G - RWTH Aachen University

Material und Methoden 32
Am Szintillationszähler wurde die Effizienz der Markierung bzw. die Radioaktivi-
tät der Probe ermittelt.
2.2.4.2.3 Durchführung des Gel- und Supershifts
Alle EMSA-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchge-
führt. Dazu wurden 5 µg Kernextrakt in 4 µl 5 x Bindungspuffer (1 M HEPES,
0,5 M MgCl2, 1 M KCl), 2 µl 10 x Proteinase-Inhibitorcocktail (1 M DTT, 0,1 M
Pefabloc, 200 �l Aprotinin), 1 µl Poly dI:dC (1 µg/µl), 1 µl BSA (10 µg/µl in H2O)
und 32 P-markiertes Oligonukleotid (30000 cpm/Reaktionsansatz) aufgenom-
men. Als Kontrolle diente der gleiche Reaktionsansatz ohne Zugabe von Kern-
protein. Die Reaktionsansätze wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschlie-
ßend erfolgte die Zugabe von 2 µl Auftragspuffer (20 %ige Ficollsuspension).
Die Proben wurden auf ein nicht denaturierendes 5 %iges Acrylamidgel aufge-
tragen und über einen Zeitraum von zwei Stunden bei konstant 300 Volt in 0,25
x TBE-Laufpuffer (22,5 mM Tris, 22,25 mM H3BO3, 0,5 mM EDTA) aufgetrennt.
Das Gel wurde nach 15-minütiger Fixierung (10 % Essigsäure; 20 % Methanol)
unter Vakuum getrocknet und bei -80°C auf einem Röntgenfilm exponiert.
Supershift-Experimente wurden nach dem gleichen Protokoll durchgeführt, je-
doch erfolgte nach der Inkubation des Reaktionsansatzes die Zugabe des spe-
zifischen Antikörpers (0,5-2 µg/Probe) und eine zusätzliche, 30-minütige Inku-
bation auf Eis.