G - RWTH Aachen University

Ergebnisse 34
renden Basenpaare sowie 1921 Basenpaare des 5´-untranslatierten Bereiches
(UTR) enthält (siehe Abb. 6A).
A
B
AvaI (51)
-1708
5‘ UTR
KpnI (182)
1
EcoRI (972)
Promotor
1981 bp
AvaI (985)
Prom2
Prom2
HindIII (1072)
Cyclin E2 mm
+91
Prom2
HindIII (1841)
1981
Ava I (985)
Chromosom 4
Prom2 Prom2
Isoform 1
kodierende Region
nicht-kodierende Region
Promotor mit Schnittstellen Luziferasegen
XhoI (1920)
Luziferase
3‘
Prom2
Isoform 2
in pGL2-Vektor
Abb. 6: Isolierung und Klonierung des potentiellen murinen Cyclin E2-Promotors (mus
musculus, mm). A: Das Cyclin-E2 Gen ist auf Chromosom 4 lokalisiert und kodiert für ein 404
Aminosäuren umfassendes Protein. Die zehn kodierenden Exons von Cyclin E2 sind durch rote
Rechtecke symbolisiert; blaue Bereiche zeigen 5´- und 3´-untranslatierte Regionen an. In der
Abbildung ist die relative Lage der Primer -1708 und +91 für die Amplifikation des längsten Cyc-
lin E2-Promotorkonstrukts eingezeichnet. Quelle: National Center for Biotechnology Information
(NCBI) B: Darstellung der Klonierungsstrategie zur Insertion des putativen Cyclin E2-Promotors
in das pGL2-Reportersystem, welches ein Luziferasegen enthält. Die Primer für die Klonierung
des initialen Promotorkonstrukts -1708/+91 enthielten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme
KpnI und XhoI. Die verschiedenen Cyclin E2-Promotorkonstrukte (siehe Abb. 7) wurden zu-
nächst in den pCR ® 2.1-TOPO ® -Vektor kloniert. Anschließend erfolgte die Amplifikation in E.
coli-Bakterien und die Ligation mit dem pGL2-Vektor zur Messung der Luziferaseaktivität.
Schnittstellen für ausgewählte Restriktionsenzyme (KpnI, XhoI, AvaI, EcoRI und HindIII) im
Cyclin E2-Promotor sind dargestellt. Quelle: Vector NTI (Invitrogen).
Für die Klonierung des initialen Promotorkonstruktes -1708/+91 wurden Primer
verwendet, die mit Restriktionsschnittstellen für KpnI (Primer -1708) bzw. XhoI
(Primer +91) flankiert waren. Für die Bezeichnung der Primer wurde das Start-