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Material und Methoden 30
2.2.4 Proteinbiochemische Methoden
Im Folgenden werden die unterschiedlichen proteinbiochemischen Methoden
beschrieben.
2.2.4.1 Präparation nukleärer Extrakte aus Zellkultur
Hepa1-6- und HuH7-Zellen wurden mit ca. 50 %iger Konfluenz (Hepa1-6: 2 x
10 5 Zellen/Schale, HuH7: 1 x 10 5 Zellen/Schale) auf Zellkulturschalen ausgesät.
Am nächsten Tag erfolgte nach zweimaligem Waschen mit 1 x PBS die Zugabe
von frischem DMEM. Zur Arretierung der Zellen wurde dem Medium zwar Peni-
cillin/Streptomycin, jedoch kein FCS zugesetzt. Proliferierende Zellen wurden in
normalem Kulturmedium mit Penicillin/Streptomycin und 10 % FCS kultiviert.
Am folgenden Tag wurden die Zellen zunächst zwei Mal mit 1 x PBS gewa-
schen und mit Hilfe eines Cellscrapers gewonnen. Anschließend erfolgte die
Überführung in ein Eppendorfgefäß mit 500 µl PBS und die Lagerung auf Eis.
Danach wurde die Zellsuspension zehn Minuten bei 4 °C und 1000 1/min zentri-
fugiert und zum Schluss der Überstand abgetrennt und verworfen. Das Pellet
wurde in 200 µl NPBT-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCl2, 140 mM
NaCl, 0,5 % Triton X-100) aufgenommen, der Ansatz vorsichtig gemischt und
für zehn Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Probe auf 200 µl
eines 50 % Sucrose-Kissens (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCl2, 140 mM
NaCl, 50 % Sucrose) aufgeladen und bei 4°C und 14000 1/min für zehn Minu-
ten zentrifugiert. Das Kernpellet wurde vorsichtig in 100 µl Lösung C (20 mM
HEPES, pH 7.9, 25 % Glycerol, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA) suspendiert und
daraufhin für 30 Minuten in einem Überkopfschüttler bei 4°C und leichter Rota-
tion inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren bei 4°C und 14000 1/min für zehn
Minuten wurde der Überstand mit dem aufgereinigten Kernextrakt bei 230 nm
und 260 nm vermessen. Die Lagerung erfolgte nach kurzem Stickstoffschock
bei -80°C. Allen oben genannten Lösungen und Puffern wurden Proteinaseinhi-
bitoren zugesetzt (1 mM Na3VO4, 2 mg/ml Aprotinin und 0,5 mM PMSF/0,5 mM
DTT).
2.2.4.2 Gelshift/Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Mit Hilfe von EMSA-Analysen können Interaktionen von DNA-Fragmenten mit
Proteinen dargestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden so potentielle
Interaktionen von Transkriptionsfaktoren mit möglichen Zielsequenzen im Cyclin