G - RWTH Aachen University

Material und Methoden 26
2.2.1.10 Quantitative Real-Time-PCR
Die Bestimmung der Genexpression von Cyclin E1 und Cyclin E2 in Hepatom-
zelllinien erfolgte quantitativ durch real-time PCR in einem ABI 7300 Real Time
PCR System mit SDS Software Version 1.3.1 (Applied Biosystems). Die PCR-
Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 25 �l mit Hilfe eines SYBR
Green PCR Kit (Invitrogen) durchgeführt und durch gleichzeitige Messung der
GAPDH-Expression als internem Standard normalisiert. Für die PCR über 40
Zyklen betrug die Annealingtemperatur 58°C (30 Sekunden) und die Elongati-
onstemperatur 60°C (30 Sekunden).
Die relative Quantifizierung der Genexpression erfolgte mit Hilfe der ΔΔCT-
Methode 58 .
2.2.1.11 Gerichtete in vitro-Mutagenese
Die Mutagenese der potentiellen E2F-Bindungsstelle im Cyclin E2-Promotor
wurde mit einem QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) gemäß
den Arbeitsanweisungen des Herstellers durchgeführt. Zum besseren Nachweis
der erfolgreichen Mutagenese wurde bei der Mutation eine zusätzliche XhoI-
Schnittstelle generiert.
Die PCR-Reaktion erfolgte in einem Endvolumen von 50 µl mit 20 bzw. 50 ng
DNA mit den unter 2.1.4 aufgeführten Primern und einer Annealingtemperatur
von 55°C für 18 Zyklen.
Nach Beendigung der PCR-Reaktion wurde der komplette Ansatz in kompeten-
te E. coli-Bakterien transformiert. Aus Einzelklonen erfolgte die Isolation von
Plasmid-DNA und mittels Restriktionsverdau die Testung auf erfolgreiche Muta-
genese.
2.2.2 RNA-Arbeitstechniken
In diesem Kapitel werden die verschiedenen RNA-Arbeitstechniken, die zur An-
fertigung der Dissertation verwendet wurden, beschrieben.
2.2.2.1 RNA-Isolierung aus Hepatomzellen
Gesamt-RNA aus Hepatomzellen wurde mit Hilfe eines peqGOLD RNAPure
Kits (Peqlab) entsprechend den Herstellerangaben aus 1-5 x 10 6 HuH7- bzw.
Hepa1-6-Zellen pro Ansatz isoliert. Das getrocknete RNA-Pellet wurde am En-
de in 30 µl RNase-freiem H2O aufgenommen, bei 260 nm und 280 nm optisch