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Material und Methoden 28
Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in einer Dichte von 2 x 10 5 Zel-
len/ml in 6 cm Zellkulturschalen ausgesät. Zur Transfektion wurden jeweils kon-
stant 5 µg DNA eingesetzt. Zunächst erfolgte die Mischung der DNA mit 150 µl
0,25 M CaCl2 und anschließend die Zugabe von 150 µl 2 x BBS-Puffer (280 mM
NaCl; 50 mM Bes; 1,5 mM Na2HPO4 x 2H2O; pH 6.87). Der Ansatz wurde vor-
sichtig mit der Pipette durchmischt und für zehn Minuten bei Raumtemperatur
zur Ausbildung der DNA-Kalziumphosphat-Präzipitate inkubiert. Der gesamte
Ansatz wurde unter leichtem Schwenken der Kulturschale auf die Zellen ge-
tropft. Anschließend fand über einen Zeitraum von 16 Stunden unter Schockbe-
dingungen (35 °C und 3 % CO2) die Inkubation der Zellen statt. Nach zweimali-
gem Waschen mit PBS und der Zugabe von frischem DMEM-Medium wurden
die Zellen zur Aufbereitung weitere 24 Stunden unter normalen Zellkulturbedin-
gungen gehalten.
2.2.3.3 Luziferase-Assay
In diesem Kapitel erfolgt die Darstellung der Methoden, die zur Durchführung
des Luziferase-Assays angewandt wurden.
2.2.3.3.1 Isolierung von Proteinextrakten für Luziferase-Assays
Zur Isolierung der Proteinextrakte für Luziferaseassays wurden die transfizier-
ten Hepatomzellen zunächst zwei Mal mit 1 x PBS gewaschen und anschlie-
ßend in 350 µl Extraktionspuffer (25 mM Tris; 20 mM H3PO4;10 % Glycerol;
1 % Triton-X 100; 2 mM EDTA; 2 mM DTT pH 7.8) für zehn Minuten inkubiert.
Nach Gewinnung der lysierten Zellen mit Hilfe eines Cellscrapers, der Überfüh-
rung in ein Eppendorfgefäß und Zentrifugation bei 4°C und 16000 1/min für
zehn Minuten, wurde der Überstand abgenommen und für Luziferase- und ß-
Galaktosidase-Messungen verwendet.
2.2.3.3.2 ß-Gal-Assay
Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden in jedem Transfektionsansatz
0,5 �g eines ß-Galaktosidase-Expressionsvektors ko-transfiziert. Die Aktivität
der ß-Galaktosidase kann in Zellextrakten in einer Farbreaktion spektrophoto-
metrisch schnell und einfach nachgewiesen werden und dient als interner Stan-
dard zum Vergleich mehrerer unabhängiger Transfektionsexperimente. Dazu