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Ergebnisse 39 Nach transienter Transfektion dieser Konstrukte und nachfolgender Analyse der Luziferaseaktivität zeigte sich, dass das Konstrukt -1418/+91 die maximal mög- liche Promotoraktivität vermittelt. Eine weitere 5´-Deletion um nur 89 Basenpaa- re führt bereits zu einer Reduktion der Promotoraktivität um etwa 90 % (Abb. 10). Weiterführende 5´-Deletionen (Konstrukte -1201/+91; -1144/+91) haben dagegen nur noch geringfügige Veränderungen in der verminderten Promotor- aktivität zur Folge (Abb. 10). Diese Daten zeigen, dass die relevanten Promo- torelemente des Cyclin E2-Gens im Bereich zwischen Position -1418 und -1329 lokalisiert sind. - 1890 c-myc E2F - 1633 -1393 +1 -1418 -1329 Promotorkonstrukt -1201 -1144 Bindungsstelle für Transkriptionsfaktor -1418/+91 Prom 4 -1329/+91 E2Prom 2 -1201/+91 E2Prom 5 -1144/+91 E2Prom 6 pGL2 als Kontrolle pGL2 Luziferase 0 50000 5 100000 10 150000 15 200000 20 250000 25 300000 30 350000 35 400000 40 450000 45 104 x Rel. Luziferaseaktivität Abb. 10: Die relevanten Promotorelemente des Cyclin E2-Gens sind im Bereich zwischen Position -1418 und -1329 lokalisiert. Im linken Teil der Abbildung sind maßstabsgerecht die Lage und Größe der verwendeten Promotorkonstrukte zur Charakterisierung der SOI dargestellt. Die relative Position der durch Datenbankanalyse vorhergesagten Bindungsstellen für c- myc und E2F sind hervorgehoben. Die Konstrukte wurden transient in HuH7-Hepatomzellen transfiziert. Zellextrakte wurden wie bereits beschrieben auf Luziferase- und ß- Galaktosidaseaktivität untersucht. Als Negativkontrolle dienten pGL2-transfizierte Zellen ohne Luziferaseaktivität. Der rechte Teil der Abbildung zeigt die durch die ß-Galaktosidaseaktivität normierte relative Luziferaseaktivität in 10 4 Fluoreszenzeinheiten an. Bei allen Messwerten handelt es sich um Mittelwerte aus mindestens vier unabhängigen Transfektionsversuchen. Die Fehlerbalken zeigen die mittlere Standardabweichung an.
Ergebnisse 40 3.1.3 Charakterisierung des Cyclin E2-Minimalpromotors Im folgenden Kapitel werden die Analyse der identifizierten Promotorsequenz auf potentielle Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und die dazugehörigen Er- gebnisse dargestellt. 3.1.3.1 Analyse der relevanten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen Die bislang gezeigten Daten belegen, dass ein Sequenzabschnitt von nur 89 bp zwischen den Positionen -1418 und -1329 für die maximale Cyclin E2- Promotoraktivität absolut essentiell ist. Diese Sequenz wird im Folgenden als „Sequence of High Interest“ (SOHI) bezeichnet und enthält einen Cyclin E2- Minimalpromotor. Mit Hilfe einer vertiefenden TESS-Datenbankrecherche wurde zunächst gezielt nach weiteren potentiellen Bindungsstellen für zellzyklusrelevante Transkripti- onsfaktoren gesucht. Die Computeranalyse ergab für die SOHI potentielle Bin- dungsstellen mit hoher Bindungswahrscheinlichkeit (Log-Likelihoodscore zwischen 8.00-12.00) für die Transkriptionsfaktoren c-myc, c-myb, Sp1, E2F(1) und p107. Die Lage dieser postulierten Bindungsstellen innerhalb der SOHI ist in Abb. 11 dargestellt. c-myc (12.00) E2F+p107 (8.00) GACACTCCG AGATCTAAGA GCCACCGTGA GGGGGCCCGG CGCGA ACTGG AAGGCGTGCG GGAGCCTGT G GTGGGCAACC AGCATGGGGG Sp1 (12.00) c-myb (10.15) E2F1 (9.31) Sp1 (12.00) Abb. 11: SOHI mit postulierten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen aufgrund von Com- puter-gestützten Datenbankanalysen. Dargestellt sind die postulierten Bindungsstellen für c- myc, c-myb, Sp1, E2F(1) und p107. In Klammern ist der jeweilige Log-Likelihoodscore angege- ben (siehe http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess), der für die Bindungswahrscheinlichkeit steht (je größer, desto höher die Wahrscheinlichkeit). Berücksichtigt wurden in dieser Analyse nur Scores ≥8.00 für zellzyklusrelevante Transkriptionsfaktoren. 3.1.3.1.1 Funktioneller Nachweis der Bindung von E2F, p107 und c-myb in der SOHI Im nächsten Schritt sollte geprüft werden, ob die durch Datenbankrecherche extrahierten Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie sowie p107 und c-myb tat- sächlich an Zielsequenzen in der SOHI binden und für die basale und/oder in- duzierbare Aktivierung des Cyclin E2-Promotors verantwortlich sind. Da die ini-
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