnisse 44
GACACTCCGAA GATCTAAGAG CCACCGTGAG GGGGCCCGGCGCGAACTGGA AGGCGTGCGG GAGCCTGTGG TGGGCAACCA GCATGGGGG
-1418 -1329
-1378 und -1374
CCCGGCGCGAACTGGA
Mutation
CCCGGCTCGAGCTGGA
pot. E2F site
mutierte E2F site -1418/+91 E2Fmut
mit XhoI-Schnittstelle
Abb. 14: Strategie zur in vitro-Mutagenese der E2F-Bindungsstelle. Die Position der Ba-
senaustausche (-1378: G gegen T; -1374: A gegen G) ist in fetten Buchstaben hervorgehoben.
Dieser Austausch generiert zusätzlich eine XhoI-Schnittstelle im Cyclin E2-Promotor, welche für
den Nachweis der erfolgreichen Mutagenese verwendet wurde.
Nach der in vitro-Mutagenese-Reaktion wurde der Reaktionsansatz in E.coli-
Bakterien transformiert und aus Einzelklonen DNA isoliert. Diese wurde mit
XhoI gespalten und in einem 2 %igem Agarosegel auf das Vorhandensein einer
zusätzlichen Bande untersucht. Abb. 15 zeigt den Nachweis der erfolgreichen
Mutagenese in einem Einzelklon, der mit -1418/+91 E2Fmut bezeichnet wurde.
8000 bp
4000 bp
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
-1418/+91 -1418/+91
E2Fmut
Abb. 15: Nachweis der erfolgreichen in vitro-Mutagenese der E2F-Bindungsstelle in der
SOHI. Das Einfügen von zwei Punktmutationen in der SOHI erzeugte eine zusätzliche XhoI-
Restriktionsschnittstelle im Cyclin E2-Promotor. Dadurch entsteht nach Verdau mit XhoI eine
zusätzliche Bande von ca. 1,5 kb (Spur 2). Das ursprüngliche Konstrukt -1418/+91 wird dage-
gen durch XhoI lediglich linearisiert und besitzt eine Größe von 7 kb.
Um den Effekt der mutierten E2F-Bindungsstelle auf die Cyclin E2-
Promotoraktivität zu untersuchen, wurde die Luziferaseaktivität in HuH7-
Hepatomzellen nach Transfektion mit den Konstrukten -1418/+91 bzw.