G - RWTH Aachen University

Ergebnisse 36
5000 bp
4000 bp
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
1 2 3 4 5 6
Abb. 7: Charakterisierung der generierten Cyclin E2-Promotorkonstrukte nach Insertion
in das pGL2 Luziferase-Reporterplasmid. Cyclin E2-Promotorfragmente wurden mittels PCR
amplifiziert und nach Zwischenklonierung in den pCR ® 2.1-TOPO ® Vektor über die Restriktions-
schnittstellen KpnI und XhoI in den Polylinker von pGL2 inseriert. Die Abbildung zeigt das Er-
gebnis der Gelelektrophorese dieser Cyclin E2-Promotorkonstrukte nach Verdau mit XhoI und
KpnI. Die pGL2-Vektor Bande läuft bei etwa 5 kb, während die verschiedenen Promotorfrag-
mente eine Größe im Bereich von 1,8 kb bis ca. 0,9 kb aufweisen.
Spur 1: -1708/+91 Spur 2: -1502/+91 Spur 3:-1444/+91 Spur 4: -1418/+91 Spur 5: -1090/+91
Spur 6: -821/+91
Zur Identifizierung des Cyclin E2-Minimalpromotors und der essentiellen regula-
torischen Elemente wurden die neu generierten Reporterkonstrukte transient in
HuH7-Hepatomzellen transfiziert. Als Negativkontrolle wurde das pGL2-
Plasmid, welches das Luziferasegen enthält, aber keine Promotoraktivität be-
sitzt, ebenfalls in HuH7-Zellen transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wur-
den die Zellen geerntet und die Zellextrakte im Luminometer auf Luziferaseakti-
vität untersucht. Zur Quantifizierung der Transfektionseffizienz wurde ein ß-
Galaktosidase-exprimierendes Plasmid ko-transfiziert, wobei die in den Zellex-
trakten gemessene ß-Galaktosidaseaktivität zur Normalisierung der Luzifera-
seaktivität diente.
Abb. 8 zeigt, dass die stärkste Promotoraktivität im Bereich zwischen -1418 und
+91 vermittelt wird, so dass in dieser Region die essentiellen und relevanten
regulatorischen Elemente des Cyclin E2-Promotors lokalisiert sind. Interessan-
terweise wird durch das benachbarte Fragment -1090/+91 keine nennenswerte
Promotoraktivität induziert, so dass durch dieses Experiment der Cyclin E2-
Kernpromotor auf den Bereich zwischen den Positionen -1418 und -1090 ein-
gegrenzt werden konnte. Dieser Sequenzbereich wird im Folgenden als „Se-
quence of Interest“ (SOI) bezeichnet und wurde im weiteren Verlauf dieser Ar-