G - RWTH Aachen University

Ergebnisse 42
Zum Nachweis der spezifischen Interaktion von inhibitorischen E2F-
Transkriptionsfaktoren (z.B. E2F3), p107 und c-myb wurden daher zusätzlich
Supershift-Experimente mit entsprechenden spezifischen Antikörpern durchge-
führt. Abb. 12 (rechter Teil, Spur 2, 4 und 6) veranschaulicht, dass die Komple-
xe mit verringerter Mobilität bei Zugabe von Antikörpern für E2F3 und p107
nicht mehr gebildet werden, was eine spezifische Bindung von E2F3 und p107
an die SOHI andeutet. Da die beiden Komplexe gleichermaßen durch diese
Antikörper depletiert werden, ist davon auszugehen, dass E2F3 und p107 in
einem Komplex an die SOHI binden. Das Fehlen einer „Superhift-Bande“ mit
weiter verringerter Mobilität könnte dadurch erklärt werden, dass die für den
Supershift verwendeten Antikörper an der DNA-bindenden Domäne der beiden
Transkriptionsfaktoren binden und somit die Interaktion mit dem verwendeten
Oligonukleotid inhibieren. Im Gegensatz dazu entsteht nach Zugabe des c-myb
Antikörpers ein neuer Komplex mit verringerter Mobilität, der mit einem Pfeil
gekennzeichnet ist (Supershift). Allerdings wird dieser nur sehr schwach aus-
gebildet. Dies deutet eine spezifische Bindung von c-myb in der SOHI an.
1
2
* * *
E2F3 p107 c-myb
3
unspezifisch
Supershift
* Spur des Supershifts
Abb. 13: Die Transkriptionsfaktoren E2F3, p107 und c-myb interagieren in proliferieren-
den Hepa1-6-Zellen mit der SOHI im Cyclin-E2-Promotor. Nukleäre Extrakte aus proliferie-
renden Hepa1-6-Hepatomzellen wurden für EMSA-Analysen eingesetzt. Als Zielsequenz wurde
das radioaktiv markierte Oligonukleotid 2 verwendet. Der linke Teil der Abbildung zeigt das voll-
ständige Autoradiogramm des EMSA. Aufgrund der relativ schwachen Signale wurde der rele-
vante Teil des Autoradiogramms ausschnittsvergrößert und ist im rechten Teil der Abbildung
dargestellt. DNA-Protein Komplexe mit verringerter Mobilität sind mit Pfeilen gekennzeichnet. In
den mit * markierten Spuren wurde zu dem Reaktionsansatz zusätzlich ein spezifischer Antikör-